Introduction
Medfødte immunceller udgør et væsentligt del af cellerne i tumoren mikromiljø og er blevet forbundet med tumor- malignitet hos patienter og dyremodeller for cancer 1. For nylig er det blevet mere almindeligt forstås, at kroniske immunreaktioner spiller kritiske roller i at fremme tumorudvikling, metastase og modstandsdygtighed over for kemoterapier 2. Makrofager er vigtige immunceller medfødte der har vist at direkte regulere tumor celle respons på kemoterapi 3,4. Imidlertid er rollen af neutrofiler, centrale aktører i det medfødte immunsystem, i regulering tumor respons på anti-cancer behandling ikke kendt. Formålene med disse protokoller er at bruge en hurtig og troværdig metode til adskillelse neutrofiler fra CLL patients blodprøver og at differentiere HL60-celler langs granulocytisk pathway for at studere deres rolle i regulering af følsomheden af lymfomceller til anti-lymfom midler.
fem og fungere som en første linje i forsvar mod invaderende mikroorganismer 6. Neutrofiler har en væsentlig rolle i stigende effektive medfødte immunrespons i tillæg til variable funktioner effektor i flere patologiske tilstande 7. Derfor er en hurtig og troværdig metode til isolering neutrofiler fra andre blodceller, såsom densitetsgradient separation metode, er påkrævet for in vitro-studier. Ved hjælp af denne metode til neutrofil isolering vil fremme yderligere forskning i neutrofil-medieret immunologiske funktioner in vivo og ex vivo.
Evnen til at opnå rene populationer af neutrofiler er et vigtigt første skridt til undersøgelse af patienter med immunologiske sygdomme 8. Densitetsgradient separation metode er en ideel teknik, hvor et højt udbytte af celler er opnået. Den method indebærer tilsætning af densitetsgradient opløsning i bunden af et rør indeholdende fortyndet humant blod efterfulgt af centrifugering ved 300 g i 35 min uden pause. Ringen af de mononukleære celler vises ved grænsefladen og neutrofilerne opholde nedenfor førstnævnte. Denne fremgangsmåde har betydelige fordele i forhold til andre tilgængelige fremgangsmåder, såsom neutrofile isolation kits, som er langt dyrere 9. Desuden isolere neutrofiler fra humant blod ved kommercielle kit under anvendelse af antistoffer rettet mod en overflademarkør specifik for humane neutrofiler, øger risikoen for celleaktivering eller differentiering. Densitetsgradient separation fremgangsmåde tillader isolering af neutrofiler inden for en kort periode. Inden for samme trin bliver mononukleære celler også adskilt og isoleret. Det er en grundlæggende teknik, hvor et højt udbytte af rene celler opnås for at opnå funktionelle integritet.
For at efterligne tumoren microenvironment, blev udført 3D eksperimenter. I betragtning af den korte halveringstid af neutrofiler in vitro, 3D eksperimenter med friske humane neutrofiler er ikke afgørende. Af denne grund er promyelocytiske (HL60) celler induceres til at differentiere til neutrofil-lignende celler med differentieringsfaktorer induktorer dimethylsulfoxid (DMSO) og retinsyre (RA). Brug differentierede HL60 celler (HL60 diff) vil forhindre at have forskellige reaktioner af neutrofiler skyldes isolation fra forskellige donorer.
In vitro 3D kultur-modeller repræsenterer et mellemstadium mellem in vitro 2D-modeller og in vivo modeller. I 2D kultur, cellerne spredes på plastoverfladen danner unaturlige celle vedhæftninger til deponerede proteiner, som er denatureret på denne syntetiske overflade. Omvendt cellerne i 3D kultur danner naturlige celle-celle vedhæftede siden cellerne og det ekstracellulære matrix, syntetiserer det naturlige materiale, til hvilket de er bundet.Af denne grund 3D co-kultur modeller, navnlig mellem cancerceller og andre celletyper, har været meget nyttige til at indikere deres bidrag til tumorvækst, angiogenese og metastase. Som et resultat, 3D kulturer gør cellekulturen efterligner fysiologiske betingelser, der eksisterer in vivo 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Neutrofil Isolation og Co-kultur med Primære leukæmiceller
BEMÆRK: Procedurer blev udført under godkendelsen af Lyon Hospital etiske komité alle patienter underskrive informeret samtykke.
- Isolering af primære leukæmiceller og neutrofiler
- Saml rør af perifert blod på EDTA (1,8 mg EDTA pr ml blod) fra patienter diagnosticeret med kronisk lymfatisk leukæmi (CLL).
- Tilføj hver 15 ml blod til et sterilt 50 ml rør og fortyndes med 15 ml RPMI (fortynding 1: 1), derefter forsigtigt og langsomt tilsættes 15 ml densitetsgradient løsning på bunden af røret uden at blande faserne. Sikre, at densitetsgradient opløsningen har stuetemperatur til fremstillingen.
- Centrifuger ved 300 xg i 35 min ved stuetemperatur og uden bremse. Blodet skal skille i fire forskellige faser som vist i figur 1A, top til bund: blodplade og plasma, mononukleære celler (white ring), densitetsgradient opløsning, granulocytter og erythrocytter.
- Opsaml hvid ring, som repræsenterer de primære leukæmiske celler med en plastik Pasteur pipette og overføres til en ny 50 ml rør.
- Fyld røret med PBS (indeholder calcium og magnesium) op til 50 ml i alt og centrifugeres ved 300 g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Pelleten resuspenderes med 5 ml PBS derefter tilføje PBS op til 50 ml i alt og centrifugeres ved 300 g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Pelleten resuspenderes med komplet RPMI-medium (RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin) til tælling under anvendelse levedygtighed celletæller.
- Aspirer de øverste faser forlader granulocytter og erythrocytter fase og tilføje PBS op til 25 ml derefter tilføje 3% dextran i 0,9% NaClup til 50 ml i alt. Bland rørene 10 gange og holde dem i 30 minutter ved stuetemperatur uden blanding.
- Saml det øverste RBC-dårlig neutrofil lag end placere dem i en ren steril 50 ml rør og centrifugeres rørene ved 300 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Resuspender hver pellet med 5 ml PBS derefter tilføje lyse af røde blodlegemer buffer op til 50 ml i alt.
- Opbevar rørene i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur centrifugeres ved 500 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask pellets med PBS (indsæt PBS op til 50 ml i alt) centrifugeres ved 500 g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspendere pillerne med komplet RPMI-medium til tælling under anvendelse levedygtighed celletæller. Hold 3 x 10 5 af hver celletype i 50 pi PBS-FBS (4%) i 5 ml plastrør til at bestemme renheden af deres isolation under anvendelse af flowcytometri.
- Analyser Morfologiske Optræden af de isolerede cellepopulationer
- For at gøre dette, resuspenderes hver 3 x 10 4 neutrofiler og 3 x 10 4 mononukleære celler i 150 pi komplet RPMI medium. Saml objektglas, filter kort, og prøve kamre i cytospin centrifuge, der sikrer, at than centrifugere er velafbalanceret.
- Placer hver celletype i prøve kammer og cyto-centrifuge ved 750 xg i 10 min ved RT Fjern dias, filter kort, og prøve kamre fra centrifugen. Skil forsigtigt for ikke at beskadige cellerne på objektglasset. Kassér filter kort og prøve kamre.
- Farv cellerne ved hjælp af Giemsa farvning kit og holde dias til 1 time for at tørre. Undersøg cellerne under mikroskop med 100X forstørrelse.
- Test renhed isolerede celler ved FACS
- Mærke de isolerede primære leukæmiske celler med anti-humant CD19-antistof konjugeret til APC (5 pl / 10 6 celler). Mærke de oprensede neutrofiler med blanding af anti-humane antistoffer, der er anført i tabel 1 (5 pl / 10 6 celler). Inkubér cellerne i mørke i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellerne med 500 pi PBS-FBS (4%) centrifugen rørene ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender hver pellet i 200 pi PBS-FBS (4%).
- Analyser på et flowcytometer ved hjælp af følgende optiske konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10bp), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Sørg for kompensation farve.
- Cokultur af Primære leukæmiceller med Autolog neutrofiler
- Seed 2 x 10 5 celler / ml af primære leukæmiske celler alene eller med autologe neutrofiler på 1:10 i komplet RPMI-medium. For at gøre dette, justere celle numre ved at fortynde cellesuspensioner og tilføje 2 x 10 5 celler / ml af primære leukæmiceller til 2 x 10 6 celler / ml neutrofiler. Bland omhyggeligt.
- Tilsæt 25 uM for Bruton s tyrosinkinase (Btk) inhibitor (ibrutinib) til cellerne. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Celle Harvest og FACS-analyse
- Collect cellerne i 5 ml plastrør til FACS-analyse og centrifuger rør ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask pellets med 1 ml PBS-FBS (4%) centrifugeres ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender pellets i Annexin V og PI ved hjælp kommercielt kit og inkuber cellerne i mørke i 10 minutter ved stuetemperatur. Analyser på et flowcytometer ved hjælp af gating strategien figur 2A og følgende optiske konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10bp), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Sørg for kompensation farve.
2. Differentiering af HL60 celler langs granulocytisk Pathway og deres co-kultur med RL lymfom B-celler i 3D Model
- Differentiering af humane Promyelocytic (HL60) Celler i Neutrofile-lignende celler
- Juster HL60 celleantal til 3 x 10 5 celler / ml og derefter tilsættes 1 pM retinoinsyre (RA) og 1,25% DMSO for at inducere deres differentiering. Seed hver 3 x 10 5 5% CO2.
- Senere, indsamle cellerne og centrifugeres ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellerne med komplet RPMI-medium til tælling under anvendelse levedygtighed celletæller.
- Derefter fortyndes cellesuspension i komplet RPMI-medium til justering HL60 celleantal til 3 x 10 5 celler / ml og inducerer igen deres differentiering ved tilsætning af 1 pM retinoinsyre (RA) og 1,25% DMSO. Seed hver 3 x 10 5 HL60 celler pr brønd i 48-brønds plade og inkuberes i yderligere 48 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Analyse af HL60 differentiering (HL60 diff)
- Opsamle cellerne og centrifugeres rørene ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur. Pelleten resuspenderes med komplet RPMI-medium til tælling under anvendelse levedygtighed celletæller.
- For at analysere ændringerne i celle-overflademarkører ekspression ved flowcytometri. Placer hver 3 x 10 5 5 HL60 diff celler i 5 ml plastrør til FACS-analyse og centrifuger rør ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender pellets i 50 pi PBS-FBS (4%). Mærk cellerne med anti-humant CD11 konjugeret til AF700 eller anti-humant CD38 konjugeret til APC (5 pl / 10 6 celler). Inkubér cellerne i mørke i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask med 500 pi PBS-FBS (4%) centrifugeres ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspendere pellets i 200 pi PBS-FBS (4%).
- Analyser på flowcytometer ved hjælp af gating strategien figur 3A og følgende optiske konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10bp); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
- For at teste de morfologiske ændringer i HL60 diff, immobilisere cellerne på objektglas til mikroskopisk undersøgelse.
- For at gøre dette, resuspendere hver 3 x 10
- Placer hver celletype i prøvekammeret og cyto-centrifuge ved 1500 rpm i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern dias, filter kort, og prøve kamre fra centrifugen. Skil forsigtigt for ikke at beskadige cellerne på objektglasset. Kassér filter kort og prøve kamre.
- Farv cellerne ved hjælp af Giemsa farvning kit og holde dias til 1 time for at tørre. Undersøg cellerne under mikroskop med 100X forstørrelse.
- For at gøre dette, resuspendere hver 3 x 10
- 3-dimensional (3D) Kultur
BEMÆRK: Sørg for, at de, der anvendes i dette eksperiment materialer er koldt og eksperimentet foregår på is.- Resuspender hver 5 x 10 4 RL-celler, enten alene eller blandet med HL60 diff diff 1:10, med 300 pi basalmembranmatrix anvendelse af 1 ml pipettespids skåret med en steril saks for at udvide åbningen til ca. 2 til 3 mm. Undgå bobler i dette trin.
- Sæd hver 300 pi cellesuspension / brønd i 24-brønds plade. Undgå bobler i dette trin. Inkubér pladen i 30 minutter ved 37 ° C med 5% CO2 derefter tilsættes 1 ml komplet RPMI-medium til hver brønd og inkuberes i 7 dage ved 37 ° C med 5% CO2. Skift medium hver to dage. Tilsæt 10 nM vincristin på dag 5.
- FACS-analyse
- Efter 7 dages dyrkning, aspireres mediet og vask hver brønd med 1 ml iskold PBS to gange. Tilsæt 3 ml / brønd iskold PBS-EDTA (5 mM). Frigør gelen fra bunden af brønden ved skrabning med den nederste af 200 pi pipettespids. Ryst pladen forsigtigt på is i 30 minutter.
- Overfør cellesuspensionen i sterilt 15 ml rør og ryst rørene forsigtigt på ice i yderligere 30 minutter. Check for forekomsten af homogen cellesuspension. (Hvis det ikke er tilfældet, så ryst cellerne i længere tid eller tilføje flere PBS-EDTA).
- Centrifuger rørene ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask pellets med PBS centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender med PBS-FBS (4%) og mærke med anti-humant CD19-antistof konjugeret til PE-Cy7 og anti-humant CD38-antistof konjugeret til APC (5 pl / 10 6 celler). Der inkuberes i mørke i 30 minutter ved 4 o C.
- Vask med 500 pi PBS-FBS (4%), derefter centrifugeglas ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellerne med Annexin V og PI hjælp kommercielt kit.
- Analyser på flowcytometer ved hjælp af gating strategien figur 4A og følgende optiske konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10bp), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Sørg for kompensation farve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Densitetsgradient separation her beskrevne fremgangsmåde tilvejebringer primære leukæmiske celler og ustimulerede neutrofiler isoleret fra blodet fra CLL-patienter Figur 1A repræsenterer de forskellige blod lag opnået efter densitetsgradientcentrifugering (fra top til bund:. Blodplader og plasma, hvid ring repræsenterer mononukleære celler, densitetsgradient opløsning, granulocytter og erythrocytter). Figur 1B og 1C viser forskellene i de morfologiske udseende mellem neutrofiler (multi-fliget kerner celler) og mononukleære celler hhv.
Resultater i figur 1D repræsenterer fremadrettede scatter (FSC) vs side-scatter (SSC) plot af primære leukæmiceller (mononukleære celler). Mærkning denne population med anti-humant CD19 konjugeret til APC viser en komplet højre skift af histogrammet (figur 1E) med kun éntop, som indikerer, at denne population er positiv for CD19 og ren. Neutrofiler er også ≥90% ren som bekræftet ved flowcytometri efter mærkning af isolerede neutrofiler med en blanding af fluorokromkonjugerede monoklonale antistoffer, der er anført i tabel 1. Figur 1F viser FSC versus SSC scatter plot af de isolerede neutrofiler, som er positive for CD45 (figur 1G), positive for CD15 og negativ for CD14 (figur 1 H), positive for både CD15 og CD16 (figur 1 i), positive for CD16 og negativ for CD56 (fig 1J).
Figur 1. Analyse af Morfologiske optrædener og renhed Primære leukæmiceller og neutrofiler isoleret fra patienternes blod. (A) Skematisk visning repræsenterer forskellige blod lag efter tæthed gradient centrifugering. (BC) Giemsa-farvning repræsenterer de morfologiske forskelle mellem (B) neutrofiler og (C) primære leukæmiske celler (mononukleære celler). Billeder blev taget af mikroskop med 100X forstørrelse. (D) Forward-scatter (FSC) og side-scatter (SSC) plot repræsenterer den isolerede primære leukæmicellepopulationen. (E) Isolerede primære leukæmiceller blev mærket med anti-CD19-APC og analyseret for ekspression af CD19. Den røde linje viser de umærkede celler og den blå linje angiver celler mærket med anti-CD19-APC. (F) FSC vs. SSC scatter plot repræsenterer den isolerede neutrofil befolkning. (GJ) Isolerede neutrofiler blev mærket med en blanding af antistoffer anført i tabel 1 og analyseret for ekspressionen af (G) CD45, (H) CD14 og CD15, (i) CD15 og CD16, (J) CD16 end CD56. Klik her for at se en større version af dette tal.
| antigener | fluorokrom | Klon |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tabel 1. fluorokromkonjugerede Rensede monoklonale antistoffer anvendes til at teste renheden af Isolated neutrofiler. Alle antistoffer blev opnået fra Miltenyi biotek.
figur 2A repræsenterer porte neutrofiler og primære leukæmiceller. Neutrofiler er meget mere kornet end de primære leukæmiceller så de vises med højere SSC. Gating på de primære leukæmiceller co-dyrket med neutrofiler i nærvær af ibrutinib, resultater viser højere procentdel af levende celler (figur 2C, 84,8%) sammenlignet med de celler dyrket alene (figur 2B, 53,1%). Boksen Grafen i figur 2D viser, at decrease af cellelevedygtighed induceret af ibrutinib blev signifikant inhiberet af tilstedeværelsen af neutrofiler (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0,001, 19 patienter).
Figur 2. Autolog Neutrofiler Protect Primære leukæmiceller mod Ibrutinib. Blod blev opsamlet fra patienter diagnosticeret med kronisk lymfatisk leukæmi (CLL). Primære leukæmiske celler blev isoleret og dyrket alene eller sammen med autologe neutrofiler (N) på primære leukæmiceller: Nratio 1:10 i 24 timer, i nærvær eller fravær af 25 uM ibrutinib. Procentdelen af levende primære leukæmiceller (Bilag IV V negativ / PI negativ) blev målt ved at dobbeltklikke farvning med annexin V-FITC og PI, efterfulgt af flowcytometrisk analyse. (A) Forward-scatter (FSC) og side-scatter (SSC) plot repræsenterer porte neutrofiler og primære leukæmiceller. (B) Bi-dimensional dot-blot viser procentdele af levende og apoptotiske primære leukæmiceller dyrket alene og behandlet med 25 pM ibrutinib. (C) Bi-dimensional dot-blot viser procentdele af levende og apoptotiske primære leukæmiceller samarbejde dyrket med neutrofiler og behandlet med 25 pM ibrutinib. (D) Box plot repræsenterer procentdelen af levende primære leukæmiske celler fra 19 patienter. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. *** p <0,001 Klik her for at se en større version af dette tal.
Den korte halveringstid af neutrofiler in vitro gør deres anvendelse i 3D kultur nyttesløse. Differentiering af HL60 celler langs granulocytisk pathway blev induceret ved differentieringsfaktorer inducere. To forskellige parametre (celle-overflademarkører udtryk og morfologiske Changes) blev anvendt til at måle differentieringen af HL60. FSC vs SSC scatter plot i figur 3A viser, at HL60 celler er større i størrelse i forhold til HL60 diff celler med højere FSC. Mærkning af celler (HL60 eller HL60 diff) med anti-humant CD11-antistof konjugeret til AF700 og anti-humant CD38antibody konjugeret til APC viser en stigning i CD11 og CD38-ekspression (figur 3B) efter differentiering, som er et tegn på granulocytisk differentiering. HL60 diff celler udviser også morfologiske ændringer detekteres ved fremkomsten af multi-fliget kerner (figur 3C).
Figur 3. Strukturelle Parametre for differentieret HL60 Cells. (A) Forward-scatter (FSC) og side-scatter (SSC) plots repræsenterer HL60 og differentierede HL60 celler (HL60 diff). (B) HL60 og HL60 diff celler blev mærket med anti-CD11-AF700 eller anti-CD38-APC efterfulgt af flowcytometri analyse. Efter gating på hver cellepopulation i FSC-A versus SSC-A scatter plot (A) blev cellerne analyseret for udtrykkene for CD11b eller CD38. (C) HL60 celler udviser morfologiske ændringer i overensstemmelse med differentiering mod granulocytter. Billeder blev taget af mikroskop med 100X forstørrelse. Fed sort pil pege multi-fliget kerne. Grafer er repræsentative for fem uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at teste virkningen af HL60 diff celler på regulering RL celle respons på vincristin i 3D-modellen blev RL-celler dyrket alene eller med HL60 diff i basalmembranmatrix i nærvær eller fravær af vincristin på 10 nM. Brug af gating-strategi er vist i figur 4A, er begge populationer diskrimineres på grundlag af CD19 og CD38 ekspression; RL celler er positive for CD19 og HL60-diff celler er positive for CD38. Gating på RL-celler co-dyrket med HL60 diff celler i nærvær af vincristin, resultater viser højere procentdel af levende celler (figur 4C, 35,9%) sammenlignet med RL-celler dyrket alene (figur 4B, 19,7%). Søjlediagrammet i figur 4D viser en betydelig stigning i procentdelen af levende RL-celler (CD19 positiv Annexin V negativ / PI negativ) i nærvær af HL60 diff celler (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1,0, p <0,001).
Figur 4. Neutrofile-lignende HL60 diff Celler Beskyt RL lymfomceller mod vincristin i 3D kultur. RL celler blev dyrket alene eller sammen med HL60 diff celler ved RL: HL60 diff 1:10 7 dage i basalmembranmatrix. På dag 5 blev vincristin (VCR) tilsat ved en koncentration på 10 nM. Sfæroider blev dissocieret på dag 7, og celler blev mærket med anti-CD19-PECy7 og anti-CD38-APC derefter resuspenderet med annexin V-FITC og PI efterfulgt af flowcytometrisk analyse. (A) Forward-scatter (FSC) og side-scatter (SSC) plot repræsenterer porte RL celler og HL60 diff celler. (B) Bi-dimensional dot-blot viser procentdele af levende og apoptotiske RL celler dyrket alene og behandlet med 10 nM vincristin. (C) Bi-dimensional dot blot viser procentdele af levende og apoptotiske RL celler co-dyrket med HL60 diff og behandlet med 10 nM vincristin. (D) søjlediagrammet repræsenterer procentdelen af levende RL celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her, en effektiv, enkel, hurtig og billig protokol til isolering af neutrofiler fra humant blod med høj renhed under anvendelse af densitetsgradientcentrifugering tilgang og inden for de samme trin mononukleære celler også adskilt og isoleret. De isolerede cellepopulationer er ≥90% ren.
Adskillige metoder er tilgængelige for neutrofil isolering fra humant blod. Disse indbefatter lignende fremgangsmåder under anvendelse af diskontinuerlige gradienter 11,12, eller under anvendelse af kommercielle kits til neutrofil isolering ved positiv immuno-magnetisk selektion i hvilken neutrofiler er immuno-magnetisk mærket med specifikt antistof, såsom anti-humant CD16 derefter Neutrofiler beriget ved binding af CD16- positive celler på en magnetisk spalte 13. Kommercielle kits med negativ immuno-magnetisk selektion er også tilgængelige i hvilken fuldblod eller granulocyt suspension er mærket med en cocktail af antistoffer, der binder på celler andre than neutrofiler 9 (dvs. antistof-komplekser, som mærker RBC'er, blodplader og uønskede celler, såsom CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glycophorin A og dextran-coatede magnetiske partikler), derefter neutrofiler beriges ved eluering som antistof- negativ fraktion af celler, der ikke binder på den magnetiske spalte. Desuden kan neutrofiler isoleres ved fluorescensaktiveret cellesortering 14.
Nogle teknikker er blevet vist at give høje udbytter af rene neutrofiler, såsom positiv immuno-magnetisk selektion. Men denne fremgangsmåde har ulemper sammenlignet med densitetsgradientcentrifugering metoder på grund af de mærkning midler, som binder på overfladen af neutrofiler og dette kunne potentielt ændre deres funktion ved at inducere deres aktivering eller differentiering. Også ved hjælp af den positive immuno-magnetisk udvælgelsesmetode, antistof-mærkede neutrofiler binder på en magnetisk søjle til separation og dette kan også påvirke deres funktion.Fluorescensaktiveret cellesortering har en anden begrænsning for så vidt som denne metode kræver længere tid til at indsamle de celler, som kan have en negativ indflydelse neutrofil overlevelse på grund af deres korte halveringstid.
Densitetsgradientcentrifugering metode er meget sammenlignelige og den neutrofile renhed kan overstige 90% ved anvendelse af begge procedurer, men førstnævnte er en to-lags-gradient, som teknisk mindre udfordrende i forhold til lagdeling gradient løsning, som består af 40%, 60% og 80% vol / vol i PBS. Det blev nævnt af Swamydas et al. 15, at sammenblanding af gradientopløsning grænseflader foregår ofte på grund af de små densitetsforskelle mellem de tre lag. Med hensyn til de negative immuno-magnetisk udvælgelse tilgange, har de også blevet rapporteret at være effektiv til neutrofil isolering med høj renhed og levedygtighed 9. Deres fordel i forhold positiv immuno-magnetisk udvælgelse og fluorescensaktiveret cellesortering er, at neutrofilerikke er mærket med eventuelle mærkningsmidler og ikke binder til magnetisk søjle, hvorved man undgår celleaktivering men denne metode er meget dyrere og mere tidskrævende sammenlignet med densitetsgradient metode.
Neutrofiler normalt undergå hurtig spontan apoptose både in vitro og in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells bevarer mange karakteristika af humane leukocyt stamceller, såsom potentialet til at undergå differentiering til neutrofiler 18. I modsætning til neutrofiler, HL60 diff celler ikke hurtigt undergår apoptose og brug af disse celler løser besværet med forskellige reaktioner af neutrofiler på grund af deres isolation fra forskellige donorer.
For nylig, 3D kulturer bliver mere moden og relevant for menneskers og dyrs fysiologi, og en attraktiv model for forskellige biologisk forskning især inden for kræft. Mønstret skift fra 2D til 3D kultur skrider hurtigt since sidstnævnte er mere iøjnefaldende under studere forskellige patologiske tilstande, såsom cancer 19. Der er en stigende bevidsthed om ulemperne ved 2D kultur, hvor tilføje en tredje dimension til en celles miljø er vigtigt for at se nærmere på betydningen af cellulære interaktioner 20 og undersøge forskellene i cellulær adfærd og karakteristika. 3D kultur skaber et miljø, der svarer til forholdene i en levende organisme (f.eks., Menneske), der fører til mere relevant forskning. Men 3D kultur indebærer det komplekse samspil mellem forskellige partnere såsom celler, ekstracellulære matricer og interstitielle væsker, som ikke udgør i 2D kultur. Således vil være påkrævet indsats for at etablere metode kalibrering og regne med god laboratoriepraksis samt effektive forsyninger især de kommercielle mærker, der er flittigt afprøvet og overvåges.
Tumormikromiljøetbestår af flere celletyper, herunder mange immuncellepopulationer, der deltager i og regulerer tumorgenese, metastase og reaktion på anticancer midler 21,22. Adskillige undersøgelser har vist, at en stigning af neutrofil infiltration i tumorer er signifikant korreleret med erhvervet resistens over for flere anticancer-midler, såsom anti-VEGF terapi 23,24. Endvidere elevation i forbehandlingen neutrofiltal i patienter med metastatisk renalcellecarcinom 25, samt tilstedeværelsen af et højt niveau af intratumoral neutrofiler hos patienter med forskellige solide tumorer, 26 er blevet foreslået som prognostiske faktorer for ringe overlevelse. Vores undersøgelse tyder på, at neutrofiler kan spille en rolle i beskyttelsen lymfom B-celler fra anticancermiddel-induceret apoptose.
Sammenfattende kan det pålidelig og reproducerbar metode beskrevet her være ansat af nogen laboratorium til at indsamle neutrofiler og mononukleære celler fra humen blod. Desuden er differentieringen af HL60-celler langs granulocytisk pathway forelægges for at undgå nogle neurophil problemer som den hurtige spontane apoptose. Disse fremgangsmåder blev anvendt til at undersøge rollen af neutrofiler på følsomheden af lymfomceller til anti-lymfom midler, hvor neutrofiler viser en beskyttende virkning på lymfomceller mod disse midler ved hjælp af 2D og 3D kultursystemer. Disse metoder kan anvendes til en række neutrofil funktionelle undersøgelser, der skal uddybe vores forståelse af neutrofil rolle i cancer biologi. Navnlig kan denne metode benyttes til bedre at forstå den krydstale mellem neutrofiler og tumorceller eller mellem neutrofiler og andre komponenter i mikromiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
