Protocol
鳥類胚はIUCACの規制の下で脊椎動物とは見なされません。
1.手術のための胚を取得
- 80インキュベート - ハミルトンとハンバーガー（HH）の段階で胚を得るために、約72時間、40℃で加湿（60％）、ロッカーインキュベーター内で90受精Bovan鶏卵（平滑末端まで）は17に基づいて、卵の正確な数を決定します胚17の電力解析と生存率。適切な空気の循環を可能にするために、インキュベーションのためプラスチック製の卵トレイを使用してください。
- この所望の発達段階が達成されたらを100mM×26ミリメートルのペトリ皿に約20ミリリットル（重炭酸ナトリウム（1 G / L）を補充した）暖かい（37℃）タイロード緩衝液を注ぎます。
- 70％エタノールで卵の殻を滅菌します。
- 静かにメスハンドルにシェルをクラックし、慎重にタイロード緩衝液を含有する皿にその内容物を放出します。彼らは視覚的に（ii）の異常が現れた（ⅰ）場合、彼らは、胚を破棄します（iii）は、それらが不適切に卵黄上に配向され、および/または（iv）のいずれかの出血が発生した右発達段階ではありません。すぐに開発を損なわないように、40℃でのOVOの元に置かれた後、手術を受けていない任意の胚を保持します。
注：ステージングがハミルトンとハンブルガー18に基づいて行われます。ニワトリ胚の異常は、肉眼でと解剖スコープの下で決定されます。胚が適切な折り畳みおよび曲げや血管系を持っていることを確認してください。
2. OFTバンディング
- 単一11/0ナイロン縫合糸から個々の長さ1cmのスレッドをピンセットで抜くと緩い結び目を形成します。 UVは、すべての予備成形されたノットを殺菌します。
- 解剖顕微鏡下では、視覚的に心臓が通常の速度（〜120拍/分）で暴行されていることを確認してください。ない場合は、胚を廃棄します。
- トランスファーピペットを用いて、胚の表面に暖かい（37℃）タイロード緩衝液の6ミリリットル - ちょうど手術の前に、5を適用します。
- OFTの下に予め形成した結び目の1自由端を渡し、OFT /心室接合（OVJ）（または、所望の位置）で縫合糸を配置し、それによってOFT心臓を取り囲む膜を含む収縮結び目に自由端を渡します。
- トランスファーピペットを用いて温かい6mlの（37℃）タイロードバッファー - 手術後、5を卵黄の表面を濡らします。
- 縞模様の胚として元のOVO管理胚を維持します。しかし、外科的処置にそれらを与えないでください。
- 加湿（60％）インキュベーター中で40℃で、所望の時間のために、胚をインキュベートします。
- 所望の時点に達すると、直線状のはさみを使用して卵黄から胚を切り出します。細かい鉗子で心臓を解剖し、そのような変更された血行動態17に起因する心臓の形態の変化など、いくつかの下流の研究のために使用します。
3.バンディングの介入は、血行動態の変化を引き起こすことを確認
注：バンディングの介入によって引き起こされる部分的なくびれはOVJでの血流速度の増加につながります。この血行動態パラメータは、都合よく、実験の所望の時点で行われる2次元超音波画像を用いて評価されます。
- 単一の胚を一度に撮像することができるので、40℃のインキュベーター中で超音波イメージングのために指定された他のすべての胚を維持します。
- 40℃に設定した加熱パッド上に結像される胚を含むペトリ皿を置きます。
- 暖かい（37℃）タイロード緩衝液で、つばまで、皿を埋めます。インタクトな卵黄を保持するようにゆっくりと皿に緩衝液を注ぎます。しかし、卵黄の完全性は、このステップの間に侵害された場合、胚を廃棄します。
- オリエント胚の中心軸は、調節可能なスタンドから吊り下げられている超音波プローブに直交するように、胚。
- 超音波装置のオペラとティンは、Bモードでは、画面上の鼓動する心臓の2D画像を取得し、OFT、心室とOVJが明瞭に見えるようなステージ（加熱パッド）を移動します。
- 所望のパルス繰り返し周波数（ 例えば 、20kHzの）で、パルス波（PW）モードに切り替えて、正確にOVJで速度データを取得します。拍動する心臓のBモード画像は、スクリーン上で得られます。
- OFT、心室とOVJを見るためにステージを移動します。超音波装置のソフトウェアを使用して、正確にOVJにおける速度測定値を得ます。
注：胚の心拍数は、撮像中に減少した場合、このようにして得られた速度データは、分析のために使用すべきではありません。速度測定のために使用されるすべての胚は、好ましくは、超音波イメージングの後に、他の実験に使用することはできません。
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Representative Results
図1に示すOFTバンディングのために必要な推奨機器です。蓋をし た胚を破壊しないように、卵は十分な深さであるべき胚の元を含むペトリ皿（ 図1A）。深いペトリ皿（ 図1C）は、タイロード緩衝液の適切な量は、卵黄の上に注ぐことができるようにするために超音波イメージングのために使用されるべきです。
単一1cmのスレッド（ 図2A）11/0ナイロン縫合糸（ 図1A）からtweezedと緩い結び目（ 図1B）に接続されています。すべての予備成形されたノットは、紫外線滅菌される。 図3Aは、受精鶏卵が所望の段階まで培養される加湿ロッカー室を示している。 図3Bは、縞模様と対照胚は、OVOの元を維持している胚の培養器を示し、
図4Aに卵黄の元、卵の上にHH17胚である。 図4Bは、HH17胚のOVJで縫合糸（バンド）の位置を示す模式図である示す。 図4Cは、撮像された縞状の胚の代表画像です手術後48時間。
狭窄部位を通る血流速度のバンディング介入の効果は、2次元超音波イメージングによって測定されます。予想通り、OVJでの速度が制御（ 図5）に比べてバンド化胚の方が高いです。我々は最近、OFT血流速度と壁せん断応力17にバンディングの効果を示す24時間の時点で、縞状および制御の心に計算流体力学（CFD）解析を行いました。
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図1.手術器具。（A）11/0ナイロン縫合糸。（B）予め形成された結び目を含むペトリプレート。（C） の元、卵胚培養および超音波イメージングのためのディープシャーレ。（D）転送ピペット。（E）メスは卵の殻を割るために処理します。（F）手術後の研究のための胚切除のためのストレートハサミ。（G）ファイン鉗子この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
OFTバンディング2.縫合図。 （A）単一1cmの糸は、縫合糸からtweezed。
図3.インキュベーションチェンバース。 （A）受精卵のための加湿ロッカーインキュベーター。（B）縞模様と制御胚の元、卵培養のための加湿チャンバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
4. OFTバンディング図。 （A）全体HH17のニワトリ胚は、くびれを描いた、スケールバー= 10ミリメートル（B）略図の元、卵を維持しましたサイト（赤）。（C）縞模様胚はOFTバンディング、スケールバー= 0.5ミリメートルの48時間後に画像化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.超音波由来の速度測定。（A）コントロールと1時間の時点で得られた（B）縞状の胚の代表的な速度プロファイル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この技術は、比較的迅速かつ実行するのは簡単です、しかし、特定のキーポイントは、正確な下流の結果を得るよう際に留意する必要があります。胚は、適切な再水和を提供するために、タイロードバッファが含まれているペトリ皿の中のOVOの元を維持すべきです。タイロード緩衝液と卵黄、手術後を水和するために、インキュベーション室が十分に水和されていることを確認することも重要です。任意の出血が表示されているか、卵黄を少しでも壊れている場合の手術は、胚上で実行するべきではありません。これは、特に長期の実験のために、胚の生存に影響を与えます。胚の致死性のもう一つの潜在的な原因は、最初の大幅心機能を損なう、適用された場合OFTの周りのバンドがきつすぎるかどうかです。
現時点では、OFTバンディング時に血流速度の変化を決定するために、確認ツールとして、超音波を使用しています。今後は、マイクロコンピュータ断層撮影を使用して確認します（CT）。また、視覚的にBモード2D画像でOFTの周りのバンドの気密性を決定します。重要なことは、心拍数と体積流量（CFDを用いて計算）に差は縞模様群と対照群17での胚の間で観察されません。これらは、心臓血管系の生理機能は、このように、さらにバンディングの介入を検証し、縞状の胚で損なわれないことを示しています。
所望の時点で、バンディング後、いくつかの分析は、重要なバルブ発生過程で変更された血行動態の影響を理解するために行うことができます。これらは、弁の開発に関与する重要な調節遺伝子の転写レベルの変化を決定するECM成分の局在を決定し、OFTの超微細構造を決定することは、それだけには限定されません。
最後に、この技術は、ウィンドウ卵19内部の胚にOFTバンディングの現在の方法に改善します。その方法は深刻ですLY下流分子分析を行うために必要な胚を蓄積することができないことによって妨げられて。この新しい技術は、同様にレスキュー実験で使用することができます。このアプリケーションは、縞状OFT救出し、胚は侮辱から回復させされることを可能にします。いいえ現在の方法は、これを行わないと、まだ統計的に有意な下流の分析を実行することができることができます。
我々は成功し、非常に初期の発達段階（ - 17 HH 16）でニワトリ胚の心臓部で血行動態の刺激を変更するには、この技術を採用しています。開発の後期の段階で手術を行う際にバンディングプロトコルが原因で胚体外血管のいずれかをニッキングのリスクに挑戦を提示する可能性があります。また、開発の後期段階では、卵の内容物をペトリ皿に移しているとき、インタクトな卵黄嚢を維持することが困難な場合が多いです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
