Summary
Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.
Abstract
Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che natural killer (NK), le cellule sono in grado di sradicare ortotopicamente impiantato GL26 topo e nel ratto CNS-1 gliomi maligni subito dopo attecchimento intracranica se le cellule tumorali sono resi carenti nella loro espressione della lectina galectina β-galactoside vincolante -1 (gal-1). Lavori più recenti mostra ora che una popolazione di + / CD11b + cellule mieloidi Gr-1 è fondamentale in tal senso. Per comprendere meglio i meccanismi con cui NK e le cellule mieloidi cooperano per conferire gal-1-deficienti rifiuto tumore abbiamo sviluppato un protocollo completo per l'isolamento e l'analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico-gliomi infiltranti (PBMC). Il metodo è dimostrato qui confrontando PBMC infiltrazione nel microambiente tumorale di gal-1-esprimendo GL26 gliomi con quelli resi gal-1-carente via shRNA atterramento. Il protocollo inizia con una descrizione di come la cultura e la preparazione GL26 cells per inoculazione nella C57BL / 6J cervello singenico del mouse. E poi spiega i passi necessari per l'isolamento e l'analisi dei flussi di citometria-glioma infiltrarsi PBMC dei primi del microambiente tumorale al cervello. Il metodo è adattabile ad una serie di disegni in vivo sperimentali in cui è richiesta dati temporali sul infiltrazione immunitario nel cervello. Il metodo è sensibile e altamente riproducibile, come PBMC-gliomi infiltranti possono essere isolati da tumori intracranici appena 24 ore attecchimento post-tumore con conta di cellule simili osservati dal punto abbinato tumori tempo durante esperimenti indipendenti. Un singolo sperimentatore può eseguire il metodo dalla raccolta cervello per analisi citofluorimetrica delle PBMC-gliomi infiltranti in circa 4-6 ore a seconda del numero di campioni da analizzare. Modelli alternativi di glioma e / o anticorpi di rilevamento specifici per cellulari possono essere utilizzati anche a discrezione degli sperimentatori 'per valutare l'infiltrazione di diversi altri immuntipi di cellule e di interesse, senza la necessità di modifica del procedimento generale.
Introduction
Gliomi sono una classe di tumori cerebrali neuroepiteliali derivanti da glia trasformato nel sistema nervoso centrale (CNS). Di tutti i gliomi, Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) di grado IV glioma, o glioblastoma (GBM), è la più comune e letale 1. GBM è altamente refrattario alla cura standard di corrente, che consiste nella resezione del tumore, per quanto possibile seguito da radioterapia più chemioterapia concomitante e adiuvante con temozolomide 2. Questi tumori mortali portare una prognosi infausta di soli 15-18 mesi di sopravvivenza dal momento della diagnosi iniziale con solo il 5% dei pazienti sopravvissuti alla malattia dopo 5 anni 3.
La presenza della barriera emato-encefalica (BBB), la mancanza di cellule presentanti l'antigene professionali (APC), e l'esistenza precedentemente non identificato di bona fide strutture linfatiche all'interno del cervello 4 hanno portato alla nozione di GBM immuni privilegiato. Tuttavia, numerosi studi ora show che questi tumori cerebrali infatti generano il reclutamento di cellule immunitarie periferiche che sono prevalentemente di origine mieloide che includono monociti, macrofagi e cellule mieloidi soppressore di derivazione (MDSCs) 5. GBM influenza anche l'attività di microglia cerebrale residente a diventare pro-oncogeno 6,7. Cellule linfoidi come le cellule T CD8 + 8 e CD56 delle cellule + natural killer 9 sono presenti anche all'interno del microambiente tumorale, ma in molte meno numeri, un dato di fatto pensa sia dovuto alla funzione immunosoppressiva istigato da fattori di glioma di derivazione sul tumore associato macrofagi ( TAM) 10. Cellule T CD4 + sono presenti anche nel GBM, ma gran parte di questa popolazione esprime anche CD25 e FoxP3, creatori di immunosoppressiva T regolatorie (T reg) celle 11. Lo stato immunosoppressivo complessivo di GBM culmina nella promozione di evasione immunologica e la progressione del tumore 12.
13-19. Il culmine di questo lavoro è ora portato ad uno studio clinico disegnato per valutare un citotossico combinato e terapeutico immuno-stimolante per i pazienti con nuova diagnosi di GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).
Il nostro lavoro più recente indica che CNS-1 le cellule GBM del mouse GL26 e ratto bloccano anti-tumorale di cellule NK sorveglianza immunitaria producendo grandi quantità di β-galattoside-lectina legante galectina-1 (gal-1) 20. Questo è stato dimostrato di sopprimere l'espressione di gal-1 nelle cellule di glioma utilizzando shRNA mediata knockdown gene. In vitro speriments hanno dimostrato che le cellule di glioma gal-1-carente proliferavano normalmente nella cultura, ma hanno subito il rifiuto rapido subito dopo attecchimento intracranica in singenico C57BL / 6J o RAG1 - / - mice, stabilendo così l'indipendenza della T o B- celle su questa forma di rifiuto del tumore. Immunodeplezione cellule NK con l'anti-asialo GM 1 anti-siero o anticorpi monoclonali NK1.1 portato alla completa ristrutturazione di intracranica crescita glioma gal-1-carente, stabilendo il ruolo delle cellule NK in gal-1-carente rifiuto glioma. Mostriamo ora che immunodeplezione di cellule mieloidi Gr-1 + / CD11b + è sufficiente a prevenire gal-1-carente rifiuto glioma nonostante la presenza di cellule NK, rivelando così un ruolo ausiliario indispensabile per le cellule mieloidi in favoreggiamento di gal NK-mediata lisi tumorale -1-deficienti (dati non pubblicati). Questo risultato inatteso ci ha portato a sviluppare un protocollo completo per l'isolamento e l'analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) cheinfiltrarsi nel microambiente tumorale al cervello poco dopo attecchimento intracranica in modo da poter meglio caratterizzare gli eventi infiltrazione immunitario quel predicato gal-1-carente rifiuto glioma.
Il metodo è dimostrata qui utilizzando cellule di glioma del mouse GL26 che la proteina fluorescente mCitrine costitutivamente espressa, chiamata GL26-Cit, che consentono la visualizzazione diretta delle cellule tumorali al microscopio a fluorescenza 21. Queste cellule sono stereotactically innestate nel cervello di singenici C57BL / 6J e sono autorizzati a crescere per 24, 48 o 72 ore prima del mouse eutanasia. PBMC-gliomi infiltranti vengono poi isolate e immunolabeled utilizzando anticorpi anti -CD45, -gr-1, -CD11b e -NK1.1 anticorpi di superficie cellulare unitamente immunomarcatura intracellulare per granzima B (GzmB). Questa combinazione specifica di anticorpi permette l'identificazione di Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi infiltranti il tumore e NK1.1 +, le cellule NK, tipi di cellule che abbiamo been implicato in gal-1-carente rifiuto tumore. Il profilo infiltrazione immunitario del gal-1-carente GL26-Cit glioma, denominato qui come GL26-Cit-gal1i, viene quindi paragonato a quello di gliomi che esprimono livelli normali di gal-1 denominato GL26-Cit-NT che contengono un non- il targeting di controllo shRNA tornante. Il protocollo inizia con una descrizione su come la cultura delle cellule GL26-Cit glioma in vitro, che è seguita da una spiegazione su come innestare ortotopicamente queste cellule nello striato di singenici C57BL / 6J. Si procede quindi a enumerare i passi necessari per l'isolamento e immunomarcatura di PBMC-gliomi infiltranti per l'analisi di citometria di flusso. Il protocollo si conclude con la spiegazione di analisi dei dati e standard di rappresentazione grafica.
La dimostrazione rivela che entrambi Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi e cellule NK1.1 + NK preferenzialmente accumulano all'interno del microambiente tumorale al cervello gal-1-carente entro 48hr di impianto del tumore, un risultato che aiuta a spiegare perché questi tumori rapidamente sottoposti a completa lisi tumorale circa 1 settimana post-tumore attecchimento 20. Il metodo è facilmente adattabile a diversi modelli sperimentali in vivo in cui è richiesta dati temporali sul infiltrazione immunitario nel cervello. Un singolo sperimentatore può eseguire il protocollo dalla raccolta cervello per analisi citofluorimetrica delle PBMC-gliomi infiltranti in circa 4-6 ore a seconda del numero di campioni da analizzare. Il metodo può anche essere combinato con esperimenti volti a caratterizzare il profilo di PBMC circolante nei topi affetti da tumore in confronto con quelli che infiltrano il cervello in modo da identificare fenotipi immunosoppressione specificamente indotti dal microambiente tumorale. L'applicazione di questa e simili metodi dovrebbe facilitare una migliore comprensione dei fattori coinvolti nel traffico di cellule immunitarie periferiche nel microambiente tumorale al cervello.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Si prega di rivedere l'intero protocollo prima di eseguire esperimenti. L'approvazione per l'uso di animali vertebrati dal comitato istituzionale adeguato per l'uso e il benessere degli animali deve essere ottenuto prima di procedere.
1. Preparazione di cellule tumorali per intracranica Attecchimento
- Lavorare in una cappa di sicurezza biologica di classe II, iniziare con la creazione GL26-Cit-NT / gal1i colture cellulari, completandola una bottiglia da 500 ml di Dulbecco modificato (DMEM) con siero sterile filtrata calore inattivato il 10% fetale bovino (FBS ), 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 600 mg / ml G418 solfato (per la selezione del vettore di espressione mCitrine) e 3 mg / ml di puromicina dicloridrato (per la selezione del non- targeting o shRNAs gal-1-specifici).
- Culture cellule GL26-Cit-gal1i GL26-Cit-NT e / o (Figure 1A e 1B 2 per 1-2 giorni prima della procedura tumore attecchimento o finché i flaconi raggiungono 50-80% di confluenza.
- Il giorno della chirurgia, rimuovere il supporto di coltura cellulare dalle cellule di glioma usando una pipetta 10 ml sierologica e una pistola pipetta e scartare il supporto in un becher rifiuti.
- Invertire il pallone con il lato superiore verso il basso e aggiungere 10 ml di DPBS al lato superiore del pallone con una pipetta 10 ml sierologica. Capovolgere lentamente il pallone per coprire le cellule in DPBS, poi punta il pallone in verticale e rimuovere ed eliminare le DPBS in un bicchiere di rifiuti.
- Aggiungere 3-4 ml di non mammiferi tripsina alternativa in DPBS con EDTA (vedi elenco dei materiali per i dettagli) per ogni T75 pallone di coltura di tessuti e inserire di nuovo nel cabinet coltura di tessuti per 2-5 min. Utilizzando un microscopio in campo chiaro, verificare che tutte le cellule non si distacchi dalla superficie di fondo prima di procedere.
- Inibizione further attività enzimatica diluendo l'alternativa tripsina con 6 ml di DPBS. Pipetta su e giù con una pipetta 10 ml sierologica risciacquare la superficie inferiore del pallone e dissociare meccanicamente eventuali aggregati cellulari. Aspirare le cellule e riporre in rispettivamente etichettati 15 ml provette. Spin giù le cellule a 550 xg (RCF max) per 5 minuti a 4 ° C (Figura 1C).
- Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente le cellule con 1 ml di non-integrato DMEM. Assicurati di pipetta le cellule su e giù a fondo con una micropipetta P-1000 per realizzare una sospensione di cellule singole.
- Effettuare una diluizione 1:10 di sospensione cellulare risultante generata in 1.6 ponendo 18 ml di DMEM supplementato un in una provetta di polipropilene da 0,6 ml conica seguita dalla aggiunta di 2 ml di sospensione cellulare tumorale. Pipettare su e giù utilizzando un P-10 micropipetta per omogeneizzare accuratamente le cellule.
- Aggiungere 10 ml &# 160; della diluizione delle cellule tumorali 01:10 generata in 1.7 per una separata 0,6 ml in polipropilene conica provetta, quindi aggiungere 10 ml di Trypan blu macchia al tubo. Mescolare bene con un P-10 micropipetta e aggiungere 10 ml di / Trypan soluzione blu cellula tumorale risultante sotto un vetrino di vetro posto sulla cima di un emocitometro facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria (Figura 1D).
- Contare le cellule con un microscopio a campo chiaro con obiettivo 10X secondo il protocollo specifico associato con l'emocitometro data. Assicurarsi di fattore di diluizione di 20 volte della sospensione originale cellule tumorali fatte durante la preparazione delle cellule per la stima accurata cellule in 1 ml un'aliquota originale. Utilizzare la seguente formula per calcolare il numero totale di cellule: cellule totali / ml = [((Σcells contati per quadrato) / # di quadrati contati) x 20 (vale a dire, fattore di diluizione) x 10.000 cellule / ml].
- Dopo determining il numero totale di celle per ciascuna linea cellulare utilizzata nell'esperimento dato, li centrifugare a 550 xg (RCF max) per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante (s) e risospendere le cellule con un volume adeguato di non-integrata DMEM al fine di raggiungere una concentrazione target di 3 x 10 4 cellule per 1 ml per ciascuna linea cellulare secondo la seguente formula: (totale ° cellule / 30.000).
- Inserire un volume equivalente di ciascuna linea cellulare in 0,6 ml provette coniche polipropilene rispettivamente etichettati e posto sul ghiaccio (Figura 1E). Assicurarsi di salvare alcune cellule di continuare a diffondere ogni linea cellulare se T75s separati non sono stati precedentemente seminate.
2. Procedura per la stereotassica attecchimento delle cellule del glioma nello striato di C57BL / 6J
- Preparare le soluzioni di anestesia chirurgica, l'analgesia e anestesia inversione di lavoro prima di un intervento chirurgico come segue:
- Per ketamina / dexmedetomidina sanestesia urgical: rimuovere 1,4 ml da una fiala di sterile allo 0,9% iniezione NaCl 10 ml e sostituirlo con 600 ml di una / soluzione madre ml 100 mg di ketamina cloridrato e 800 ml di una / soluzione madre ml 0,5 mg di dexmedetomidina cloridrato per produrre un soluzione di lavoro mista di ketamina cloridrato (6 mg / ml) e dexmedetomidina cloridrato (0,04 mg / ml).
- Per buprenorfina analgesia: rimuovere 1 ml da un flaconcino da 10 ml di 0,9% sterile iniettabile NaCl e sostituirlo con l'intero volume 1 ml di una singola 0,3 mg / ml di brodo buprenorfina cloridrato fiala per produrre un / ml soluzione di lavoro 0,03 mg.
- Per atipamezolo inversione anestesia chirurgica: rimuovere 1 ml da un flaconcino da 10 ml di soluzione sterile 0,9% iniezione NaCl e sostituirlo con 1 ml di una / soluzione madre ml 5 mg di cloridrato atipamezolo per produrre un / ml soluzione di lavoro 0,5 mg.
- Lavorare in un luogo autorizzato per la sopravvivenza del mouse surgery, iniziare con la creazione di strumenti chirurgici sterilizzati in autoclave o perline sterilizzato e altri reagenti come indicato in (Figura 2A), quindi ottenere abbastanza 8-10 settimane di età femminile C57BL / 6J (singenico con GL26 glioma) necessari per lo studio; assicurare il loro accesso continuo al cibo e all'acqua.
- Anestetizzare il primo mouse con una singola intraperitoneale (ip) iniezione della soluzione anestesia lavoro fornendo una dose di 75 mg / kg e 0,5 mg di ketamina / kg di dexmedetomidina (circa 250 microlitri per 20 g mouse). Quindi, assegnare un kg per via sottocutanea (sc) iniezione di 5 mg / di carprofen (circa 100 ml per 20 g del mouse). Assicurarsi che il mouse non è sensibile a punta e coda pizzicotti prima di procedere.
- Utilizzando tagliatori chirurgici, accorciare il pelo dal cranio. Applicare soluzione antisettica iodopovidone alla zona rasata, strofinare con un tampone isopropilico preparazione alcool al 70%, poi ri-applicare soluzione antisettica iodopovidone. Quindi, applicare una piccola quantità di sterile vaselina pomata oftalmica per ciascun occhio per evitare l'essiccazione.
- Fissare il cranio nel frame stereotassico secondo il seguente protocollo:
- Aprire con cautela la bocca raggiungendo in con un paio di pinze dissezione curve per tirare delicatamente fuori la lingua e passare a un lato della bocca per evitare il soffocamento. Lasciare le pinze per ritraggono mentre in bocca per diffondere la mascella aperta e guidare i due incisivi nel buco della serratura della barra dente sul telaio stereotassico. Fissare la barra dente da perno orizzontale o in verticale regolando le rispettive viti. Assicurarsi che il cranio del mouse è a livello con la parte superiore del banco.
- Posizionare le barre orecchio saldamente contro le ossa postorbitale del cranio facendo attenzione a non applicare troppa pressione al cranio per evitare schiacciamenti.
- Posizionare la barra naso sul muso e avvitare fino aderente. Verificare che non vi è alcun movimento verticale / laterale nel testa applicando una leggera pressionecon un pollice e il dito indice. Un mouse correttamente inserito in una cornice stereotassica è mostrato nella (Figura 2B).
- Usando un bisturi, fare un 1 centimetro incisione mediana sopra il cranio dalla osso frontale per l'osso occipitale. Ritrarre la pelle presso l'incisione utilizzando divaricatori Colibri.
- Abbassare la siringa microlitri con ago 33 G attaccata al braccio verticale del telaio stereotassico direttamente sopra la posizione del bregma (Figura 2C). Da lì, regolare la posizione del mm AP ago +0,5, +2.5 mm ML per raggiungere il sito di destinazione per l'impianto del tumore. Utilizzare una siringa tubercolina 1 ml dotato di un ago G 26 per contrassegnare questa posizione dal condannando delicatamente il periostio.
- Praticare un foro nel cranio presso il sito di destinazione fino a raggiungere la dura madre sottostante usando un trapano a batteria di potenza precisione dotato di un "(0,8 mm) bit 1/32. Mentre la perforazione, applicare pressione intermittente seguita dalla rimozione del drill bit dalla superficie del cranio per evitare un eccessivo calore e forza che potrebbe altrimenti portare alla punta puntura del tessuto cerebrale sottostante.
- Lavare la siringa microlitri con 0,9% NaCl in 1,7 ml conica in polipropilene microprovetta per assicurare che l'ago non sia ostruito. Flick delicatamente la provetta polipropilene 0,6 ml conica contenente le cellule tumorali più volte per risospendere le cellule.
- Aspirare 2 ml di cellule nella siringa microlitro garantire che bolle d'aria sono introdotti nella siringa. Dispensare 1 ml di cellule su un alcool isopropilico prep pad 70% lasciando esattamente 1 ml di cellule tumorali rimanenti nella siringa.
- Portare l'ago verso il basso fino a toccare la dura madre, poi introdurre l'ago nel cervello -3.5 mm ventrale e ritrarre da 0,5 millimetri. Lentamente e dolcemente fornire le cellule premendo lo stantuffo della siringa nel corso di 1-2 min.
- Consentire alle cellule di Settle al sito di iniezione per 5 minuti prima di ritirare lentamente l'ago. Pulire il sangue coagulato o materia cerebrale dalla punta dell'ago con un panno pulito il 70% di alcool isopropilico prep pad. Risciacquare l'ago e siringa accuratamente con il 0,9% di NaCl da 2,6 a passo assicurare che l'ago non sia ostruito per l'iniezione successiva.
- Rimuovere i divaricatori Colibri e suturare il cuoio capelluto con tre 3-0 punti di sutura in nylon monofilamento. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico e somministrare 0,1 mg / kg di buprenorfina cloridrato per via sottocutanea (sc) (circa 67 ml di / ml soluzione di lavoro 0,03 mg per un 20 g di mouse) seguita da 2,5 mg / kg atipamezolo cloridrato per via intramuscolare (im) (circa 100 ml di / ml soluzione di lavoro 0,5 mg per un 20 g del mouse) per alleviare il dolore post-operatorio e l'inversione anestesia. Mettere topi post-chirurgica nelle loro gabbie sotto una lampada riscaldante per recuperare.
3. mouse transcardial Perfusioni e raccolta del Cervello
- Preparare la soluzione di eparina Tyrode secondo il seguente protocollo:
- Mettere una barretta magnetica in una bottiglia di archiviazione tappo a vite 1 L bicchiere e riempirlo a volume con acqua deionizzata ultrapura. Posizionare la bottiglia su una piastra di agitazione.
- Pesare e aggiungere le seguenti sostanze chimiche per la bottiglia di vetro sotto agitazione: 8 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,264 g di cloruro di calcio (CaCl 2 • 2H 2 O), 0,05 g Sodio fosfato monobasico (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), 1.0 g D-glucosio (C 6 H 12 O 6), 1,0 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3), 0,2 g di cloruro di potassio (KCl). Lasciare i sali per sciogliere, poi aggiungere 100 ml di una soluzione madre 1,000U / ml di eparina sodica per la soluzione del Tyrode.
- Rimuovere il contenitore dalla piastra di agitazione ed estrarre la barra di agitazione utilizzando un magnete. Conservare la soluzione eparinizzata Tyrode a 4° C.
- Preparare una soluzione di lavoro per l'anestesia terminale come segue:
- Per l'anestesia terminale ketamina / xylazina: rimuovere 1,360 ml da una fiala di sterile allo 0,9% iniezione NaCl 10 ml e sostituirlo con 1.200 ml di una / soluzione madre ml 100 mg di ketamina cloridrato e 160 ml di una / soluzione madre ml 100 mg di xylazina cloridrato di ottenere una soluzione di lavoro misto di ketamina cloridrato (12 mg / ml) e xilazina cloridrato (1,6 mg / ml).
- Preparare la soluzione media mix di centrifugazione densità inserendo 90 ml di 10x PBS in 264 ml di acqua deionizzata ultrapura (3.93x), in un contenitore di plastica sterile. Titolare a pH 7.0-7.2 con HCl e filtrare sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 micron. Conservare a 4 ° C.
- Preparare il 70% dei media centrifugazione densità combinando 18 ml di soluzione di media mix di centrifugazione densità con 30 ml di mezzi centrifugazione densità (vedi elenco dei materialiper i dettagli) in 50 ml di tubo di polipropilene centrifuga. Conservare a 4 ° C, ma portare a RT prima dell'uso.
- Preparare 37% supporti centrifugazione densità combinando 9,6 ml di DPBS con 10,4 ml 70% supporti centrifugazione densità in una provetta da centrifuga da 50 ml. Conservare a 4 ° C, ma portare a RT prima dell'uso.
- Preparare tampone flusso ponendo 500 ml di FBS in 50 ml di DPBS (~ 1% FBS) in una provetta da centrifuga da 50 ml. Conservare a conservare a 4 ° C
- Riempire un 4.5 L secchiello del ghiaccio in poliuretano a capienza con frammenti di ghiaccio.
- Fare una soluzione combinata di 1 mg / ml di collagenasi e 1 mg / ml DNase-I in quantità sufficiente per 1 ml per campione cervello nello studio diluendo un / ml soluzione madre di DNasi I-10 mg 01:10 e 50 mg / ml soluzione collagenasi magazzino 01:50 con DPBS sterile in una singola da 15 ml tubo di polipropilene centrifuga. Mescolare delicatamente la soluzione pipettando su e giù con una micropipetta P-1000. Memorizzare sul ghiaccio nel poliuretanicoane secchio dal punto 3.7.
- Ottenere due macine di tessuto di vetro Dounce 7 ml. Etichettare un "NT" e l'altro "gal1i". Posizionare le macine dei tessuti nel secchiello del ghiaccio e aggiungere 1 ml di DPBS a ciascuno.
- Ottenere abbastanza provette 15 ml centrifuga per raccogliere la materia cerebrale di ogni mouse nello studio e posto nel secchiello del ghiaccio.
- Luogo ~ 150 ml di DPBS tra tre 50 ml provette nel secchiello del ghiaccio.
- Ottenere piatti abbastanza polistirolo esagonali di pesatura (diametro interno superiore (ID) 115 millimetri, ID di base di 85 mm, 203 ml di volume) per ogni mouse nello studio. Il set up completo per la dissezione e la triturazione di cervello di topo è mostrato in (figura 3A)
- A intervalli di tempo prescelti, anestetizzare il primo mouse portatore di tumore nello studio utilizzando una singola iniezione ip di 150 mg / kg di ketamina cloridrato e 20 mg / kg cloridrato xilazina (circa 250 microlitri della combinata 12 mg / ketamina ml / 1,6 mg / ml xilazina soluzione di lavoro di 20 g mouse) per indurre anestesia profonda. Assicurarsi che il mouse non è risposta a punta e coda pizzicotti prima di procedere.
- Recuperare la soluzione Tyrode precedentemente preparata e posto in una cappa a flusso laminare dedicato a interventi chirurgici su animali terminale. Posizionare gas impermeabile tubo polimerico collegato a un serbatoio di CarboGen nella soluzione del Tyrode. Aprire il rubinetto della bombola per consentire il 95% O 2/5% di CO 2 per CarboGen continuamente bolla nella soluzione.
- Attaccare un ago smussato 20 hub alluminio G al fine di gas addizionale impermeabile tubo polimerico attaccato ad una pompa peristaltica. Posizionare il tubo all'altra estremità della pompa peristaltica nella soluzione del Tyrode e accendere la pompa per consentire al tubo di riempimento con la soluzione ossigenata e eparinizzata Tyrode. Il set up per il mouse transcardial perfusione è illustrato nella (Figura 3B).
- Utilizzando quattro aghi 26 G, definire con precisioneil mouse anestetizzato lato ventrale dal fronte e zampe posteriori su un blocco di polistirene espanso estruso coperto con un asciugamano assorbente disposizione nella cappa a flusso laminare.
- Afferrare la pelle sopra la cavità peritoneale usando un paio di pinze dissezione smussa, e con un grosso paio di forbici dissezione fare una incisione "Y" penetrando nel muro peritoneale, il taglio cefalicamente forare il diaframma, poi biforcano a sterno per terminare a ascelle sinistra e destra.
- Utilizzare un emostatico per serrare sterno e riflettono la gabbia toracica sopra la spalla sinistra del mouse. Rimuovere il pericardio con la coppia di pinze scollamento.
- Accendere la pompa peristaltica per iniziare una flebo costante di soluzione ossigenata e eparinata Tyrode (circa 2,3-2,5 ml / min).
- Inserire l'ago smussato nel ventricolo sinistro del cuore. Utilizzare un paio di piccole forbici dissezione per tagliare l'atrio destro per consentire dissanguamento (Figura3C).
- Lasciare la soluzione del Tyrode di defluire in fondo il sistema circolatorio del mouse fino fegato e polmoni sono completamente imbiancato a causa della mancanza di sangue. Assicurarsi che non importi lordi di sangue continuano a uscire dal atrio destro prima di rimuovere il ago smussato 20 mozzo in alluminio G dal ventricolo sinistro.
- Sblocca il mouse dal blocco polistirene espanso estruso e girare il lato ventrale del mouse verso il basso. Utilizzando un grosso paio di forbici dissezione, separare la testa dal resto del corpo a livello del collo.
- Usando un piccolo paio di forbici dissezione, tagliare il cuoio capelluto sulla linea mediana iniziando occipitale lavorare avanti verso il muso per esporre il cranio.
- Rientrare la pelle su entrambi i lati del cranio con un pollice e l'indice e tenere saldamente il cranio. Utilizzare un paio di Rongeurs ossa di sfondare il cranio a partire dalla osso occipitale e lavorare in avanti per esporre completamente dorsale e lateralesuperfici del cervello. Fare attenzione a minimizzare i danni al cervello.
- Una volta che le ossa del cranio sono state rimosse, ruotare la testa del topo lato ventrale e utilizzare un piccolo paio di forbici dissezione per tagliare i nervi cranici alla base del cervello per liberarla dal cranio.
4. Isolamento di PBMC-Glioma infiltrato
- Utilizzando un unico lama di rasoio taglio pulito, isolare l'area del cervello che contiene il tumore effettuando un taglio sagittale lungo il centro del cervello per bisect due emisferi. Ruotare lato omolaterale dell'emisfero mediale giù e fare due tagli coronali ai livelli del cervelletto e bulbo olfattivo di isolare il tessuto bersaglio contiene l'impianto del tumore (Figura 4A). Una porzione equivalente dell'emisfero controlaterale può anche essere isolato ed utilizzato come controllo negativo.
- Posizionare il tessuto bersaglio nel bicchiere Dounce smerigliatrice tessuto rispettivamente l'etichetta contenente 1 ml, di DPBS, spingere lo stantuffo fino in fondo e girare 7 volte per interrompere inizialmente il tessuto. Sollevare lo stantuffo per permettere al liquido di stabilirsi di nuovo al fondo della smerigliatrice tessuti. Ripetere questa operazione tre volte; però solo ruotare lo stantuffo 4 volte nel corso dei prossimi due ripetizioni e 3 volte durante l'ultima ripetizione, onde evitare di triturare il tessuto.
- Usando una micropipetta P-1000, sequenzialmente applicare tre 1 ml di DPBS volumi ghiacciate (preparati in 3.11) lungo i lati del pistone per sciacquare nel macinino tessuti.
- Risospendere materia cerebrale triturato pipettando su e giù e posto in una provetta etichettata centrifuga da 15 ml su ghiaccio. Risciacquare i lati della smerigliatrice tessuto Dounce con 1 ml aggiuntivi di DPBS ghiacciata e aggiungere allo stesso 15 ml provetta da centrifuga. Tenere tutte le provette contenenti materia cerebrale triturato in ghiaccio fino sono stati elaborati tutti i campioni.
- Ripetere i passaggi 3,13-3,25 e 4,1-4,4 per ogni mouse nello studio.
- Una volta che tutti i campioni have stato trasformato, centrifugare la materia cerebrale triturato nei 15 ml provette a 740 g (max RCF) per 20 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta 10 ml sierologica e pipetta pistola e risospendere materia cerebrale pellet in 1 ml di preparato in precedenza collagenasi / DNase-I enzimi digestivi usando un P-1000. Posizionare i 15 ml provette in un rack provetta e posto in un bagno d'acqua a 37 ° per 15 minuti.
- Agitare delicatamente i campioni due volte durante il periodo di incubazione sfogliando i tubi per facilitare disaggregazione del tessuto.
- Aggiungere 6 ml di DPBS ghiacciata con un 10 ml pipetta sierologica ad ogni provetta per diluire gli enzimi digestivi. Pipetta su e giù per risospendere, e filtrare i volumi complessivi attraverso sterili 70 micron filtri a rete di nylon in nuovi etichettati provette 15 ml centrifuga su ghiaccio.
- Spin la sospensione cellulare cerebrale giù 740 xg (RCF max) per 20 min a 4 ° C per unpellet singola cellula (Figura 4B). Dopo aver rimosso i 15 ml provette dalla centrifuga disporli sul ghiaccio e aumentare impostazione centrifuga a circa 21 ° C, in preparazione per il passo successivo della temperatura.
- Rimuovere completamente il supernatante da ciascuna provetta contenente cellule cerebrali e inizialmente risospendere il pellet in 1 ml di 70% supporti centrifugazione densità utilizzando una micropipetta P-1000. Quindi aggiungere 4 ml supplementari di 70% Mezzi di centrifugazione densità in ogni provetta con una pipetta 10 ml sierologica. Avvitare i tappi in modo sicuro e omogeneizzare la sospensione cellulare invertendo delicatamente per tubi diverse volte.
- Rimuovere i 15 ml provette contenenti cellule cerebrali risospese nel 70% dei media centrifugazione densità da ghiaccio, e posto in un rack provetta a temperatura ambiente. Uno alla volta, coprile accuratamente 2 ml di 37% soluzione di supporti centrifugazione densità sulle 5 ml di 70% supporti centrifugazione densità con una micropipetta P-1000 per formare acinterfaccia magra tra i due strati di media densità centrifugazione (Figura 4C).
- Usare un pennarello a punta fine per indicare la posizione dell'interfaccia in modo che possa essere facilmente identificato dopo centrifugazione, quando la differenza diventa meno evidente.
- Spin down dei 15 ml provette a 740 g (max RCF) per 20 minuti a temperatura ambiente, senza pausa per evitare di interrompere l'interfaccia.
- Dopo centrifugazione, raccogliere le PBMC che si sono accumulati all'interfaccia tra i due strati di media densità centrifugazione (Figura 4D) introducendo un P-200 micropipetta nel tubo lungo il suo lato, bypassando accuratamente lo strato lipidico.
- Giunti al livello della banda PBMC, lentamente estrarre 200 microlitri dalla superficie dello strato di supporto centrifugazione densità 70% e posto in un tubo di polipropilene FACS rispettivamente etichettati sul ghiaccio. Ripetere una volta per un volume totale di 400 microlitri per campione.
- Aggiungere 3 ml di tampone di flusso per ciascuna provetta FACS contenente 400 ml di PBMC per diluire sufficientemente media densità centrifugazione, poi girare le cellule a 660 xg giù (max RCF) per 20 min a 4 ° C.
5. immunomarcatura di PBMC-Glioma infiltrato
- Prima di analizzare i campioni sperimentali PBMC, eseguire una singola, esperimento, indipendente superficie cellulare controllo isotipico per stabilire cancelli di base per essere associato con una serie di tensioni PMT fissi all'interno di un modello di analisi dei dati di citometria a flusso dedicato alla valutazione di PBMC-gliomi infiltranti secondo la seguente procedura:
- Innestare un topo C57BL / 6J con GL26-Cit-gal1i e un altro con GL26-Cit-NT secondo la procedura descritta nella sezione 2. Dopo 72 ore di crescita tumorale, eutanasia entrambi i topi e isolare i PBMC tumore infiltrante secondo le procedure delineato in tutta sezioni 3 e 4.
- Unire i due campioni di PBMC (NT unnd gal1i) in un unico volume (ad esempio, 100 ml), poi dividere ulteriormente il campione in modo uniforme tra tre tubi FACS (vale a dire, il 33,3 ml per provetta) con l'etichetta "CD45 isotipo", "Gr-1 / CD11b isotipo", e "NK1. 1 isotipo ". Aggiungere i seguenti anticorpi (ciascuno al diluizione 1: 100 e diluita ad un volume totale di 200 microlitri di tampone di flusso) per i tubi FACS rispettivamente etichettati: "CD45 isotipo": Alexa Fluor rat 700-coniugato IgG2b, κ (clone: RTK4530 ), "Gr-1 / CD11b isotipo": Alexa Fluor ratto 700-coniugato anti-topo CD45 (clone: 30-F11), ratto PE-coniugato IgG2b, κ (clone: eB149 / 10H5), e PerCP / Cy5.5 coniugata IgG2b ratto, κ (clone: RTK4530); "NK1.1 isotype": Alexa Fluor ratto 700-coniugato anti-topo CD45 (clone: 30-F11), PE-coniugato ratto anti-topo Gr-1 (clone: RB6-8C5), PerCP / ratto Cy5.5-coniugato anti-topo CD11b (clone: M1 / 70), e APC-conjugated del mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a).
- Lasciare PBMC a immunolabel sul ghiaccio al buio per 20 minuti. Flick i tubi una volta a metà del periodo di incubazione di mescolare delicatamente. Lavare con 1 ml di tampone di flusso, centrifugare a 660 xg (RCF max) per 10 min a 4 ° C e risospendere ogni tubo FACS contenente PBMC con 200 ml di tampone di flusso.
- Utilizzando un citofluorimetro dotato di un ugello integrato 85 micron, analizzare il tubo "CD45 isotipo" prima di stabilire una linea di base CD45 porta dell'intervallo. Quindi, eseguire il tubo "Gr-1 / CD11b isotipo" per stabilire una linea di base Gr-1 / CD11b cancello quadrante utilizzando solo veri CD45 + cellule come input. Infine, eseguire il tubo "NK1.1 isotipo" per stabilire una linea di base NK1.1 cancello intervallo utilizzando solo vero CD45 + / Gr-1 basse cellule / CD11b +/- come input.
- Utilizzare la seguente procedura per tutti i futuri sperimentaleANALISI:
- Effettuare una quantità sufficiente di una diluizione 1: 100 di anticorpi sulla superficie cellulare in tampone di flusso per ottenere un volume di 200 microlitri per campione (più 1 per isotipo GzmB): Alexa Fluor rat 700-coniugato anti-topo CD45 (clone: 30-F11 ), ratto PE-coniugato anti-topo Gr-1 (clone: RB6-8C5), ratto PerCP / Cy5.5 coniugato anti-topo CD11b (clone: M1 / 70), mouse APC-coniugato anti-topo NK1.1 (clone: PK136).
- Rimuovere con cura il supernatante delle PBMC centrifugare da 4,15 fino menisco è appena sopra la parte inferiore di ciascun tubo FACS (~ 50 microlitri) per evitare perdite di cellule. Risospendere le PBMC in ogni provetta FACS utilizzando il buffer di flusso residua con un P-200 micropipetta e rimuovere (1 / # di campioni) del valore del volume da ciascuna provetta FACS e combinare in un nuovo tubo FACS etichetta "isotipo pool".
- Aggiungere 200 ml di cocktail di anticorpi superficie cellulare preparato in 5.2.1 per ogni campione PBMC. Lasciare PBMC a immunolabel sul ghiaccio al buio per 20 minuti. Flick tegli Tubi una volta a metà del periodo di incubazione di mescolare delicatamente.
- Lavare con 1 ml di tampone di flusso; spin down a 660 g (max RCF) x 10 minuti a 4 ° C.
- Risospendere tutti i tubi FACS contenenti PBMC in 200 ml di un fissativo a base formalina disponibile in commercio (vedi elenco dei materiali per i dettagli) per 15 min in ghiaccio nel buio. Flick i tubi una volta a metà del periodo di incubazione di mescolare delicatamente.
- Lavare con 1 ml di tampone 1x permeabilizzazione / lavaggio disponibile in commercio (vedi elenco dei materiali per i dettagli) e spin down a 660 g (max RCF) per 10 minuti a 4 ° C.
- Mentre PBMC girano giù, preparare una quantità sufficiente di una diluizione 1: 100 di topo Pacific Blue-coniugato anti-topo GzmB (Clone: GB11) anticorpi intracellulari in 1x tampone di permeabilizzazione / lavaggio per ottenere un volume di 200 microlitri per campione.
- In un tubo separato, preparare un unico volume di 200 ml di una diluizione 1: 100 di Pacific Blue-conjugated topo IgG1, κ (clone: MOPC-21) anticorpo controllo isotipico.
- Risospendere ciascuno dei campioni sperimentali PBMC con 200 microlitri della diluizione 1: 100 di anticorpi anti-topo GzmB e risospendere il singolo tubo FACS etichetta "isotipo pool" con il volume di 200 ml della diluizione 1: 100 di anticorpi isotipo.
- Consentire a tutti i campioni di PBMC immunolabel sul ghiaccio al buio per 20 minuti. Flick i tubi una volta a metà del periodo di incubazione di mescolare delicatamente.
- Lavare con 1 ml di tampone di flusso; spin down a 660 g (max RCF) per 10 minuti a 4 ° C e risospendere PBMC con 200 ml di buffer di flusso per l'analisi.
- Flusso cytometrically analizzare-glioma infiltrazione PBMC utilizzando un ugello integrato 85 micron e le porte e le tensioni PMT precedentemente stabiliti nel paragrafo 5.1 22. Assicurarsi di eseguire l'intero volume di ciascun campione sulla citofluorimetro per garantire un equo confronto tra il numero totale di glioma-infiltPBMC di rating in ogni campione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La seguente strategia di gating viene utilizzato per un tipico esperimento: FSC-A e SSC-A → SSC-H e SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. conteggio → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs conteggio. Gates posto su Gr-1 le cellule mieloidi + / CD11b + e cellule NK1.1 + NK vengono poi stratificati sulla base di espressione GzmB (Figura 5A). Backgating quelle cellule identificate come cellule NK1.1 + NK e Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi in nostri esperimenti Onto FSC-A e SSC-A conferma delle dimensioni linfoide più piccola delle cellule NK e le dimensioni relativamente grandi di cellule mieloidi ( Figura 5B). File di dati grezzi (cioè., File FC) sono analizzati da disponibili in commercio software di analisi dati di citometria a flusso, come FlowJo.
Un totale di 18 C57BL / 6J sono stati usati per illustrare questo metodo. Nove (9) sono state innestate con GL26-Cit-NT e 9 sono state innestate con GL26-Cit-gal1i sulla stessa day utilizzando il numero equivalente di cellule (3x10 4). Tre topi di ogni gruppo sono stati sacrificati a 24, 48, e 72 ore dopo il tumore attecchimento. I dati mostrano che l'attecchimento delle cellule di glioma GL26-Cit-gal1i nel cervello di singenici C57BL / 6J induce rapidamente il reclutamento di CD45 + PBMC (figura 6A). Sulla base del cocktail anticorpo specifico utilizzato nella dimostrazione può inoltre dimostrare che Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi e cellule NK NK1.1 + specificamente immettere il tumore microambiente gal-1-deficient entro 48 ore di tumore attecchimento (Figura 6B e 6C); tuttavia il numero totale di cellule mieloidi-glioma infiltrante supera di gran lunga quella delle cellule NK.
Figura 1: Preparazione di cellule GL26-Cit per intracranica Attecchimento (A.) Rappresentante 10X in campo chiaro e micrografie epifluorescenza di GL26-Cit-NT (immagini a sinistra) e GL26-Cit-gal1i (immagini giuste), le cellule in coltura. (B) Western Blot di GL26-Cit-NT (corsia di sinistra) e GL26-Cit-gal1i (corsia di destra) intero lisato cellulare. Gamma tubulina (γ-vasca.) Viene visualizzato come controllo di caricamento. (C) GL26-Cit pellet cellulare da un confluenti T75 pallone di coltura tissutale circa il 50% dopo centrifugazione a 550 xg (RCF max) per 5 minuti a 4 ° C. (D) vista Luminoso-campo di un emocitometro contenente cellule GL26-Cit (punti bianchi) diluito 1: 1 con Trypan Blue per valutare il numero di cellule e la vitalità. Le cellule devono essere> 90% valida per garantire la crescita del tumore riproducibile. La media dei conteggi di cella dalle piazze etichettati da 1 a 5 deve essere assunto per aumentare la precisione della stima conta cellulare. Cellule (E) GL26-Cit risospese a 3 x 10 4 cellule / ml in un-integrato DMEM per IMPLA intracranicantazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: stereotassica attecchimento delle cellule del glioma nello striato di C57BL / 6J (A) Disposizione chirurgica privato che mostra gli strumenti chirurgici necessari e reagenti.. (B) Primo piano vista di un topo C57BL / 6J imbrigliato in un telaio stereotassico con il corretto posizionamento dell'ago a 0,5 millimetri AP, 2,5 millimetri ML, e -3.0 mm DV rispetto al bregma. Vista (C) dorsale del cranio del mouse mostra la posizione del bregma e il sito di destinazione per l'attecchimento delle cellule tumorali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Mouse transcardial perfusione (A) i reattivi necessari per la dissezione, triturazione, e la digestione enzimatica del tessuto cerebrale mouse. (B) Disposizione degli strumenti e reagenti necessari per il mouse transcardial perfusione con soluzione ossigenata e eparinizzato di Tyrodes visualizzati in una cappa a flusso laminare dedicata a procedure chirurgiche topo terminale. (C) Rappresentazione schematica del cuore dimostrando strumenti adeguati e posizionamenti richiesti per perfusione transcardial. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Isolamento di Glioma-infiltrantePBMC. (A) Strategia per la dissezione del tessuto cerebrale del mouse contenente early stage impianti di glioma ortotopico. Il pannello superiore mostra la bisection sagittale dell'emisfero ipsilaterale dal emisfero controlaterale. Il pannello inferiore mostra i due tagli coronali aggiuntivi necessari per isolare il tessuto bersaglio contenente l'impianto del tumore (evidenziato in viola). Pellet (B) cella singola tessuto cerebrale (freccia bianca) dopo la digestione enzimatica, filtrazione attraverso una rete di nylon 70 micron e centrifugazione. (C) correttamente versato gradiente mezzi di centrifugazione densità prima della centrifugazione. La freccia bianca indica l'interfaccia pulita formata tra gli strati dei media centrifugazione due densità. (D) Densità supporti centrifugazione gradiente dopo centrifugazione dimostrando strato lipidico che si forma nella parte superiore della freccia bianca 37% strato supporti centrifugazione densità) e la banda PBMC (delineato da the tratteggiate linee nere) a livello di interfaccia tra i due strati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: citometria a flusso strategia di gating utilizzato per identificare-glioma infiltrazione Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi e cellule NK (A) Fase 1:. Totale cellule immunolabeled isolate dalla banda PBMC di un gradiente di densità multimediale centrifugazione sono gated a escludere detriti cellulari (FSC-A meno di ~ 50 K). I punti 2 e 3: Doublet discriminazione gating per filtrare aggregati cellulari. Fase 4: cancello CD45 per identificare le cellule immunitarie-glioma infiltrante. Isotipo di controllo è mostrato come la sagoma grigia. Fase 5: CD45 + cellule stratificate basati su Gr-1 e CD11b. Controllo isotipico per entrambi Gr-1 e CD 11b è sovrapposto sulla trama e chiuso dal cerchio d'oro. Il cerchio rosso indica cellule mieloidi Gr-1 + / CD11b +. Passo 5 ': cellule mieloidi Gr-1 + / CD11b + stratificate sulla base di espressione GzmB. Come predicato, queste cellule non etichettare con anticorpi anti-GzmB oltre controllo isotipico (grigio silhouette). Passo 6: Gr-1 le cellule bassi delineate dal rettangolo nero al punto 5 stratificato basato sull'espressione NK1.1. Isotipo di controllo è mostrato come la sagoma grigia. Passo 6 ': cellule NK1.1 alto stratificato basato sull'espressione GzmB. Queste cellule infatti etichetta con anticorpi anti-GzmB sopra controllo isotipico (grigio silhouette). (B) Backgating di Gr-1 le cellule mieloidi + / CD11b + su FSC-A e SSC-A dimostrazione che le cellule NK hanno una dimensione più piccola linfoide rispetto alle dimensioni Gr-1 + cellule mieloidi / CD11b + grandi."_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Confronto di PBMC Infiltrazione nel GL26-Cit-NT vs GL26-Cit-gal1i microambiente tumorale nei primi tre giorni di crescita tumorale intracranica (A) CD45 + Totale cellule immunitarie.. (B), le cellule mieloidi CD45 + / Gr-1 + / CD11b +. (C) CD45 + /NK1.1 + cellule NK. I punti dati da PBMC isolate da gliomi GL26-Cit-gal1i sono collegati da linee morbide, talora quelli isolati da gliomi GL26-Cit-NT sono collegati da linee tratteggiate. -Glioma infiltrazione PBMC da tre topi sono stati analizzati per tipo di tumore in ogni punto. I numeri associati a ciascun punto dati sulle curve GL26-Cit-gal1i rappresentano la piega-induzione di quel particolare tipo PBMC over GL26-Cit-NT all'ora specificata post-tumore impianto (HPI). I dati rappresentano il numero medio di cellule immunitarie contate ± l'errore standard della media (SEM). L'analisi statistica è stata effettuata mediante analisi a 2 vie della varianza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo robusto e riproducibile per l'isolamento e analisi citofluorimetrica delle PBMC che hanno infiltrato inizi del mouse tumore cerebrale microambiente. Sospensioni cellulari glioma sono generati ad una concentrazione specificato dal sperimentalista che sono stereotactically innestato nello striato del cervello di topo. I topi sono poi eutanasia in momenti predeterminati previsti dal disegno sperimentale e il loro cervello sono raccolta e trattata per isolare PBMC-glioma infiltrante che sono immunolabeled con combinazioni di anticorpi primari fluorocromi coniugati; cellule immunolabeled sono poi quantificati mediante citometria di flusso. Anche se la manifestazione qui presentata si concentra sui punti di tempo primi, PBMC-glioma infiltrante possono essere valutate in qualsiasi punto nel tempo di post-tumore attecchimento fino topo agonia. Il metodo è altamente modulare qualsiasi numero di differenti combinazioni di anticorpi può essere utilizzato per esaminare le cellule immunitarie di interesse including cellule T, cellule B, le cellule NK, monociti e macrofagi. Si noti che il protocollo è stato ottimizzato per l'uso con femmine C57BL / 6J 8-10 settimane di età. Topi al di fuori di questa fascia di età può aver alterato le percentuali di PBMC circolanti, che possono portare a conteggio delle cellule in momenti equivalenti che non sono rappresentativi dei dati presentati qui. Esperimenti di caratterizzazione possono essere richiesti se modelli tumorali alternativi sono utilizzati o se vengono utilizzati topi diverse da quelle sullo sfondo B6 dovuto al fatto che i ceppi possono differire nella loro profili PBMC (Jaxpheno6; mouse Phenome Database, Jackson Laboratory). Condizioni di genere e ambientali possono anche essere fonte di disparità tra le frequenze PBMC e percentuali.
Questo metodo è stato dimostrato utilizzando una combinazione di anticorpi superficie quattro celle che consentono il rilevamento di Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi e cellule NK NK1.1 +, tipi cellulari coinvolti nel rifiuto di gal-1-carente glioma. L'inclusione di anticorpi intracellulari GzmB consente inoltre il rilevamento di potenziale citotossico nel sottoinsieme di cellule NK. I risultati rappresentativi sono previste per l'infiltrazione di cellule immunitarie in primi gliomi GL26-Cit in singenici C57BL / 6J che o esprimono livelli normali di gal-1 o che hanno ridotto i livelli a causa di shRNA mediata knockdown gene. La dimostrazione mostra la sensibilità e la riproducibilità della tecnica mostrando che PBMC-gliomi infiltranti possono essere isolati e riproducibile quantificati appena 24 h post-tumorale attecchimento. Oltre a rivelare una popolazione di Gr-1 CD11b + cellule di alta / mieloidi infiltranti il tumore, la dimostrazione rivela anche una popolazione di Gr-1 int CD11b + cellule / la cui identità è attualmente definita.; ulteriori esperimenti sono necessari per decifrare ulteriormente il carattere di questa popolazione cellulare. Notiamo anche che non osserviamo una popolazione facilmente distinguibili di CD45
Anti-Gr-1 anticorpi riconoscono sia le proteine di superficie cellulare Ly6G e Ly6C che sono specifici per polimorfonucleati e cellule mieloidi mononucleate rispettivamente 25. L'uso di anti-Gr-1 gli anticorpii preclude quindi distinzione tra questi due popolazioni di cellule. I risultati preliminari nel nostro laboratorio ora stanno cominciando a far luce su una descrizione più accurata delle prime cellule Gr-1 + / CD11b + che si infiltrano il glioma microambiente gal-1-carenti. Esperimenti che incorporano anti-Ly6G (clone: 1A8) e anti-Ly6C (clone: AL-21) anticorpi insieme con anticorpi anti-CCR2 ora indicano che il GR-1 CD11b + cellule / alta infiltrazione dei primi gal-1-carente microambiente tumorale sono coerenti con Ly6C alto / CCR2 alti monociti infiammatori, anche se ulteriori esperimenti sono necessari per confermare questo risultato (dati non riportati).
A causa delle cellule perde che si possono verificare durante le fasi di ripetizione centrifugazione e risospensione coinvolte in isolamento PBMC-glioma infiltrante, è probabile che osservare il conteggio delle cellule sono infatti inferiori che ciò che è effettivamente presente nel cervello intatto. Tuttavia, le differenze tra egruppi Xperimental dovrebbero tenere se i volumi equivalenti dell'interfaccia multimediale centrifugazione 37/70 densità vengono estratti e se l'intero volume di ogni campione è analizzato dal citofluorimetro. Il mancato rispetto di questa procedura comporterà confronti sleali tra i campioni e preclude l'analisi imparziale. L'incapacità di quantificare il numero esatto di PBMC entrano nel microambiente tumorale cervello non è uno specifico limite di questo protocollo. Metodi alternativi come le strategie di conteggio delle cellule immunoistologici sono soggetti a errore dovuto alla estrapolazioni di numeri cellulari totali in base ai conteggi stereologici e il requisito della soglia immagine equivalente sezione di tessuto al microscopio, che si differenziano per il loro livello di colorazione di fondo, che potrebbe condurre a false segnali -negativa o falsi positivi. Tuttavia, un confronto di analisi andamento nel tempo tra i diversi metodi di analisi dovrebbe rivelare le curve immunitario-afflusso dipendenti dal tempo con forma complessiva simile. Unulteriore svantaggio per i metodi di immunoistochimica è l'incapacità di alcuni anticorpi convalidati per citometria a flusso di legarsi al epitopo antigenica equivalente nel contesto di sezioni di tessuto cerebrale fissate in formalina.
Ci sono alcuni passaggi chiave di questo protocollo che può servire come limitazioni per chi non conosce la sua metodologia. Un tale passo è la raccolta del cervello dal cranio senza danneggiarlo. Si consiglia di praticare le tecnica più volte prima di eseguire esperimenti appropriati. Tuttavia, poiché il cervello finirà per essere triturato, lievi danni agli strati superficiali del cervello probabilmente irrilevante per la quantificazione precisa delle PBMC-glioma infiltrante. Un secondo passo che gli investigatori inesperti possono inizialmente trovare difficile è la colata del gradiente di densità mezzi di centrifugazione. La capacità dei sperimentalisti 'a formare una interfaccia pulita, mentre sovrastante le 2 ml di 37% Mezzi di centrifugazione densità in cimalo strato 70% è cruciale per l'isolamento riproducibile di PBMC. Anche se questo passaggio può inizialmente rivelarsi stimolante, arricchisce notevolmente per PBMCs e riduce drasticamente il periodo di tempo altrimenti necessario per l'analisi dei campioni se il tessuto intero cervello dove da analizzare il flusso cytometrically. PBMC arricchimento riduce anche il numero totale di eventi acquisiti dal citofluorimetro, riducendo così le dimensioni dei file .fcs e aiutando a risolvere rare popolazioni di cellule immunitarie del cervello infiltrante. Per ottenere i migliori risultati nella creazione di un ambiente pulito un'interfaccia centrifugazione densità si consiglia di versare la densità dei media centrifugazione 37% con una micropipetta P-1000 con l'azione stantuffo liscio. Angolo provetta da 15 ml circa 20-30 ° sopra il banco. Posizionare la punta della micropipetta sul lato delle marcature ml tubo 3-5 sopra la superficie dello strato di supporto centrifugazione densità 70%. Versare costantemente e lentamente in modo da ridurre al minimo palese slancio verso l'esterno del 37% dei media centrifugazione densità come Extrudes dalla punta micropipetta per evitare di disturbare il sottostante del 70% dei media centrifugazione densità. Infine, il fatto che l'architettura tessuto cerebrale è necessariamente distrutto nel processo di isolamento-glioma infiltrante PBMC significa che i topi supplementari dovranno avere punto di tempo corrispondenti dati istologici.
Modelli di glioma nuovi generati attraverso l'iniezione di oncogeno DNA plasmide nel normale cervello dei roditori sono stati sviluppati negli ultimi anni 26-32. Questi modelli tumorali "endogeni" aggirare potenziali artefatti causati da stereotactically innestando ex vivo cellule tumorali e più da vicino imitare le caratteristiche istologiche di glioma clinica. Il metodo qui descritto è adatto allo studio di eventi infiltrazione immunitarie che caratterizzano questi sistemi modello più clinicamente rilevanti. Studi sulla afflusso immunitaria nei topi neonati possono essere eseguite anche con questo metodo anche se la densità di mous neonatalee cervello è inferiore a quella degli adulti, che possono richiedere una ottimizzazione della fase di digestione enzimatica per evitare sopra digestione del tessuto cerebrale. Ulteriori applicazioni della tecnica includono indagini sulle classi alternative di malattia del cervello infiammatoria a parte tumori maligni quali encefalomielite sperimentale allergica (EAE) e le risposte immunitarie alle infezioni virali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / Istituto nazionale dei disordini neurologici e Stroke (NIH / NINDS) concede R01-NS074387, R01-R21 NS057711 e-NS091555 a MGC; NIH / NINDS concede R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21 NS082311 e-NS084275 a PRL; sovvenzioni da Happy Hearts Leah, Università del Michigan Comprehensive Cancer Center assegnato a MGC e PRL; il Dipartimento di Neurochirurgia, Università del Michigan School of Medicine; l'Istituto del Michigan per clinica e ricerca di salute, sostenuto da NIH concedere 2UL1-TR000433; l'Università del Michigan Cancer Biology borsa di formazione sostenuto da NIH / NCI (National Cancer Institute) concessione T32-CA009676; l'Università del Michigan di formazione clinica e di base Neuroscienze sostenuto da NIH / NINDS concedere T32-NS007222; e l'Università del Michigan Medical Training Program Scientist sostenuto da NIH / NIGMS (Istituto Nazionale di Medicina Generale Scienze) concedere T32-GM007863. Gli autori unre grato per la leadership accademica e il sostegno ricevuto dalla dottoressa Karin Muraszko e il Dipartimento di Neurochirurgia; a M. Dahlgren, D. TomFord, e S. napoletano per eccellente supporto amministrativo; a M. Dzaman per l'eccellente assistenza tecnica; e di Phil F. Jenkins per il generoso sostegno per l'acquisto di un microscopio elettronico a scansione Zeiss 3D. Riconosciamo anche il laboratorio Kuchroo alla Harvard Medical School da cui è stata redatta una versione modificata della strategia mediatica-mediata centrifugazione densità per isolamento delle cellule mononucleari del cervello.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
- Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E.
- Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
