Introduction
Durante casi 50 años los nematodo Caenorhabditis elegans se estableció como un poderoso modelo para estudiar cuestiones importantes en el desarrollo, la neurobiología, la evolución, las interacciones huésped-patógeno, etc. 1 La fuerza de este modelo en el estudio del desarrollo radica en: su ciclo de vida corta de 3 días; la facilidad con que estos animales pueden ser alterados genéticamente; su transparencia que permite la observación de los desplazamientos y la morfología celular en los animales vivos y su desarrollo que es en su mayoría extrauterino. Las etapas de desarrollo del nematodo implican la embriogénesis y cuatro etapas de larvas (L1 a L4), seguido de la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la morfogénesis epidérmica atrajo una considerable atención por su capacidad para permitir una mejor comprensión de cómo epitelial células migran como un grupo, cómo se reorganizan sus uniones y modificar su morfología individual, así como su posición relativa dentro de un epitelio funcional.morfogénesis epidérmico se divide en cuatro etapas: intercalación dorsal que consiste en la reorganización de las células epidérmicas dorsal, referido como la hipodermis; recinto ventral, que consiste en la migración de las células hypodermal ventral hacia la línea media ventral que encierra por lo tanto el embrión en una monocapa de células epiteliales; temprana y tardía de elongación transformar el embrión en forma de frijol en larvas vermiformes. Después de la morfogénesis, la portilla de embriones y larvas L1 comienzan a alimentarse utilizando bacterias disponibles en su entorno inmediato.
por lo tanto la elongación embrionarias es una fase tardía del desarrollo embrionario. Se compone de la extensión del embrión a lo largo de su eje longitudinal y una reducción de su diámetro transversal. Esto implica una modificación dramática de la forma de las células hipodermis. Alargamiento se divide en una temprana y una fase tardía. La primera fase comienza en la fase de coma y termina cuando los músculos del cuerpo de paredes comienzan a contraer en la etapa de 1.75 veces en wde tipo ILD (en peso) de embriones - correspondiente a los embriones que son 1,75 veces mayor en longitud en comparación con los embriones no alargada. Procesos morfogenéticos que se producen en esta fase son impulsados principalmente por la contracción de los haces de actina filamentosa (FB) situados en el polo apical de las células hipodérmicas que impulsan su alargamiento a lo largo del eje antero-posterior del embrión 2. La contracción de los FB es el control por la fosforilación de las cadenas de miosina luz por tres quinasas LET-502 / rock, MrCk-1 y PAK-1 5. La fase tardía de la elongación, comienza cuando los músculos del cuerpo se vuelven funcionales de pared y empiezan contratación. Se trata de la señalización mechanotransduction de los músculos del cuerpo de pared a las células dorsales y ventrales hipodermis y termina cuando los animales salen del cascarón 3.
defectos de elongación se caracterizan generalmente por el porcentaje de animales que mueren como embriones (embriones de letalidad; Emb) y los deteniendo su desarrollo como larvas L1 (fenotipo detención larval; Lva) y ser significativamente más corto que en peso. Identificación de la etapa de detención del desarrollo requiere la observación microscópica de embriones muertos y detenido larvas 3-6.
Recientemente se demostró que varios genes, como el regulador de Cdc42 / Rac y el efector pix-1 y pak-1, el control de los procesos morfogenéticos durante la temprana y tardía de elongación 3,7. También demostraron recientemente que los procesos morfogenéticos difieren a lo largo del eje antero-posterior de los embriones durante la elongación temprana 3 7. Estos hallazgos motivaron el desarrollo de nuevas métricas específicamente dirigidas a las etapas tempranas o tardías de elongación y otras métricas que permiten la caracterización de la morfología de los embriones a lo largo de su eje antero-posterior durante la elongación temprano.
Estos nuevos métodos consisten en la medición de la longitud de los embriones al principio y al final de elongación temprano, así como la anchura de su élanuncios y colas. 7 Dos protocolos también se han desarrollado para medir la longitud de las larvas recién eclosionadas, sincronizada en fase L1 7.
Las cáscaras de huevo de los embriones a proteger contra el tratamiento con hipoclorito alcalino, mientras que las larvas, adultos y bacterias presentes en el medio de cultivo se disuelven por el tratamiento. Este tratamiento se utiliza a continuación para purificar embriones a partir de una población no sincronizada que contiene una mayoría de los bien alimentados adultos 8. la restricción de alimentos se utiliza para sincronizar las larvas recién eclosionadas. La medición de la longitud de estas larvas se usa entonces para detectar defectos de elongación. Esta medición se prefiere sobre la medición de las larvas detenido en placas de cultivo porque las larvas que eclosionan de que no esté totalmente embriones alargados puede recuperar a "longitud normal" cuando la alimentación pero mantendrá su tamaño reducido cuando detenido en la ausencia de alimento.
A continuación, presentamos los protocolos que permitan a la medición de la length de alargarse embriones, así como la anchura de la cabeza y la cola utilizando lapso de tiempo DIC microscopía y análisis de imagen (Protocolo 1). También proporcionamos protocolos detallados para medir la longitud de las larvas sincronizado usando análisis de imágenes (Protocolo 2) y citometría de flujo (Protocolo 3).
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Protocol
1. Caracterización de defectos de elongación tempranos en WT y mutantes Animales
- Los embriones de montaje para Normarski DIC Microscopía
- Preparar los siguientes medios de cultivo y el material:
- M9 Buffer, se disuelven 12,8 g / L de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L de NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7H 2 O en agua destilada y autoclave para esterilizar.
- NGM placas, se disuelven 3 g / l de NaCl, 16 g / l de agar, 2,5 g / L de bactopeptona en ddH2O Autoclave y añadir 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl 2, tampón de fosfato 1 mM y 5 mg de colesterol / ml. Verter 6 ml de NGM por placas de 60 mm. Dejar que el medio se solidifique durante 24 horas a temperatura ambiente. Añadir unas gotas de un cultivo saturado de E. bacterias OP50 coli cultivaron en caldo Luria (LB). Deje que las bacterias crecen durante 48 horas y almacenan las placas a 4 ° C.
- Para generar el gusano pick, montar un alambre de platino 0,01 "de diámetro en un corto pipeta Pasteur. Fije el alambre de platino a la extremidad de la pipeta de vidrio por calentamiento de este extremo con un quemador de benceno. Aplanar el extremo del alambre para generar una especie de pala.
- Crecer la cepa gusano en 60 mm NGM placas con OP50 a 20 ° C.
NOTA: alelos termosensibles pueden requerir creciente los animales a temperaturas no permisivas en hasta 25,5 ° C. Las placas deben contener muchos adultos jóvenes y todavía un montón de alimentos con el fin de seguir los protocolos. - Colocar un portaobjetos de microscopio entre dos portaobjetos spacer cubiertos por dos capas de cinta adhesiva (Figura 1A).
- Preparar una solución de agarosa al 3% (peso / volumen) en tampón M9 disolviendo 0,6 g de polvo de agarosa en 20 ml de tampón M9 por calentamiento en el microondas durante 30 seg. Deje que la solución se enfríe durante 5 min.
NOTA: La solución de agarosa se puede utilizar para unos pocos días después de la fusión en un horno de microondas. Esotambién puede ser en alícuotas y se almacena a 4 ° C durante semanas. - Coloque una gota de solución de agarosa al 3% caliente en el portaobjetos de vidrio situada entre los dos espaciadores toboganes. Evitar la formación de burbujas.
- Rápidamente cubrir la agarosa con otra diapositiva como se muestra en la Figura 1B y presione hacia abajo suavemente. El carro superior se aplanar la gota de agarosa y generar una almohadilla con el grosor de dos capas de cinta adhesiva.
- Dejar que la agarosa solidifique durante al menos 1 min a temperatura ambiente o hasta que los embriones están listos para ser transferidos a la almohadilla.
- El uso de un pick gusano, transferir 20 a 30 adultos jóvenes bien alimentados desde el NGM-placa en un tubo de microcentrífuga que contiene 400 l de tampón M9.
- Permitir que los gusanos se sedimenten por gravedad durante aproximadamente 5 minutos y eliminar el sobrenadante utilizando una micropipeta. Este paso tiene como objetivo eliminar el máximo de bacterias escogidas con los nematodos.
- Añadir 200 l de tampón M9 a cada tubo.
- El uso de un pip Pasteurette, transferir el contenido del tubo (tampón y nematodos) a un vidrio de reloj.
- Utilice una o dos agujas 25G 5/8 "para cortar los animales en la sección media del cuerpo (entre la espermateca y la vulva).
NOTA: una hoja de bisturí también se puede utilizar como una alternativa a la aguja (s). Hacer esto en natación nematodos y puede requerir un poco de práctica. La idea es utilizar agujas como tijeras o un cuchillo como dependiendo de cómo se utilizan muchas agujas. Una vez que los animales se cortan abierta, hermafroditas liberan sus embriones en el buffer. - Concéntrese embriones en el centro del cristal de reloj a través de la generación de un vórtice circular dentro del líquido.
- Eliminar la mayor parte de la M9 desde el vidrio de reloj utilizando una micropipeta. Deje aproximadamente 30 l de M9 con los embriones.
- Retire la corredera que cubre el tampón de agarosa (Figura 1B) deslizándolo fuera de la almohadilla.
- Cortar la almohadilla con una hoja de afeitar con el fin de ser capaz de cubrir por completo con un cubreobjetos (Figura 1C).
- Utilizando una pipeta Pasteur, transferir todos los embriones (y restos gusano) en la almohadilla de agarosa.
- Grupo de los embriones en el centro de la almohadilla usando una pestaña pegada en el extremo de una punta utilizada para micropipetas 200 l.
- Lentamente colocar un cubreobjetos sobre la almohadilla para evitar la formación de burbujas y sellarlo.
NOTA: Varias selladores pueden ser utilizados. Utilizamos la elaboración de las encías encuentra en las tiendas de arte y artesanía (generalmente utilizado como enmascaramiento de goma de la pintura acuarela). Esta goma se utiliza porque es hidrófilo y se solidifica razonablemente rápido y no es tóxico para los gusanos. Los portaobjetos también se puede sellar con esmalte de uñas o valap (mezcla hecha de vaselina, lanolina y cera Parafin). - Permitir que el dibujo seca la goma durante aproximadamente 15 min.
- Preparar los siguientes medios de cultivo y el material:
- Alargamiento grabación temprana por medio de cuatro dimensiones Normarski DIC Microscopía
NOTA: El objetivo de este paso es registrar alargamiento temprano de la coma para el inicio de la elongación tarde- Definido como el momento en que los músculos del cuerpo de pared comienzan contratación. También tenemos como objetivo registrar más de un embrión en el momento. Ocho horas de grabación suelen ser necesarios para registrar el alargamiento temprano para un grupo de embriones no sincronizadas.- Coloque la corredera montada en la platina de un microscopio. Asegúrese de que el microscopio está equipado con 10X y 60X objetivos, así como lentes de DIC, prisma, cámara y software de captura que permitan la microscopía de lapso de tiempo y la generación de Z-pilas (automatizado Z-plataforma).
NOTA: asegúrese de que la temperatura es constante entre 20 y 23 ° C en la sala de microscopía. Una cámara de calentamiento-enfriamiento puede ser requerida en la platina del microscopio, especialmente cuando se utilizan mutantes termosensibles. - Identificar un grupo de embriones en etapas pre-morfogénesis utilizando el objetivo de 10X.
- Una vez localizado, deslice el objetivo de 10X y añadir una gota de aceite de inmersión en la diapositiva.
- Usando el objetivo 60X, identificar la parte superior y la parte inferior de embryos para configurar los parámetros de imagen Z-Stack.
NOTA: No dude en establecer la pila Z mayor que el espesor de los embriones. Establecer la distancia entre dos planos adyacentes como 0,8 micras. Esto permitirá que para cubrir la profundidad total de los embriones en 35 a 50 Z-planes.
NOTA: Si el microscopio contiene una plataforma xy automatizado, los embriones ubicados en diferentes lugares de la almohadilla se podrían registrar simultáneamente. Para ello, ficha coordenadas xy de cada ubicación en la almohadilla que se desea analizar durante el transcurso del experimento. Asegúrese de seleccionar la xy la hora de establecer el parámetro de grabación y seguir el resto del protocolo como se indica. Delgada Z-seccionamiento del embrión durante la grabación no se requiere necesariamente para las mediciones que se detallan en este protocolo. Grabación de desarrollo embrionario de los animales WT y mutantes con la máxima resolución sin embargo, es una buena práctica con el fin de construir una biblioteca de grabaciones capaces de apoyar los análisis adicionales. - Conjuntoel lapso de tiempo con intervalos de 2 min entre dos adquisiciones de duración de 8 horas.
NOTA: El tiempo de exposición dependerá de la intensidad de la luz establecido para el microscopio. el movimiento celular durante la elongación temprana es muy lento; la exposición a tiempo podría ser de aproximadamente un fotograma por segundo o menos. Si los embriones se encuentran en etapas tempranas (morfogénesis de intercalación dorsal, ventral del recinto), el alargamiento anticipada se registró dentro de 1 hora. Hacer obturación de luz esté cerrada entre cada adquisición. - Ejecutar la adquisición y guardarlo.
- Coloque la corredera montada en la platina de un microscopio. Asegúrese de que el microscopio está equipado con 10X y 60X objetivos, así como lentes de DIC, prisma, cámara y software de captura que permitan la microscopía de lapso de tiempo y la generación de Z-pilas (automatizado Z-plataforma).
- La medición de los defectos de elongación tempranas usando análisis de imagen
- El software ImageJ Fiji-abierta ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- En el menú seleccione Analizar / mediciones indicadas, seleccione perímetro. Para cada embrión, ajustar la barra Z-escala para centrarse en la faringe del embrión como se muestra en la Figura 2A. Esto asegurará que usted se centra en el centro del embrión. Para medir la longitud del embrión, ajustar la barra de escala de tiempo para que el embrión de interés en el inicio de la elongación temprano (etapa coma; Figura 2A). Tenga en cuenta el tiempo ( "Time-inicio").
- Elija la herramienta de línea segmentada. Dibujar una línea segmentada de la punta de la boca del embrión hasta la punta de la cola después de la línea media del embrión (Figura 2A). Uso de la pestaña del menú Analizar / Medida, obtener la longitud de la línea dibujada ( "principio de longitud").
- Repetir la medición para el mismo embrión al final de elongación temprano (momento en que comienzan los músculos de contratación). Tenga en cuenta el tiempo ( "Time-end") y medir la longitud del embrión ( "Largo-end"), como se detalla más arriba (Figura 2B).
- Calcular la duración (D) de la elongación temprana y el aumento de la longitud (L) durante esta etapa de la siguiente manera:
D = "Tiempo de fin" - "Time-inicio"
& #160; L = "Longitud de extremo" - "Longitud-inicio" - Para medir la anchura de la cabeza, ajustar la barra de escala de tiempo para tener un embrión en la fase de interés (etapa 1.2 veces o al final de elongación temprano). Elija la herramienta de línea recta. Dibuje la línea media transversal (eje dorso-ventral) de la cabeza. Esta sección es la parte más gruesa del embrión (Figura 2C). Mediante el menú Analizar / Medir, obtener la longitud de la línea correspondiente a la anchura de la cabeza.
- En el mismo punto de tiempo, repetir este paso dibujando la línea media transversal de la cola (línea media entre la válvula intestinal y la punta de la cola; Figura 2C) y medirlo para obtener el ancho de la cola.
NOTA: Use esta medida para comparar los embriones en la misma etapa a través de diferentes fenotipos. Para asegurar la reproducibilidad de esta medición, asegúrese de encontrar un lugar situado alrededor de la línea media de la cola del animal que puede ser reconocida fácilmente de un animal a unano ella. - Para el cálculo de la cabeza a anchura de la cola, se divide el ancho de la cabeza por la anchura de la cola.
2. Caracterización de defectos tardío de elongación usando análisis de imagen
- Sincronización de L1 larvas mediante tratamiento con hipoclorito alcalino
- A partir de una placa no hambre de 60 mm que contiene muchos adultos grávidas, recoger todos los gusanos en un tubo de microcentrífuga de lavado de los nematodos de la placa con 1 ml de tampón M9 con una pipeta Pasteur.
- nematodos sedimentario a 3.500 xg durante 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante utilizando una micropipeta sin perturbar el sedimento gusano.
- Añadir 1 ml de solución de hipoclorito a cada tubo (0,4 M de hipoclorito, NaOH 0,5 M) y agitar durante 3 min.
NOTA: La solución de hipoclorito alcalino y se deberá preparar y embriones de que esta solución debe agitarse suavemente pero de forma continua para optimizar la disolución de los adultos y la oxigenación de la EMBRyos. Después de 3 min de agitación, la mayoría de los adultos deben liberar sus huevos en la solución. - Giran a 3500 xg durante 3 min a temperatura ambiente y rápidamente eliminar el sobrenadante utilizando una micropipeta sin perturbar el sedimento.
- Lavar cuatro veces con 1 ml de tampón M9 seguido de centrifugación a 3500 xg durante 3 min.
- Después de que el cuarto de lavado, quitar los huevos sobrenadante y resuspender en 700 l de tampón M9 sin pipeteando arriba los huevos (como los huevos se pegarían al plástico de la punta).
- Tape el tubo en un agitador orbital 3-mm colocado en una incubadora a la temperatura de crecimiento apropiada y agitar a 600 rpm durante la noche.
- Medida de longitud de larvas Sincronizada
- Centrifugadora detenido larvas L1 a 3.500 xg durante 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Resuspender las larvas en 100 l de tampón de M9 y transferirlos a una almohadilla de agarosa usando una pipeta Pasteur (agarosa almohadillas deben preparand como se describe en la sección 1.1.2 a 1.1.8). Colocar un cubreobjetos sobre la almohadilla.
NOTA: La almohadilla no necesita ser sellado con goma de mascar para este experimento que involucra la adquisición corto. - Utilice un objetivo de contraste de fase y de iluminación 10 veces para medir la longitud de las larvas si se utiliza una cámara de alta resolución. Aumentar la intensidad de la luz para ser capaz de capturar imágenes en unos pocos milisegundos y por lo tanto obtener una imagen clara de las larvas (Figura 2D).
NOTA: Si bien las basuras de natación de las larvas se reducen por la almohadilla de agarosa, se siguen moviendo. Por lo tanto, la grabación rápida es esencial para obtener una imagen clara. - Abrir Fiji-ImageJ y repita el paso 1.3.1. Para medir la longitud de las larvas, seleccionar la herramienta de línea segmentada. Dibujar una línea segmentada de la punta de la cabeza hasta la punta de la cola siguiendo la línea media de las larvas (Figura 2D, panel derecho).
- Usando el menú Análisis / Medida se obtiene la longitud de lalínea trazada correspondiente a la longitud de las larvas en micrómetros.
- Centrifugadora detenido larvas L1 a 3.500 xg durante 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Resuspender las larvas en 100 l de tampón de M9 y transferirlos a una almohadilla de agarosa usando una pipeta Pasteur (agarosa almohadillas deben preparand como se describe en la sección 1.1.2 a 1.1.8). Colocar un cubreobjetos sobre la almohadilla.
3. Caracterización de defectos Late elongación mediante citometría de flujo
- Las larvas sincronizar
- Purificar embriones utilizando el tratamiento con hipoclorito alcalino tal como se describe en la sección 2.1 de platos llenos 100 mm de adultos jóvenes bien alimentados y dejar que la escotilla del embrión y la detención L1 en tampón M9 de 16 a 24 horas a 20 o 25,5 ° C dependiendo de la cepa analizado.
NOTA: Un plato lleno de adultos bien alimentados por la tensión es suficiente para el análisis se describe a continuación.
- Purificar embriones utilizando el tratamiento con hipoclorito alcalino tal como se describe en la sección 2.1 de platos llenos 100 mm de adultos jóvenes bien alimentados y dejar que la escotilla del embrión y la detención L1 en tampón M9 de 16 a 24 horas a 20 o 25,5 ° C dependiendo de la cepa analizado.
- Calibración del Clasificador de Gusano
NOTA: El citómetro de flujo se utiliza aquí es un flujo de partículas grandes citómetro (en lo sucesivo, el clasificador de gusano). El clasificador de tornillo sin fin incluye un láser de diodo de 670 nm de color rojo, que se encuentra frente a un detector de extinción. El clasificador de gusano también contiene un láser de argón de varias líneas para la excitación fluorescente. los sinstrumentos ORMA tienen tres tubos fotomultiplicadores detectores (PMT) de fluorescencia utilizados para detectar emisiones de fluorescencia en las regiones verde, amarillo y rojo del espectro. En el protocolo descrito aquí, TOF se utiliza para medir el tamaño de las larvas, el canal rojo será utilizado para identificar gusanos muertos que se tiñeron con yoduro de propidio (PI). GP (General Purpose) de alta fluorescencia de Control de Partículas utiliza para calibrar el instrumento y como control interno en nuestro experimento de visualización de alta fluorescencia de color verde, amarillo y rojo. Ellos serán los únicos objetos de la muestra analizada con alta emisión detectada en el canal verde y serán posteriormente identificado a partir de esta característica.
NOTA: Living animales se identifican en base a la ausencia de fluorescencia en el canal verde y rojo, así como en el TOF. emisión autofluorescente desde el intestino de las larvas no es detectable en la fase L1.- Encender el bloque de láser, el ordenador, el de un compresord el instrumento gusano clasificador. Pulse el botón START en el software clasificador de gusano abierto como se indica en el manual de instrucciones del instrumento.
- Observe la ventana emergente de control de láser de argón. Seleccione el modo RUN y espere a que las potencias de láser llegan a 10 ± 1 mW. Seleccione Listo en la ventana de control de láser.
- Establecer la vaina y las presiones de la muestra a 5,10 ± 0,02 y 5,51 ± 0,01, respectivamente. Deje que la presión se equilibre durante al menos 15 minutos y haga clic en la casilla de verificación Aceptar PRESIÓN.
NOTA: El caudal depende de la vaina y las presiones de la muestra. - Asegúrese de eliminar todas las burbujas presentes en los túbulos de canales de flujo entre la copa de muestra y la cámara de análisis. Para ello, haga clic en adquirir y golpee suavemente el túbulo hasta que se adquieren sin burbujas (como se ve en la ventana de adquisición).
- Configuración de todos los parámetros para la medición y detección de la siguiente manera fluorescente y TOF:
- Establecer las escalas de TOF, Ext, verde, amarillo y rojo de256. Conjunto de ganancia como se describe en la Tabla 1. Ajustar control de PMT a 700ºC durante verde y amarillo y 900 para Red.
NOTA: Dos filtros de excitación están disponibles (488 nm y 514 nm) y se pueden utilizar ya sea para excitar la proteína fluorescente verde (GFP) o la proteína fluorescente amarilla (YFP) o cualquier fluorocromos se excita a estas longitudes de onda con el láser de argón de líneas múltiples. filtros adecuados para que se inserta en la cámara de filtro del equipo. Se utilizó el filtro de 488 nm para el siguiente experimento.
- Establecer las escalas de TOF, Ext, verde, amarillo y rojo de256. Conjunto de ganancia como se describe en la Tabla 1. Ajustar control de PMT a 700ºC durante verde y amarillo y 900 para Red.
- Para calibrar el clasificador de tornillo sin fin, seleccione "partículas de control Ejecutar" en el menú de herramientas. Poner 20 ml de 1x GP (General Purpose) de alta fluorescencia Partículas de control en la taza (estas partículas son partículas fluorescentes de tamaño preciso, que se vende por el fabricante citometría de calibrar sus instrumentos).
- Haga clic en el botón ADQUISICIÓN para comenzar la vaina y el flujo de la muestra.
NOTA: Esperar una media relacionado con el control de la distribución de partículas de 21 ± 6 y acoefficient de variación en torno a esa media (CV) ≤11. Si el CV es> 11 y la media es> 27 intento de limpiar los túbulos haciendo clic varias veces en el botón limpio o con un movimiento rápido del canal de flujo.
- Adquisición de Animal TOF
NOTA: La luz dispersa cuando un objeto pasa por la celda de flujo entre la fuente láser y el detector de extinción. El tiempo que tarda la luz se disperse por el objeto volador (tiempo de vuelo, TOF) se utiliza para medir la longitud axial del objeto. La extensión de la luz enmascarada por el objeto (extinción, EXT) se utiliza como una medida de su opacidad densidad / óptico.- Colocar 10 l de tipo salvaje sincronizado (en peso) L1 en un vidrio de reloj y estimar el porcentaje de muertos-huevos usando un microscopio de disección.
NOTA: Sincronizado L1 presentan alta EMB (mayor que 20%) en peso no debe ser utilizado para un análisis adicional. - La transferencia sincronizada de L1 de la microcentrífuga (unaproximadamente 700 l de M9 que contiene L1) a un tubo cónico de 15 ml. Añadir yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 10 g / ml (dilución 1/100 de una solución madre 1 mg / ml) y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: los huevos y larvas muertas se tiñeron utilizando PI y detectados como objetos altamente fluorescentes utilizando el canal rojo. - Añadir 10 ml de tampón M9 para diluir las poblaciones de colores. Tomar 5 ml de las poblaciones diluidas y los diluir cuatro veces mediante la adición de 15 ml de M9. Coloque esta dilución en la copa de muestra.
- Ejecutar el flujo de la muestra por ACQUIRE pulsando y observar la velocidad de flujo.
NOTA: Con el fin de tener una medición precisa, el caudal debe mantenerse entre 15 y 25 objetos / seg. - Si es necesario, ajustar la cantidad de animales en la taza para alcanzar el caudal deseado.
NOTA: La voluntad velocidad de flujo depende de las presiones (de la vaina y de la muestra) que son constantes como se indica en 3.2.3 y de la concentración de i larvasn la copa. Si el caudal es mayor de 25 objetos / seg añadir un poco de memoria intermedia en la taza. Si es menor de 15 objetos / seg añaden L1 concentrada (de la etapa 3.3.3) en la taza. - Una vez que se alcanza la concentración apropiada de objeto, evaluar el volumen de la taza y añadir 1/4 º de este volumen en una solución de alta fluorescente GP Control de Partículas 4x.
- Ajustar el parámetro de compuerta y la clasificación. Para ello, haga clic en "apertura" en el menú y seleccione 'vs. TOF' y 'verde'. Haga clic en "Clasificación" en el menú y seleccione 'TOF vs' y 'Rojo'. Aparecerán entonces de apertura de puerta y los gráficos de clasificación tal como se muestra en la Figura 3A.
NOTA: Esto permitirá la visualización de las partículas de control (emisión en verde y rojo), animales muertos manchados por PI y las burbujas (emisión en rojo y no verde) y los animales que viven (sin emisión en canales ni verdes ni rojos) (Figura 3A ). - Ejecutar el experimento haciendo clic ACQUIRE.
NOTA: Para identificar pequeñas diferencias de tamaño entre las larvas, analizar alrededor de 10.000 objetos, por lo que alrededor de 8.000 animales. Detener el experimento y exportar los datos mientras que el formato .txt haciendo clic en GUARDAR.
- Colocar 10 l de tipo salvaje sincronizado (en peso) L1 en un vidrio de reloj y estimar el porcentaje de muertos-huevos usando un microscopio de disección.
- Medición del tamaño relativo de la vida de los animales en las poblaciones sincronizado
- Abra el archivo .txt utilizando un software capaz de gestionar grandes tablas de datos.
- A partir de los objetos analizados extraer los valores TOF asociados con partículas de control que se caracterizan por la emisión en el canal verde mayor de 100 unidades arbitrarias (este valor depende de los parámetros establecidos en la sección 3.2.5). Crear una nueva columna y lo llaman "partículas de control '. Crear una columna que contiene todos los otros objetos, excepto las partículas de control llamado "muestra". NOTA: la emisión de fluorescencia de las nuevas necesidades de lotes de partículas para ser verificada antes de iniciar las adquisiciones. Esto fijará el umbral de fluorescencia que permite la identificación departículas de control sobre L1.
- Para cada cepa analizada identificar la porción del experimento en el que la velocidad de flujo ha sido alterado (debido a la presencia de un tapón de huevos por ejemplo). Para ello:
- Trazar el TOF de partículas '' de control para cada muestra como un factor de tiempo (Figura 3B).
- Dibuje la línea de tendencia lineal utilizando la herramienta de línea de tendencia y mostrar la ecuación en el gráfico.
NOTA: El TOF de partículas de control debe ser constante en el tiempo (línea horizontal, Figura 3B). Teniendo en cuenta la ecuación de la línea de tendencia lineal trazada en los datos y = ax + b, asegúrese de que la 'a' valor es menor que el 10 -4. Todas las mediciones realizadas dentro de secciones de tiempo que muestra una ruptura en la alineación de las partículas de control deben ser retirados del análisis.
- La toma de embriones muertos y burbujas (de emisión superior a 15 en el rojo), así como los desechos pequeños y grandes tapones de huevo (TOF inferior a 10 y de altoer del 70, respectivamente) a partir de la medición "muestra".
- Trazar la distribución '' partículas de control para cada cepa analizada. Como se ve en la Figura 3C estas distribuciones deben superponer casi perfectamente. Esto asegura que las mediciones TOF obtenidos para diferentes cepas se pueden comparar. NOTA: normalización de elementos de muestra TOF sobre partículas de control pueden ser usados si las distribuciones de partículas de control en una muestra no se superponen con los de las muestras de control. TOF normalizado se calcula como sigue:
- Normalizar TOF para el genotipo G = (TOF muestra para G) / ( 'control de partículas' TOF promedio de G) x ( 'partícula de control "promedio TOF de peso), donde p es la muestra de control.
- Trazar la distribución de larvas TOF para cada cepa incluida la muestra de control, en nuestro caso, en peso de los animales (Figura 3D). Medir la media y el error estándar de la media (SEM) para cada población (
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Representative Results
Partida, con maletero y Jefe / Relación de la cola de ancho son métricas robustas.
Los protocolos descritos aquí se han utilizado con éxito para caracterizar la función de los reguladores y efectores de Rho GTPasas pix-1, pak-1 y dejar-502 durante la elongación temprano 7. Pix-1 y pak-1 código, respectivamente, para un factor de intercambio de guanina (GEF) y un efector específico para Rac / Cdc42 GTPasas y LET-502 códigos de un efector de RHO-1 7. En este estudio, se demostró que pix-1 y pak-1 para controlar la morfogénesis epidérmica durante la elongación temprano 7. Este estudio utilizó la cabeza y la anchura de la cola de medida métricas como demuestran, por primera vez, que las células situadas en la hipodermis emb anteriorRyo seguir diferentes programas morfogenéticas que aquellas ubicadas en su posterior 7. Para establecer la reproducibilidad y robustez de estas métricas, ancho de la cabeza se midió independientemente cinco veces en 12 embriones de tipo salvaje (wt) en la etapa de 1,2 veces. Las variaciones entre los cinco grupos diferentes de medición se compararon luego evaluaron mediante la prueba de Brown-Forsythe (utilizando el paquete estadístico R) revela diferencias significativas entre las mediciones (F- valor p de prueba> 0,5; Figura 4A) lo que sugiere que las mediciones de un grupo de embriones son reproducible. Evaluación de la reproducibilidad y de lote efectos asociados con estas mediciones se realiza a través de la medición de la anchura de la cabeza de embriones en peso en la fase de 1,2 veces a partir de imágenes 4D-DIC hecho en tres días diferentes (n = 12 embriones). A través de estos tres grupos de medida, la diferencia no fue significativamente diferente y no se encontraron efectos significativos de lotes para impactar la cabeza-wIDþ resultados de medición (prueba F de valor P> 0,5; Figura 4B).
Se obtuvieron resultados similares para las mediciones de la anchura de la cola y para mediciones realizadas en diferentes etapas de alargamiento temprano (datos no mostrados). Estos datos establecen la cabeza de ancho, la cola y la cabeza de ancho / anchura de la cola como métricas robustas para caracterizar los defectos de elongación tempranas.
La medición de la cabeza y la cola Ancho así como la longitud de los embriones Permite la caracterización de genes que controlan Elongación temprano a lo largo del eje anteroposterior del embrión.
La medición de la longitud de los embriones, así como la anchura de su cabeza y la cola se realizó en embriones de WT y mutantes que llevan nulo o termosensible fuerte pérdida de alelos de función para los genes que controlan la elongación temprano: pix-1 (gk416);pak-1 (ok448) y dejar-502 (7) sb118ts. Se midió la cabeza / cola (H / T) la relación de anchura de embriones WT y mutantes al principio (etapa 1.2 veces) y al final de la elongación temprano a temperaturas no permisivas (Figura 4C fuimos y panel de la derecha respectivamente). Mientras que al comienzo del alargamiento temprano no había cambio- o un H reducida / se observó relación T en pix-1, pak-1 y dejar-502 mutantes en comparación con los animales WT (etapa 1.2 veces, la Figura 2C, el panel izquierdo ), al final de elongación a principios de los tres mutantes mostraron una proporción significativamente más alta H / T de embriones en peso de (t-test p-valores <0,006; Figura 4C; panel derecho). Esto demostró que pix-1, pak-1 y let-502 embriones mutantes mostrar morfología anormal antero-posterior al final de elongación temprano. Un análisis más detallado comparando ancho de la cabeza y la cola anchura entrn etapa 1.2 veces y el final de la elongación temprano, usando los mismos parámetros de medición revelaron que el ancho de la cabeza es menos reduce en pix-1, pak-1 y dejar-502 mutantes mientras que la anchura de la cola reduce significativamente menor en los mutantes LET-502 sólo el 7. Esto reveló que let-502 controla los procesos morfogenéticos de manera similar a lo largo del eje antero-posterior del embrión, mientras que los procesos morfogenéticos pix-1 y pak-1 de control se presenta principalmente en la parte anterior del embrión 7. También se midió la diferencia de longitud entre los embriones en el extremo con respecto al comienzo de la elongación temprano (Figura 4D). Se encontró que el alargamiento temprano se redujo significativamente en pix-1, pak-1 y dejar-502 mutantes en comparación con peso lo que sugiere que la alteración de la morfogénesis anterior en PIX-1 y PAK-1 mutantes por sí sola es suficiente para reducir significativamente la elongation del embrión.
Protocolo 2 y 3 se utilizaron para evaluar la longitud de las larvas detenido en fondos WT y mutantes. La longitud de estas larvas se evaluó utilizando tanto análisis de imágenes (Protocolo 2) 7 y citometría de flujo (Protocolo 3; datos no publicados). Las mediciones de la longitud larvas utilizando los resultados del análisis de la imagen en las mediciones absolutas de la longitud de los animales en micrómetros en una robusta y altamente reproducible de forma (Figura 5A). Este análisis reveló que sincronizado pantalla larvas mutante redujo significativamente la longitud en comparación con wt (Figura 5A) 7. La medición de estas larvas utilizando el protocolo basado en citometría de flujo (Protocolo 3) dio resultados comparables (Figura 5B). Sin embargo, hay que señalar que el gran número de larvas medido usando el último enfoque aumentó significativamente la solidez estadística de la comparación genotipo (t - -valores de prueba p <10 -24). Sobre la base de estos resultados, el enfoque de la citometría de flujo puede ser una mejor opción sobre el análisis de imágenes con el fin de caracterizar los animales mutantes que exhiben defectos de elongación muy sutiles.
Figura 1. Preparación de una almohadilla de agarosa. A, Portaobjetos de microscopio colocado entre dos espaciadores toboganes cubiertos por dos capas de cinta adhesiva. B, la almohadilla de agarosa se cubre con otra diapositiva con el apoyo de los dos espaciadores-diapositivas. C, La forma final y las dimensiones de la almohadilla de agarosa después de cortar con una hoja de afeitar para adaptarse a la cubreobjetos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
g2.jpg "/>
. Figura 2. Medición de la temprana y defectos de elongación tardíos A - B, medición de la longitud de un embrión en la fase de coma (A) y al final de la elongación temprana (B). La línea roja, que se utiliza para medir los embriones se dibuja con la herramienta de línea segmentada de ImageJ. C, la cabeza y la anchura de la cola se miden en embriones a 1,2 veces la etapa (a la izquierda) y al final de la elongación temprano (a la derecha). Las flechas representan la localización de áreas medidas (modificado de Martin et al., 2014). Barra de escala:. 20 micras D, longitud de las larvas se mide para L1-larvas sincronizada. Panel derecho es una vista ampliada de la imagen capturada (izquierda). La línea roja se dibuja con la herramienta de línea segmentada de ImageJ. Se utiliza para medir la longitud de la larva. Barra de escala:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Medición de la longitud de Sincronizada larvas El uso de citometría de flujo. A, apertura de puerta y ventana de la clasificación de COPAS Biosort mostrando Verde y Roja de emisión de partículas de control, burbujas, muertos y los animales que vivían con respecto a su tiempo de vuelo (TOF ). B, TOF de partículas de control en diferentes puntos de tiempo para un experimento representativo. La pendiente de la función lineal de TOF en función del tiempo es de alrededor de 10 -5, lo que indica que TOF de partículas de control es constante en el tiempo durante todo el experimento. C, Distribución de partículas TOF de control expresados como porcentaje del valor máximo de las distribuciones. Distribuciones de partículas de control no normalizados y normalizados están representados por pak-1 (ok448). Otras distribuciones no están normalizados. D, distribución de TOF para la vidaanimales expresan como un porcentaje del valor máximo de las distribuciones. TOF no están normalizados en las partículas del control excepto pak-1 (ok448) como se indica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Pix-1, Pak-1 y LET-502 Mutants presentara alguna anomalía temprana de elongación. A - B, la reproducibilidad y robustez de evaluación de la cabeza de la anchura mediciones A, cinco mediciones independientes de la anchura de la cabeza para los embriones en peso a 1,2 veces la etapa (n = 12 embriones).. Los medios y las desviaciones estándar (barras de error) se indican. No significativas (ns) diferencias entre las mediciones se calcularon utilizando la prueba de Brown-Forsythe nosotros (ING paquete estadístico R) (F-test, p-valor> 0,5). B, Cabeza medida de ancho para los embriones en peso en tres días diferentes (n = 12 embriones). Los medios y las desviaciones estándar se indican también; no hubo diferencia significativa en la varianza entre las medidas (ns; Brown-Forsythe prueba F valor de p> 0,5) C, Distribuciones de anchura cabeza / cola en la etapa de 1,2 veces (panel izquierdo), al final de la primera. elongación (panel derecho) en peso, LET-502 mutantes (sb118ts) a 23 pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) y - 24 ° C. Tenga en cuenta que las madres de embriones let-502ts utilizados para este estudio fueron cultivadas a 25,5 ° C. D, Distribución de la elongación en peso, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) y dejar-502 (sb118ts) mutantes entre etapa coma y el inicio de la elongación tarde. Los caja de parcelas representan los valores mínimo, máximo, 25º, 50º (la mediana) y 75º percentiles de la población. * T-test p-valor <0,05, ** p-valor de la prueba t <0,006 (modificado de Martin et al., 2014). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) y L et-502 (sb118ts) Larvas defectos presentes longitud. A, Longitud de larvas medido en peso, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) y dejar-502 (sb118ts) animales midió usando análisis de imágenes (Protocolo 2). B, la longitud de las larvas relativa se mide utilizando citómetro de flujo ( Protocolo 3). Los números entre paréntesis corresponden al número de animales utilizados para THmediciones e. Medios de longitudes y error estándar de la media (SEM; las barras de error) se representan. T de Student-test valores p se indican (p). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe nuevas métricas para caracterizar principios y fases tardías de la elongación embrionario.
En la sección 1, el paso crítico es la posible presencia de bacterias en la plataforma. Los embriones se encierran herméticamente entre la almohadilla y el cubreobjetos durante la adquisición de imagen. Sellado de la corredera se requiere para evitar la desecación de los animales durante la adquisición que dura más de dos horas. Para nuestro conocimiento, ninguno de los selladores utilizados para montar almohadillas de agarosa entre portaobjetos y cubreobjetos son permeable al aire. En consecuencia, cuando está presente en la plataforma de una gran cantidad de bacterias (o embriones), pueden ser privados de oxígeno después de unas pocas horas que conducen a su muerte prematura. Tener embriones de tres veces - que corresponde a los embriones que son de 3 veces en longitud en comparación con los embriones no alargadas - grabadas junto con los embriones de interés será un buen indicador de posibles condiciones de hipoxia, ya que esos embriones dejarán de moverse en theicáscaras de huevo R en ausencia de oxígeno. No hay mediciones morfológicas deben realizarse en condiciones de hipoxia o en embriones muertos.
Otro paso importante cuando se utiliza la imagen de lapso de tiempo es la temperatura a la cual ocurre el desarrollo del embrión. Mutantes termosensibles se utilizan actualmente en C. elegans. El efecto biológico de cambio de temperatura puede ser inmediata o retardada en función de la vida media de la proteína y la naturaleza de la mutación su acarreos. En consecuencia, la temperatura a la que se expone el embrión debe ser constante en el tiempo y debe ser controlada por ventilación apropiada de la sala de microscopía o una cámara de calentamiento-enfriamiento en la platina del microscopio.
Sección 2 es dependiente de la sincronización de las larvas mediante tratamiento con hipoclorito alcalino. Bajo ciertas circunstancias, este tratamiento puede dar lugar a la letalidad embrionaria (Emb). Emb por encima del 20% de la población en peso sugiere una toxicidad elevada durante el tratamiento de hipocloritoción que pueda afectar negativamente a la morfogénesis. L1 sincronizada presentan alta Emb en el fondo en peso no debe ser utilizado para un análisis adicional. Esta restricción también se aplica al protocolo 3.
No se recomienda el uso de fármacos anestésicos para inmovilizar las larvas. Levamisol, en particular, inmoviliza el nematodo través de la inducción de la tetania muscular que tiende a reducir las larvas introducir un sesgo experimental. Si el tiempo de exposición no es lo suficientemente rápido como resultado de las limitaciones del microscopio, recomendamos reducir la motilidad de las larvas mediante el aumento de la concentración de la agarosa en la almohadilla y la reducción de la cantidad de líquido entre la almohadilla y el cubreobjetos. Se debe tener cuidado, sin embargo, no para desecar las larvas, ya que la desecación reducirá su tamaño.
En la sección 3, la medición de la longitud de las larvas utiliza la comparación de las tasas de flujo entre las muestras analizadas. Para ello, la distribución de las partículas de control tiene que ser comparojo. Si las distribuciones totalmente de superposición, el TOF (tiempo de vuelo) valores obtenidos para muestras correspondientes se puede comparar, si no, estos valores deben ser normalizado. La normalización de la muestra-TOF sobre partículas-TOF de control (como se detalla en 3.4.5.1) se ha utilizado con éxito como se muestra para pak-1 (ok448) (Figura 3C y Figura 5B). Se encontró longitud relativa de pak-1 (ok448) vs peso que sea similar en al menos 3 experimentos independientes con o sin normalización (datos no mostrados). Sin embargo, recomendamos, lo que confirma los resultados obtenidos con la normalización con los obtenidos sin él, especialmente cuando se comparan con las larvas pequeñas diferencias de tamaño. Cabe señalar que la medición de la longitud de las larvas mediante citometría de flujo proporciona una longitud en relación con una muestra de control, en este caso, en peso de las larvas en lugar de una longitud absoluta en micrómetros como para análisis de imágenes. Esto implica que las mediciones de experimentos independientes no puedencombinar menos de cálculo de relación tamaño en peso.
El tampón utilizado para la dilución en la copa de muestra tendrá un impacto en la tasa de flujo. Hemos observado que la memoria intermedia de vaina recomendado por el fabricante contiene detergente que aumenta la cantidad de burbujas generadas durante la adquisición. Usando tampón M9, que no contiene detergente, redujo significativamente la formación de burbujas, pero era menos eficaz en evitar el taponamiento de los huevos en los túbulos de la clasificadora, que afecta a la velocidad de flujo de muestras. taponamiento del huevo se detecta fácilmente durante la adquisición por una marcada disminución de la TOF observable de las partículas de control por unos pocos segundos seguido de un TOF- elevada también por un par de segundos. taponamiento del huevo también puede conducir a la obstrucción del canal y la detención completa del flujo de partículas (menos de 5 objetos por segundo). Si esto ocurre, haga clic en el botón limpia hasta que se restablezca la velocidad de flujo. Cualquier medida que se producen durante estos eventoss deben ser excluidos de los análisis de datos. tampón funda puede ser recomendado para los experimentos con cepas caracterizadas por altas tasas de huevos muertos.
La muestra y la vaina de presión (fijado en la etapa 3.2.3), puede cambiar (ligeramente) en el tiempo y debe ser ajustado manualmente durante todo el experimento con el fin de garantizar una velocidad de flujo muy constante. La reducción o aumento de la tasa de baja serán observables en el análisis de los resultados y el trazado de los TOF de partículas de control con el tiempo (Figura 3C). La reducción de la velocidad de flujo dará lugar a un aumento de los TOF promedio de partículas en el tiempo, mientras que un aumento de la velocidad de flujo dará lugar a la opuesta. La alteración de la velocidad de flujo tendrá un impacto negativo de la sensibilidad del método en la detección de pequeñas diferencias de tamaño entre las poblaciones de larvas.
Los métodos destinados a identificar los genes que controlan la elongación y que requieren la grabación microscopía de lapso de tiempo son generalmente altosLy consume tiempo y tedioso cuando fenotipificación varios genotipos. El enfoque basado en citómetro de flujo, mientras que requiere un equipo no está disponible para todos los laboratorios, es menos tiempo y por lo tanto más eficiente cuando varias cepas necesitan ser caracterizado. Este método también es más estadísticamente robusto en comparación con las mediciones utilizando análisis de imagen (evaluado mediante la prueba t de Student comparando las distribuciones de mutantes y WT TOF; Figura 5A y B). Este método puede ser entonces muy adecuado para las cepas que expresan defectos de elongación con baja expresividad / penetrancia.
Varios métodos utilizando citometría de flujo se han desarrollado en el pasado para medir la aptitud de los nematodos 9-12. Estos métodos utilizan animales dispensados en un placas de 96 pocillos y el módulo Reflex del gusano clasificador '. El módulo Reflex permite el análisis directo de la población de nematodos dispensada dentro de placas de 96 pocillos. Por consiguiente, estos métodos son capaces de CharacteRize cientos de condiciones por día y constituyen una forma robusta en la cual medir la aptitud de una población no sincronizada. Ellos son, sin embargo, no es apropiado para identificar pequeñas diferencias de tamaño entre L1 sincronizada. La medición de pequeñas diferencias entre las larvas L1 requiere la medición a través de un gran número de animales, que es incompatible con el uso de placas de 96 pocillos y del módulo Reflex que pueden caracterizar de manera eficiente 100 objetos en el más por pocillo. El método aquí descrito está diseñado para este fin, a expensas del rendimiento, que se reduce significativamente. Se permite la caracterización de 3 a 4 condiciones por hora una vez que el instrumento se calibra, que es una mejora marcada sobre el uso de análisis de imagen en el protocolo 2.
La medición de la relación cabeza y la cola ancho es el primer método que fue desarrollado para caracterizar los procesos morfogenéticos que se producen de forma desigual a lo largo del eje antero-posterior del embrión 7. Cuandoaplicado a los genes que se muestran para el control de la elongación a tiempo, estos métodos serán aclarar la distribución espacial de vías de control de la morfogénesis en esa etapa de señalización. La medición de la longitud de las larvas detenido utilizando análisis de imagen o citometría de flujo en combinación con la medición de la longitud de los embriones en el extremo de la elongación temprano permitirá la identificación de genes que controlan o bien alargamiento temprana o tardía o ambos con alta sensibilidad y precisión. Estos procedimientos pueden entonces contribuir significativamente a la comprensión futura de la regulación espacial y temporal de las vías de control de la elongación embrionaria en C. señalización elegans. Además, estos métodos también se pueden adaptar para estudiar las vías de señalización que controlan la longitud del cuerpo, tales como la insulina y el TGF-beta vías 13, 14 y crónica de la exposición a los contaminantes ambientales 15, 16. Estas mediciones se pueden realizar en diferentes etapas larvales o en adultos using variaciones menores de los Protocolos 2 y 3. Medir las diferencias de tamaño en L1 es más difícil con el clasificador de tornillo sin fin de objetos más grandes, como L3, L4 larvas o adultos. Protocolo 3 puede ser fácilmente adaptado para hacer estas mediciones.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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