Abstract
Øjet linse er en gennemsigtig organ, der bryder og fokuserer lys til at danne et klart billede på nethinden. Hos mennesker, at ciliære muskler kontrakt deformere linsen, hvilket fører til en stigning i linsen 'optisk effekt at fokusere på genstande i nærheden, en proces kendt som indkvartering. Aldersrelaterede ændringer i linsen stivhed har været knyttet til presbyopi, en reduktion i objektivets evne til at rumme, og dermed behovet for læsebriller. Selvom mus linser ikke rumme eller udvikle presbyopi, kan musemodeller give et uvurderligt genetisk værktøj til forståelse linse patologier, og accelereret ældning observeret hos mus muliggør studiet af aldersrelaterede forandringer i linsen. Denne protokol viser en enkel, præcis og omkostningseffektiv metode til bestemmelse af mus linse stivhed, ved hjælp af dækglas sekventielt at anvende stigende trykbelastninger på linsen. Repræsentative data bekræfter, at mus linser bliver stivere med alderen, ligesommenneskelige linser. Denne metode er meget reproducerbar og kan potentielt skaleres op til mekanisk test linser fra større dyr.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health og under en godkendt protokol af Institutional Animal Care og brug Udvalg på The Scripps Research Institute.
1. Linse Dissektion
- Afliv mus ifølge anbefalingerne i National Institutes of Health "Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr" og godkendte brug protokoller institution dyr.
- Enucleate øjet fra mus under anvendelse buet pincet. Tryk vævet omkring øjet med pincet for at bringe øjet ud af stikkontakten, og derefter plukke øjet fra soklen med pincetten. Overfør øjne til frisk 1x phosphatpufret saltvand (PBS) i dissektion skål.
- Afbrød synsnerven så tæt på øjeæblet som muligt. Forsigtigt og omhyggeligt indsætte fine lige pincet ind i øjeæblet gennem hullet Where synsnerven forlader posterior.
- gøre omhyggeligt et indsnit med en saks i øjeæblet fra den bageste til kanten af hornhinden. Gnaver linser besætte ~ 30% af øjet. Gør disse indsnit omhyggeligt, og ikke indsætte en pincet eller saks for dybt ind i øjet for at undgå at beskadige linsen.
- Klip langs krydset mellem hornhinden og sclera mindst halvvejs rundt om øjeæblet.
- Skub forsigtigt på hornhinden at fjerne linsen fra øjet gennem åbningen lavet i trin 1.4 og 1.5.
- Brug fine tip lige pincet til forsigtigt at fjerne alle store rester, der stadig er fastgjort til linsen. Efterse linsen for skader før man går videre til stivhed målinger.
2. Stivhed Målinger
- Veje mindst 10 dækglas fra samme kasse ved hjælp af en analytisk balance. Find den gennemsnitlige vægt af dækglassene. For konsistens, bruge den samme kasse med dækglas til alle eksperimenter. Pre-wetden dækglas og retvinklet spejl i 1x PBS ved stuetemperatur i mindst 2 timer før start eksperimenter.
- Fylde kammeret måling (se figur 1) med 65 - 75 ml 1x PBS. Målingen Kammeret blev lavet af plexiglas ved en in-house maskinværksted, og opslåede græstørv i kammeret blev foretaget af en boremaskine presse indstillet til den ønskede dybde med en passende bor. Linser forbliver transparente i 1x PBS ved stuetemperatur i varigheden af mekanisk afprøvning.
Figur 1:. Stivhed målekammer Et billede, der viser dimensionerne af skræddersyede stivhed målekammer med en række opslåede med forskellige dybder og former. De runde opslåede, der er 200 um eller 300 um dybe (gule pilespidser) anvendes til målingerne på musen linser. Divots er 2 mm i diameter og ~ 13-. 14 mm fra kanten af kammeret Klik her for at se en større version af dette tal.
- Placer retvinklet spejl ind i kammeret ved en konstant afstand fra divot, der skal bruges til at holde linsen. Sørg for, at spejlet ikke bevæger sig under eksperimentet.
- Overfør dissekerede linser til måling kammer omhyggeligt med beslaglæggelse pincet eller buede pincet.
- Tag en top-view billede af den ubelastede linsen fra direkte overhead. Tag musen linse fotos på 30X forstørrelse med belysning fra dissektionsmikroskop (nederst) og en fiberoptisk lyskilde på venstre og højre side. Indstil fiberoptiske strømforsyning til 80% af den maksimale lysintensitet. Juster strømforsyningen output baseret på omgivende belysning, brugerens præferencer og billedkvalitet efter behov.
- Tag en side-view billede af den ubelastede linse, der kan ses gennem riGHT-vinkel spejl. Hvis kameraet ikke er kalibreret, tage et billede af spejlet kant i fokus. Spejlet kant er 5 mm lange og denne måling kan senere anvendes til at bestemme pixel / mm og tjene som en målestok bar i billederne.
- Placer linsen ind i divot, og bekræfter, at linsen sidder sikkert og lige i divot. Tag et billede af linsen før ilægning. Linsen skal hvile i divot på forreste eller bageste pol.
- Placer en dækglas forsigtigt på objektivet. Vent 2 minutter for at tillade krybning, og tage en anden side-view billede af den indlæste linse.
- Fortsæt med at tilføje dækglas som i trin 2.8 og under side-view billeder efter tilsætning af hvert dækglas som i trin 2.8, indtil alt 10 dækglas anvendes.
- Fjern alle dækglas. Vent 2 minutter, og tage en side-view billede af linsen (i og uden for divot) efter at fjerne alle dækglas.
3. Linse Nucleus Måling
- at determine linsen kerne størrelse, flytte linsen til en ren petriskål fyldt med 1x PBS.
- decapsulate forsigtigt linsen ved hjælp af fine lige pincet.
- Slough off kortikale fiber celler ved at rulle linsen mellem behandskede fingre. Den resterende linse kerne vil føles som en hård marmor. Brug denne fremgangsmåde til at isolere kernen på voksne linser startende ved 1 måned. Da det isolerede kerne er et stift legeme, kan yderligere mekanisk afprøvning af linsenucleus ikke udføres ved hjælp af denne beskrevne fremgangsmåde.
- skylles forsigtigt linsenucleus i 1x PBS i petriskålen.
- Placer linsenucleus tilbage i målekammeret (ikke i divot), og tage et billede af linsenucleus gennem højre-vinkel spejl.
Figur 2:. En mus Linser Komprimeret af Dækglas (A) Skematisk og (B) fotografi af den færdigetelle setup viser en 2-måneder gamle mus linse i en 200-um-dyb divot i målekammeret fyldt med 1x PBS. En ret vinkel spejl og et digitalt kamera monteret på en dissektion mikroskop blev anvendt til at indsamle billeder af linsen under komprimering af dækglas. (C) Billeder af sagittale visninger af en 2-måneder gamle vildtype linse komprimeret af successivt stigende antal dækglas billede rådata til måling aksiale og ækvatoriale diametre og beregning aksiale og ækvatoriale stammer under dækglas-baseret kompression test. En afspejling af linsen kan undertiden ses i dækglassene (mest tydeligt i 1 dækglasset billede). Når du foretager målinger, ignorere refleksion og måle til spidsen af linsen. (D) Billeder af sagittale visninger af 2 måneder gamle vildtype linse efter kompression og det isolerede linsenucleus. Den post-kompression linse og isoleret kerne sidder uden for divot. Scale barer, 1 mm. Dette tal er modificeret fra Gokhi, et al. PLoS ONE 2012 19. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Image Analysis
- Mål ækvatoriale og aksiale diametre af linser før pålæsning og efter hver læsning trin ved hjælp ImageJ eller lignende software. Mål diameteren af hver linsenucleus. Linsen kerne er næsten kugleformet, så en måling på ethvert orientering vil være tilstrækkeligt 19,21.
- Korrigere linsen aksiale diametre ved tilsætning af dybden af divot anvendes. I målekammeret, divot tilsløret 200 um (2 måneder gamle mus linser) eller 300 um (4 måneder gamle og 8 måneder gamle mus linser) af den aksiale tykkelse af linsen.
- Beregn den aksiale og ækvatoriale stammer fra målinger linsen diameter ved hjælp af ligningen, ε = (d - d 0) / d 0, hvor ε er stammen, d er den aksiale eller equatorial diameter ved en given belastning, og d 0 er den tilsvarende aksiale eller ækvatorial diameter ved nul belastning.
- Plot aksiale og ækvatoriale stammer som funktioner af den påførte belastning (i mg).
- Plot den aksiale, ækvatoriale og nukleare diametre. Beregn og plot linsen billedformatet ved at dividere den aksiale diameter af den ækvatoriale diameter.
- Beregn og plot linsen lydstyrken ved hjælp af ligningen, volumen = 4/3 × π × r E 2 × r A, hvor r E er den ækvatoriale radius og r A er den aksiale radius målt fra billede taget i trin 2.6. Denne ligning antager linsen er en fladtrykt klumpformet (ellipsoide) 1,22.
- Beregn og plot den nukleare lydstyrken ved hjælp af ligningen, volumen = 4/3 × π × r N 3, hvor r N er radius af linsen kerne målt fra billedet taget i trin 3.5. Denne ligning antager linsenucleus Isa kugle 19,21.
- Beregne og plotte den nukleare fraktion som forholdet mellem den nukleare volumen til linsen volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stivheden og dimensioner 2-, 4- og 8-måneder gamle mus linser blev målt. Mus blev alle vildtype-dyr på en ren C57BL6 stamme baggrund opnået fra TSRI Animal Breeding Facility, og hver linse blev indlæst med 1 til 10 dækglas. De aksiale og ækvatoriale stammer blev beregnet som en funktion af påført belastning ved at måle den aksiale og ækvatoriale diametre af linsen efter tilsætning af hver dækglas, og derefter normalisere hver ændring i diameter til den tilsvarende losses diameter. Otte linser fra hver alder blev testet, og resultaterne er udtrykt som den gennemsnitlige ± standardafvigelse. Som vist tidligere 19, aksial stamme er en logaritmisk funktion af påført belastning (figur 3A). Der var en statistisk signifikant aldersafhængig nedgang i aksiale og ækvatoriale stammer under den maksimalt påførte belastning (figur 3), hvilket indikerer, at muse linse stivner med alderen. Stnedbørsmålingen var meget reproducerbar tværs linser af samme alder, hvilket fremgår af de små standardfejl.
De billeddata indsamlet under dette eksperiment blev også anvendt til at bestemme flere andre linse morfologiske karakteristika (figur 4). Som forventet, aksiale og ækvatoriale diametre og linsen steg med alderen (Figur 4A, 4B og 4D). Formatforholdet indikerer, at linsen har en lidt større diameter i tværsnit end aksial diameter, og denne parameter ændrede ikke med alderen (figur 4C). Diameteren, volumen og fraktion af linsen kernen steg med alderen (Figur 4E, 4F og 4G). Disse resultater antyder, at linsenucleus remodels at stige i relativ størrelse som linsen aldre.
Disse data viser, at mus linser øges i stivhed med alderen, ligner ændringer i enging menneskelige linser 9,15. Disse data er også enig med tidligere bemærkninger ved hjælp af en lignende metode 18 og ved Brillouin optisk mikroskopi 23, at mus linser stige i stivhed med alderen. To andre undersøgelser har anvendt den beskrevne fremgangsmåde til at vise, at tropomodulin-1, en actin pegede-end capping protein, CP49, en beaded mellemliggende filament protein og aquaporin 0 er nødvendige for at opretholde linse stivhed 19,20. Med denne metode kan overfloden af musemodeller for linse patologier og accelereret ældning af mus bruges til at forstå linse stivhed ændringer som følge af genetisk variation og / eller ældning. Denne metode kan også tilpasses til linser fra andre arter. Dimensionerne af kammeret anvendt til disse eksperimenter er optimeret til mus linser, men kan let opskaleres for linser fra større arter. I fremtiden vil det være interessant at undersøge, om linsen størrelse skalaer med linse stivhed på tværs af arter.
Figur 3:. Aksiale og Equatorial Strain-load kurver for 2-, 4- og 8-måneder gamle (2 M, 4 M og 8M) Wild-type mus linser (A) Axial trykpåvirkning afbildet som en funktion af den påførte belastning ( mg). (B) Ækvatorial compressive stamme afbildet som en funktion af den påførte belastning (mg). Fire- og 8 måneder gamle objektiver udstillet mindre belastning end 2 måneder gamle objektiver på tilsvarende maksimale belastninger, hvilket indikerer en stigning i linsen stivhed med alderen. **, P <0,01. Bemærk, at Y-aksen er forskellig mellem (A) og (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Morfologiske Karakteristik af 2-, 4- og 8-måneder gamle (2M, 4 M og 8M) Wild-type mus objektiver (A) Axial diameter og (B) diameter i tværsnit progressivt øges med alderen. Linsen formatforhold (C) viser, at muse linser er lidt bredere ved linsen ækvator. Lens volumen (D), nuklear diameter (E), nuklear volumen (F) og nuklear fraktion (G) progressivt øges med alderen. **, P <0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere vigtige overvejelser, når du bruger denne metode til at måle linse stivhed. Først dækglassene påføres linsen på et lidt skrå vinkel (8 - 8,5 °) i forhold til bunden af kammeret (θ). Dette vil gælde en meget lille del af belastningen equatorially snarere end aksialt. Men dette ækvatoriale belastning for ubetydelig, fordi synd θ ≈ 0,1 19. Hvis denne fremgangsmåde tilpasses til større linser, vil vinklen på dækglassene til bunden af kammeret skal måles for at bestemme, om ækvatorial belastning bør indgå i strain beregninger. For det andet er det afgørende at gøre det muligt for linsen at ligevægt efter tilsætning af hvert dækglas. Ventetiden på 2 minutter giver tidsafhængig deformation (dvs.., Krybning) at forekomme, således at billederne kun er taget, når objektivet er på en ligevægt form 19. For det tredje er denne protokol er optimeret til at måle trykstyrke pres på mOuse objektiver på tværs af en bred dynamisk vifte af belastninger. I pilotundersøgelser, en anvendt belastning på 1293 mg (dvs. ti 18 x 18 mm dækglas) komprimeret musen linse til en maksimal belastning, over hvilken øgede belastninger ikke forårsager mærkbar yderligere deformation. Dette er på grund af tilstedeværelsen af den stive linsenucleus der ikke deformeres mærkbart under kompression 19. For det fjerde, denne protokol undgår irreversibel vævsskade. I tidligere publicerede eksperimenter blev der ikke observeret ændringer i de mekaniske egenskaber af muse linser ved gentagen belastning, hvilket antyder, at denne metode ikke beskadiger linsen 19. Når mekanisk teste linser af en anden art eller mutant linser, bør pilotforsøg skal gøres for at bestemme den maksimale belastning er nødvendig for maksimal belastning ved at gentage trin 2,8-2,10 og sammenligne de stamme-belastningskurver, linse diametre og linse mængder mellem den første og anden lastning. Endelig er denne fremgangsmåde tilvejebringer en empirisk måling af stivhed o f hele linsen og kan ikke differentiere bidragene fra forskellige celletyper (epitelceller kortikale fibre, nukleare fibre) og linsekapslen til hel-linse mekaniske egenskaber.
De aksiale og ækvatoriale stammer er plottet her som funktioner af den påførte belastning. Tidligere undersøgelser har kvantificeret muse linse stivhed 19,21, modstandsdygtighed 21 eller ændringen i diameter 18 ved påført belastning. Stamme er en dimensionsløs mængde, der giver mulighed for direkte sammenligning mellem linser af forskellig størrelse. Bemærk at ækvatoriale forlængelse (positiv stamme) forekommer samtidigt med den anvendte aksial kompression (negativ stamme) på grund af bevarelse af linsen volumen (dvs. Poisson effekt). Men de observerede ækvatoriale stammer var meget mindre i absolut størrelse end de aksiale belastninger, hvilket indikerer, at denne fremgangsmåde har mindre opløsning til at detektere små ændringer i ækvatoriale stamme sammenlignet med aksial belastning.
nt "> Sammenfattende kan denne simple metode med en let monteret anordning til måling muse linse stivhed anvendes generelt og bredt i linsen forskning for bedre at forstå, hvordan mutationer i proteiner, patologier og / eller ældning påvirke linse stivhed. Mens mus linser ikke rumme, denne metode kan stadig belyse de proteiner og aldersrelaterede ændringer, der bidrager til øget linse stivhed, og potentielt bidrage med ny viden til at udvikle nye behandlinger for presbyopi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
