Summary
技术描述于免疫染色在整个斑马鱼胚胎磷酸的表位，然后进行在小至初级纤毛细胞结构双色荧光共焦定位。用于固定和成像技术可以定义位置和特定蛋白质的外观或活化的动力学。
Abstract
细胞迅速增殖，基因的组织特异性表达和信令网络的出现表征所有脊椎动物的早期胚胎发育。即使在单个细胞 - - 动力学和信号的位置，在胚胎发育补充重要的发育基因的鉴定。免疫染色技术描述已被证明以限定小至初级纤毛结构的细胞内和整个动物的信号的动力学。使用激光扫描共聚焦显微镜复合固定，成像和图像处理技术可以在短短36小时内完成。
斑马鱼（ 斑马鱼 ）是谁寻求脊椎动物物种是负担得起的和相关的人类疾病进行研究调查一个理想的有机体。遗传击倒或击倒，必须通过实际的蛋白质产物的损失来确认。蛋白质丢失这样的确认可以使用这里描述的技术来实现。线索到信号通路，也可以通过使用与已经由磷酸化的翻译后修饰的蛋白反应的抗体破译。维护和优化表位的磷酸化状态，因此这一决定的关键，并通过该协议来实现的。
这项研究的发展和第一72小时期间介绍了技术修复的胚胎共定位的各种与在枯否囊泡（KV）纤毛相关的表位，肾脏和内耳。这些技术是简单的，不需要清扫，并可以在一个相对较短的时间内完成。焦投影图像堆栈成一个单一的形象呈现这些数据的有效手段。
Protocol
在此协议的斑马鱼程序已经批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在弗吉尼亚联邦大学。
1.试剂的制备
- 4％PFA / PBS中。在通风柜权衡，8g仲甲醛（PFA）。同时仍然在通风柜，溶解干燥的PFA在〜80毫升蒸馏H 2ö搅拌并加热至50℃。边搅拌，加3 - 新鲜的1N NaOH 10滴，直到PFA完全溶解，溶液澄清。从火上移开，并加入100 ml 2倍磷酸盐缓冲液（PBS）。带来体积至200毫升蒸馏水H 2 O冷却至室温，并在使用前确认的7.4 pH值。存放在4℃的暗，但用一个星期内。
- 用100％的甲醇，没有任何补充剂。使用95％乙醇而没有任何补充剂。
- 制备磷酸盐缓冲吐温（PBT）。补充磷酸盐缓冲盐水（PBS）的0.1％吐温-20。添加0。5mL的20％吐温-20原液至100毫升1×PBS中。存放在室温下。
- 制备磷酸盐缓冲的Triton-X（PBTx）。补充的PBS含有0.1％的Triton X-100。加入0.5毫升20％的Triton X-100的股票，以100毫升的PBS。存放在室温下。
- 准备10％NGS / PBTx。正常山羊血清（NGS）嵌段的非特异性结合位点。商店NGS中在-20℃等分试样。使用，将1ml加入9mL的PBTx。
- 制备50％甘油/ PBS中。混合2×PBS中，100％的甘油，完全相等的部分。存放在室温下。
2.胚胎固定
- 。（ 如 β-actin的：CAAX-GFP） 育种获得野生型（AB和WIK）或转基因胚胎通过自然交配。如果需要的话，注射用构建体或吗啉代胚胎，如所描述。15,16
- 提高胚胎。收集胚胎，并如所述在28.5℃下在0.003％1-苯基-2-硫脲（PTU）阻止色素沉着的存在下孵育17 p>
- 修正。当胚胎已达到所希望的发育阶段，18个， 麻醉用MESAB胚胎，删除尽可能多的系统中的水可能和补充新鲜4％PFA / PBS 3 - 在室温4小时。注：在时间少于20小时受精后（HPF），修复了之前dechorionation。在经过20 HPF倍，采用在解剖显微镜下2对细点镊子的前固定dechorionate。
- 简单地通过使胚胎通过重力而不离心沉降变化的解决方案。传输使用宽孔移液管的胚胎，如上所述。在加盖的微量离心管1.5毫升17变化的解决方案。
- 后固定剂后3 - 4小时，除去PFA / PBS中，用100％甲醇和存储替换在-20℃至少48小时。注：对于最大的P-钙调蛋白激酶-II免疫反应，限制总的甲醇储存时间为一个星期。
- 将最低10胚胎在上限1.5 ml离心管每个实验条件，并贴上标签。
- 允许胚胎定居。除去并弃去甲醇，并用含有0.5毫升递减的乙醇浓度的渐进洗涤再水化，如在接下来的步骤表示。每一步都是一个5分钟洗具摇摆。
- 这些5溶液逐步再水化：66％乙醇/ 33％PBTx，33％乙醇/ 66％PBTx，100％PBTx，100％PBTx（这是PBTx的第一重复），100％PBTx（这是第二个重复PBTx）。
- 删除最后PBTx洗。将0.5ml 10％NGS / PBTx。在室温下孵育至少1小时与温和的摇摆，然后取出并丢弃的解决方案。
- 通过在10％NGS / PBTx稀释制备一级抗体溶液。如果联合免疫，先用较高的亲和力抗体。在这项研究中，孵育稀释1小鼠抗乙酰化微管蛋白的单克隆抗体：500。对于为例即，如果有10个样品中，结合6微升股票抗体溶液用3毫升10％NGS / PBTx的，然后分发0.3ml的此到每个管中。
- 将0.5ml稀释的初级抗体与每个管浸入所有胚胎 - 0.2添加。在室温下伴随温和的摇摆O / N培养。
- 当天上午，删除和丢弃抗体溶液。将0.5ml 2％NGS / PBTx洗去多余的主要抗体。轻轻摇动5分钟。取下并丢弃的解决方案。重复两次。
- 暗淡顶灯和稀适当荧光标记的二抗在10％NGS / PBTx使得每个条件包含至少0.5毫升用小鼠抗微管蛋白乙酰化的第一抗体，使用绿色荧光染料的山羊抗小鼠IgG在1：500的稀释。
- 孵育次级抗体进行4小时以在室温下在黑暗中轻轻摇动。从现在起，处理样品下变暗的灯光，并在黑暗的容器孵化或在铝箔包装。
- 在温育结束时，除去并丢弃二级抗体溶液。将0.5ml 2％NGS / PBTx洗。轻轻摇动5分钟。取下并丢弃的解决方案。重复两次。
- 如果共免疫染色，来自不同物种比第一初级抗体获得第二初级抗体。在这些研究中，通过红色荧光染料缀合的山羊抗兔IgG二级抗体跟随兔子抗磷酸钙调蛋白激酶-Ⅱ抗体。
- 稀释兔抗磷酸钙调蛋白激酶-II抗体1:20。对于胚胎的各管，暂停0.3含10％NGS / PBTx，再加入15微升股票抗体溶液。
- 确保胚胎都沉浸和灯光会变暗。在黑暗中轻轻摇摆O / N孵育RT。
- 在昏暗的灯光上午，删除和丢弃抗体溶液。加入0.5毫升2-％NGS / PBTx。轻轻摇动5分钟。取下并丢弃的解决方案。重复两次。
- 保持顶灯暗，淡化相应的荧光conju足够门控的第二抗体，使每个条件包含至少0.5毫升在这项研究中，淡化红色荧光染料缀合的山羊抗兔IgG二级抗体（红色通道）1：500在10％NGS / PBTx。
- 孵育第二次级抗体进行4小时以在室温下在黑暗中轻轻摇动。
- 在此孵化，并在昏暗的灯光年底，捞出弃去二抗溶液。将0.5ml PBTx。轻轻摇动5分钟。取下并丢弃的解决方案。重复两次。商店在任PBTx或50％甘油/ PBS中根据成像过程。
4.共焦成像和处理
- 摩胚胎成像。将1 - 5胚胎在玻片上。创建主盖玻片并用在腔室的每一侧盖玻片片段滑动之间的腔室。通常，四＃1盖玻片被用来制造这些垫片堆栈而不封口。
注：没有安装介质是必要的。 - 使用100X油浸客观上使单个胚胎成焦点采用透射光。关闭灯光。打开共聚焦显微镜。确保适当的激光器（绿色和/或红色）开启和远程对焦附带从事。
- 打开共聚焦程序。在“采集栏，”选择合适的目标。在“XY基本”栏，点击1,024按钮设置的图像大小为1024。
- 在“激光器和探测器”栏，点击红色框488和568的绿色盒子打开激光器和探测器每个通道。针孔设置为中，并调整每个通道以可视化的“增益”栏的增益。
- 在“获取设置”栏中，单击“活着”开始采集图像。在“视图设置”栏中，取消选中“强制积分变焦”框中心“实时”窗口。
- 在“获取设置”栏中的“Z”选项卡下，逐步完成图像的图层。选择后，NU光学切片的MBER掺入到图象，将移动到某一点在z平面的“中心”。
- 在“Z”选项卡，单击红色的小“引用”对话框。这将归零RFA在选定为“中心”的地步。在标有“步长”的方框中，选择图层（0.25和2.0微米之间微米是理想的）厚度。需要注意的是“文件大小”框，并试图限制到1GB。
注意：通常情况下，可达0.5 40光学切片 - 为1.0μm而得到的，但可以根据经验来确定区段的数量。 - 要找到图像的顶部极端，点击旁边的圆圈为“top”，并通过Z轴移动图层。现在点击圆圈旁边的“底”，计算机将图像回层为中心。再次通过层移动到找到图像的底部极端。
- 点击在“获取设置”“活”再次框停止激光收购。在此面板中，单击标平均红色框和Z堆栈。这些框变成绿色。
- 在“获取设置”框中，单击“单次”收购整个系列的图像。因为它在两个信道，并通过在整个Z堆叠扫描可以监视进展情况。
- 若要保存，单击该卷窗口中，点击“另存为”，并命名该文件。另存为“.ids”文件。体积渲染文件，而Z堆栈仍然是开放的，选择数据下拉菜单，点击“批量渲染”。保存文件渲染为TIFF文件。这是本出版物中显示的投影图像。
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Representative Results
可视化的磷酸化表位条件最优
描述蛋白抗原决定簇在斑马鱼胚胎的免疫组化方法相比，通过原位杂交本地化的mRNAs一直比较稀疏。在定位在斑马鱼胚胎的纤毛细胞蛋白的表位使用的固定剂包括4％PFA / PBS中并登特的固定剂，它是甲醇和DMSO。19定位RNA的由整体原位杂交（WISH）的混合物中，通常使用的PFA实现接着存储在100％甲醇。20,21我们的研究，发现该WISH固定液组合，限制在甲醇中的时间到数天2至7之间时，是大大优于任何其他固定剂为与P钙调蛋白激酶-Ⅱ抗体免疫定位。与此PFA /甲醇的组合取得的信号是ALS□当登特的固定剂，4％PFA / PBS或甲醇中单独使用，这取决于对胚胎内发育时间和位置比显著更大。
当优化这里使用的每个固定剂和发育时间中描述的技术，制备对照样品，其中所有的步骤都接着，除了将初级抗体被删去。当上述相同的条件下成像的这样的对照样品缺乏荧光信号。这种控制建议其他研究者复制与任何抗体这种方法。
的PFA /甲醇固定液组合产生的最强的P-钙调蛋白激酶-Ⅱ信号和也与免疫染色对乙酰微管蛋白，这是纤毛标准标记兼容。发育，第一纤毛的器官，并出现在这些研究中已经成像是枯否囊泡（KV）。对KV位于脊索的后端作为在12体节（15 HPF）阶段（图1）所示。对KV是一个短暂的器官，并负责左右不对称。它出现在2体节阶段（12 HPF）和周围的18体节阶段消失。跳动初级纤毛产生流体的循环流动，从而导致钙离子的纤毛细胞衬KV和钙调蛋白激酶-Ⅱ在离散位置的活化（图1）的正视图。 P-钙调蛋白激酶-II的反应出现，只要纤毛跳动。12上的 KV的一侧消失在这个早期阶段，总胚胎钙调蛋白激酶-II水平仍然只有一半的水平在24高倍视野和水平的十分之一在发展的3天。11也许是因为总钙调蛋白激酶-II表达是在15 HPF相对较低，在此阶段中的免疫染色技术的任何改进是特别重要的。
Betwe烯24和72 HPF发展，P-钙调蛋白激酶-II的显示纤毛细胞衬pronephric管（ 图2,3）的特定区域的顶端表面上。总钙调蛋白激酶-Ⅱ沿着整个pronephric导管和整个相邻体节（图2）的免疫反应性表明，只有胚胎钙调蛋白激酶-II的一个子集被激活（P-钙调蛋白激酶-II）。
固定条件为，在保留绿色荧光兼容
这些固定技术也与保持绿色荧光蛋白（GFP）的荧光没有增强的（图3）兼容。在GFP标记钙调蛋白激酶-Ⅱ构造是在该图中使用的，GFP保持足够的荧光虽然PFA /甲醇固定和随后的免疫染色。在细胞衬pronephric管的高倍率视图（图3），第ËGFP-钙调蛋白激酶-II的马赛克表达可以在也被免疫染色P-钙调蛋白激酶-II细胞进行查看。
斑马鱼胚胎的耳朵是另一种组织中钙离子的升高，通过钙调蛋白激酶-II作用，影响了它的发展。14斑马鱼的耳朵通常出现在各地的人的发展。此时，钙调蛋白激酶-Ⅱ是强烈的kinocilia的基部和在沿着kinocilium（图4）较低水平激活。这组图像显示，该固定和免疫定位技术可以检测纤毛内染色，一个结构，其横截面小于1微米。这些纤毛保持整个固定和染色过程中的结构。
在发展的稍后时间内耳双色复染的附加 例子是由染色与两个的Alexa 488取得鬼笔环肽和抗乙酰微管蛋白，随后通过一个Alexa 568标记的第二抗体（图5）。值得注意的是，在PFA /甲醇固定方法保留两个F-肌动蛋白和微管蛋白，这是不是所有的固定剂的真。本实施例中被示为用于整个耳朵合并彩色图像，然后为子区域。14
双色复染的最后代表例用其生产的用膜定位的GFP（图6）的胚胎鱼的菌株来实现。膜靶向GFP没有连接到任何其它蛋白质，当用甲醇提取，因此是从分别单独固定的PFA鱼获得该图像丢失。这一结果表明，甲醇处理提取的膜，因此不建议可能只膜结合蛋白。在该图中的P-钙调蛋白激酶-Ⅱ信号相对被减小到实现如果甲烷醇也使用，但是这表明在胚胎发育的阶段和位置（肾）中，信号是足够强无甲醇处理来进行检测。这不是在对KV阶段真; 即 ，甲醇，需要进行可视化的P-钙调蛋白激酶-II的免疫染色。这个例子只显示一个合并图像，其中肾脏的pronephric管道毗邻躯干肌。
总之，这里所描述的PFA /甲醇固定方法是用GFP的保存，并与染色F-肌动蛋白，微管蛋白乙酰化，总钙调蛋白激酶-Ⅱ和P-钙调蛋白激酶-II的兼容。
图1，P- 钙调蛋白激酶-II复染乙酰化微管蛋白（纤毛）斑马鱼KV。一单活12体节期的浏览次数（12 SS）胚胎由AR揭示了KV的位置后rowhead（侧位片，A）和框内的圆（腹面，B）。在这个阶段胚胎固定使用PFA /甲醇。胚胎免疫染色微管蛋白乙酰化后跟一个Alexa 488 -标记的第二抗体（绿色通道）。接着，对P-钙调蛋白激酶-II中的兔多克隆抗体，随后通过一个Alexa 568-标记的第二抗体（红色通道）。如在逐渐升高的放大倍率（C，D）中描述的被收购双通道荧光图像投影。比例尺= 10微米。这个数字从先前公布修改。12 ，请点击这里查看本图的放大版本。
图2 P-钙调蛋白激酶-II的复染为沿斑马鱼肾总钙调蛋白激酶-II在30 HPF单dechorionated胚胎使用PFA /甲醇固定。然后胚胎染色总钙调蛋白激酶-II后跟的Alexa 488标记的第二抗体（绿色）。接着，在P-钙调蛋白激酶-Ⅱ初级抗体随后的Alexa 568标记的第二抗体（红色）。染色揭示了活化钙调蛋白激酶-Ⅱ沿该行的pronephric斑马鱼肾而总钙调蛋白激酶-Ⅱ的管道在整个肌节相邻的肌肉组织和体节的界限富集细胞的顶表面上的富集（红色）。比例尺= 50微米。这些图像是在比在文本以便看到整个肾脏中描述了一种低倍率获得的。这个数字从先前公布修改。13 ，请点击这里查看本图的放大版本。
图3，P- 钙调蛋白激酶-II柜台成像的GFP斑马鱼中的肾细胞。这30 HPF胚胎用基因编码显性负GFP-钙调蛋白激酶-II 13这样的注射通常显示马赛克表达注射。使用PFA /甲醇胚胎固定，然后用一个Alexa 568标记的第二抗体进行免疫染色用于P-钙调蛋白激酶-II成像显示，GFP一直持续到PFA /甲醇固定，补液，阻塞和染色。比例尺= 10微米。这个数字从先前公布修改。13 ，请点击这里查看本图的放大版本。
图4 P-钙调蛋白激酶-II复染与微管 蛋白乙酰化斑马鱼的内耳。这30 HPF胚胎使用PFA /甲醇固定。抗乙酰化微管蛋白抗体通过了Alexa 488标记的第二抗体中，P-钙调蛋白激酶-Ⅱ抗体和Alexa 568标记的第二抗体，以便遵循。染色揭示了P-钙调蛋白激酶-II是沿内耳纤毛存在并与乙酰化微管蛋白共定位。比例尺=5μm以下。这个数字从先前公布修改。14 ，请点击这里查看本图的放大版本。
图5. 肌动蛋白和乙酰化微管蛋白斑马鱼内耳。一个三日龄（72 HPF）斑马鱼胚胎是固定的免疫染色乙酰化Ťubulin使用的Alexa 568标记的第二抗体，随后使用的Alexa 488鬼笔环肽的肌动蛋白可视化。纤毛以及耳的轴突神经支配由乙酰化微管蛋白揭示（红色）和F-肌动蛋白的结构包括肌肉纤维（绿色）。斑马鱼耳的两个纤毛感官区域示于更详细地：前黄斑（点）和后嵴（PC）。比例尺= 10微米。这个数字从先前公布修改。14 ，请点击这里查看本图的放大版本。
图6 P- 钙调蛋白激酶-II柜台为成像GFP膜斑马鱼肾脏这种单一的合并图像，其中β-actin的：CAAX-GFP胚胎（30 HPF）固定和染色P-CaMK-二后跟的Alexa 568标记的第二抗体。染色揭示了活化钙调蛋白激酶-Ⅱ沿该行的pronephric斑马鱼肾的导管细胞的顶表面上的富集（红色）。这些肾导管细胞被坐落只是肌肉组织的下面，并都通过膜靶向GFP表达（绿色）标记的。比例尺= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
煤灰/甲醇方法，在这个实验室使用斑马鱼发育期间优化磷酸-T 287 -CaMK-II型表位的免疫定位的主要目的开发的。这种方法的几个纤毛器官，包括斑马鱼KV，12内耳14和肾脏。13特别是在对KV阶段，这种技术是必要的形成过程中成功地本地化的P-钙调蛋白激酶-II该方法的成功可能是由于一个）的自体荧光的最小化，b）该磷钙调蛋白激酶-II型表位的保存和c）的表位的抗体的提高可访问的组合。
这种方法的一个主要限制因素是存储在甲醇中的时间。而P钙调蛋白激酶-Ⅱ的免疫反应性是后在-20℃在甲醇2天最大，此表位的反应性存储在甲醇中一周后丢失。目前尚不清楚是否此时的磷酸基是HYdrolyzed或发生进一步的变性降低免疫反应。在-20℃的甲醇/ EGTA是早期胚胎的发育过程中保留富含微管蛋白结构的传统快速固定剂22然而，单独的甲醇是不希望的用于保存的形态，甚至结构如肌动蛋白细胞骨架，并且必须由前面PFA。
这种方法的另外的优点是，它也保留其它表位，如F-肌动蛋白和微管蛋白乙酰化和未消除的GFP的天然荧光。其他的固定剂，如登特的固定液，均优于其他13表位，并保持与P-钙调蛋白激酶-II染色兼容，虽然P-钙调蛋白激酶-II染色是在登特的固定液比PFA /甲醇弱。由于磷酸化蛋白质在信令早期发育过程中是活动的途径盛行，登特的固定液和PFA /甲醇推荐两个固定剂在瑞伯其他磷酸表位rafish胚胎。在发展与该技术对其它蛋白及其抗体的应用，它已经有帮助的，同时也是反应活性上免疫印迹的抗体并已克隆和过表达与抗体可以验证蛋白质。12
值得优化技术免疫定位，因为它一个）可以在蛋白质水平证实基因抑制和b）使得能够动作的模型的开发努力。在该实验室，这些试验的结果已经允许的模型，通过该钙调蛋白激酶-II功能的制剂。例如，其在对KV位置是短暂的，不对称的，像这样的机构的作用。在肾，其上pronephric导管细胞的顶边的位置表明，从导管的信号作出反应的作用。最后，在特定激烈泪点的这种酶在耳kinocilia的底部的活化表明的局部的 Ca 2+信号。此处所描述的方法也应该是谁寻求获得在两种荧光通道任何胚胎细胞类型的高清晰度图像的任何研究者有用。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由美国国家科学基金会资助IOS-0817658的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
| Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
| Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| anti-acetylated α-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
| anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
| anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
| Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
| Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
| Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1 ml tubes, store in freezer |
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10x stock solution or made in lab |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at RT |
| Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
| C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |
References
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