Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Immunofarvning phospho-epitoper i cilierede organer Whole Mount zebrafisk embryoer

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53747
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Summary

Teknikker beskrives at immunfarve phospho-epitoper i hele zebrafisk embryoner og derefter foretage tofarvet fluorescerende konfokal lokalisering i cellulære strukturer så små som primær cilier. Teknikkerne til fastgørelse og billeddannelse kan definere placeringen og kinetik for udseende eller aktivering af specifikke proteiner.

Abstract

Den hurtige spredning af celler, væv-specifikke ekspression af gener og fremkomsten af ​​signalering netværk karakterisere tidlige embryonale udvikling af alle hvirveldyr. De kinetik og placering af signaler - selv inden for enkelte celler - i udviklingslandene embryo supplerer kortlægge vigtige udviklingsmæssige gener. Immunofarvning teknikker er beskrevet som har vist sig at definere kinetikken for intracellulære og hele dyret signaler i konstruktioner så små som primær cilier. De teknikker til fastsættelse, billedbehandling og behandling af billeder ved hjælp af en laser-scanning konfokal sammensat mikroskop kan være afsluttet i så få som 36 timer.

Zebrafisk (Danio rerio) er en ønskelig organisme til efterforskere, der forsøger at gennemføre undersøgelser i et hvirveldyr, der er overkommelig og relevante for human sygdom. Genetiske udslagsblanketter eller knockdowns skal bekræftes af tabet af den faktiske proteinprodukt. Denne bekræftelse af protein tabkan opnås ved anvendelse af teknikkerne beskrevet her. Spor i signalveje kan også tydes ved anvendelse af antistoffer, der er reaktive med proteiner, der er blevet posttranslationelt modificeret ved phosphorylering. Bevarelse og optimere det phosphorylerede tilstand af en epitop er derfor afgørende for denne beslutsomhed og opnås ved denne protokol.

Denne undersøgelse beskriver teknikker til at fastsætte embryoner i første 72 timer af udvikling og samarbejde lokalisere en række relevante epitoper med cilier i Kupffer s vesikel (KV), nyren og det indre øre. Disse teknikker er ligetil, kræver ikke dissektion og kan afsluttes i et relativt kort tidsrum. Projektering konfokal billedstakke til et enkelt billede er et nyttigt middel til at præsentere disse data.

Protocol

De zebrafisk procedurer i denne protokol er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Virginia Commonwealth University.

1. Fremstilling af reagenser

  1. 4% PFA / PBS. Afvej 8 g paraformaldehyd (PFA) i stinkskab. Mens stadig i stinkskab, opløse tør PFA i ~ 80 ml ​​destilleret H2O under omrøring og opvarmning til 50 ° C. Under omrøring tilsættes 3 - 10 dråber frisk 1N NaOH, indtil PFA er fuldstændigt opløst og opløsningen bliver klar. Fjern fra varmen og tilsæt 100 ml 2x phosphatbufret saltvand (PBS). Der fortyndes til 200 ml med destilleret H2O Der afkøles til stuetemperatur og bekræft pH på 7,4 før anvendelse. Opbevares i mørke ved 4 ° C, men brug inden for en uge.
  2. Brug 100% methanol uden eventuelle tillæg. Brug 95% ethanol uden eventuelle tillæg.
  3. Forbered phosphatpufret Tween (PBT). Supplement phosphatbufret saltvand (PBS) med 0,1% Tween-20. Tilføj 0.5 ml af en 20% Tween-20 stamopløsning til 100 ml 1x PBS. Opbevar ved stuetemperatur.
  4. Forbered phosphatpufret Triton-X (PBTx). Supplere PBS med 0,1% Triton X-100. Tilsæt 0,5 ml af en 20% Triton X-100 lager til 100 ml PBS. Opbevar ved stuetemperatur.
  5. Forbered 10% NGS / PBTx. Normalt gedeserum (NGS) blokerer ikke-specifikke bindingssteder. Store NGS i alikvoter ved -20 ° C. For at bruge, tilsættes 1 ml til 9 ml PBTx.
  6. Forbered 50% glycerol / PBS. Bland grundigt lige dele af 2x PBS og 100% glycerol. Opbevar ved stuetemperatur.

2. Embryo Fiksering

  1. . (. Fx β-actin: CAAX-GFP) Avl Opnå vildtype (AB og WIK) eller transgene embryoner gennem naturlige parringer. Hvis det ønskes, injicere embryoner med konstruktioner eller morpholinos, som beskrevet. 15,16
  2. Hæv embryoner. Saml embryoner og inkuberes ved 28,5 ° C i nærvær af 0,003% 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU) for at blokere pigmentering som beskrevet. 17 p>
  3. Fix. Når embryoner har nået den ønskede udviklingsstadiet, 18,   bedøver embryoner under anvendelse MESAB, fjerne så meget ordning vand som muligt, og der tilsættes frisk 4% PFA / PBS i 3 - 4 timer ved stuetemperatur. BEMÆRK: Til tider mindre end 20 timer efter befrugtning (HPF), fix før dechorionation. Til tider efter 20 HPF, dechorionate før fiksering bruger to par fine point tang under et dissektionsmikroskop.
  4. Ændring løsninger. Overfør embryoner ved hjælp af en bred boring pipette, som beskrevet. 17 Skift løsninger i 1,5 ml udjævnede mikrocentrifugerør, blot ved at lade embryoner at bosætte af tyngdekraften uden centrifugering.
  5. Post-fiksativ Efter 3 -. 4 t, fjerne PFA / PBS, erstatte med 100% methanol og opbevares ved -20 ° C i mindst 48 timer. BEMÆRK: maksimal P-CaMK-II immunreaktivitet, begrænser total methanol opbevaringstid til en uge.
"> 3. Immunfarvning Whole Embryoner

  1. Placer mindst 10 embryoner for hver eksperimentel tilstand udjævnede 1,5 ml mikrocentrifugerør, og mærke dem.
  2. Lad embryoner at bosætte. Fjern og kassér methanol og rehydrere med progressive vaske indeholdende 0,5 ml faldende koncentrationer af ethanol, som angivet i det næste trin. Hvert trin er en 5 min vask med vuggende.
  3. Gradvist rehydrere med disse 5 opløsninger: 66% ethanol / 33% PBTx, 33% ethanol / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (dette er den første gentagelse af PBTx), 100% PBTx (dette er den anden gentagelse af PBTx).
  4. Fjern sidste PBTx vask. Tilsæt 0,5 ml 10% NGS / PBTx. Der inkuberes i mindst 1 time ved stuetemperatur under forsigtig vipning og derefter fjerne og kassere opløsning.
  5. Forbered primære antistofopløsning ved fortynding i 10% NGS / PBTx. Hvis co-immunfarvning, bruge højere affinitet antistof først. Til denne undersøgelse inkuberes med muse-anti-acetyleret tubulin monoklonalt antistof fortyndet 1: 500. For example, hvis der er 10 prøver, kombinerer 6 pi af bestanden antistofopløsning med 3 ml 10% NGS / PBTx og derefter distribuere 0,3 ml af denne i hvert rør.
  6. Tilsæt 0,2 - 0,5 ml af det fortyndede primære antistof til hvert rør for at fordybe alle embryoner. Inkuber under forsigtig vipning O / N ved stuetemperatur.
  7. I morgen, fjerne og kassere antistof løsning. Tilsæt 0,5 ml 2% NGS / PBTx at vaske væk overskydende primære antistof. Forsigtigt rocke i 5 min. Fjern og kassér løsning. Gentag to gange.
  8. Dim loftslampe og fortyndes passende fluorescens-konjugeret sekundært antistof i 10% NGS / PBTx således at hver betingelse indeholder mindst 0,5 ml. Med muse-anti-acetyleret tubulin primære antistof, bruge grøn-fluorescerende farvestof ged anti-mus IgG ved en 1: 500 fortynding.
  9. Inkuber sekundært antistof i 4 timer under forsigtig vipning ved stuetemperatur i mørke. Fra nu af proces prøverne under nedtonet lys og inkuberes i en mørk beholder eller ved indpakning i alufolie.
  10. Ved slutningen af ​​inkubationen fjernes og kasseres det sekundære antistof opløsning. Tilsæt 0,5 ml 2% NGS / PBTx at vaske. Forsigtigt rocke i 5 min. Fjern og kassér løsning. Gentag to gange.
  11. Hvis co-immunfarvning opnå det andet primære antistof fra en anden art end den første primære antistof. I disse undersøgelser følg kanin-anti-phospho CaMK-II-antistof af røde fluorescerende farvestof-konjugeret gede anti-kanin IgG sekundært antistof.
  12. Fortynd kanin-anti-phospho CaMK-II-antistof 1:20. For hvert rør af embryoner, suspendere 0,3 ml 10% NGS / PBTx, tilsæt derefter 15 pi af bestanden antistof løsning.
  13. Sørg for, at embryoner er nedsænket og lys er nedtonet. Inkuber under forsigtig vipning O / N ved stuetemperatur i mørke.
  14. Om morgenen under dæmpet lys, fjerne og kassere antistof løsning. Tilsæt 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Forsigtigt rocke i 5 min. Fjern og kassér løsning. Gentag to gange.
  15. Hold loftslampe dim og fortyndes nok af det passende fluorescens-conjugated sekundært antistof, således at hver tilstand indeholder mindst 0,5 ml. I denne undersøgelse fortyndes den rød-fluorescerende farvestof-konjugeret gede anti-kanin IgG sekundært antistof (rød kanal) 1: 500 i 10% NGS / PBTx.
  16. Inkuber andet sekundært antistof i 4 timer under forsigtig vipning ved stuetemperatur i mørke.
  17. Ved afslutningen af ​​denne inkubation og under dim lys, fjerne og kassere det sekundære antistof løsning. Tilsæt 0,5 ml PBTx. Forsigtigt rocke i 5 min. Fjern og kassér løsning. Gentag to gange. Opbevares i enten PBTx eller 50% glycerol / PBS afhængigt af imaging procedure.

4. Konfokal Imaging og behandling

  1. Mount embryoner til billeddannelse. Placer 1 - 5 embryoer på en glasplade. Skabe et kammer mellem de vigtigste dækglasset og objektglasset under anvendelse dækglas fragmenter på hver side af kammeret. Typisk fire # 1 dækglas bruges til at gøre disse spacer stakke uden forsegling.
    BEMÆRK: Ingen montering medium er nødvendig.
  2. Brug en 100X nedsænkning oliemålsætning at bringe enkelt embryo i fokus ved hjælp transmitteret lys. Sluk lys. Tænd konfokalt mikroskop. Sikre, at relevante lasere (grønne og / eller røde) er tændt og remote fokus accessary er engageret.
  3. Tænd for konfokal program. I "Hent bar," vælge den korrekte mål. I "XY Basic" bar, sæt billedstørrelsen til 1024 ved at klikke på knappen 1024.
  4. I "Laser og Detector", klik på den røde 488 boksen og den grønne 568 boksen for at aktivere laser og detektor for hver kanal. Indstil pinhole til medium og justere forstærkningen i "Gain" bar for hver kanal at visualisere.
  5. I "Acquire Indstillinger" bar, klik på "live" for at begynde at erhverve billeder. I "Vis indstillinger" bar, fjerne markeringen i feltet "Gennemtving Integral Zoom" til center i "Live" vinduet.
  6. I "Acquire Indstillinger" bar, under fanen "Z", trin gennem lagene af billedet. Efter valg af number af optiske sektioner til at optage i billedet, flytte til et tidspunkt i "midten" af z-planet.
  7. Under fanebladet "Z", klikke på det lille røde boks "Reference". Dette vil nulstille RFA ved valgt som "center" punkt. I feltet "Step Size", vælge tykkelsen af ​​lagene (mellem 0,25 um og 2,0 um er ideel). Vær opmærksom på feltet "File Size" og forsøge at begrænse til 1 GB.
    BEMÆRK: Typisk op til 40 optiske sektioner på 0,5 - 1,0 um opnås, men antallet af sektioner kan bestemmes empirisk.
  8. For at finde den øverste ekstreme af billedet ved at klikke på cirklen ved siden af ​​"Top" og bevæge sig gennem z lag. Klik nu på cirklen ved siden af ​​"Bottom", vil computeren tage billedet tilbage til laget som centrum. Igen bevæger sig gennem lagene for at finde den nederste ekstreme af billedet.
  9. Klik på "Live" igen i "Acquire Settings" boksen for at stoppe laserenerhvervelse. I dette panel, skal du klikke på de røde kasser mærket Average og Z-stack. Disse bokse bliver grønt.
  10. I boksen "Acquire Indstillinger", klik på "Single" at erhverve hele serier af billeder. Du kan overvåge fremskridt, som den scanner i begge kanaler og gennem hele z-stak.
  11. For at gemme, klik på vinduet volumen og klik på "gem som" og navngive filen. Gem som en ".ids" fil. Til volumen gør filen, mens z-stakken er stadig åben, skal du vælge Data rullemenuen og klik på "volumen gengive". Gem gengives fil som en tiff-fil. Dette er det projicerede billede, der er vist i denne publikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optimale betingelser til visualisering phospho-epitoper

Metoder, der beskriver immunlokalisering af protein-epitoper i zebrafisk embryoner har været relativt sparsomme i forhold til dem til lokalisering mRNA via in situ hybridisering. Fikseringsmidler anvendes i lokalisering proteinepitoper i cilierede celler af zebrafisk embryoner har inkluderet 4% PFA / PBS og Dent fiksativ, som er en blanding af methanol og DMSO. 19 Lokalisering af RNA ved hele mount in situ hybridisering (WISH) opnås typisk ved anvendelse af PFA efterfulgt af opbevaring i 100% methanol. 20,21 Vores undersøgelser viste, at WISH fiksativ kombination, når begrænse den tid i methanol til mellem to og syv dage, var langt overlegen i forhold til enhver anden fiksativ i immunlokalisering med P-CaMK-II-antistof . Signalet opnået med denne PFA / kombination methanol var also signifikant større, end når Dent fiksativ, 4% PFA / PBS eller methanol blev anvendt alene, afhængigt af den udviklingsmæssige tidspunkt og placering i embryoet.

Når optimere teknikken beskrevet her og for hver fiksativ og udviklingsmæssige tidspunkt anvendes, blev en kontrolprøve fremstilles, i hvilket blev fulgt alle trin, bortset fra at det primære antistof blev udeladt. Sådanne kontrolprøver manglede en fluorescerende signal, når afbildet under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. anbefales Denne kontrol for andre efterforskere replikerer denne tilgang med nogen antistof.

Den / methanol fiksativ kombination PFA gav den stærkeste P-CaMK-II signal og var også kompatibel med immunfarvning for acetyleret tubulin, som er en standard markør for cilier. Udviklingsmæssigt, den første cilierede organ, der opstår, og er afbildet i disse studier er Kupffer s vesikel (KV). KV er placeret ved den bageste ende af rygstrengen som vist ved 12 somit (15 HPF) fase (figur 1). Den KV er en forbigående orgel og er ansvarlig for venstre-højre asymmetri. Det fremgår i 2-somit fase (12 HPF) og forsvinder omkring 18-somit fase. Slå primære cilier generere en cirkulær strømning af fluidum, hvilket fører til en stigning af Ca2 + i de cilierede celler, der beklæder KV og aktiveringen af CaMK-II i diskrete steder (figur 1). P-CaMK-II reaktivitet vises og forsvinder på den ene side af KV, så længe cilier er at slå. 12. På dette tidlige stadium, i alt embryonale CaMK-II niveauer er stadig kun halvdelen af niveauet som ved 24 HPF og en tiendedel af niveauet ved 3 dages udvikling. 11. Måske fordi alt CaMK-II-ekspression er relativt lav ved 15 HPF, enhver forbedring i immunfarvning teknik på dette trin er særligt vigtigt.

betweda 24 og 72 HPF af udvikling, synes P-CaMK-II på den apikale overflade af cilierede celler foring specifikke regioner af de pronephric kanaler (fig 2,3). Immunoreaktiviteten af samlet CaMK-II langs hele pronephric kanalen og i sammenhængende somitter (figur 2) viser, at kun en delmængde af embryonale CaMK-II aktiveres (P-CaMK-II).

Fiksering betingelser er forenelige med Bevarelse GFP Fluorescens

Disse fiksering teknikker er også kompatible med fastholdelse grønt fluorescerende protein (GFP) fluorescens uden forøgelse (figur 3). I GFP-mærkede CaMK-II konstruktion, der bruges i denne figur GFP bibeholder tilstrækkelig fluorescens selvom PFA / methanol fiksering og efterfølgende immunfarvning. I en stor forstørrelse visning af celler, der beklæder pronephric kanalen (figur 3), the mosaik ekspression af GFP-CaMK-II kan ses i celler, der er også blevet immunofarvede for P-CaMK-II.

Zebrafisken embryonale øre er en anden væv, hvor højden af Ca2 +, der virker gennem CaMK-II, påvirker dens udvikling. 14 zebrafisk ører vises normalt på omkring én dag i udvikling. På dette tidspunkt er CaMK-II intenst aktiveret ved foden af de kinocilia og ved lavere niveauer i kinocilium (figur 4). Dette sæt af billeder viser, at denne fiksering og immunolokalisering teknik kan detektere farvning inden cilier, en struktur, hvis tværsnit er mindre end 1 um. Disse cilier bevare deres struktur i hele denne fiksering og immunfarvning proces.

Yderligere et eksempel på to-farvet kontrastfarvning i det indre øre på et senere tidspunkt i udviklingen blev opnået ved farvning med både Alexa 488phalloidin og anti-acetyleret tubulin efterfulgt af en Alexa 568 mærket sekundært antistof (figur 5). Det er bemærkelsesværdigt, at PFA / methanol fiksering metode bevarer både F-actin og tubulin, hvilket ikke er tilfældet for alle fikseringsmidler. Dette eksempel er vist som en fusioneret farvebillede for hele øret og derefter i subregioner. 14

Et sidste repræsentativt eksempel af tofarvede modfarvning blev opnået med en stamme af fisk, der producerede embryoner med membran-målrettet GFP (figur 6). Membrane målrettet GFP er ikke knyttet til nogen anden protein og går tabt, når ekstraheres med methanol, derfor dette billede blev opnået fra fisk, der blev fastsat med PFA alene. Dette resultat antyder, at methanol behandling ekstraherer membraner, så det anbefales ikke til proteiner, kan udelukkende membranbundne. P-CaMK-II signal i denne figur er formindsket i forhold til den, der opnås, hvis methanol blev også brugt, men dette viser, at på dette tidspunkt og sted (nyre) af det udviklende foster, signalet er stærkt nok til at blive opdaget uden methanol behandling. Det er ikke sandt i KV fase;. Dvs, methanol er forpligtet til at visualisere P-CaMK-II immunfarvning. Dette eksempel er kun vist som en sammenflettede billede hvor nyrernes pronephric kanal støder op til stammen muskel.

Sammenfattende PFA / methanol fiksering her beskrevne fremgangsmåde er forenelig med bevarelsen af ​​GFP og med farvning for F-actin, acetyleret tubulin, total CaMK-II og P-CaMK-II.

Figur 1
Figur 1. P-CaMK-II kontrastfarvet for Acetylated tubulin (cilier) i zebrafisk KV. Udsigt over en enkelt levende 12 somite etape (12 ss) embryo afslører den bageste placering af KV ved arrowhead (sidebillede, A) og en cirkel, inden boksen (ventrale visning, B). Embryoner på dette tidspunkt blev fastsat ved hjælp af PFA / methanol. Embryoner blev immunfarvet for acetyleret tubulin efterfulgt af en Alexa 488 -mærkede sekundært antistof (grøn kanal). Dernæst blev kanin-polyklonalt antistof mod P-CaMK-II efterfulgt af en Alexa 568- mærket sekundært antistof (rød kanal). To-kanal fluorescerende billede fremskrivninger blev erhvervet som beskrevet på gradvis højere forstørrelser (C, D). Scale bar = 10 um. Dette tal er modificeret fra en tidligere publikation. 12 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. P-CaMK-II kontrastfarvet forTotal CaMK-II sammen zebrafisk Nyre. En enkelt dechorionated embryo ved 30 HPF blev fastsat ved hjælp af PFA / methanol. Embryoner blev derefter farvet for total CaMK-II efterfulgt af Alexa 488 mærket sekundært antistof (grøn). Dernæst blev den primære P-CaMK-II-antistof efterfulgt af Alexa 568 mærket sekundært antistof (rød). Farvning afslører en berigelse af aktiveret CaMK-II (i rødt) langs den apikale overflade af cellerne, der beklæder kanalerne i pronephric zebrafisk nyre henviser total CaMK-II er beriget på somit grænserne for tilstødende muskelvæv og hele sarkomerer. Scale bar = 50 um. Disse billeder blev erhvervet ved en lavere forstørrelse, end der er beskrevet i teksten for at visualisere hele nyren. Dette tal er modificeret fra en tidligere publikation. 13 Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 3. P-CaMK-II Counter afbildes for GFP i zebrafisk nyreceller. Denne 30 HPF embryo blev injiceret med et cDNA, der koder en dominant negativ GFP-CaMK-II. 13 Sådanne injektioner typisk viser mosaik ekspression. Embryonet blev fastsat under anvendelse af PFA / methanol og derefter immunfarvet for P-CaMK-II ved hjælp af en Alexa 568 mærket sekundært antistof. Imaging afslører, at GFP fortsætter gennem PFA / methanol fiksering, rehydrering, blokering og immunfarvning. Scale bar = 10 um. Dette tal er modificeret fra en tidligere publikation. 13 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4 P-CaMK-II modfarvet med Acetylated tubulin i zebrafisk indre øre. Denne 30 HPF foster blev fastsat ved hjælp af PFA / methanol. Den anti-acetyleret tubulin antistof blev fulgt med henblik på Alexa 488 -mærket sekundært antistof, P-CaMK-II-antistof og Alexa 568 mærket sekundært antistof. Farvning afslører, at P-CaMK-II er til stede langs indre øre cilier og co-lokaliserer med acetyleret tubulin. Scale bar = 5 um. Dette tal er modificeret fra en tidligere publikation. 14 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Actin og Acetylated tubulin i zebrafisk indre øre. En tre dage gamle (72 HPF) zebrafisk embryo blev fikseret og immunfarvet for acetyleret tubulin hjælp Alexa 568 -mærkede sekundære antistoffer, efterfulgt af actin visualisering under anvendelse Alexa 488 phalloidin. Cilia samt axonal innervation af øret er afsløret ved acetyleret tubulin (i rødt) og F-actin strukturer omfatter muskelfibre (i grønt). To cilierede sensoriske regioner af zebrafisk øre er vist mere detaljeret: den forreste macula (am) og posterior crista (pc). Scale bar = 10 um. Dette tal er modificeret fra en tidligere publikation. 14 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
. Figur 6 P-CaMK-II Counter filmede for Membrane GFP i zebrafisk Nyre Dette enkelt flettede billede, hvor β-actin:. CAAX-GFP foster (30 HPF) blev fikseret og farvet for P-CaMK-II efterfulgt af Alexa 568 mærket sekundært antistof. Farvning afslører en berigelse af aktiveret CaMK-II (i rødt) langs den apikale overflade af cellerne, der beklæder kanalerne i pronephric zebrafisk nyre. Disse nyre duktale celler er puttet lige under muskelvæv og begge er præget af ekspression af membranen målrettet GFP (grønt). Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PFA / methanol Metoden er udviklet i dette laboratorium med det primære formål at optimere immunlokalisering af phospho-T 287 -CaMK-II epitop under zebrafisk udvikling. Denne metode med succes lokaliseret P-CaMK-II under dannelsen af adskillige cilierede organer, herunder zebrafisk KV, 12 indre øre 14 og nyre. 13 Særligt i KV stadium, denne teknik var nødvendig. Succesen af ​​denne fremgangsmåde skyldes sandsynligvis en kombination af a) minimering af autofluorescens, b) bevarelse af phospho-CaMK-II epitopen og c) øget tilgængelighed af epitopen til antistoffer.

En primær begrænsning ved denne fremgangsmåde er tidspunktet for oplagring i methanol. Mens immunoreaktiviteten af ​​P-CaMK-II er maksimal efter to dage i methanol ved -20 ° C, er reaktiviteten af ​​denne epitop tabt efter en uges opbevaring i methanol. Det er ikke klart, om på dette tidspunkt phosphatgruppen er hydrolyzed eller yderligere denaturering opstår der reducerer immunoreaktivitet. Methanol / EGTA ved -20 ° C er en traditionelt hurtig fiksativ for at bevare tubulin-rige strukturer under udviklingen af tidlige embryoner. 22 Dog, methanol alene er ikke ønskværdigt for at bevare morfologi eller endda strukturer såsom actincytoskelettet og skal ske efter PFA.

Yderligere fordele ved denne fremgangsmåde er, at den også bevarer andre epitoper, såsom F-actin og acetyleret tubulin og eliminerer ikke den native fluorescens af GFP. Andre fikseringsmidler, såsom Dent fiksativ, er overlegne til andre epitoper 13 og er forenelige med P-CaMK-II-farvning, selvom P-CaMK-II-farvning er svagere i Dent fiksativ end PFA / methanol. Da phospho-proteiner er fremherskende i signalveje, der er aktive i den tidlige udvikling, er Dent fiksativ og PFA / methanol anbefales som to fixativer for andre phospho-epitoper i ZEBAFRICANrafish embryoner. Ved udviklingen af applikationer med denne teknik til andre proteiner og deres antistoffer, har det været nyttigt at have antistoffer, der også er reaktive på immunblots og at have klonet og overudtrykt proteiner med hvilke antistoffer kan valideres. 12

Det er værd at optimere teknikker til immunlokalisering fordi det a) kan kontrollere gen undertrykkelse på proteinniveauet og b) gør det muligt at udvikle modeller for handling. I dette laboratorium har resultaterne af disse assays tilladt formuleringen af ​​modeller hvorigennem CaMK-II-funktioner. For eksempel dets placering i KV er forbigående og asymmetrisk, ligesom rolle dette organ. I nyrerne dens placering på den apikale side af pronephric duktale celler antyder roller, der reagerer på signaler fra kanalen. Endelig aktiveringen af dette enzym i specifikke intens puncta ved basis af øret kinocilia antyder en lokaliseret Ca2 + signal. Fremgangsmåderne beskrevet herbør også være nyttigt at enhver investigator, der søger at opnå høj opløsning billeder af enhver embryonale celletype i to fluorescerende kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation tilskud IOS-0.817.658.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P-7629 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water
Alexa488 anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 anti-rabbit IgG Life Technologies A11008 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 phalloidin Life Technologies A12379 Preferentially binds to F-actin
Alexa568 anti-mouse IgG Life Technologies A11004 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG Life Technologies A11011 Goat polyclonal, use at 1:500
anti-acetylated α-tubulin Sigma T7451 Mouse monoclonal, use at 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II EMD Millipore 06-881 Rabbit polyclonal, use at 1:20
anti-total CaMK-II BD Biosciences 611292 Mouse monoclonal, use at 1:20
Ethanol Fisher S96857 Lab grade, 95% denatured
Forceps Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Glass coverslips VWR 16004-330 #1  thickness
Glass microscope slides Fisher 12-550-15 Standard glass slides
Methanol Fisher A411 Store in freezer
Microcentrifuge tubes VWR 20170-038 capped tubes, not sterile
Normal goat serum Life Technologies 16210-064 Aliquot 1 ml tubes, store in freezer
Paraformaldehyde Sigma P-6148 Reagent grade, crystalline
Phosphate buffered saline (PBS) Quality Biological 119-069-131 10x stock solution or made in lab
Triton X-100 Sigma BP-151 10% solution in water, store at RT
Tween-20 Life Technologies 85113 10% solution in water, store at RT
Compound microscope Nikon E-600 Mount on vibration-free table
C1 Plus two-laser scanning confocal Nikon C1 Plus Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Tags

Kemi Fiksering phospho-epitoper calcium cilier mikroskopi Kupffer s vesikel nyre øre zebrafisk
Immunofarvning phospho-epitoper i cilierede organer Whole Mount zebrafisk embryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothschild, S. C., Francescatto, L., … More

Rothschild, S. C., Francescatto, L., Tombes, R. M. Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53747, doi:10.3791/53747 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter