Summary
Hier beschrijven we een werkwijze uit te drukken en te zuiveren uitstekende kwaliteit norovirus (P) domeinen in E. coli voor röntgen- kristallografie studies. Deze methode kan worden toegepast op andere calicivirus P domeinen, alsmede niet-structurele eiwitten, bijv., Viraal eiwit-gekoppelde genoom (VPG), protease en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp).
Abstract
Norovirus capside is samengesteld uit een enkele belangrijke structurele eiwit VP1 genoemd. VP1 is onderverdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein. De S-domein vormt een aaneengesloten steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormen virale spikes op de S domein en bevat determinanten voor antigeniciteit en gastheer-cel interacties. De P-domein bindt koolhydraatstructuren, dwz., Histo-bloedgroep antigenen, die vermoedelijk belangrijk norovirus infecties. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het produceren van hoogwaardige norovirus P domeinen in hoge opbrengsten. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden gebruikt voor röntgenkristallografie en ELISA om antigeniciteit en gastheer-cel interacties te bestuderen.
De P domein wordt eerst gekloneerd in een expressievector en tot expressie gebracht in bacteriën. Het eiwit wordt gezuiverd met behulp van drie stappen die gepaard geïmmobiliseerde metaalion-affiniteitschromatografie en gelpermeatiechromatografie. Inprincipe is het mogelijk om te klonen, express, zuiveren en kristalliseren eiwitten in minder dan vier weken, die dit protocol een snel systeem voor het analyseren van opkomende norovirus stammen maakt.
Introduction
Human noroviruses zijn de belangrijkste oorzaak van acute gastro-enteritis in de wereld 1. Deze virussen behoren tot de familie Caliciviridae, waarvan er ten minste vijf geslachten, met inbegrip van Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus en Nebovirus. Ondanks hun grote impact op de gezondheidszorg en de brede verspreiding, is de studie van de menselijke norovirussen gehinderd door het ontbreken van een robuust celcultuur systeem. Tot op heden zijn er geen goedgekeurde vaccins of antivirale strategieën beschikbaar.
Norovirus belangrijkste capside eiwit VP1 genoemd, kan worden verdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein 2. De P-domein is verbonden met het S domein een flexibel scharnier (H) gebied. De S-domein vormt een steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormt de buitenste deel van het virale capside. P domein verzamelt in biologisch relevante dimeren bij expressie in bacteriën. De Pdimer interageert met koolhydraten structuren, genaamd histo-bloedgroep antigenen (HBGAs), die aanwezig is als oplosbare antigenen in het speeksel en te vinden op bepaalde gastheercellen 3 zijn. De P-domein HBGA interactie gedacht belangrijk voor infectie 4 te zijn. Inderdaad, een recent rapport bleek het belang van synthetische HBGAs of HBGA expressie bacteriën voor menselijke norovirus infectie in vitro 5.
Huidige studies over de gastheercel hechting van noroviruses hoofdzakelijk uitgevoerd met virusachtige deeltjes (VLP's) die kunnen worden uitgedrukt in insectencellen of recombinant P-domeinen tot expressie gebracht in Escherichia coli (E. coli). Om de P-domein-HBGA interacties op atomaire resolutie te begrijpen, kan P domein HBGA complexe structuren worden opgelost met behulp van X-ray kristallografie. We beschrijven hier een protocol P domein expressie en zuivering waarmee de productie van P-domein in hoge hoeveelheid en kwaliteit te gebruiken voor X-ray CrystallOGRAFIE. Bovendien kan deze methode worden toegepast voor andere calicivirus P domeinen en niet-structurele proteïnen.
De P domein codon-geoptimaliseerd voor E. coli expressie en gekloond in een standaard overdracht vector. De P domein wordt vervolgens opnieuw gekloneerd in een expressievector die een polyhistidine (His) tag en een mannose-bindend eiwit (MBP) die gevolgd worden door een protease-splitsingsplaats codeert. De MBP-His-P domein fusieproteïne wordt tot expressie gebracht in E. coli, gevolgd door drie zuiveringsstappen. De MBP-His-P-domein fusieproteïne gezuiverd met geïmmobiliseerd metaalion affiniteitschromatografie (IMAC). Vervolgens wordt het fusie-eiwit geknipt met humaan rhinovirus (HRV) -3C protease en de P-domein wordt van het MBP-His met een extra IMAC zuiveringsstap. Tenslotte wordt de P domein gezuiverd met size exclusion chromatografie (SEC). Het gezuiverde P domein kan dan worden gebruikt voor röntgenkristallografie. Screening van eiwit kristallisatie voorwaarden performed met commercieel verkrijgbare screening kits met behulp van verschillende P-domein eiwit concentraties. Kristalgroei wordt waargenomen en de meest veelbelovende omstandigheden worden geoptimaliseerd.
Met de hier beschreven methoden, is het mogelijk om van gen eiwit te structureren in minder dan vier weken. Daarom is onze werkwijze P domein expressie, zuivering en kristallisatie geschikt norovirus-gastheer interacties op moleculair niveau verschaffen belangrijke gegevens helpt bij up-to-date vaccinontwerp en drug discovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. P Domain Klonen
- Bepaal de P-domein coderende gebied door middel van sequentie uitlijning van norovirus stammen (bijv GII.10 stam, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. Bovendien verwijdert het flexibele gebied aan het C-uiteinde van het P-domein (Figuur 2A). Codon-geoptimaliseerd DNA voor E. coli expressie en omvatten BamHI (N-terminal) en Notl (C-terminal) restrictie sites om sub-kloon van de P-domein coderende gebied in de pMalc2x expressievector 6,7.
Opmerking: De P-domein coderende gebied wordt geoptimaliseerd en gesynthetiseerd door een commerciële dienst. De P-domein coderende sequentie (insert) ongeveer 1 kb lang en geleverd met normale transfervector. - Digest 2 pg van de overdrachtsvector met elke 1 ui BamHI (20.000 U / ml) en Notl (10.000 U / ml) restrictie-enzymen gedurende 1 uur bij 37 ° C met fabrikant buffers.
- Scheid de gedigereerde inzetstuk op een 1% agarosegelgedurende 20 minuten bij 135 V en zuivert het insert-DNA uit de gel met behulp van een commerciële kit.
- Bereid de pMalc2x expressie vector door digestie 2 pg van deze vector met elk 1 ui BamHI (20.000 U / ml) en Notl (10.000 U / ml) restrictie-enzymen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Zuiver de vector uit een agarosegel zoals hierboven (1.3) beschreven. Opmerking: Beide monsters (1,2 en 1,4) kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
- Ligeren het gezuiverde insert in de gedigereerde vector pMalc2x de BamHI en NotI restrictieplaatsen met 1 pi T4-DNA-ligase (400.000 U / ml) gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT) (figuur 2B en 2C). Gebruik minimaal 20 ng van de pMalc2x vector en een vector: insert verhouding 1: 3 (moleculair gewicht). Het ligatiemengsel is gewoonlijk ~ 20 pi.
- Transformatie 2 ui van het ligatiemengsel in 50 ui chemisch competente E. coli DH5a bacteriecellen gebruik van een standaard transformatieprotocol (10 min op ijs, hitteschok 45 seconden bij 42 ° C) en groeien in 600gl SOC medium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Centrifugeer de getransformeerde cellen gedurende 3 min bij 1000 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 30 gl SOC medium.
- Plaat het transformatiemengsel op LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline voor selectie en gedurende de nacht groeien bij 37 ° C. Kies ten minste vijf kolonies.
- Voor elk van de vijf kolonies enten 2-3 ml kweek van LB-medium aangevuld met 50 ug / ml ampicilline (LB-Amp) en groeien door schudden gedurende de nacht bij 160 rpm bij 37 ° C.
- Pak de plasmiden uit de kweek van een nacht met behulp van een commerciële kit. Controleer de aanwezigheid van de P-domein insert door sequentiebepaling met pMalc2x voorwaartse primer (5'- TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') en omgekeerde primer (5'- GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').
2. P Domain Expression
- Transformatie 1 pl (150 ng / ul - 400 ng / pl) van de pMalc2x vector codeert voor de MBP-His-P domeinfusie-eiwit in 50 pi competente E. coli BL21 cellen onder toepassing van een standaard transformatieprotocol (10 min op ijs, hitteschok 45 seconden bij 42 ° C) en groeien in 600 gl SOC medium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Subcultuur in 120 ml LB-amp nacht bij 160 rpm en 37 ° C.
- Inoculeer negen liter (bijvoorbeeld 6 x 5 liter flessen met 1,5 liter medium elk) van LB-amp met de subcultuur (1: 100). Kweek de cellen onder schudden bij 160 rpm en 37 ° C totdat de OD600 0,4 bereikt - 0,6. Vervolgens laat de temperatuur tot 22 ° C gedurende ~ 1 uur en vervolgens het induceren van eiwitexpressie met 0,66 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 8. Groeien de cellen overnacht bij 22 ° C (~ 18 uur).
Opmerking: De temperatuur kan worden gevarieerd, maar we raden aan 22 ° C of lager te gebruiken. - Oogst de cellen door centrifugatie (10.543 x g, 15 min, 4 ° C). Verwijder het supernatant en vries de celpellet bij -20 ° C.
ste zuiveringsstap en Protease Cleavage
- Bereid buffers die worden gebruikt tijdens de eiwitzuivering stappen van voorraadoplossingen reproduceerbaarheid en stabiliteit van de experimenten te garanderen. Neem vier verschillende buffers voor de geïmmobiliseerde metaalion affiniteitschromatografie (IMAC), die elk een andere concentratie imidazool (10 mM, 20 mM, 50 mM en 250 mM). Voor de SEC, stelt een gelfiltratie buffer (GFB) met een hogere zoutconcentratie, maar zonder imidazool. Gebruik gedeïoniseerd water en filter alle buffers voor gebruik met een poriegrootte van 0,45 urn.
Opmerking: Voor een gedetailleerde buffer voorbereiding regeling, zie tabel 1. - Ontdooi de celpellet van negen liter kweek en los op in 150 ml PBS bij 4 ° C. Ultrasone trillingen de celsuspensie drie keer gedurende 2 min (vermogen 130 W, 20% amplitude, pulsfrequentie 50%) om de cellen te verstoren. Houd de celsuspensie op ijs tijdens ultrasoonapparaat.
- centrifugalege de gesoniceerde celsuspensie (43.667 x g, 30 min, 4 ° C) om celafval te scheiden van het supernatans dat tot expressie gebracht eiwit. Verzamel de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet.
- Wassen en equilibreer 10 ml (= 1 kolomvolume [CV]) suspensie van Nikkel (Ni) NTA-agarose kralen met 10 mM imidazool buffer in een chromatografiekolom. Voeg de geëquilibreerde Ni kralen om de supernatant van stap 3,3 bevattende expressie MBP-His-P-domein fusie-eiwit en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder langzame rotatie.
- Na incubatie toepassen gehele Ni-bead-eiwitmengsel een chromatografiekolom. Was de kolom langzaam bij elke 5 CVs 10 mM, 20 mM en 50 mM imidazool buffers, te beginnen met 10 mM, 20 mM en vervolgens laatste 50 mM (Figuur 3A).
- Elueer het MBP-His-P domein fusieproteïne behulp 250 mM imidazool buffer (Figuur 3A). Tijdens elutie Controleer de OD 280 nm om de elutie van het fusie-eiwit (de toename van OD 28 verifiëren0nm). Ga door elutie totdat de OD 280 nm daalt tot ~ 0.1. Was de kralen met een gehalte van 250 mM imidazool buffer (minimaal 10 cv), gevolgd door ten minste 10 CV van 10 mM imidazool buffer. Sla de kralen voor de tweede zuiveringsstap (deel 4).
- Controleer de aanwezigheid van MBP-His-P-domein fusie-eiwit met SDS-PAGE onder toepassing van een 12% SDS-polyacrylamide gel (10 x 8 cm) 9 (Figuur 3A). Voer gelelektroforese op 45 A en 200 V gedurende 45 minuten.
- Concentraat (bijvoorbeeld met behulp van een commercieel concentrator) het geëlueerde MBP-His-P-domein fusie-eiwit tot een uiteindelijke concentratie van ~ 3 mg / ml. Klieven MBP-His-P domein fusie met HRV-3C protease tijdens dialyse tegen 2 liter 10 mM imidazool buffer (~ 1: 100) gedurende de nacht bij 4 ° C (Figuur 3A). Afhankelijk van het eindvolume van geconcentreerde proteïneoplossing Voer dialyse in een dialyse cassette of dialyse tubing.
Opmerking: De hoeveelheid HRV-3C protease voor eiwittensplitsing wordt berekend volgens de specifieke proteaseactiviteit (2 U / pl, 1 U volstaat aanhangende 100 ug eiwit) en de hoeveelheid geëlueerd fusie-eiwit dat varieert het expressieniveau en kan geschat worden uit de SDS-PAGE resultaat (3,7 ).
4. 2 nd zuiveringsstap
- Equilibreren de Ni-korrels uit stap 3.6 in 10 mM imidazool buffer.
- Incubeer de gedialyseerde eiwit van stap 3,7 (bevattende gesplitst P-domein, MBP eiwit, en HRV-protease) met de geëquilibreerde Ni-parels (4,1) gedurende 30 min bij 4 ° C onder langzame rotatie.
- Breng de Ni-kraal mengsel naar een kolom en verzamel het doorstroomkanaal (gesplitst P-domein) (figuur 3B). Meet de eiwitconcentratie zoals het komt uit de kolom totdat de OD 280nm ~ 0,1 bereikt.
Opmerking: De MBP-His moet gebonden blijven aan de Ni-korrels (Figuur 3B). - Controleer de aanwezigheid van gesplitst P domein met behulp van SDS-PAGE met een 12% gel zoals hierboven (figuur 3B) beschreven. Concentreer het geëlueerde P domein ~ 3 mg / ml en dialyseer gedurende de nacht bij 4 ° C tegen GFB voor daaropvolgende SEC zuivering.
5. 3 rd zuiveringsstap
- Was de pompen en leidingen van de HPLC zuivering systeem en pre-evenwicht van de SEC-kolom (zie Materials List) met GFB.
- Injecteer de P-domein aan de kolom bij een debiet van 1 ml / min met behulp van een superloop (tot 12 ml) of lus (tot 3 ml), afhankelijk van het volume van de geconcentreerde monster. Nadat de injectie is voltooid, verhoging van de stroomsnelheid 2,5 ml / min.
- Aangezien de OD toeneemt en de P domein loskomt van de kolom laat fracties van 1,5 ml. Raadpleeg fracties middels SDS-PAGE met 12% gel (figuur 4A en 4B). Pool alleen de zuiverste fracties en concentreer tot ~ 3 mg / ml en ~ 8 mg / ml.
Let op: Na ~ 110 ml (void volume) de meeste onzuiverheden worden uitgewassen uit een SEC-kolom met 320 ml bed volume. DeP domein wordt gewoonlijk geëlueerd als een dimeer. Elutietijd / volume van de P domein dimeer is afhankelijk van de graad prep (pg) van de kolom SEC.
6. Kristallisatie van het P Domein
- Gebruik de P domein aan ~ 3 mg / ml en 8 mg / ml voor de initiële kristallisatie screening. Maak minstens 100 ul P domein per concentratie voor de eerste schermen met 384 in de handel verkrijgbare screening omstandigheden. Gevolgd door screening bij 18 ° C in een 96-well plaat formaat, waarbij het reservoir bevat 100 ul moederoplossing en een druppel uit 0,2 pi moederoplossing en 0,2 ul eiwit.
- Herhaal en optimaliseren succesvolle kristallisatie omstandigheden. Gebruik daarom 15-well platen die 3 rijen bevatten. Het opzetten van de eerste rij met 100% moeder oplossing, de tweede rij met 90% moeder-oplossing en 10% water, en de derde rij met 80% moeder-oplossing en 20% water. Gebruik een druppelgrootte van 2 pl (1 ul eiwit + 1 gl moederoplossing) en 50081; l van de moeder oplossing als reservoir volume.
- Gebruik geoptimaliseerd kristal voorwaarden voor co-kristalliseren van het P domein liganden. Bereid platen zoals beschreven in 6.2. In plaats van 2 pl druppelgrootte ingestelde druppels bevattende 1 pi moederoplossing, 1 ul eiwit, en 1 ul van ligand bij een concentratie van 1 mg / ml.
- Verzamel data sets van enkele kristallen met behulp van synchrotronstraling. Voer moleculaire vervanging met behulp van gepubliceerde P-domein structuren met een hoge sequentie-overeenkomst als initiële zoekopdracht model 6,10-13.
Opmerking: De aanwezigheid van een ligand te zien als-un gemodelleerd blob van elektronendichtheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schema van de beschreven protocol is in Figuur 1. Het protocol omvat 6 belangrijke delen die klonering van het doelwitgen, expressie, een drie-staps zuivering en kristallisatie omvatten. Figuur 2 illustreert het ontwerp van het expressieconstruct (EC) en kenmerken van de pMalc2x expressievector. De volgorde van de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van de pMalc2x vector toont restrictie en protease splitsingsplaatsen. Figuur 3 toont representatieve SDS-PAGE resultaten van MBP-His-P-domein fusie-eiwit en gesplitst P-domein met de overeenkomstige schema van de eerste twee zuiveringsstappen. De derde zuiveringsstap is in Figuur 4 en omvat een zuiveringsschema, de elutie chromatogram van gezuiverd P-domein en een representatieve SDS-PAGE resultaat van de verzamelde fracties. De zuiverste fracties (volgens SDS-PAGE) worden samengevoegd, concentrated, en gebruikt voor röntgenkristallografie.
Figuur 1. Schematische voorstelling van norovirus P domein Expressie en zuivering. Het protocol voor norovirus P domein expressie en zuivering omvat zes grote delen, die klonering en expressie (1 en 2), zuivering (3-5) en kristallisatie (6). Rode driehoekjes vertegenwoordigen de P domein (gen- en eiwit), terwijl blauwe rechthoeken vertegenwoordigen de MBP-His. Ni-NTA agarose korrels die worden gebruikt tijdens IMAC (3 en 4) worden weergegeven als grote cyaan bollen. De SEC kralen worden afgeschilderd als grijs bollen.
Figuur 2. Ontwerp en Klonering van het expressieconstruct (EC). De P-domein ECDe expressievector kaart en de meervoudige kloneringsplaats (MCS) getoond. A) Alignment van de norovirus capside-eiwit (VP1) en de P-domein EG illustreert het ontwerp van de EC met de C-terminale deletie (groen). B ) Schematische weergave van de pMalc2x expressievector voor P domein expressie in E. coli met ampicilline-resistentie cassette (AmpR), lac-operon (lad), mannose-bindend eiwit (man, MBP) en een MCS. C) Volgorde van de MCS van de pMalc2x expressievector. Gemarkeerde zijn het restrictie-enzym splitsingsplaatsen (rode vakjes) en de herkenningssequentie LEVLFQGP voor de HRV 3C protease (precisie, blauwe doos).
Figuur 3. Schematische en Representatieve resultaten voor de 1 e en 2 e Purification Step. Zuivering overzicht en representatieve SDS-PAGE resultaten worden getoond. A) Zuivering van de MBP-His-P-domein fusie-eiwit met behulp van Ni-NTA agarose parels (grote bollen cyaan). De 12% SDS-PAGE gel toont de MBP-His-P-domein fusie-eiwit. B) Scheiding van MBP-His (blauwe rechthoek) van gesplitste P domein (rode driehoek). Elutie van gesplitst P domein wordt geanalyseerd door SDS-PAGE op een 12% gel.
Figuur 4. Schematische en representatieve resultaten voor de 3 e zuiveringsstap. Chromatogram van P domein elutie met behulp van SEC en de bijbehorende SDS-PAGE resultaat. Zwarte getallen geven de fracties die worden verzameld. A) Schematische voorstelling van de scheiding op de kolom SEC (SEC kralen worden afgebeeld als grijze bollen). De 12% SDS-PAGE toont het eiwit aanwezigin de fracties die bij SEC elutie wordt verzameld en die vervolgens samengevoegd en gebruikt voor röntgenkristallografie. B) Het chromatogram toont de SEC gemeten absorptie (zwarte lijn) over elutievolume. De rode lijn geeft aan wanneer de P domein in naar de tweede piek van B werd geïnjecteerd in de SEC-kolom. C) Zoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| buffer naam | 1 M Tris pH 7,6 | 5 M NaCl | 3,5 M imidazool, pH 8 |
| 250 mM imidazoolbuffer | 20 ml | 40 ml | 71 ml |
| 50 mM imidazoolbuffer | 20 ml | 40 ml | 14 ml |
| 20 mM imidazoolbuffer | 20 ml 40 ml | 5,7 ml | |
| 10 mM imidazool buffer | 20 ml | 40 ml | 2,8 ml |
| GFB (gelfiltratie buffer) | 25 ml | 60 ml | - |
Tabel 1. Stelsel voor pipetteren gemeenschappelijk buffers gebruikt tijdens de zuivering. Voorraadoplossingen van Tris-HCl, natriumchloride (NaCl) en imidazool worden bereid zoals aangegeven in de kop van de tabel. De hoeveelheid voorraadoplossing nodig 1 L van de gewenste buffer in water bereid wordt vertegenwoordigd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor de expressie en zuivering van norovirus P domeinen in hoge kwaliteit en kwantiteit. Norovirussen zijn niet goed bestudeerd en structurele gegevens worden voortdurend nodig. Voor zover wij weten, heeft P domein productie met behulp van andere protocollen (bv-GST gelabeld P domeinen) problematisch geweest, tot nu toe, en voldoende structurele gegevens over norovirus-gastheer interactie hebt gemist. Met de hier beschreven methode, hebben we onlangs aanzienlijk bijgedragen aan het begrijpen van de moleculaire details van norovirus koolhydraat binden. Dit protocol kan worden aangepast om een verscheidenheid aan eiwitten. Echter succesvolle implementatie van dit protocol hangt af van verschillende factoren in elk deel van de zuiveringswerkwijze.
Ontwerp van het expressieconstruct is de eerste stap van belang. We voeren codon-optimalisatie van de P domein expressieconstruct voor de expressie in E. rendement verbeteren coli en verwijder relevant restrictie sites, aanwezig in het coderende gebied. Bovendien verwijderen we een flexibel gebied aan het C-uiteinde dat tijdens expressie en eiwit verpakking tijdens kristallisatie nadelig voor eiwitvouwing zijn. Expressie MBP-fusie-eiwit is een middel om het eiwit in oplossing te houden tijdens expressie.
Betreffende eiwitexpressie oplosbare er extra parameters worden overwogen. E. coli BL21 stam is geoptimaliseerd voor high yield eiwit expressie en daarom gebruikt in dit protocol. Expressie wordt overnacht uitgevoerd bij 22 ° C en een verminderde hoeveelheid IPTG wordt gebruikt voor inductie. Dit is gunstig voor de kinetiek van eiwitexpressie en daardoor minder eiwitten aggregeren tot inclusielichamen door verkeerd vouwen. Daarom is het belangrijk afkoelen van de kweek tot 22 ° C vóór inductie van eiwitexpressie met IPTG. Als het eiwit opbrengst onbevredigend, is het mogelijk om de temperat verdere dalingure en pas de hoeveelheid IPTG.
Bepaalde zorg moet worden genomen met betrekking tot de zuivering columns. In principe kan Ni-kralen meerdere malen gebruikt worden. Toch zal bindingsvermogen worden verlaagd na verloop van tijd. Als de Ni-oplossing de standaard blauwe kleur verliest, kunnen de korrels worden gestript en opgeladen volgens de instructies in de handleiding van de fabrikant. Bovendien is het belangrijk om de SEC kolom in goede staat te houden en regelmatig reinigen hoge prestatie mogelijk. Afhankelijk van het eiwit grootte die gezuiverd moet worden van een andere prep waardering (pg) van de kolom SEC worden gekozen. De P domein dimeer ~ 65 kDa groot en goed gescheiden van verontreinigingen van ~ 100 kDa met een 75 pg kolom, terwijl grotere eiwitten beter kunnen worden gescheiden met een 200 pg kolom.
Als een combinatie van geoptimaliseerde sequentie ontwerp, expressie en zuivering procedure is het mogelijk zeer zuivere kwaliteit P domein krijgen in onze method. Vanwege de hoge kwaliteit van het gezuiverde P-domein kunnen aanvullende geschikt, waaronder immunisatie voor antilichaamproductie, NMR experimenten en ELISA-gebaseerde onderzoeken. Bovendien kan het gezuiverde P-domein worden gebruikt voor complexvorming met antilichamen en Fab Nanobodies 14,15. Voor zover wij weten is dit het eerste protocol dat P domein kristallisatie maakt in een high throughput wijze en met dit protocol, hebben we meer dan 20 complexe profielen voor verschillende norovirus en lagovirus P domeinen complex bepaald HBGAs 6,16.
Volgens onze ervaring, kan het protocol beperkt tot eiwitten tot 65 kDa. Er werden echter capside eiwitten van verschillende calicivirussen 17 en niet-structurele eiwitten, zoals virale eiwit-gekoppelde genoom (VPG), protease en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp) succesvol tot expressie gebracht en gezuiverd met behulp van deze methode (ongepubliceerd). Bij toepassing van deze methode om eiwitten van andere virussen capside it noodzakelijk kunnen variëren en verschillende parameters te optimaliseren (bv., de imidazool concentratie van de elutiebuffer) voldoende hoeveelheid eiwit te verkrijgen. Bovendien kunnen verschillende behalve GFB (bijvoorbeeld PBS of TBS) opslag buffers worden getest optimale eiwitstabiliteit.
Het merendeel van de geanalyseerde constructen leverde in kubieke / plaatachtige kristallen, die afgebogen hoge resoluties. Daarom is de huidige protocol voorziet in een instrument om pure eiwit dat goed kristalliseert verkrijgen. Zolang er nu sterke celcultuurmodel beschikbaar Deze methode vormt een belangrijke stap bij te dragen aan het begrip van norovirus-gastheercel interactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W.
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al.
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
