Summary
Представленные здесь простой метод для изоляции и потока цитометрии анализа глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови, что дает время зависит от количественных данных о количестве и состоянии активации иммунных клеток, входящих в ранней микросреду опухоли головного мозга.
Abstract
В нашей лаборатории недавно показали, что естественные киллеры (NK) клетки способны ликвидации ортотопически имплантированный GL26 мыши и крысы ЦНС 1 злокачественных глиом вскоре после внутричерепной приживления, если раковые клетки оказываются несовершенными в их экспрессии β-галактозид лектин галектина -1 (Gal-1). Более поздние работы в настоящее время показывает, что население Gr-1 + / CD11b + миелоидных клеток имеет решающее значение для этой цели. Чтобы лучше понять механизмы, с помощью которых НК и миелоидных клеток сотрудничать, чтобы придать гал-1-дефицитных отторжение опухоли мы разработали комплексную протокол для выделения и анализа глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Метод демонстрируется здесь, сравнивая МКПК проникновение в опухолевую микросреду Гал-1-экспрессирующих GL26 глиомы с тех, кто оказался Гал-1-дефицитных помощью shRNA нокдаун. Протокол начинается с описания того, как к культуре и подготовить GL26 CEзаполняет для прививки в сингенной C57BL / 6J мозга мыши. Затем объясняет этапы в изоляции и потока цитометрии анализа глиомы инфильтрирующие МНПК от раннего микросреды опухоли головного мозга. Метод адаптируется к ряду в естественных экспериментальных конструкций, в которых требуется временные данные по иммунной инфильтрации в головном мозге. Метод чувствителен и высокой воспроизводимостью, а глиомы-проникновения РВМС могут быть выделены из внутричерепными опухолями, как только 24 ч после приживления опухоли с аналогичными количество клеток, наблюдаемых из точечных соответствует опухолей времени на протяжении независимых экспериментов. Один экспериментатор может выполнять способ лесозаготовок мозга течь цитометрический анализ глиомы инфильтрирующие МНПК в примерно 4-6 часов в зависимости от количества анализируемых образцов. Альтернативные модели глиомы и / или клеточно-специфические антитела обнаружения также могут быть использованы по усмотрению экспериментаторов "для оценки инфильтрации нескольких других ImmunТипы электронной клеток, представляющих интерес, без необходимости изменения в общей процедуре.
Introduction
Глиомы представляют собой класс нейроэпителиальных рака головного мозга, вытекающих из трансформированной глии в центральной нервной системе (ЦНС). Из всех глиом, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) класса IV глиомы, глиобластомы или (GBM), является наиболее распространенным и смертельный 1. GBM является весьма резистентны к текущей стандарт оказания медицинской помощи, которая состоит из удаления опухоли в максимально возможной степени с последующим излучением плюс сопутствующей и адъювантной химиотерапии темозоломидом 2. Эти смертоносные раки нести мрачный прогноз только 15-18 месяцев выживания с момента установления диагноза с только 5% больных, перенесших заболевание после 5 лет 3.
Наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), отсутствие профессиональных антиген-представляющих клеток (БТР), и ранее неизвестный наличие добросовестных лимфатических структур в мозге 4 привели к понятию GBM, как иммунной привилегированных. Тем не менее, многочисленные исследования в настоящее время шож, что эти рака мозга действительно порождают набор периферийных иммунных клеток, которые преимущественно миелоидной происхождения, которые включают моноциты, макрофаги, и миелоидных полученных клеток-супрессоров (MDSCs) 5. GBM также влияет на деятельность головного мозга резидентом микроглии стать про-онкогенные 6,7. Лимфоидных клеток, такие как CD8 + Т-клеток 8 и CD56 + натуральных киллеров 9 также присутствуют в опухоли микроокружения, но в гораздо меньшем количестве, факт считается, в связи с иммуносупрессивной функции спровоцированного глиомы, полученных факторов на ассоциированных с опухолью макрофаги ( ТАМ) 10. CD4 + T-клетки также присутствуют в GBM, но многое из этого населения также выражает CD25 и FoxP3, производители иммуносупрессивной T нормативной (T) клеток обл 11. Общая иммуносупрессивной состояние GBM завершается в продвижении иммунологической побега и опухолевой прогрессии 12.
13-19. Кульминацией этой работы в настоящее время привело к клиническому испытанию, предназначенный для оценки комбинированного цитотоксические и иммунной стимулирующее терапевтическое для пациентов с впервые выявленным GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).
Наша последняя работа показывает, что GL26 мыши и крысы ЦНС 1 GBM клетки блокируют противоопухолевую НК клеток иммунного надзора по производству больших количеств β-галактозид лектина галектин-1 (Gal-1) 20. Это было продемонстрировано путем подавления экспрессии Gal-1 в клетках глиомы, используя shRNA-опосредованной генной нокдаун. В пробирке экспериментальTS показали, что Гал-1-дефицитных клеток глиомы распространение как правило, в культуре, но подверглись быстрому отказ вскоре после внутричерепного приживления сингенным C57BL / 6J или RAG1 - / - мышей, таким образом, установление независимости Т- или В- клеток на этом виде отказ опухоли. НК клеток immunodepletion с анти-асиало GM 1 анти-сыворотки или моноклональных антител NK1.1 привели к полному восстановлению внутричерепного Гал-1-дефицитных роста глиомы, устанавливающих роль NK-клеток в Гал-1-дефицитных отказа глиомы. Покажем теперь, что immunodepletion ГР-1 + / CD11b + миелоидной клетки достаточно, чтобы предотвратить гал-1-дефицитных отказ глиомы, несмотря на наличие NK клеток, таким образом, открывая незаменимым вспомогательную роль для миелоидных клеток в пособничестве в НК-опосредованной гал -1-дефицитных лизиса опухоли (неопубликованные данные). Этот неожиданный результат привел нас к разработке комплексной протокол для выделения и анализа мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК), чтопроникнуть в микросреду опухоли мозга вскоре после внутричерепного приживления, чтобы мы могли лучше характеризуют иммунную инфильтрации события, которые предикатов гал-1-дефицитных отказ глиомы.
Метод демонстрируется здесь с помощью мыши GL26 глиомы клетки, которые конструктивно экспресс mCitrine флуоресцентный белок, называемый GL26-CIT, которые позволяют прямой визуализации опухолевых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии 21. Эти клетки стереотаксически привиты в мозг сингенных C57BL / 6J и давали расти в течение 24, 48 или 72 ч до мыши эвтаназии. Глиомы инфильтрирующие РВМС затем выделяют и immunolabeled с использованием анти -CD45, -GR-1, -CD11b и -NK1.1 клеточной поверхности антитела вместе с внутриклеточной иммунноокрашивания для гранзима (GzmB). Это специфическое сочетание антител позволяет идентифицировать опухолевых инфильтрующих GR-1 + / CD11b-миелоидных клеток и NK1.1 +, NK клеток, клеточных типов имеем Вееп вовлечен в гал-1-дефицитных отторжение опухоли. Иммунная профиль инфильтрация гал-1-дефицитных GL26-чит глиомы, называемый здесь GL26-чит-gal1i, затем по сравнению с глиом, выражающих нормальные уровни Гал-1 под названием GL26-чит-НТ, которые содержат не- ориентации управления shRNA шпильку. Протокол начинается с описания о том, как культура GL26-Соч клеток глиомы в пробирке, которая сопровождается объяснением о том, как привить ортотопически эти клетки в стриатуме сингенным C57BL / 6J. Затем переходит перечислить этапы выделения и иммунноокрашивания глиомы инфильтрирующие МНПК для анализа потока цитометрии. Протокол заключает с объяснением стандартного анализа и графического представления.
Демонстрация показывает, что оба Гр-1 + / CD11b + миелоидных клеток и NK NK1.1 + клетки преимущественно накапливаются в гал-1-дефицитных опухолей головного мозга микросреды в 48ч имплантации опухоли, в результате которых помогает объяснить, почему эти опухоли быстро пройти полный лизис опухоли примерно 1 неделю после приживления опухоли 20. Способ может быть легко адаптирован к ряду различных естественных экспериментальных в конструкции, в которых требуется временные данные по иммунной инфильтрации в головном мозге. Один экспериментатор может выполнить протокол от уборки мозга течь цитометрический анализ глиомы инфильтрирующие МНПК примерно 4-6 часа в зависимости от количества анализируемых образцов. Способ также может быть объединена с экспериментов, направленных охарактеризовать профиль циркулирующего РВМС в мышей, несущих опухоли для сравнения с тем, что проникают в головной мозг, так, чтобы идентифицировать иммуносупрессии фенотипы частности, вызванные опухоли микроокружения. Применение этой и подобных методов должно способствовать лучшему пониманию факторов, участвующих в торговле периферийных иммунных клеток в опухоли микроокружения головного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Пожалуйста, пересмотреть всю протокол до проведения экспериментов. Разрешение на использование позвоночных животных от соответствующей институциональной комитета по использованию и благосостояния животных должны быть получены до судебного разбирательства.
1. Подготовка опухолевых клеток для внутричерепных приживления
- Работа в класс II кабинете биологической безопасности следует начинать с подготовки GL26-чит-NT / gal1i культуры клеток путем дополнения 500 мл бутылку Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% стерильной фильтрацией тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS ), 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 600 мкг / мл G418 сульфат (по выбору вектора экспрессии mCitrine) и 3 мкг / мл пуромицин дигидрохлорида (по выбору не- ориентации или гал-1-специфические shRNAs).
- Культура GL26-чит-НТ и / или GL26-чит-gal1i клетки (рис 1А и 1В 2 в течение 1-2 дней до процедуры приживления опухоли или до колбы достигают 50-80% слияния.
- В день операции, удалить среды для культивирования клеток из клеток глиомы с использованием 10 мл серологической пипеткой и пипетки пистолет и выбросить носитель в химическом стакане с отходами.
- Обратить колбу сверху стороной вниз и добавить 10 мл DPBS в надводной части колбы с помощью 10 мл серологические пипетки. Медленно переверните флягу, чтобы покрыть клетки в DPBS, то чаевые колбу вертикально и снимите и выбросьте DPBS в стакан с отходами.
- Добавить 3-4 мл немлекопитающих трипсина альтернативы в DPBS с ЭДТА (см список материалов для деталей) к каждому T75 тканевой культуральной колбы и поместить обратно в ткани культуры шкафу в течение 2-5 мин. Использование ярко-поле микроскопа, проверьте, что все клетки, отделившиеся от нижней поверхности до судебного разбирательства.
- Запрет furtheR ферментативную активность путем разбавления трипсина альтернативу с 6 мл DPBS. Пипетка вверх и вниз с помощью 10 мл пипетки серологические для полоскания нижнюю поверхность колбы и механически отделить клеточные агрегаты любых. Аспирируйте клетки и поместить в соответственно меченных 15 мл центрифужные пробирки. Спин клетки вниз на 550 мкг (макс RCF) в течение 5 мин при 4 ° С (рис 1c).
- Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют клеток с 1 мл без карнозина DMEM. Убедитесь, что пипетки клетки вверх и вниз полностью с P-1000 микропипетки достичь суспензии отдельных клеток.
- Делают разбавление полученной суспензии клеток в 1,6 генерируемого 1:10, помещая 18 мкл без карнозина DMEM в 0,6 мл коническую полипропиленовую микропробирок с последующим добавлением 2 мкл суспензии клеток опухоли. Внесите вверх и вниз с помощью П-10 микропипетки для гомогенизации клетки тщательно.
- Добавить 10 мкл &# 160; разбавления 1:10 опухолевых клеток, генерируемого в 1,7 к 0,6 мл отдельных конической полипропиленовой микропробирку, а затем добавить 10 мкл трипанового синевы к трубе. Тщательно перемешайте с Р-10 микропипетки и добавить 10 мкл результате клетки опухоли / трипанового синего раствора под покровным стеклом расположен на вершине гемоцитометре будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха (рис 1D).
- Граф клеток с ярко-поле микроскопа с использованием цели 10X в зависимости от конкретного протокола, связанного с данной гемоцитометре. Обязательно фактором в 20-кратного разведения исходного суспензии опухолевых клеток, сделанные в ходе подготовки клеток для точной оценки клеток в исходной 1 мл аликвоты. Используйте следующую формулу для расчета общее количество клеток: клетки всего / мл = [((Σcells насчитал за квадрат) / # квадратов подсчитанных) х 20 (т.е. коэффициент разбавления) х 10000 клеток / мл].
- После Determining общее количество клеток для каждой клеточной линии, используемой в данном эксперименте, спина их вниз на 550 мкг (макс RCF) в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант (ы) и ресуспендирования клеток с соответствующим объемом без карнозина DMEM с целью достижения целевой концентрации 3 х 10 4 клеток на 1 мкл для каждой клеточной линии в соответствии со следующей формулой: (Общее количество клеток / 30000).
- Поместите эквивалентный объем каждой клеточной линии в соответственно меченных 0,6 мл конических пробирках и полипропиленовых месте на льду (рис 1E). Будьте уверены, чтобы сохранить некоторые клетки, чтобы продолжить распространения каждой клеточной линии, если отдельные T75s ранее не заполняется.
2. Порядок стереотаксической приживления клеток глиомы в стриатуме C57BL / 6J
- Подготовка рабочих растворов хирургической анестезии, обезболивания, и анестезии разворота до операции следующим образом:
- Для кетамина / дексмедетомидина сurgical анестезии: удалить 1,4 мл из 10 мл флакон стерильного 0,9% инъекции NaCl и заменить 600 мкл 100 мг / мл маточного раствора гидрохлорида кетамина и 800 мкл 0,5 мг / мл маточного раствора гидрохлорида дексмедетомидина с получением смешанный рабочий раствор кетамина гидрохлорида из (6 мг / мл) и гидрохлорида (дексмедетомидина 0,04 мг / мл).
- Бупренорфина обезболивания: удалить 1 мл из 10 мл флакон стерильного 0,9% NaCl инъекции и заменить весь объем 1 мл одного 0,3 мг / мл гидрохлорида сток бупренорфин ампуле с получением 0,03 мг / мл рабочего раствора.
- Для Атипамезол разворота хирургической анестезии: удалить 1 мл из 10 мл флакон стерильного 0,9% NaCl инъекции и заменить 1 мл 5 мг / мл исходного раствора гидрохлорида Атипамезол с получением 0,5 мг / мл рабочего раствора.
- Работа в утвержденной место для выживания мыши сurgery, начинают путем установки в автоклаве или шарик стерилизовать хирургические инструменты и другие реагенты, как показано на (фиг.2А), то получить достаточное 8-10 недельных самок мышей C57BL / 6J (сингенных с GL26 глиомы), необходимое для исследования; обеспечения их постоянного доступа к пище и воде.
- Обезболить первую мышь с одной внутрибрюшинного (ф) инъекции рабочего раствора анестезии, предоставляя дозе 75 мг / кг кетамина и 0,5 мг / кг (примерно дексомедетомидина 250 мкл для 20 г мыши). Далее, дать 5 мг / кг подкожно (SC) инъекции карпрофена (примерно 100 мкл для 20 г мыши). Убедитесь, что мышь не реагируют на носок и хвост щепотки до перехода.
- Использование хирургических ножницы, брить шерсть от черепа. Применить повидон-йода антисептический раствор для бритой области, скраб с 70% изопропиловый спирт подготовительной площадки, а затем вновь применить повидон йод антисептическим раствором. Далее, нанесите небольшое количество Steriле вазелин глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить высыхание.
- Безопасный череп в стереотаксической рамы по следующему протоколу:
- Осторожно откройте рот, достигнув с парой изогнутых щипцов рассечения мягко вытащить язык и двигаться в сторону рта, чтобы предотвратить удушье. Разрешить щипцы, чтобы убрать то время как в рот, чтобы распространить челюсть открыта и направлять две верхние резцы в замочную скважину баре зуба на стереотаксической рамы. Закрепите планку зуба от поворота по горизонтали или вертикали, регулируя соответствующие винты. Убедитесь, что череп мыши на одном уровне с рабочей поверхностью.
- Поместите ухо баров надежно против заглазничными костей черепа будьте осторожны, чтобы не применять слишком много давления на внутреннюю черепа для того, чтобы предотвратить дробление.
- Поместите бар нос по языку и не закрутите до упора. Убедитесь, что нет вертикали / боковое движение в голову, слегка надавливаяс большим и указательным пальцами. Мышь помещают в правильной стереотаксической рамки, показан на фиг.2В ().
- Использование лезвие скальпеля, сделать 1 см разрез над срединной черепа из лобной кости к затылочной кости. Уберите кожу в разрез с помощью Colibri преднатяжителями.
- Опустить мкл шприца, снабженного 33 G иглой в вертикальном плече стереотаксической раме непосредственно над позицией темени (фиг.2с). Оттуда, отрегулируйте положение мм AP иглы +0,5 +2,5 мм, ML, чтобы достичь целевой сайт для имплантации опухоли. Используйте 1 мл туберкулиновые шприцы, оснащенный 26 G иглы, чтобы отметить это место, осторожно раздражающие надкостницы.
- Не Просверлите отверстие в черепе в целевом сайте до достижения основной твердой мозговой оболочки с помощью Аккумуляторные дрели Precision Power, оснащенный "(0,8 мм) немного 1/32. При бурении, применяют прерывистый давлении с последующим удалением DRILL немного от поверхности черепа, чтобы избежать перегрева и силы, которые могут привести к иным сверла прокалывания основной ткани мозга.
- Флеш мкл шприц с 0,9% NaCl в 1,7 мл коническую полипропиленовую микропробирок чтобы гарантировать, что игла не забит. Аккуратно вылить 0,6 мл коническую полипропиленовую микропробирку, содержащий опухолевые клетки несколько раз для ресуспендирования клеток.
- Составьте 2 мкл клеток в микролитр шприца гарантируя, что пузырьки воздуха не будут введены в шприц. Разлить по 1 мкл клеток на 70% изопропилового спирта препаративной площадку, оставляя ровно 1 мкл опухолевых клеток, остающихся в шприце.
- Принесите иглу вниз, пока она не коснется твердую мозговую оболочку, то ввести иглу в мозг -3.5 мм вентрально и сжимаются +0,5 мм. Медленно и плавно доставить клетки путем нажатия шприца в течение 1-2 мин.
- Разрешить клетки посе в месте инъекции в течение 5 мин перед медленно извлечение иглы. Вытрите свернувшейся крови или мозговое вещество из кончика иглы с чистым 70% -ным изопропиловым спиртом препаративной площадку. Промыть иглу шприца и тщательно с 0,9% NaCl с шага 2.6, чтобы гарантировать, что игла не засорен для следующей инъекции.
- Снимите втягивающие Colibri и шов кожи головы, используя три 3-0 нейлон мононити швов. Удалить мышь от стереотаксической рамы и управлять 0,1 мг / кг бупренорфина гидрохлорида подкожно (п) (приблизительно 67 мкл 0,03 мг / мл рабочего раствора на 20 г мыши), а затем 2,5 мг / кг атипамезола гидрохлорид внутримышечно (IM) (примерно 100 мкл 0,5 мг / мл рабочего раствора для 20 г мыши) для послеоперационного обезболивания и анестезии разворота. Поместите послеоперационных мышей обратно в их клетках под нагревательным лампы, чтобы оправиться.
3. Мышь Transcardial Perfusионов и Заготовка мозга
- Подготовьте гепаринизированной решение Тирода соответствии со следующим протоколом:
- Поместите магнитной мешалкой в завинчивающейся крышкой бутылки хранения 1 л стекла и заполнить до объема сверхчистой деионизированной воды. Поместите бутылку на пластины для перемешивания.
- Взвесьте и добавьте следующие химические вещества в стеклянной бутылке при перемешивании: 8 г хлорида натрия (NaCl) 0,264 г хлорида кальция (CaCl 2 • 2H 2 O), 0,05 г фосфата натрия одноосновной (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), 1,0 г D-глюкозы (C 6 H 12 O 6), 1,0 г бикарбоната натрия (NaHCO 3), 0,2 г хлорида калия (KCl). Разрешить соли растворить, а затем добавить 100 мкл 1,000U / мл маточного раствора гепарина натрия в растворе Тирода.
- Удалить контейнер из перемешивающей пластине и извлечь планку перемешивании с использованием магнитной палочки. Храните гепаринизированную решение Тирода на 4° С.
- Подготовка рабочего раствора для терминальных анестезии следующим образом:
- Для кетамин / ксилазина терминала анестезии: удалить 1360 мкл с 10 мл флакон стерильного 0,9% инъекции NaCl и заменить 1200 мкл 100 мг / мл маточного раствора гидрохлорида кетамина и 160 мкл 100 мг / мл маточного раствора ксилазина гидрохлорид с получением смешанного рабочего раствора кетамина гидрохлорида (12 мг / мл) и ксилазина гидрохлорида (1,6 мг / мл).
- Подготовка плотность раствора центрифугирования СМИ смеси путем размещения 90 мл 10x PBS в 264 мл сверхчистой деионизированной воды (3.93x) в стерильной пластиковой таре. Титрование до рН 7,0-7,2 с помощью НСl и фильтруют стерилизовать через фильтр 0,22 мкм. Хранить при 4 ° С.
- Подготовка 70% плотность центрифугирования СМИ путем объединения 18 мл плотности центрифугирования медиа-решение смешать с 30 мл плотность центрифугирования СМИ (см список материаловподробности) в 50 мл полипропиленовые трубки центрифуги. Хранить при 4 ° С, но довести до комнатной температуры перед использованием.
- Подготовка 37% центрифугирования в градиенте плотности носитель путем объединения 9,6 мл DPBS с 10,4 мл 70% центрифугирования в градиенте плотности сред в 50 мл центрифужную пробирку. Хранить при 4 ° С, но довести до комнатной температуры перед использованием.
- Получают буфер потока, помещая 500 мкл FBS в 50 мл DPBS (~ 1% FBS) в 50 мл центрифужную пробирку. Храните в магазине при 4 ° C
- Заполните 4.5 L полиуретан ведро льда, чтобы емкость с ледяной стружки.
- Сделать комбинированный раствор 1 мг / мл коллагеназы и 1 мг / мл ДНКазы I-в количестве, достаточном для 1 мл в образце мозга в исследовании разбавлением 10 мг / мл ДНКазы I-маточного раствора 1:10 и 50 мг / мл коллагеназы раствор 1:50 стерильными DPBS в одном 15 мл полипропиленовую центрифужную пробирку. Аккуратно перемешать раствор с помощью пипетки вверх и вниз с P-1000 микропипеткой. Храните на льду в polyurethане ведро с шага 3.7.
- Получить два 7 мл стеклянные Dounce ткани шлифовальные. Добавьте один "NT", а другой "gal1i". Поместите ткани шлифовальные в ведерке со льдом и добавить 1 мл DPBS друг.
- Получить достаточно 15 мл центрифужные пробирки для сбора мозгового вещества из каждой мыши в области исследования и место в ведерке со льдом.
- Место ~ 150 мл DPBS среди трех 50 мл центрифужные пробирки в ведерке со льдом.
- Получить достаточно полистирола шестиугольные весом блюда (верхний внутренний диаметр (ID) 115 мм, база ID 85 мм, 203 мл объем) для каждой мыши в исследовании. В комплект для вскрытия и растирания мозгов мыши показано на (3А)
- В выбранных точках времени, анестезию первую мышь, несущих опухоль в исследовании с использованием одного инъекцией 150 мг / кг кетамина гидрохлорида и 20 мг / кг ксилазина гидрохлорид (приблизительно 250 мкл объединенного 12 мг / мл кетамина / 1,6 мг / мл ксилазин рабочего раствора для 20 г мыши), чтобы вызвать глубокий наркоз. Убедитесь, что мышь не является ответом на носок и хвост щепотки до судебного разбирательства.
- Получить заранее подготовленный раствор Tyrode и поместить в ламинарном потоке, посвященном хирургических процедур терминал животных. Поместите газа непроницаемый полимерный шланг, прикрепленный к карбогена бака в растворе Тирода. Откройте вентиль баллона, чтобы 95% O 2/5% СО 2 карбогена постоянно пузырь в раствор.
- Приложить 20 г алюминиевого ступицы тупую иглу до конца дополнительного газонепроницаемого полимерной трубки, прикрепленной к перистальтического насоса. Поместите трубку на другом конце перистальтического насоса в раствор в Тирода и поверните насос на, чтобы трубка для заполнения раствором насыщенной кислородом и Гепаринизированные Тирода. Набор для мыши transcardial перфузии показано на (рис 3B).
- Используя четыре 26 г иглы, придавитьнаркозом мыши вентральной стороной вверх в передней и задних лап на экструдированного пенополистирола блока, покрытого полотенцем утилизации абсорбента в капюшоне ламинарного потока.
- Возьмитесь за кожей над брюшную полость, используя пару тупым пинцетом и, используя большой пара рассечение ножницами сделать "Y" разрез с проникновением в брюшную стенку, резка cephalically проколоть мембрану, то бифурцирующих на грудине, чтобы прекратить в левый и правый подмышечные впадины.
- Используйте кровоостанавливающего зажать грудины и отражают грудную клетку над левым плечом мыши. Удалить перикарда с парой тупым пинцетом.
- Включите перистальтического насоса, чтобы начать устойчивый капельного раствора насыщенной кислородом и гепаринизированной Тирода (примерно 2,3-2,5 мл / мин).
- Вставьте тупую иглу в левый желудочек сердца. Используйте маленькую пару рассечение ножницами, чтобы отрезать правое предсердие, чтобы позволить обескровливания (рис3C).
- Разрешить Решение Тирода тщательно заливать систему кровообращения мыши, пока печень и легкие не полностью бланшируют в связи с отсутствием крови. Убедитесь, что нет валовых количество крови не продолжать выхода из правого предсердия до удаления 20 г алюминия ступицы тупую иглу из левого желудочка.
- Открепить мышь от экструдированного пенополистирола блока и включите мыши вентральной стороной вниз. Использование большого пару рассечение ножницами, отделить голову от остальной части тела на уровне шеи.
- С помощью небольшой пару рассечение ножницами, вырезать головы по срединной линии, начиная с затылочной кости рабочей вперед к морде, чтобы разоблачить череп.
- Уберите кожу на обеих сторонах черепа, используя большой и указательный палец и надежно удерживать череп. Используйте пару Кость Рейнджерс прорваться черепа, начиная с затылочной кости и работать вперед, чтобы полностью раскрыть спинной и боковойПоверхности мозга. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму повреждение мозга.
- После того, как кости черепа были удалены, вскружить голову мыши вентральной стороной вверх и использовать небольшое пару рассечение ножницами, чтобы сократить черепных нервов в основании головного мозга для того, чтобы освободить его от черепа.
4. Выделение глиомы инфильтрирующие МНПК
- Используя чистую одного краями лезвия бритвы, изолировать область мозга, содержащего опухоль, делая сагиттальный разрез по центру мозга пополам два полушария. Поверните той же стороне полушария медиальной вниз и сделать два корональных сокращений на уровне мозжечка и обонятельных луковиц, чтобы изолировать ткань-мишень, содержащий имплантат опухоли (рис 4а). Эквивалентный часть контралатеральной полушария могут быть также выделены и использованы в качестве отрицательного контроля.
- Поместите ткань-мишень в соответственно меченой стекла Даунса гомогенизатора тканей, содержащего 1 мл, из DPBS, толкать поршень полностью вниз и поворот 7 раз изначально нарушить ткани. Лифт плунжер, чтобы позволить жидкости возвращаться к нижней части гомогенизатора тканей. Повторите этот шаг трижды; Однако только крутить на поршень 4 раза в течение следующих двух повторов и 3 раза в течение последнего повторения, чтобы избежать чрезмерного растирания ткани.
- Использование P-1000 микропипетку, последовательно применяются три 1 мл объемы ледяной DPBS (подготовленной в 3.11) вдоль сторон поршня, чтобы ополоснуть в ткани мясорубку.
- Ресуспендируют растирают мозга дело с помощью пипетки вверх и вниз и поместить в маркированную 15 мл центрифужную пробирку на льду. Промыть стороны ткани мясорубку Dounce с 1 мл дополнительных ледяного DPBS и добавить к той же 15 мл центрифужную пробирку. Хранить все пробирки, содержащие растирают мозгового вещества на льду, пока все образцы не были обработаны.
- Повторите шаги 3,13-3,25 и 4,1-4,4 для каждой мыши в исследовании.
- После того как все образцы гаве были обработаны, спина вниз растирают мозгового вещества в центрифужные пробирки объемом 15 мл в 740 мкг (макс RCF) в течение 20 мин при 4 ° С.
- Удалить супернатант с 10 мл серологической пипеткой и пипетки пистолета и ресуспендируют гранулированный мозгового вещества в 1 мл предварительно приготовленного коллагеназы / ДНКазы I-пищеварительных ферментов с использованием P-1000. Поместите 15 мл центрифужные пробирки в стойку пробирку и в месте водяной бане при 37 ° С в течение 15 мин.
- Аккуратно агитировать образцы дважды в течение инкубационного периода, щелкая трубки для облегчения ткани разбивку.
- Добавить 6 мл охлажденного льдом ДЗФР помощью 10 мл пипетки серологические в каждую пробирку для разбавления пищеварительные ферменты. Пипетка вверх и вниз для ресуспендирования и фильтровать общие объемы через стерильные фильтры нейлоновое сито 70 мкм в новые меченых 15 мл центрифужные пробирки на льду.
- Спин мозга клеточной суспензии вниз на 740 мкг (макс RCF) в течение 20 мин при 4 ° С для достиженияодин осадок клеток (4В). После удаления 15 мл пробирки из центрифуги разместить их на лед и задания увеличения на центрифуге до примерно 21 ° С при подготовке к следующему шагу температуры.
- Полностью удалить супернатант из каждой пробирки, содержащей клетки мозга и первоначально ресуспендируют гранул в 1 мл 70% центрифугирования в градиенте плотности носителей, использующих P-1000 микропипетки. Затем добавить 4 дополнительных миллилитров 70% плотность центрифугирования СМИ в каждую пробирку с использованием 10 мл серологические пипетки. Винт крышки на надежно и гомогенизации суспензии клеток осторожно переворачивая, чтобы трубки несколько раз.
- Снимите центрифужные пробирки, содержащие 15 мл клетки мозга ресуспендировали в 70% плотность центрифугирования СМИ от льда, и место в стойке пробирки при комнатной температуре. По одному, тщательно накладывать 2 мл 37% центрифугирования в градиенте плотности носителей раствора на 5 мл 70% центрифугирования в градиенте плотности среды с P-1000 микропипетки с образованием переменногопостное интерфейс между двумя центрифугирования в градиенте плотности медиа слоев (фиг.4С).
- Использовать маркер с острым концом для указания положения интерфейса, так что можно легко определить после центрифугирования, когда различие становится менее заметным.
- Спин вниз центрифужные пробирки объемом 15 мл при 740 х г (макс RCF) в течение 20 мин при комнатной температуре без перерыва, чтобы избежать нарушения интерфейс.
- После центрифугирования собирают РВМС, которые накопились на поверхности раздела между двумя центрифугирования в градиенте плотности медиа слоев (рис 4D) путем введения Р-200 микропипетки в пробирку вдоль его стороны, тщательно обход липидный слой.
- После на уровне группы РВМС, медленно извлечь 200 мкл из поверхности 70% медиа слой центрифугирования в градиенте плотности и поместить в соответственно меченой полипропилена FACS трубы на льду. Повторить один раз при общем объеме 400 мкл на образец.
- Добавить 3 мл буфера потока к каждому FACS пробирку, содержащую 400 мкл РВМС в достаточной степени разбавления центрифугирования в градиенте плотности носитель, то вращаться клетки вниз на 660 мкг (макс RCF) в течение 20 мин при 4 ° С.
5. иммунноокрашивания глиомы инфильтрирующие МНПК
- До анализа никаких экспериментальных образцов РВМС, выполнить один, независимо, на поверхности клетки контрольный эксперимент изотип определить исходные ворота, которые будут связаны с набором фиксированных напряжений PMT в шаблоне анализа данных проточной цитометрии, посвященном оценке глиомы-проникновения РВМС согласно со следующим протоколом:
- Привить одной C57BL / 6J мышь с GL26-чит-gal1i, а другой с GL26-чит-NT в соответствии с процедурой, описанной в разделе 2. После 72 ч роста опухоли, усыпить мышей и изолировать опухоль проникает МНПК в соответствии с процедурами изложил всей разделах 3 и 4.
- Объедините две пробы PBMC (NTй gal1i) в одном объеме (т.е. 100 мкл), затем дополнительно разделить образец равномерно среди трех FACS труб (то есть, 33,3 мкл на пробирку) с маркировкой "CD45 изотипа", "GR-1 / CD11b изотипа" и "NK1. 1 изотипу ". Добавьте следующие антитела (каждый по 1: 100 разбавлении и разбавляют до общего объема 200 мкл в буфере потока) на соответственно обозначенных FACS труб: «CD45 изотипа": Alexa Fluor 700-конъюгированного крысы IgG2b, К (клон: RTK4530 ); "GR-1 / CD11b изотип": Alexa Fluor 700, конъюгированных крысы против мышиного CD45 (клон: 30-F11), ПЭ-конъюгированного крысы IgG2b, κ (клон: eB149 / 10H5) и PerCP / Cy5.5 -conjugated крысы IgG2b, κ (клон: RTK4530); "NK1.1 изотип": Alexa Fluor 700, конъюгированных крысы против мышиного CD45 (клон: 30-F11), ПЭ-конъюгированного крысы против мышиного GR-1 (клон: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-конъюгированные анти-мышиных CD11b (клон: М1 / 70), и АРС-Conjugated мыши IgG2a, κ (клон: eBM2a).
- Разрешить МНПК к immunolabel на льду в темноте в течение 20 мин. Флик трубки раз на полпути через инкубационного периода, чтобы мягко смешать. Промыть 1 мл буфера потока, спин вниз при 660 х г (макс RCF) в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют каждый FACS трубки, содержащей РВМС с 200 мкл буфера потока.
- Использование потока цитометр, оснащенный встроенным соплом 85 мкм, анализировать "CD45 изотипа" трубку первым установить базовые CD45 интервал ворота. Далее, запустите "Гр-1 / CD11b изотипный" трубку, чтобы установить базовый Гр-1 / CD11b квадрант ворота, используя только истинные CD45 + клеток в качестве входных. Наконец, запустите "NK1.1 изотипный" трубу установить базовый NK1.1 интервал ворота, используя только истинное CD45 + / GR-1 низкая / CD11b +/- клетки как вход.
- Используйте следующую процедуру для всех будущего экспериментального апalysis:
- Сделать достаточное количество 1: 100 разбавлении клеточной поверхности антитела в буфере потока для достижения объема 200 мкл на образце (плюс 1 для изотипа GzmB): Alexa Fluor 700, конъюгированных крысы против мышиного CD45 (клон: 30-F11 ), ПЭ-конъюгированного крысы против мышиного GR-1 (клон: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-конъюгированные анти-мышиных CD11b (клон: М1 / 70), APC-сопряженных мыши против мышиного NK1.1 (клон: PK136).
- Осторожно удалите супернатант из центрифугировали МНПК от 4,15 до мениск не только выше нижней части каждой трубы FACS (~ 50 мкл), чтобы избежать потери клеток. Ресуспендируют МНПК в каждом FACS трубы, используя буфер остаточного потока с П-200 микропипеткой и удалить (1 / # образцов) на сумму объема от каждого FACS трубы и объединить в новую пробирку FACS "объединили изотипу".
- Добавить 200 мкл коктейля антител на клеточной поверхности, полученной в 5.2.1 к каждому образцу РВМС. Разрешить МНПК к immunolabel на льду в темноте в течение 20 мин. Флик тон трубок раз на полпути через инкубационного периода, чтобы аккуратно перемешать.
- Промыть 1 мл буфера потока; спин вниз при 660 х г (макс RCF) х 10 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют все трубы FACS, содержащих МНПК в 200 мкл коммерчески доступного формалина на основе фиксатора (см список материалов для деталей) в течение 15 мин на льду в темноте. Флик трубки раз на полпути через инкубационного периода, чтобы мягко смешать.
- Промыть 1 мл коммерчески доступного буфера 1x пермеабилизации / стирки (см список материалов для деталей) и спин вниз в 660 мкг (макс RCF) в течение 10 мин при 4 ° С.
- В то время как РВМС вращаются вниз, подготовить достаточное количество 1: 100 разбавлении Pacific Blue-конъюгированные мыши против мышиного GzmB (Клон: GB11) внутриклеточных антител в 1X пермеабилизации / промывочного буфера для достижения объема 200 мкл на образце.
- В отдельную пробирку, подготовить единый объем 200 мкл 1: 100 разбавлении Pacific Blue-Conjugated мыши IgG1, κ (клон: МОРС-21) контроль изотипа антитела.
- Ресуспендируют каждый из образцов РВМС экспериментальных с 200 мкл 1: 100 разбавления анти-мышиного антитела GzmB и ресуспендируют одного FACS пробирку "объединили изотип" с объемом 200 мкл 1: 100 разбавлении изотипа антител.
- Разрешить все образцы РВМС, чтобы immunolabel на льду в темноте в течение 20 мин. Флик трубки раз на полпути через инкубационного периода, чтобы мягко смешать.
- Промыть 1 мл буфера потока; спин вниз при 660 х г (макс RCF) в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют РВМС с 200 мкл буфера для анализа потока.
- Поток cytometrically проанализировать глиомы инфильтрирующие МНПК, используя интегрированную насадку 85 мкм и ворота и PMT напряжения, установленные ранее в разделе 5.1 22. Будьте уверены, чтобы запустить весь объем каждого образца на проточном цитометре для обеспечения справедливого сравнения общего числа глиомы-infiltРейтинг МНПК в каждом образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следующую стратегию стробирования для типичного эксперимента: FSC-A по сравнению с SSC-A → SSC-H по сравнению с ССК-W → FSC-H по сравнению с ЛПС-W → CD45 против граф → Gr-1 по сравнению с CD11b → NK1.1 против графа. Гейтс размещены на Gr-1 + / CD11b + миелоидной клетки и NK1.1 + NK клетки затем стратифицированных на основе GzmB выражения (5А). Backgating эти клетки, идентифицированные как NK1.1 + NK-клеток и GR-1 + / CD11b + миелоидных клеток в наших экспериментах на FSC-SSC А против-А подтверждает меньший размер лимфоидной НК-клеток и относительно большой размер миелоидных клеток ( 5В). Сырье файлы данных (т.е., FC. Файлы) анализируются с помощью коммерчески доступного программного обеспечения для анализа данных проточной цитометрии, таких как Flowjo.
В общей сложности 18 C57BL / 6J были использованы для демонстрации этого метода. Девять (9) были привиты с GL26-чит-NT и 9 привиты с GL26-чит-gal1i на той же гай, используя эквивалентное количество клеток (3x10 4). Три мышей из каждой группы были подвергнуты эвтаназии на 24, 48 и 72 ч приживления после опухоли. Данные показывают, что приживление GL26-чит-gal1i клеток глиомы в мозг сингенным C57BL / 6J быстро вызывает набор CD45 + МНПК (6А). На основе определенной смесь антител, используемых в демонстрации, причем можно показать, что GR-1 + / CD11b-миелоидных клеток и NK1.1 + NK-клетки специфически ввести Гал-1-дефицитных опухолей микросреду в течение 48 ч приживления опухоли (рис 6В и 6С); Однако общее количество глиомы-проникновения миелоидных клеток, что намного превышает НК-клеток.
Рисунок 1: Получение GL26-КИТ клеток для внутричерепных приживления (А.) Представитель 10X светлого поля и эпифлуоресцентной микрофотографии GL26-чит-NT (слева) и изображений GL26-чит-gal1i (справа) изображений клеток, выращенных в культуре. (Б) Вестерн-блот из GL26-чит-NT (левая полоса) и GL26-чит-gal1i (справа) полосы всего клеточного лизата. Гамма тубулина (γ-ванна.) Показана в виде управления загрузкой. (С) GL26-Cit Осадок клеток из примерно 50% сплошности T75 тканевой культуральной колбы после центрифугирования при 550 мкг (макс RCF) в течение 5 мин при 4 ° С. (D) Светлый поле зрения гемоцитометре содержащей GL26-Соч клетки (белые точки) разбавляют 1: 1 трипановым синим, чтобы оценить количество клеток и жизнеспособность. Клетки должны быть> 90%, чтобы обеспечить жизнеспособность воспроизводимый рост опухоли. Среднее значение количество клеток из квадратов, обозначенных 1 по 5 должны быть приняты для повышения точности оценки клеточной массы. (Е) GL26-Соч клетки ресуспендировали в 3 х 10 4 клеток / мкл в ООН-дополняется DMEM для внутричерепного implantation. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: стереотаксической приживления клеток глиомы в стриатуме C57BL / 6J (A) хирургической макет ванной, показывая необходимые хирургические инструменты и реактивы.. (Б) Закройте вид C57BL / 6J мыши, запряженной в стереотаксической рамки с правильного размещения иглы на +0,5 мм АР, 2,5 мм ML и -3,0 мм DV по отношению к темени. (С) Спинной зрения черепа мыши, показывая положение брегмы и целевой сайт для приживления опухолевых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Мышь Transcardial перфузии (А) Обязательные реагенты для вскрытия, растирание, и ферментативного расщепления мышиного мозга ткани. (Б) Схема инструментов и реактивов, необходимых для мыши transcardial перфузии раствором насыщенной кислородом и Гепаринизированные Tyrodes показал в капюшоне ламинарного потока, посвященного терминал мыши хирургических процедур. (С) Схематическое представление сердца, демонстрируя правильные инструменты и необходимые для размещения transcardial перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Выделение глиомы-ПроникнувМНПК. (А) Стратегия для вскрытия мозга мыши ткани, содержащей ранней стадии имплантатов ортотопическая глиомы. На верхней панели показывает сагиттальный деление пополам ипсилатерального полушария от контралатерального полушария. Нижняя панель показывает два дополнительных корональные сокращений необходимо изолировать целевой ткани, содержащей имплантат опухоли (выделено фиолетовым). (Б) одной клетки тканей мозга осадок (белая стрелка), после ферментативного расщепления, фильтрации через нейлоновую сетку 70 мкм и центрифугирования. (С) Правильно налил центрифугирования СМИ градиент плотности перед центрифугированием. Белая стрелка указывает на чистый интерфейс, сформированный между двумя плотности центрифугирования СМИ слоев. (D) центрифугирования в градиенте плотности носителя градиента после центрифугирования, демонстрирующего липидный слой, который образует в верхней части белой стрелкой 37% слоя центрифугирования в градиенте плотности носителя) и группу РВМС (изложено гое пунктирная линии) черные на границе между двумя слоями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: проточной цитометрии Память стратегии используется для идентификации глиомы-проникновения Gr-1 + / CD11b + миелоидных клеток и NK клеток (А) Шаг 1:. Всего immunolabeled клетки, выделенные из РВМС полосы в центрифугирования в градиенте плотности носителей градиента закрытого на исключить продукты распада клеток (ЛПС-А меньше, чем ~ 50 К). Шаги 2 и 3: Дуплет дискриминация стробирования, чтобы отфильтровать клеточные агрегаты. Шаг 4: CD45 ворота, чтобы определить глиомы инфильтрирующие иммунные клетки. Контроль Изотип показано как серая силуэта. Шаг 5: CD45 + клетки стратифицированных на основе Gr-1 и CD11b. Контроль Изотип как для GR-1 и CD 11b накладывается на участке и заключены в золотой круг. Красный круг показывает Гр-1 + / CD11b + миелоидных клеток. Шаг 5 ': Гр-1 + / CD11b + миелоидной клетки стратифицированных на основе выражения GzmB. Как основывается, эти клетки не этикетка с анти-антител GzmB за контроль изотипа (серый силуэт). Шаг 6: GR-1 низкая клетки, описанные черным прямоугольником в шаге 5 стратифицированных на основе выражения NK1.1. Контроль Изотип показано как серая силуэта. Шаг 6 ': NK1.1 высокого клетки расслаивается на основе выражения GzmB. Эти клетки действительно этикетка с анти-GzmB антител выше контроля изотипа (серый силуэт). (Б) Backgating ГР-1 + / CD11b + миелоидных клеток на FSC-SSC А против А-демонстрации того, что NK клетки имеют меньший размер лимфоидную по сравнению с большего размера GR-1 + / CD11b + миелоидных клеток."_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Сравнение ОКПК проникновение в GL26-чит-NT против GL26-чит-gal1i опухоли микроокружения в течение первых трех дней внутричерепного опухолевого роста (A) Всего CD45 + клетки иммунной.. (Б) CD45 + / GR-1 + / CD11b + миелоидных клеток. (С) CD45 + NK + /NK1.1 клетки. Точки данных из РВМС, выделенных из GL26-Cit-gal1i глиом соединены плавными линиями, в то время как выделенные из GL26-Cit-NT глиом соединены пунктирными линиями. Глиомы-проникновения РВМС от трех мышей были проанализированы от типа опухоли в каждой временной точке. Числа, связанные с каждой точки данных на кривых GL26-чит-gal1i представляют диван-индукцию определенного типа ОКПК над GL26-Ciт-НТ в указанный час имплантации после опухоли (ИНН). Данные представляют собой среднее число иммунных клеток, подсчитанных ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистический анализ проводили с помощью 2-дисперсионного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает надежный и воспроизводимый метод для изоляции и проточной цитометрии анализа МНПК, которые проникли в начале мыши опухоли мозга микросреду. Глиомы клеточные суспензии генерируются в концентрации, указанной экспериментатора, которые привиты стереотаксически в полосатом теле мозга мыши. Затем мышей умерщвляли заданных точках времени, указанного эксперимента и их мозг собирают и обрабатывается, чтобы изолировать глиомы-проникновения РВМС, которые immunolabeled с комбинациями, конъюгированное с флуорохромом первичных антител; immunolabeled клетки затем количественно с помощью проточной цитометрии. Хотя демонстрация представлены здесь сосредотачивается на ранних временных точках, глиомы-проникновения МНПК могут быть оценены в любой момент времени после приживления опухоли вплоть до мыши moribundity. Метод имеет модульную а любое количество различных комбинаций антитело может быть использован для изучения иммунных клеток интересомзажимные Т-клетки, В-клетки, NK-клетки, моноциты и макрофаги. Обратите внимание, что протокол был оптимизирован для использования с женскими C57BL / 6J 8-10-недельного возраста. Мыши за пределами этого возрастного диапазона может изменить процент циркулирующих МНПК, которые могут привести к кровяных клеток в эквивалентных точек время, которые не представитель данных, представленных здесь. Также может потребоваться Характеристика эксперименты, если альтернативные модели опухоли, или при других, чем те, на фоне B6 мышей используют в связи с тем, что штаммы могут отличаться в их профиле РВМС (Jaxpheno6; мышь феном базы данных; лаборатории Джексона). Гендерные и экологические условия также могут быть источниками неравенства среди МКПК частот и процентах.
Этот метод был продемонстрирован с помощью комбинации поверхностных антител четырех клеток, которые позволяют обнаруживать Гр-1 + / CD11b + миелоидных клеток и NK NK1.1 + клетки, клеточные типы причастны к отказу от гаL-1-дефицитных глиомы. Включение внутриклеточных антител GzmB дополнительно позволяет обнаруживать цитотоксическое в клеточной подмножества НК. Представитель результаты предоставляются для иммунной клеточной инфильтрацией в начале GL26-КИТ глиом изогенным C57BL / 6J мышей, которые выражают либо нормальные уровни Гал-1, или которые сократили уровень из-за shRNA-опосредованной генной нокдаун. Демонстрация экспонатов чувствительность и воспроизводимость метода, показав, что глиомы инфильтрирующие МНПК могут быть выделен воспроизводимым и количественно, как только 24 ч после приживления опухоли. Помимо выявления население опухолевых инфильтрирующие GR-1 / высокой CD11b-клеток миелоидного, демонстрация также показывает население Гр-1 INT / CD11b + клетки, чья личность в настоящее время не определено. Дополнительные эксперименты необходимо дальнейшее расшифровать характер этого клеточной популяции. Отметим также, что мы не наблюдаем легко различимый население CD45
Анти-GR-1 антитела распознают как Ly6G и Ly6C белки клеточной поверхности, которые являются специфическими для полиморфноядерных и мононуклеарных клеток миелоидного, соответственно 25. Использование анти-Gr-1 antibodТаким образом, исключает х годов различие между этими двумя клеточных популяций. Предварительные результаты нашей лаборатории в настоящее время начинают пролить свет на более точное описание ранних Гр-1 + / CD11b + клеток, которые проникают Гал-1-дефицитных глиомы микросреду. Эксперименты, включающие анти-Ly6G (клон 1A8) и анти-Ly6C (клон: АЛ-21) антитела вместе с анти-CCR2 антитела в настоящее время показывают, что GR-1 высокий / CD11b + клетки проникают в ранней Гал-1-дефицитных микросреду опухоли согласуются с высокой Ly6C / CCR2 воспалительных моноцитов высоких, хотя дальнейшие эксперименты для подтверждения этого результата (данные не показаны).
Из клетки теряет, что может произойти во время повторного центрифугирования и ресуспендирования этапов выделить глиомы-проникновения МНПК, вполне вероятно, что число клеток наблюдалось в действительности меньше, что на самом деле присутствует в интактном мозге. Тем не менее, различия между еXperimental группы должны иметь место, если эквивалентные объемы интерфейса центрифугирования СМИ 37/70 плотности извлекаются и если весь объем каждого образца анализировали с помощью проточной цитометрии. Несоблюдение этих шагов может привести к недобросовестной сравнений между образцами и исключает непредвзятого анализа. Неспособность количественно точное количество МНПК, входящих в микроокружение опухоли головного мозга не является ограничением, специфичных для данного протокола. Альтернативные методы, такие как иммуногистологических стратегий подсчета клеток также подвержены ошибкам из-за экстраполяции общего числа клеток на основе стереологических графов и требования эквивалентного порога изображения на срез ткани микрофотографии, которые могут отличаться по уровню фонового окрашивания, потенциально ведущих к ложным -отрицательное или ложно-позитивные сигналы. Тем не менее, сравнение анализа временного хода между различными аналитическими методами, должны раскрыть зависящих от времени кривые иммунной притока с аналогичным общую форму.Дополнительный недостаток иммуногистохимических способов является неспособность некоторых антител проверенных на проточной цитометрии для связывания с эквивалентным антигенный эпитоп в контексте фиксированных формалином секций ткани головного мозга.
Есть несколько ключевых шагов в этом протоколе, что может служить в качестве ограничений для тех, кто незнаком с его методологии. Одним из таких шагов является сбор мозга от черепа без повреждения. Мы предлагаем практиковать технику несколько раз перед запуском собственных экспериментов. Тем не менее, так как мозг в конечном итоге будет растирают, незначительные повреждения поверхностных слоев мозга, вероятно, несущественно для точной количественной оценки глиомы-проникновения РВМС. Второй шаг, который неопытные следователи первоначально может найти сложно заливки градиента плотности центрифугирования СМИ. Возможность экспериментаторов ", чтобы сформировать чистый интерфейс, а покрывающий 2 мл 37% плотность центрифугирования СМИ сверху70% слой имеет решающее значение для воспроизводимой изоляции МНПК. Хотя этот шаг может первоначально оказаться сложной задачей, то значительно обогащает по РВМС и резко уменьшается период времени в противном случае требуется для анализа проб, если вся ткань мозга, где должны быть проанализированы поток cytometrically. РВМС обогащение также уменьшает общее число событий, захваченных цитометра, тем самым уменьшая размеры файлов и .fcs помогает решить редкие мозга инфильтрирующие населения иммунные клетки. Для получения наилучших результатов в создании понятный интерфейс плотность центрифугирования мы рекомендуем заливки 37% плотность центрифугирования с использованием средств массовой информации P-1000 микропипетку с гладкой действий плунжера. Угол 15 мл центрифужную пробирку примерно 20-30 ° выше поверхности стола. Отдых кончик микропипетки на стороне маркировки трубки 3-5 мл выше поверхности 70% медиа слой центрифугирования в градиенте плотности. Налейте стабильно и медленно, так, чтобы минимизировать открытой наружу импульс 37% плотность центрифугирования СМИ, так как extruдез от кончика микропипетки для того, чтобы не мешать, лежащий в основе 70% центрифугирования в градиенте плотности носителей. Наконец, тот факт, что архитектура ткани мозга обязательно уничтожены в процессе выделения глиомы-проникновения РВМС означает, что дополнительные мышей потребуется получить временную точку подобранные гистологические данные.
Более новые модели глиомы, созданные посредством инъекции плазмидной ДНК онкогенных в нормальном мозге грызунов были разработаны в последние годы 26-32. Эти «эндогенные» модели опухоли обойти потенциальные помехи, вызванные стереотаксически прививку Экс Vivo раковые клетки и более тесно имитировать гистологические признаки клинической глиомы. Метод, описанный в настоящем документе, хорошо подходит для изучения иммунной инфильтрации событий, которые характеризуют эти более клинически значимых модельных систем. Исследования иммунного притока в неонатальном мышей также могут быть выполнены с помощью этого метода, хотя плотность новорожденных МОВэлектронной мозга меньше, чем у взрослых, что может потребовать оптимизацию ферментативной стадии варки, чтобы предотвратить течение переваривания ткани мозга. Дополнительные приложения этого метода относятся исследования по альтернативным классов воспалительного заболевания головного мозга в сторону от злокачественных опухолей, таких как экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ) и иммунных реакций на вирусную инфекцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здоровья / Национальный институт неврологических расстройств & Stroke (NIH / NINDS) предоставляет R01-R01, NS074387-NS057711 и R21-NS091555 к MGC; NIH / NINDS предоставляет R01-R01, NS061107-NS076991, R01-R21 и NS082311-NS084275 к ПРЛ; гранты от Лии Счастливые сердца, Мичиганский университет всеобъемлющем онкологического центра присуждена MGC и ПРЛ; Департамент нейрохирургии университета Мичигана в Школе медицины; Мичиган Институт клинической и исследования в области здравоохранения, при поддержке гранта NIH 2UL1-TR000433; Мичиганский университет биологии рака Обучение Грант поддерживается NIH / NCI (Национальный институт рака) гранта T32-CA009676; Мичиганского университета Обучение в клинических и фундаментальных Neuroscience поддерживается NIH / NINDS предоставить T32-NS007222; и Мичиганского университета Медицинской Программы подготовки Scientist поддерживается NIH / NIGMS (Национальный институт наук Общая медицина) предоставлять T32-GM007863. АвторыRe благодарны за академического руководства и поддержки, полученной от доктора Карин Muraszko и отделение нейрохирургии; М. Дальгрен, Д. TOMFORD, С. наполитан для превосходным административной поддержки; М. Dzaman за выдающиеся технической помощи; и Фил Дженкинс Ф. для щедрой поддержке к покупке Zeiss 3D Сканирующий электронный микроскоп. Мы также признаем, лаборатории Kuchroo в Гарвардской медицинской школе, из которой составлялся модифицированная версия медиа-опосредованной стратегии плотность центрифугирования для выделения мозга мононуклеарных клеток.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
- Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E.
- Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
