Summary
Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.
Abstract
Nuestro laboratorio ha demostrado recientemente que las células asesinas naturales (NK) son capaces de erradicar ortotópicamente implantado GL26 de ratón y de rata CNS-1 gliomas malignos pronto después del injerto intracraneal si las células cancerosas se vuelven deficientes en su expresión de la galectina lectina β-galactósido vinculante -1 (gal-1). Un trabajo más reciente ahora demuestra que una población de células mieloides Gr-1 + / CD11b + es fundamental en este sentido. Para comprender mejor los mecanismos por los cuales NK y células mieloides cooperan para conferir el rechazo del tumor gal-1-deficiente hemos desarrollado un protocolo completo para el aislamiento y análisis de las células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes (PBMC). El método se demuestra aquí comparando PBMC infiltración en el microambiente tumoral de gal-1 que expresan GL26 gliomas con los prestados gal-1-deficientes través shRNA desmontables. El protocolo comienza con una descripción de cómo la cultura y preparar GL26 ceLLS para la inoculación en el singénico C57BL / 6J cerebro de ratón. A continuación, se explican los pasos que intervienen en el aislamiento y el flujo de análisis de citometría de glioma de PBMCs infiltrarse desde el microambiente tumoral temprano del cerebro. El método es adaptable a una serie de diseños experimentales in vivo en el que se requieren los datos temporales sobre la infiltración inmune en el cerebro. El método es sensible y altamente reproducible, como PBMCs de glioma infiltrantes pueden ser aislados de tumores intracraneales tan pronto como 24 hr injerto post-tumor con recuentos de células similares observados desde el punto emparejado tumores tiempo a lo largo experimentos independientes. Un único experimentador puede realizar el método de la cosecha cerebro para análisis citométrico de flujo de PBMCs de glioma infiltrantes en aproximadamente 4-6 horas, dependiendo del número de muestras a analizar. Modelos alternativos de glioma y / o anticuerpos de detección de células específicas también pueden utilizarse a discreción de los experimentadores 'para evaluar la infiltración de varios otros immuntipos e celulares de interés sin la necesidad de modificaciones en el procedimiento general.
Introduction
Los gliomas son una clase de cánceres de cerebro neuroepiteliales derivadas de la glía transformado dentro del sistema nervioso central (SNC). De todos los gliomas, Organización Mundial de la Salud (OMS) glioma de grado IV, o glioblastoma (GBM), es el más común y letal 1. GBM es altamente refractaria a la atención estándar de corriente que consta de la resección del tumor a la medida de lo posible seguida de radiación y quimioterapia concomitante y adyuvante con temozolomida 2. Estos cánceres mortales tienen un pronóstico sombrío de sólo 15 a 18 meses de supervivencia desde el momento del diagnóstico inicial con sólo el 5% de los pacientes que sobreviven la enfermedad después de 5 años 3.
La presencia de la barrera hematoencefálica (BBB), la falta de células presentadoras de antígenos profesionales (APC), y la existencia previamente no identificado de estructuras linfáticas de buena fe dentro del cerebro 4 han dado lugar a la noción de GBM como inmune privilegiados. Sin embargo, numerosos estudios ahora show que estos cánceres de cerebro de hecho generan el reclutamiento de células inmunes periféricos que son predominantemente de origen mieloide, que incluyen monocitos, macrófagos y células supresoras mieloides derivadas de MDSCs (5). GBM también influye en la actividad de la microglia del cerebro residente para convertirse en pro-tumorigénico 6,7. Las células linfoides tales como células T CD8 + 8 y CD56 células + asesinas naturales 9 también están presentes en el microambiente del tumor, pero en mucho menor número, un hecho piensa que es debido a la función inmunosupresora instigado por factores de glioma derivado de macrófagos asociados al tumor ( TAM) 10. Las células T CD4 + también están presentes en GBM, pero gran parte de esta población también expresa CD25 y FoxP3, los responsables de inmunosupresora T reguladoras (Treg) células 11. El estado inmunosupresor general de GBM culmina en la promoción de evasión inmunológica y la progresión tumoral 12.
13-19. La culminación de este trabajo ha dado lugar a un ensayo clínico diseñado para evaluar un citotóxico combinado y terapéutico inmune-estimulantes para los pacientes con diagnóstico reciente (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT01811992) GBM.
Nuestro trabajo más reciente muestra que GL26 de ratón y de rata CNS-1 células GBM bloquean antitumoral de las células NK vigilancia inmunológica mediante la producción de grandes cantidades de la lectina de unión a β-galactosidasa-galectina-1 (Gal-1) 20. Esto se demostró mediante la supresión de la expresión de gal-1 en células de glioma usando mediada por shRNA desmontables gen. In vitro experiments mostraron que las células de glioma-gal 1-deficiente proliferaron normalmente en cultivo, sin embargo, fueron sometidos a rechazo rápido pronto después del injerto singénico intracraneal en ratones C57BL / 6J o RAG1 - / - ratones, estableciendo así la independencia de T o células B en esta forma de el rechazo del tumor. Immunodepletion células NK con anti-asialo GM 1 anti-suero o anticuerpos monoclonales NK1.1 llevó a la restauración completa de glioma intracraneal crecimiento gal-1-deficientes, se crea la función de las células NK en gal-1-deficiente rechazo glioma. Ahora demuestran que immunodepletion de las células mieloides GR-1 + / CD11b + es suficiente para prevenir el rechazo de glioma gal-1-deficiente a pesar de la presencia de células NK, revelando así un papel auxiliar indispensable para las células mieloides en la ayuda a la gal mediada por NK lisis tumoral -1-deficiente (datos no publicados). Este resultado inesperado nos ha llevado a desarrollar un protocolo integral para el aislamiento y el análisis de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) queinfiltrarse en el microambiente del tumor cerebral poco después el injerto intracraneal para que podamos caracterizar mejor los eventos de infiltración inmunes que predican el rechazo glioma gal-1-deficientes.
El método se demuestra aquí utilizando células de glioma GL26 de ratón que la proteína fluorescente mCitrine expresan constitutivamente, llamado GL26-Cit, que permite la visualización directa de las células tumorales mediante microscopía de fluorescencia 21. Estas células se estereotácticamente injertaron en el cerebro de singénicos ratones C57BL / 6J y se dejaron crecer durante 24, 48, o 72 hr antes de la eutanasia del ratón. PBMCs glioma infiltrantes son entonces aislados y immunolabeled utilizando anti -CD45, -GR-1, -CD11b y -NK1.1 anticuerpos de la superficie celular, junto con immunolabeling intracelular de granzima B (GzmB). Esta combinación específica de anticuerpos permite la identificación de Gr-1 + / + células CD11b infiltrantes de tumores mieloides y NK1.1 +, células NK, los tipos de células que tenemos been implicado en el rechazo del tumor gal-1-deficientes. El perfil inmunológico de la infiltración gal-1-deficiente GL26-Cit glioma, se hace referencia aquí como GL26-Cit-gal1i, se compara entonces con la de gliomas que expresan niveles normales de gal-1 llamado GL26-Cit-NT que contienen un no- focalización de control shRNA horquilla. El protocolo comienza con una descripción de cómo la cultura células GL26-Cit glioma in vitro, que es seguido por una explicación sobre cómo injertar ortotópicamente estas células en el cuerpo estriado de singeneicos C57BL / 6J. A continuación, procede a enumerar los pasos implicados en el aislamiento y la inmunomarcación de PBMCs de glioma infiltrantes para el análisis de citometría de flujo. El protocolo concluye con una explicación de análisis de datos estándar y representación gráfica.
La manifestación revela que tanto Gr-1 + / CD11b + células mieloides y células NK1.1 + NK preferentemente acumularse dentro del microambiente del tumor cerebral gal-1-deficientes dentro de 48h de la implantación del tumor, un resultado que ayuda a explicar por qué estos tumores se someten rápidamente lisis tumoral completa aproximadamente 1 semana injerto post-tumoral 20. El método es fácilmente adaptable a una serie de diferentes diseños experimentales in vivo en el que se requieren los datos temporales sobre la infiltración inmune en el cerebro. Un único experimentador puede realizar el protocolo de recolección cerebro para análisis citométrico de flujo de PBMCs de glioma infiltrantes en aproximadamente 4-6 horas, dependiendo del número de muestras a analizar. El método también se puede combinar con experimentos destinados para caracterizar el perfil de la circulación de PBMCs en ratones portadores de tumor para la comparación con los que se infiltran en el cerebro para identificar fenotipos de inmunosupresión específicamente inducidos por el microambiente tumoral. La aplicación de este y otros métodos debería facilitar una mejor comprensión de los factores que intervienen en el tráfico de células inmunes periféricas en el microambiente del tumor cerebral.
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Protocol
Nota: Por favor, revise todo el protocolo antes de realizar experimentos. La aprobación para el uso de los animales vertebrados del comité institucional adecuado en el uso y el bienestar de los animales debe ser obtenido antes de continuar.
1. Preparación de las células tumorales para intracraneal injerto
- Trabajando en una cabina de seguridad biológica clase II, empezar por la preparación GL26-Cit-NT / gal1i medios de cultivo celular, completándolo una botella de 500 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal inactivado por calor filtrada de forma estéril 10% (FBS ), 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 600 g / ml de sulfato de G418 (para la selección del vector de expresión mCitrine) y 3 g / ml de dihidrocloruro de puromicina (para la selección de la no- orientación o shRNAs-1-específicas gal).
- Cultura células GL26-Cit-gal1i GL26-Cit-NT y / o (Figura 1A y 1B 2 durante 1-2 días antes del procedimiento injerto del tumor o hasta que los frascos alcanzan el 50-80% de confluencia.
- En el día de la cirugía, retire el medio de cultivo celular de las células de glioma usando una pipeta serológica de 10 ml y una pistola de pipeta y descartar los medios de comunicación en un vaso de precipitados de residuos.
- Invierta el frasco de tapa boca abajo y añadir 10 ml de DPBS a la parte superior del frasco utilizando una 10 ml pipeta serológica. Lentamente invertir el frasco para cubrir las células en DPBS, luego inclinar el frasco verticalmente y retirar y eliminar los DPBS en un vaso de residuos.
- Añadir 3-4 ml de tripsina alternativa no mamífero en DPBS con EDTA (véase la lista de materiales para más detalles) a cada frasco de cultivo de tejidos T75 y colocarlo de nuevo en el armario de cultivo de tejidos de 2-5 min. Utilizando un microscopio de campo claro, compruebe que todas las células se hayan desprendido de la superficie del fondo antes de proceder.
- Inhibir further actividad enzimática mediante la dilución de la alternativa de tripsina con 6 ml de DPBS. Pipetear arriba y abajo con una pipeta serológica de 10 ml para enjuagar la superficie de fondo del matraz y para disociar mecánicamente cualquier agregados celulares. Aspirar las células y colocar en la etiqueta, respectivamente 15 ml tubos de centrífuga. Girar las células hacia abajo a 550 xg (max RCF) durante 5 min a 4 ° C (Figura 1C).
- Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente las células con 1 ml de un-DMEM suplementado. Asegúrese de pipetear las células arriba y abajo a fondo con una micropipeta P-1 000 para lograr una única suspensión celular.
- Hacer una dilución 1:10 de la suspensión celular resultante generada en 1,6 mediante la colocación de 18 l de un-DMEM suplementado en un microtubo de polipropileno de 0,6 ml cónica seguido por la adición de 2 l de la suspensión de células tumorales. Pipetear hacia arriba y abajo utilizando una micropipeta P-10 para homogeneizar las células a fondo.
- Añadir 10 l y# 160; de la dilución 1:10 tumor de células generada en 1,7 a un separadas 0,6 ml de polipropileno cónico microtubo, a continuación, añadir 10 l de Trypan mancha azul al tubo. Mezclar bien con una micropipeta P-10 y añadir 10 l de la solución de azul célula tumoral resultante / Trypán bajo un cubreobjetos de vidrio colocado en la parte superior de un hemocitómetro teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire (Figura 1D).
- Contar las células con un microscopio de campo brillante usando un objetivo 10X de acuerdo con el protocolo específico asociado con el hemocitómetro dado. Asegúrese de tener en cuenta la dilución de 20 veces de la suspensión de células del tumor original hecha durante la preparación de las células para la estimación precisa de células en el original alícuota de 1 ml. Utilice la siguiente fórmula para calcular el número total de células: células totales / ml = [((Σcells contadas por metro cuadrado) / Nº de plazas contados) x 20 (es decir, el factor de dilución) x 10.000 células / ml].
- Después dara determinar el número total de células para cada línea celular utilizada en el experimento dado, girar hacia abajo a 550 xg (max RCF) durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante (s) y resuspender las células con un volumen apropiado de un-DMEM suplementado con el fin de lograr una concentración diana de 3 x 10 4 células por 1 l para cada línea celular de acuerdo con la siguiente fórmula: (número total de células / 30.000).
- Colocar un volumen equivalente de cada línea celular en 0,6 ml tubos de polipropileno cónicos respectivamente etiquetados y el lugar en el hielo (Figura 1E). Asegúrese de guardar algunas células para continuar propagando cada línea celular si T75s separadas no se sembraron previamente.
2. Procedimiento para la estereotáctica injerto de células de glioma en el cuerpo estriado de ratones C57BL / 6J
- Preparar soluciones de anestesia quirúrgica, analgesia, anestesia y la reversión de trabajo antes de la cirugía como sigue:
- Para ketamina / dexmedetomidina sanestesia urgical: eliminar 1,4 ml de un vial de 0,9% de inyección de NaCl estéril 10 ml y reemplazar con 600 l de una solución madre 100 mg / ml de clorhidrato de ketamina y 800 l de una solución madre de 0,5 mg / ml de clorhidrato de dexmedetomidina para producir una solución de trabajo mixto de hidrocloruro de ketamina (6 mg / ml) e hidrocloruro de dexmedetomidina (0,04 mg / ml).
- Para la analgesia buprenorfina: Eliminar 1 ml de un vial de 10 ml de NaCl 0,9% para inyección estéril y reemplazar con todo el volumen de 1 ml de un solo 0,3 mg / ml de clorhidrato de buprenorfina ampolla para producir un / ml solución de trabajo de 0,03 mg.
- Para atipamezol reversión anestesia quirúrgica: Eliminar 1 ml de un vial de 10 ml de NaCl 0,9% para inyección estéril y sustituir con 1 ml de una solución madre 5 mg / ml de clorhidrato de atipamezol para producir un / ml solución de trabajo de 0,5 mg.
- Trabajar en un lugar aprobado por la supervivencia del ratón surgery, empezar por la creación de instrumentos quirúrgicos tratado al autoclave o esterilizados de cuentas y otros reactivos como se muestra en la (Figura 2A), a continuación, obtener suficiente 8-10 semanas de edad, hembras C57BL / 6J (singénica con GL26 glioma) requerido para el estudio; garantizar su acceso continuo a los alimentos y el agua.
- Anestesiar el primer ratón con una sola inyección intraperitoneal (ip) de la solución de la anestesia de trabajo mediante la entrega de una dosis de 75 mg / kg de ketamina y 0,5 mg / kg dexmedetomidina (aproximadamente 250 l para un ratón de 20 g). A continuación, dar una (sc) de inyección de 5 mg / kg subcutánea de carprofeno (aproximadamente 100 l para un ratón de 20 g). Asegúrese de que el ratón no responde a los pies y cola pellizcos antes de proceder.
- El uso de máquinas de cortar quirúrgicas, afeitarse la piel del cráneo. Aplicar solución antiséptica de povidona yodada al área afeitada, frote con una toallita de alcohol isopropílico al 70%, a continuación, volver a aplicar solución antiséptica de povidona yodada. A continuación, aplicar una pequeña cantidad de Sterile vaselina pomada oftálmica para cada ojo para evitar que se seque.
- Asegurar el cráneo en el marco estereotáxico de acuerdo con el siguiente protocolo:
- Abra cuidadosamente la boca al llegar con un par de pinzas de disección curvas para tirar suavemente la lengua y pasar a un lado de la boca para evitar que se ahogue. Permita que los fórceps para retraen mientras que en la boca para difundir la mandíbula abierta y guiar a los dos primeros incisivos en la cerradura de la barra de dientes en el marco estereotáxico. Asegure la barra dentada pivote horizontal o verticalmente mediante el ajuste de los respectivos tornillos. Asegúrese de que el cráneo del ratón es la altura de la mesa de trabajo.
- Coloque las barras de oído firmemente contra los huesos postorbitales del cráneo con cuidado de no aplicar demasiada presión interna en el cráneo con el fin de evitar que se aplaste.
- Coloque la barra de la nariz sobre el hocico y atornille hasta que quede ajustado. Compruebe que no hay movimiento vertical / lateral en la cabeza mediante la aplicación de presión suavecon un pulgar y el dedo índice. Un ratón correctamente colocado en un marco estereotáxico se muestra en la (Figura 2B).
- Usando una hoja de bisturí, hacer una incisión en la línea media de 1 cm por encima del cráneo del hueso frontal hasta el hueso occipital. Retraer la piel en la incisión utilizando retractores Colibri.
- Bajar la jeringa microlitro equipada con una aguja 33 G unido al brazo vertical del marco estereotáxico directamente por encima de la posición del bregma (Figura 2C). A partir de ahí, ajustar la posición de la aguja de 0,5 mm AP, 2,5 mm ML para llegar al lugar de destino para la implantación del tumor. Use una jeringa de tuberculina de 1 ml equipada con una aguja de 26 G para marcar esta ubicación por excoriantes suavemente el periostio.
- Perforar un agujero en el cráneo en el lugar de destino hasta llegar a la duramadre subyacente utilizando un taladro eléctrico de precisión inalámbrico equipado con un "(0.8 mm) 1/32 bit. Durante la perforación, aplicar presión intermitente seguido de la eliminación de la DRIll poco de la superficie del cráneo para evitar el calor excesivo y la fuerza que de lo contrario puede dar lugar a la broca perforando el tejido cerebral subyacente.
- Enjuague la jeringa microlitro con 0,9% de NaCl en un 1,7 ml microtubo de polipropileno cónico para asegurar que la aguja no está obstruido. Flick suavemente el microtubo de polipropileno de 0,6 ml cónica que contiene las células tumorales varias veces para resuspender las células.
- Elaborar 2 l de células en la jeringa microlitro asegurar que no hay burbujas de aire se introducen en la jeringa. Dispensar 1 l de las células sobre una almohadilla con alcohol isopropílico al 70%, dejando exactamente 1 l de células tumorales restantes en la jeringa.
- Lleve la aguja hacia abajo hasta que toque la duramadre, a continuación, introducir la aguja en el cerebro -3.5 mm ventral y retraer por 0,5 mm. Lenta y suavemente entregar las células al presionar el émbolo de la jeringa en el transcurso de 1-2 minutos.
- Permitir que las células se Settle en el sitio de la inyección durante 5 minutos antes de retirar la aguja lentamente. Limpie la sangre coagulada o materia cerebral desde la punta de la aguja con un 70% almohadilla con alcohol isopropílico limpio. Enjuague la aguja y jeringa a fondo con el NaCl 0,9% desde el paso 2.6 para asegurar que la aguja no esté obstruido para la siguiente inyección.
- Retire los retractores Colibri y suturar el cuero cabelludo con tres 3-0 suturas de monofilamento de nylon. Retire el ratón desde el marco estereotáctico y administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina clorhidrato por vía subcutánea (sc) (aproximadamente 67 l de la / ml solución de trabajo de 0,03 mg para un ratón de 20 g), seguido de 2,5 mg / kg atipamezol clorhidrato por vía intramuscular (im) (aproximadamente 100 l de la / ml de solución de trabajo 0,5 mg para un ratón de 20 g) para el alivio del dolor post-operatorio y reversión anestesia. Coloca los ratones post-quirúrgicos de nuevo en sus jaulas bajo una lámpara de calor para recuperarse.
3. Ratón transcardial Perfusiones y la recolección de la Cerebro
- Preparar la solución de Tyrode heparinizada de acuerdo con el siguiente protocolo:
- Ponga una barra de agitación magnética en una botella de almacenamiento con tapón de rosca de 1 l de vidrio y llenar el volumen con agua desionizada ultrapura. Coloque la botella en una placa de agitación.
- Pesar y añadir las siguientes sustancias químicas de la botella de vidrio con agitación: 8 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,264 g de cloruro de calcio (CaCl 2 • 2H 2 O), 0,05 g de fosfato monobásico de sodio (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), 1,0 g de D-glucosa (C 6 H 12 O 6), bicarbonato de 1,0 g de sodio (NaHCO3), 0,2 g de cloruro de potasio (KCl). Permitir a las sales para disolver, a continuación, añadir 100 l de una solución madre 1,000U / ml de heparina sódica a la solución de la Tyrode.
- Retire el recipiente de la placa de agitación y extraer la barra de agitación utilizando una varita magnética. Guarde la solución heparinizada de Tyrode a las 4DO.
- Preparar una solución de trabajo para la anestesia terminales como sigue:
- Para la anestesia terminal de ketamina / xilazina: eliminar 1.360 l de un vial de 0,9% de inyección de NaCl estéril 10 ml y reemplazar con 1.200 l de una solución madre 100 mg / ml de clorhidrato de ketamina y 160 l de una solución madre 100 mg / ml de xilazina hidrocloruro para dar una solución de trabajo mixto de hidrocloruro de ketamina (12 mg / ml) y clorhidrato de xilazina (1,6 mg / ml).
- Prepare la solución de mezcla de medios de centrifugación de densidad mediante la colocación de 90 ml de 10x PBS en 264 ml de agua ultrapura desionizada (3.93x) en un recipiente de plástico estéril. Valorar a pH 7,0 a 7,2 con HCl y filtrar esterilizar a través de un filtro de 0,22 micras. Almacenar a 4 ° C.
- Preparar 70% de medios centrifugación de densidad mediante la combinación de 18 ml de solución de mezcla de medios centrifugación de densidad con 30 ml de medio de centrifugación por densidad (véase la lista de materialespara más detalles) en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Almacenar a 4 ° C, pero llevar a RT antes de su uso.
- Preparar 37% de medios centrifugación de densidad mediante la combinación de 9,6 ml de DPBS con 10,4 ml 70% de medios centrifugación de densidad en un tubo de centrífuga de 50 ml. Almacenar a 4 ° C, pero llevar a RT antes de su uso.
- Preparar tampón de flujo mediante la colocación de 500 l de FBS en 50 ml de DPBS (~ 1% de FBS) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Guarde en la tienda a 4 ° C
- Llene un 4.5 L cubo de hielo de poliuretano a capacidad con cubitos de hielo.
- Hacer una solución combinada de 1 mg / ml de colagenasa y 1 mg / ml de ADNasa-I en cantidad suficiente para 1 ml por muestra en el estudio del cerebro mediante la dilución de una solución de 10 mg / ml de ADNasa-I de la 1:10 y un 50 mg / solución ml de colagenasa de stock 1:50 con DPBS estériles en un solo tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml. Mezclar suavemente la solución con la pipeta de arriba abajo con una micropipeta P-1000. Almacenar en el hielo en el polyurethane balde desde el paso 3.7.
- Obtener dos molinillos de tejido Dounce 7 ml de vidrio. Marque un solo "NT" y el otro "gal1i". Coloca los molinos de tejido en el cubo de hielo y añadir 1 ml de DPBS a cada uno.
- Obtener suficientes tubos de 15 ml de centrífuga para recoger materia cerebral de cada ratón en el estudio y el lugar en el cubo de hielo.
- Coloque ~ 150 ml de DPBS entre tres 50 ml tubos de centrífuga en el cubo de hielo.
- Obtener suficiente hexagonales platos de poliestireno con un peso superior (diámetro interior (ID) 115 mm, ID base de 85 mm, 203 ml de volumen) para cada ratón en el estudio. El conjunto completo para la disección y la trituración de los cerebros de ratón se muestra en la (Figura 3A)
- En los puntos de tiempo seleccionados, anestesiar el primer ratón portador de un tumor en el estudio utilizando una sola inyección ip de 150 mg / kg de clorhidrato de ketamina y kg de hidrocloruro de 20 mg / xilazina (aproximadamente 250 l de la 12 mg / ml de ketamina combinada / 1,6 mg / ml xilazina solución de trabajo para un ratón de 20 g) para inducir la anestesia profunda. Asegúrese de que el ratón es la falta de respuesta a los pies y cola pellizcos antes de continuar.
- Recuperar la solución de Tyrode preparado previamente y colocar en una campana de flujo laminar dedicada a procedimientos quirúrgicos animales terminal. Coloque gas tubo polimérico impermeable unido a un tanque de carbógeno en la solución de la Tyrode. Abra la válvula del tanque para permitir que el 95% de O 2/5% de CO 2 carbógeno de forma continua de burbujas en la solución.
- Adjuntar una aguja roma 20 G buje de aluminio hasta el final del tubo polimérico impermeable al gas adicional conectado a una bomba peristáltica. Colocar el tubo en el otro extremo de la bomba peristáltica en la solución de la Tyrode y encienda la bomba para permitir que el tubo para llenar con solución heparinizada oxigenada y de Tyrode. La puesta en marcha para la perfusión transcardial ratón se muestra en la (Figura 3B).
- Utilizando cuatro agujas 26 G, precisarel lado ventral del ratón anestesiado por las patas traseras frente y en un bloque de espuma de poliestireno extruido cubierta con una toalla absorbente disposición en la campana de flujo laminar.
- Agarre la piel por encima de la cavidad peritoneal usando un par de pinzas de disección roma, y el uso de un gran par de tijeras de disección hacer una incisión "Y" mediante la penetración de la pared peritoneal, cortando cefálica para perforar el diafragma, a continuación, se bifurca en el esternón para terminar en la axila izquierda y derecha.
- Use una pinza hemostática para sujetar el esternón y reflejar la caja torácica sobre el hombro izquierdo del ratón. Retire el pericardio con el par de pinzas de disección roma.
- Encienda la bomba peristáltica para comenzar un goteo constante de solución oxigenada y heparinizada de Tyrode (aproximadamente 2.3-2.5 ml / min).
- Insertar la aguja roma en el ventrículo izquierdo del corazón. Use un pequeño par de tijeras de disección para cortar la aurícula derecha para permitir el desangramiento (Figura3C).
- Permitir que la solución de Tyrode para perfundir a fondo el sistema circulatorio del ratón hasta que el hígado y los pulmones han completamente blanqueadas debido a la falta de sangre. Asegúrese de que no hay importes brutos de sangre continúan para salir de la aurícula derecha antes de retirar la aguja roma 20 G buje de aluminio desde el ventrículo izquierdo.
- Liberar el ratón desde el bloque de espuma de poliestireno extruido y gire la parte ventral del ratón. El uso de un gran par de tijeras de disección, separar la cabeza del resto del cuerpo a nivel del cuello.
- El uso de un pequeño par de tijeras de disección, corte el cuero cabelludo en la línea media que comienza en el hueso occipital de trabajo hacia adelante hacia el hocico con el fin de exponer el cráneo.
- Retraer la piel a ambos lados del cráneo usando un dedo pulgar y el índice y mantenga el cráneo de forma segura. Use un par de Rongeurs hueso para romper el cráneo que comienza en el hueso occipital y trabajar hacia adelante para exponer completamente el dorsal y lateralsuperficies del cerebro. Tenga cuidado para minimizar el daño al cerebro.
- Una vez que se han quitado los huesos craneales, gire la cabeza de la parte ventral del ratón y utilizar un pequeño par de tijeras de disección para cortar los nervios craneales en la base del cerebro con el fin de liberarla del cráneo.
4. Aislamiento de PBMC Glioma infiltrantes
- Utilizando una hoja de afeitar limpia solo filo, aislar la zona del cerebro que contiene el tumor haciendo un corte sagital en el centro del cerebro para bisecar los dos hemisferios. Girar el lado medial hemisferio ipsilateral hacia abajo y hacer dos cortes coronales a nivel del cerebelo y el bulbo olfatorio para aislar el tejido diana que contiene el implante del tumor (Figura 4A). Una porción equivalente del hemisferio contralateral también puede aislarse y utilizarse como un control negativo.
- Coloque el tejido diana en el triturador de tejidos Dounce vidrio respectivamente marcado que contiene 1 ml; de DPBS, empuje el émbolo hacia abajo y toque 7 veces para interrumpir inicialmente el tejido. Descolgar el émbolo para permitir que el líquido se asiente de nuevo a la parte inferior del triturador de tejidos. Repita este paso tres veces; sin embargo, sólo girar el émbolo 4 veces durante los próximos dos repeticiones y 3 veces durante la última repetición para evitar el exceso triturando el tejido.
- Usando una micropipeta P-1000, se aplican secuencialmente tres volúmenes de 1 ml de DPBS enfriado con hielo (preparado en 3,11) a lo largo de los lados del émbolo para enjuagar en el triturador de tejidos.
- Resuspender la materia cerebral tritura pipeteando arriba y abajo y colocar en un tubo de centrífuga de 15 ml etiquetados en hielo. Enjuagar los lados de la trituradora de tejidos Dounce con 1 ml adicionales de DPBS enfriado con hielo y añadir a la misma tubo de centrífuga de 15 ml. Mantenga todos los tubos que contienen materia cerebral se tritura en hielo hasta que se han procesado todas las muestras.
- Repita los pasos 03.13 a 03.25 y de 04.01 a 04.04 para cada ratón en el estudio.
- Una vez que todas las muestras de hahe sido procesado, girar por la materia cerebral se tritura en los 15 ml tubos de centrífuga a 740 xg (máx RCF) durante 20 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante con una pistola de pipeta y pipeta de 10 ml serológica y volver a suspender la materia cerebral se sedimentaron en 1 ml de la colagenasa / preparado previamente DNasa-I enzimas digestivas con un P-1000. Coloque los tubos de centrífuga de 15 ml en un bastidor de tubo de ensayo y colocar en un 37 ° C baño de agua durante 15 minutos.
- Agite suavemente las muestras dos veces durante todo el período de incubación sacudiendo los tubos para facilitar la disgregación del tejido.
- Añadir 6 ml de DPBS enfriado con hielo usando un 10 ml pipeta serológica a cada tubo para diluir las enzimas digestivas. Pipeta arriba y hacia abajo para volver a suspender, y filtrar los volúmenes totales a través de filtros de malla de nylon de 70 micras estériles en nuevos tubos de centrífuga de 15 ml etiquetados en el hielo.
- Girar la suspensión de células del cerebro hacia abajo a 740 xg (max RCF) durante 20 min a 4 ° C para lograr unapellet de células individuales (Figura 4B). Después de retirar los tubos de 15 ml de la centrífuga colocarlos en hielo y aumentar el ajuste de temperatura en la centrífuga a aproximadamente 21 ° C en preparación para el siguiente paso.
- Eliminar completamente el sobrenadante de cada tubo que contiene las células cerebrales e inicialmente resuspender los gránulos en 1 ml de 70% de medios centrifugación de densidad utilizando una micropipeta P-1000. A continuación, añadir 4 mililitros adicionales de 70% de medios de centrifugación de densidad a cada tubo utilizando un 10 ml pipeta serológica. Atornille las tapas de forma segura y homogeneizar la suspensión celular invirtiendo suavemente a los tubos varias veces.
- Retire los tubos de centrífuga de 15 ml que contienen las células del cerebro se resuspendieron en 70% los medios centrifugación de densidad del hielo, y colocar en un bastidor de tubo de ensayo a temperatura ambiente. Uno a la vez, cubrirás cuidadosamente 2 ml de solución de medios centrifugación de densidad 37% a los 5 ml de 70% de medios centrifugación de densidad con una micropipeta P-1000 para formar acinterfaz magra entre las dos capas de medios de comunicación de la centrifugación de densidad (Figura 4C).
- Use un marcador con punta fina para indicar la posición de la interfaz para que pueda ser fácilmente identificado después de la centrifugación, cuando la distinción se hace menos evidente.
- Centrifugar los tubos de 15 ml de centrífuga de 740 xg (máx RCF) durante 20 minutos a temperatura ambiente sin descanso para evitar la interrupción de la interfaz.
- Después de la centrifugación, recoger las PBMCs que se han acumulado en la interfaz entre las dos capas de medios de comunicación centrifugación de densidad (Figura 4D) mediante la introducción de una micropipeta P-200 en el tubo a lo largo de su lado, evitando cuidadosamente la capa lipídica.
- Una vez en el nivel de la banda PBMC, extraer lentamente 200 l de la superficie de la capa de centrifugación de densidad media 70% y colocar en un tubo de FACS polipropileno respectivamente etiquetada en hielo. Repetir una vez para un volumen total de 400 l por muestra.
- Añadir 3 ml de tampón de flujo FACS a cada tubo que contiene 400 l de PBMCs para diluir suficientemente los medios de comunicación centrifugación de densidad, a continuación, girar las células hacia abajo a 660 xg (max RCF) durante 20 min a 4 ° C.
5. Immunolabeling de PBMCs Glioma infiltrantes
- Antes de analizar las muestras experimentales PBMC, realizar una sola, independiente, de la superficie celular experimento de control de isotipo para establecer puertas de línea de base para ser asociado con un conjunto de voltajes PMT fijos dentro de una plantilla de análisis de datos de citometría de flujo dedicado a la evaluación de PBMCs de glioma infiltrantes de acuerdo con el siguiente protocolo:
- Injertar un solo C57BL / 6J de ratón con GL26-Cit-gal1i y otro con GL26-Cit-NT de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección 2. Después de 72 h de crecimiento del tumor, la eutanasia a los dos ratones y aislar los PBMCs infiltrantes de tumor de acuerdo con los procedimientos esbozado en toda las secciones 3 y 4.
- Combinar las dos muestras de PBMC (NT unnd gal1i) en un solo volumen (es decir, 100 l), a continuación, dividir aún más la muestra uniformemente entre tres tubos de FACS (es decir, 33,3 l por tubo) con la etiqueta "isotipo CD45", "Gr-1 / CD11b isotipo", y "NK1. 1 isotipo ". Añadir los siguientes anticuerpos (cada uno a una dilución 1: 100 y se diluyó hasta un volumen total de 200 l en tampón de flujo) a los tubos de FACS respectivamente etiquetados: "isotipo CD45": Alexa Fluor rata 700 conjugado con IgG2b, κ (clon: RTK4530 ); "Gr-1 / CD11b isotipo": Alexa Fluor 700 de rata conjugado anti-CD45 de ratón (clon: 30-F11), rata conjugado con PE IgG2b, κ (clon: eB149 / 10H5), y PerCP / Cy5.5 IgG2b de rata conjugado, κ (clon: RTK4530); "isotipo NK1.1": Alexa Fluor 700 de rata conjugado anti-CD45 de ratón (clon: 30-F11), PE conjugado de rata anti-ratón Gr-1 (clon: RB6-8C5), PerCP / rata Cy5.5-anti-ratón conjugado CD11b (clon: M1 / 70), y APC-conjugated ratón IgG2a, κ (clon: eBM2a).
- Permitir PBMCs a inmunomarcador en hielo en la oscuridad durante 20 min. Flick los tubos una vez a mitad del período de incubación para mezclar suavemente. Lavar con 1 ml de tampón de flujo, girar hacia abajo a 660 xg (max RCF) durante 10 min a 4 ° C y resuspender cada tubo de FACS que contiene PBMCs con 200 l de tampón de flujo.
- El uso de un citómetro de flujo equipado con una boquilla de 85 micras integrado, analizar el tubo "isotipo CD45" primero para establecer una línea de base CD45 puerta de intervalo. A continuación, ejecute el tubo "Gr-1 / CD11b isotipo" para establecer una línea de base Gr-1 / CD11b puerta cuadrante utilizando sólo los verdaderos CD45 + células como entrada. Por último, ejecute el tubo "isotipo NK1.1" establecer un NK1.1 puerta intervalo de línea de base utilizando única verdadera + / Gr-1 células bajas / CD11b +/- como entrada CD45.
- Use el siguiente procedimiento para todos los futuros experimentalANÁLISIS:
- Hacer una cantidad suficiente de una dilución 1: 100 de anticuerpos de la superficie celular en tampón de flujo para conseguir un volumen 200 l por muestra (más 1 para el isotipo GzmB): Alexa Fluor rata 700-conjugado anti-ratón CD45 (clon: 30-F11 ), rata conjugado con PE anti-ratón Gr-1 (clon: RB6-8C5), rata PerCP / Cy5.5-anti-ratón conjugado CD11b (clon: M1 / 70), ratón APC-anti-ratón conjugado NK1.1 (clon: PK136).
- Retirar con cuidado el sobrenadante de los PBMCs hiladas hacia abajo desde 4,15 hasta que el menisco es justo por encima de la parte inferior de cada tubo FACS (~ 50 l) para evitar pérdidas de células. Resuspender las PBMCs en cada tubo de FACS usando el buffer de flujo residual con una micropipeta P-200 y quitar (1 / # de muestras) por valor del volumen de cada tubo de FACS y se combinan en un nuevo tubo FACS etiqueta "isotipo combinado".
- Añadir 200 l de la mezcla de anticuerpos de superficie celular preparado en 5.2.1 a cada muestra PBMC. Permitir PBMCs a inmunomarcador en hielo en la oscuridad durante 20 min. Flick tque los tubos una vez a mitad del período de incubación se mezcle suavemente.
- Lavar con 1 ml de tampón de flujo; centrifugar a 660 xg (máx RCF) x 10 min a 4 ° C.
- Resuspender todos los tubos FACS contienen PBMCs en 200 l de un fijador a base de formol disponible en el mercado (véase la lista de materiales para más detalles) durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. Flick los tubos una vez a mitad del período de incubación para mezclar suavemente.
- Lavar con 1 ml de un tampón 1x permeabilización / lavado disponible en el mercado (véase la lista de materiales para más detalles) y centrifugar a 660 xg (máx RCF) durante 10 min a 4 ° C.
- Mientras PBMCs están girando hacia abajo, preparar una cantidad suficiente de una dilución 1: 100 de ratón Pacific Blue-anti-ratón conjugado GzmB (Clon: GB11) anticuerpos intracelulares en 1x tampón de permeabilización / lavado para lograr un volumen de 200 l por muestra.
- En un tubo separado, preparar un solo volumen de 200 l de una dilución 1: 100 de Pacific Blue-conconjugada ratón IgG1, κ (clon: MOPC-21) anticuerpo de control de isotipo.
- Resuspender cada una de las muestras experimentales de PBMC con 200 l de la dilución 1: 100 de anticuerpos anti-ratón GzmB y resuspender el tubo de FACS sola etiqueta "isotipo combinado" con el volumen 200 l de la dilución 1: 100 de anticuerpos de isotipo.
- Permitir que todas las muestras de PBMC a inmunomarcador en hielo en la oscuridad durante 20 min. Flick los tubos una vez a mitad del período de incubación para mezclar suavemente.
- Lavar con 1 ml de tampón de flujo; girar hacia abajo a 660 xg (max RCF) durante 10 min a 4 ° C y volver a suspender las PBMCs con 200 l de tampón de flujo para el análisis.
- El flujo citometría analizar PBMCs glioma infiltrantes utilizando una boquilla integrada 85 micras y las puertas y los voltajes PMT previamente establecidos en la sección 5.1 22. Asegúrese de ejecutar todo el volumen de cada muestra en el citómetro de flujo para garantizar una comparación equitativa en el número total de glioma-infiltPBMCs de calificación en cada muestra.
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Representative Results
La estrategia gating siguiente se utiliza para un experimento típico: FSC-A vs SSC-A → SSC-H vs SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. recuento → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. recuento. Puertas coloca en Gr-1 células mieloides + / CD11b + y las células NK1.1 + NK son estratificados basados en la expresión GzmB (Figura 5A). Backgating las células identificadas como células NK1.1 + NK y Gr-1 + / CD11b + células mieloides en nuestros experimentos Onto FSC frente a SSC-A-A confirma el tamaño más pequeño linfoide de las células NK y el tamaño relativamente grande de las células mieloides ( Figura 5B). Archivos de datos brutos (es decir., Archivos de FCS) son analizados por citometría de flujo disponible en el mercado de software de análisis de datos como FlowJo.
Un total de 18 ratones C57BL / 6J se utilizaron para demostrar este método. Nueve (9) fueron injertadas con GL26-Cit-NT y 9 fueron injertadas con GL26-Cit-gal1i en el mismo day el uso de un número equivalente de células (3x10 4). Tres ratones de cada grupo fueron sacrificados a las 24, 48, y el injerto 72 hr post-tumor. Los datos muestran que el injerto de células de glioma GL26-Cit-gal1i en el cerebro de singénicos ratones C57BL / 6J rápidamente induce el reclutamiento de CD45 + PBMCs (Figura 6A). Basado en el cóctel de anticuerpos específicos utilizados en la manifestación más lejos se puede demostrar que Gr-1 + / CD11b + células mieloides y las células NK1.1 + NK entrar específicamente el microambiente tumoral gal-1-deficiente dentro de 48 h de injerto tumor (Figura 6B y 6C); sin embargo, el número total de células mieloides de glioma infiltrantes es mucho mayor que la de las células NK.
Figura 1: Preparación de las células GL26-CIT para intracraneal injerto (A.) Representante 10X de campo brillante y micrografías epifluorescencia de GL26-Cit-NT (imágenes izquierda) y las células cultivadas en la cultura GL26-Cit-gal1i (imágenes de la derecha). (B) Western blot de GL26-Cit-NT (carril izquierdo) y GL26-Cit-gal1i (carril derecho) lisado de células enteras. Tubulina gamma (γ-tina.) Se muestra como control de carga. (C) GL26-Cit pellet de células a partir de un T75 confluente matraz de cultivo tisular aproximadamente 50% después de centrifugación a 550 xg (max RCF) durante 5 min a 4 ° C. (D) vista de campo brillante de un hemocitómetro que contiene células GL26-Cit (puntos blancos) diluido 1: 1 con azul tripán para evaluar el número de células y la viabilidad. Las células deben ser> 90% viable para garantizar el crecimiento del tumor reproducible. La media de los recuentos de células de las plazas marcadas 1 a 5 se debe tomar para aumentar la precisión de la estimación de recuento de células. Células (E) GL26-Cit resuspendidas en 3 x 10 4 células / l en un-DMEM suplementado por IMPLA intracranealntation. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: estereotáctica injerto de células de glioma en el cuerpo estriado de ratones C57BL / 6J (A) distribución de la suite quirúrgica mostrando los instrumentos quirúrgicos y reactivos requeridos.. (B) Cierre de vista de un ratón C57BL / 6J aprovechado en un marco estereotáxica con la colocación de la aguja adecuada a 0,5 mm AP, 2,5 mm ML y -3,0 mm DV relación al bregma. Vista (C) dorsal del cráneo del ratón que muestra la posición del bregma y el sitio de destino para el injerto de células tumorales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Ratón transcardial perfusión (A) los reactivos necesarios para la disección, trituración y digestión enzimática del tejido cerebral de ratón. (B) Disposición de los instrumentos y reactivos requeridos para el ratón transcardial de perfusión con solución heparinizada oxigenada y de Tyrodes muestran en una campana de flujo laminar dedicado a procedimientos quirúrgicos ratón terminal. (C) Representación esquemática del corazón demostrando instrumentos y colocaciones requeridas para la perfusión transcardial adecuados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aislamiento de Glioma-infiltrantePBMCs. (A) Estrategia para la disección de tejido cerebral de ratón que contiene las primeras etapas de los implantes de glioma ortotópico. El panel superior muestra la bisección sagital del hemisferio ipsilateral lejos del hemisferio contralateral. El panel inferior muestra los dos cortes coronales adicionales necesarias para aislar el tejido diana que contiene el implante del tumor (resaltado en púrpura). Pellet (B) tejido cerebral celda individual (flecha blanca) después de la digestión enzimática, filtración a través de una malla de nylon 70 micras y centrifugación. (C) correctamente vertido gradiente de centrifugación de densidad media antes de la centrifugación. La flecha blanca indica la interfaz limpia formado entre las capas de medios de comunicación de la centrifugación de dos densidad. (D) Densidad gradiente de medios de centrifugación después de la centrifugación que demuestra la capa lipídica que se forma en la parte superior de la flecha blanca 37% de capa de medios centrifugación de densidad) y la banda de PBMC (esbozó por The discontinua líneas negras) en la interfaz entre las dos capas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: citometría de flujo Estrategia de apertura de puerta utilizado para identificar Glioma infiltrantes Gr-1 + / CD11b + células mieloides y células NK (A). Paso 1: Total de células inmunomarcadas aisladas a partir de la banda de PBMC de un gradiente de medios centrifugación de densidad son cerradas a excluir los desechos celulares (FSC-A menos de ~ 50 K). Los pasos 2 y 3: Doblete gating discriminación para filtrar los agregados celulares. Paso 4: Puerta de CD45 para identificar las células inmunes de glioma infiltrantes. Control de isotipo se muestra como la silueta gris. Paso 5: células CD45 + estratificados basan en Gr-1 y CD11b. Control de isotipo tanto Gr-1 y CD 11b se superpone en la parcela y rodeado por el círculo de oro. El círculo rojo indica las células mieloides Gr-1 + / CD11b +. Paso 5 ': las células mieloides Gr-1 + / CD11b + estratificados en base a la expresión GzmB. Como predica, estas células no se etiquetan con anticuerpos anti-GzmB por el control de isotipo (silueta gris). Paso 6: Gr-1 células bajas señaladas por el rectángulo negro en el Paso 5 estratificados basan en la expresión NK1.1. Control de isotipo se muestra como la silueta gris. Paso 6 ': las células NK1.1 alta estratificado basado en la expresión GzmB. Estas células de hecho etiquetan con anticuerpos anti-GzmB anteriores control de isotipo (silueta gris). (B) Backgating de Gr-1 células mieloides + / CD11b + a FSC frente a SSC-A-A que demuestra que las células NK tienen un tamaño linfoide menor en comparación con los Gr-1 + células mieloides grandes / CD11b + de tamaño."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Comparación de PBMC Infiltración en el GL26-Cit-NT vs. microambiente tumoral GL26-Cit-gal1i durante los tres primeros días de crecimiento del tumor intracraneal (A) CD45 total + células inmunes.. (B) las células mieloides CD45 + / Gr-1 + / CD11b +. (C) CD45 + /NK1.1 + células NK. Los puntos de datos a partir de PBMCs aisladas de gliomas GL26-Cit-gal1i están conectados por líneas suaves, entre tanto que los aislados de gliomas GL26-Cit-NT están conectados por líneas de trazos. PBMCs Glioma infiltrantes de tres ratones fueron analizados según el tipo de tumor en cada punto de tiempo. Los números asociados a cada punto de datos en las curvas GL26-Cit-gal1i representan el pliegue de la inducción de ese tipo CMSP particular durante GL26-Cit-NT en la implantación del tumor después de la hora especificada (HPI). Los datos representan la media del número de células inmunes contados ± el error estándar de la media (SEM). El análisis estadístico se realizó mediante el análisis de 2 vías de la varianza. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un método robusto y reproducible para el análisis de citometría de flujo y el aislamiento de PBMCs que se han infiltrado en el microambiente tumoral temprano del ratón cerebro. Suspensiones celulares de glioma se generan a una concentración especificada por el experimentador que se estereotácticamente injertado en el cuerpo estriado del cerebro de ratón. Los ratones son entonces sacrificados en puntos de tiempo predeterminados especificados por el diseño experimental y sus cerebros se cosechan y se procesa para aislar PBMCs de glioma infiltrantes que se immunolabeled con combinaciones de anticuerpos primarios conjugados con fluorocromo; células inmunomarcadas se cuantificaron entonces mediante citometría de flujo. Aunque la manifestación que aquí se presenta se centra en puntos de tiempo tempranos, PBMCs de glioma infiltrantes se pueden evaluar en cualquier punto de tiempo de post-tumor injerto hasta moribundity ratón. El método es altamente modular como cualquier número de diferentes combinaciones de anticuerpos puede ser utilizado para examinar las células inmunes de interés including células T, células B, células NK, monocitos y macrófagos. Tenga en cuenta que el protocolo ha sido optimizado para su uso con hembras C57BL / 6J 8-10 semanas de edad. Los ratones fuera de este rango de edad puede haber alterado porcentajes de PBMCs circulantes, lo que puede dar lugar a recuentos de células en momentos equivalentes que no son representativos de los datos presentados aquí. Experimentos de caracterización también puede ser necesaria si se utilizan modelos de tumores alternativas o si los ratones distintos a los que en el fondo B6 se utilizan debido al hecho de que las cepas pueden diferir en sus perfiles de PBMC (Jaxpheno6; Base de datos Phenome Mouse; Laboratorio Jackson). Condiciones de género y ambientales también pueden ser fuentes de disparidad entre las frecuencias y porcentajes PBMC.
Este método ha sido demostrado usando una combinación de anticuerpos de superficie de cuatro células que permiten la detección de Gr-1 + / CD11b + células mieloides y las células NK1.1 + NK, tipos de células implicadas en el rechazo de gal-1-deficiente glioma. La inclusión de anticuerpos intracelulares GzmB permite además la detección de potencial citotóxico en el subconjunto de células NK. Los resultados representativos se proporcionan para la infiltración de células inmunes en los primeros gliomas GL26-CIT en singeneicos C57BL / 6J que, o bien expresan niveles normales de gal-1 o que han reducido los niveles debido a mediada shRNA desmontables gen. La demostración presenta la sensibilidad y la reproducibilidad de la técnica al demostrar que PBMCs de glioma infiltrantes pueden ser aislados y cuantificados tan pronto como 24 hr injerto post-tumor de forma reproducible. Aparte de revelar una población de 1-Gr + células mieloides tumor infiltrante altas / CD11b, la demostración también revela una población de Gr-1 int / + células CD11b cuya identidad es actualmente definido.; experimentos adicionales son necesarios para descifrar aún más el carácter de esta población de células. También observamos que no se observa una población fácilmente distinguibles de CD45
Anti-Gr-1 anticuerpos reconocen tanto las proteínas de superficie celular Ly6G y Ly6c que son específicos de polimorfonucleares y células mieloides mononucleares, respectivamente 25. El uso de anti-Gr-1 antibodpor tanto, se opone a IES distinción entre estas dos poblaciones celulares. Los resultados preliminares de nuestro laboratorio están empezando a arrojar luz sobre una descripción más precisa de las células tempranas Gr-1 + / CD11b + que se infiltran en el glioma microambiente gal-1-deficientes. Los experimentos que incorporan anti-Ly6G (clon: 1A8) y anti-Ly6C (clon: AL-21) anticuerpos junto con anticuerpos anti-CCR2 indican ahora que el GR-1 células altas / CD11b + infiltrarse en la temprana microambiente tumoral gal-1-deficiente son consistentes con Ly6c alta / CCR2 altos monocitos inflamatorios, aunque se requieren más experimentos para confirmar este resultado (datos no mostrados).
Debido a célula pierde que pueden ocurrir durante las etapas de repetición centrifugación y resuspensión en el aislamiento de PBMCs involucrados glioma infiltrantes, es probable que observaron recuentos de células son de hecho más baja que lo que son en realidad presente en el cerebro intacto. Sin embargo, diferencias entre Egrupos Xperimental deben mantener si se extraen volúmenes equivalentes de la interfaz de medios centrifugación 37/70 densidad y si todo el volumen de cada muestra se analiza por el citómetro de flujo. El incumplimiento de estas medidas dará lugar a comparaciones injustas entre las muestras y se impedirá imparcial análisis. La incapacidad de cuantificar el número exacto de PBMCs que entran en el microambiente del tumor cerebral no es una limitación específica de este protocolo. Los métodos alternativos tales como las estrategias de conteo de células inmunohistológicos también están sujetos a error debido a las extrapolaciones de los números de células totales basados en recuentos estereológicos y el requisito del umbral de imagen equivalente en la sección de tejido micrografías, que pueden diferir en su nivel de tinción de fondo, que puede conducir a la falsa señales -negativo o falsos positivos. Sin embargo, una comparación de los análisis de evolución en el tiempo entre los diferentes métodos de análisis debería revelar curvas inmune afluencia dependientes del tiempo con forma general similar. Uninconveniente adicional a los métodos inmunohistoquímicos es la incapacidad de ciertos anticuerpos validados para citometría de flujo para unirse al epítopo antigénico equivalente en el contexto de secciones de tejido de cerebro fijadas en formalina.
Hay unos cuantos pasos clave en este protocolo que puede servir como limitaciones para quienes no están familiarizados con su metodología. Una de esas medidas es la cosecha del cerebro del cráneo sin dañarlo. Se aconseja practicar la técnica varias veces antes de ejecutar experimentos apropiados. Sin embargo, ya que con el tiempo se trituró el cerebro, daños menores en las capas superficiales del cerebro es probable intrascendente para la cuantificación exacta de PBMCs de glioma infiltrantes. Un segundo paso que los investigadores sin experiencia pueden encontrar al principio difícil es el vertido del gradiente de medios de centrifugación de densidad. La capacidad de los experimentadores 'para formar una interfaz limpia, mientras que recubre los 2 ml de 37% de medios de centrifugación de densidad en la parte superior de lala capa 70% es crucial para el aislamiento reproducible de PBMCs. Aunque este paso inicial puede ser un reto, enriquece enormemente de PBMCs y disminuye drásticamente el periodo de tiempo requerido de otro modo para el análisis de muestras, si todo el tejido cerebral, donde se analizó el flujo de citometría. Enriquecimiento PBMC también reduce el número total de eventos capturados por el citómetro de flujo, reduciendo de este modo los tamaños de archivo .fcs y ayudar a resolver las poblaciones de células inmunes infiltrantes cerebrales raras. Para obtener los mejores resultados en el establecimiento de una interfaz de centrifugación de densidad limpio se recomienda verter los medios de comunicación centrifugación de densidad 37% utilizando una micropipeta P-1000 con la acción del émbolo suave. Ángulo del tubo de centrífuga de 15 ml aproximadamente de 20 a 30 ° por encima de la mesa de trabajo. Resto de la punta de la micropipeta en el lado de las marcas ml tubo de 3-5 por encima de la superficie de la capa de medios de centrifugación de densidad 70%. Vierta de manera constante y lentamente, de modo de minimizar el impulso hacia el exterior abierta de los medios de centrifugación de densidad 37%, ya que Extrudes de la punta de la micropipeta con el fin de no molestar a los que subyace un 70% de medios centrifugación de densidad. Por último, el hecho de que la arquitectura del tejido cerebral está necesariamente destruido en el proceso de aislamiento de glioma infiltrantes PBMCs significa que se necesitarán ratones adicionales para obtener puntuales tiempo emparejados datos histológicos.
Modelos de glioma más recientes generados a través de la inyección de ADN plásmido oncogénico en el cerebro normal de roedores se han desarrollado en los últimos años 26-32. Estos modelos de tumores "endógenos" eludir posibles artefactos causados por estereotácticamente injertar ex vivo las células cancerosas e imitar más de cerca las características histológicas de glioma clínica. El método descrito en este documento es muy adecuado para el estudio de los acontecimientos de infiltración inmunes que caracterizan a estos sistemas más clínicamente relevantes modelo. Los estudios sobre la afluencia inmune en ratones recién nacidos también pueden realizarse usando este método aunque la densidad de mous neonatale cerebro es menor que la de los adultos, que pueden requerir una optimización de la etapa de digestión enzimática con el fin de evitar el exceso de la digestión del tejido cerebral. Aplicaciones adicionales de la técnica incluyen investigaciones sobre las clases alternativas de enfermedad cerebral inflamatoria aparte de los tumores malignos tales como encefalomielitis alérgica experimental (EAE) y la respuesta inmune a la infección viral.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NIH / NINDS) otorga R01-NS074387, R01-R21-NS057711 y NS091555 al MGC; NIH / NINDS otorga R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21-NS082311 y NS084275 de PRL; subvenciones de Leah Corazones Felices, Universidad de Michigan Comprehensive Cancer Center adjudicado a MGC y PRL; el Departamento de Neurocirugía de la Universidad de la Escuela de Medicina de Michigan; el Instituto Michigan de Investigación Clínica y de la Salud, con el apoyo de NIH subvención 2UL1-TR000433; la Beca de Formación de Biología de la Universidad de Michigan cáncer apoyado por el NIH / NCI (National Cancer Institute) subvención T32-CA009676; la Universidad de Michigan en Capacitación Clínica y Neurociencia Básica apoyado por el NIH / NINDS conceder T32-NS007222; y la Universidad de Programa de Entrenamiento Científico Michigan Medical apoyado por el NIH / NIGMS (Instituto Nacional de Medicina General de Ciencias) conceder T32-GM007863. Los autores de unre agradecidos por el liderazgo académico y el apoyo recibido del Dr. Karin Muraszko y el Departamento de Neurocirugía; M. Dahlgren, D. TOMFORD, y S. napolitana de apoyo administrativo excelente; M. Dzaman para la asistencia técnica en circulación; y Phil F. Jenkins para el generoso apoyo para la compra de un microscopio electrónico de barrido Zeiss 3D. También reconocemos el laboratorio Kuchroo en la Escuela de Medicina de Harvard de la que se ha elaborado una versión modificada de la estrategia de los medios de comunicación mediada por centrifugación de densidad para el aislamiento de células mononucleares cerebrales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
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