Summary
In vitro koloni analyser for å avdekke selvfornyelse og differensiering av stamceller isolert fra voksne murine bukspyttkjertelen er utviklet. I disse assays, pankreas forløpere gir opphav til cellekolonier i tre-dimensjonalt rom i metylcellulose inneholdende halvfast medium. Protokoller for håndtering av enkeltceller og karakterisering av individuelle kolonier er beskrevet.
Abstract
Stilk og progenitorceller fra den voksne bukspyttkjertelen kan være en potensiell kilde for terapeutiske beta-lignende celler for behandling av pasienter med type 1 diabetes. Det er imidlertid fremdeles ukjent hvorvidt stamceller og forløperceller eksisterer i den voksne bukspyttkjertelen. Forskningsstrategier ved hjelp av CRE-lox avstamning-sporing i voksne mus har gitt resultater som enten støtte eller avkrefte ideen om at beta-cellene kan genereres fra kanalene, den antatte stedet der voksne bukspyttkjertelen stamfedre kan ligge. Disse in vivo CRE-lox avstamning-sporing metoder, men kan ikke svare på spørsmål om selvfornyelse og multi-avstamning differensiering-to kriterier som er nødvendige for å definere en stamcelle. For å begynne å ta opp dette tekniske gap, utviklet vi tre-dimensjonale koloni analyser for bukspyttkjertelen stamfedre. Snart etter vår første utgivelse, andre laboratorier uavhengig utviklet en lignende, men ikke identisk, metode kalt organoid analysen. Sammenlignet med organoid analysen, benytter vår metodemetylcellulose, som danner viskøse løsninger som tillater inkludering av ekstracellulære matriksproteiner ved lave konsentrasjoner. De metylcellulose inneholder analyser tillate enklere gjenkjenning og analyser av stamceller ved encellede nivå, som er kritisk når stamfedre utgjør en liten sub-populasjon, slik tilfellet er for mange voksne organ stamceller. Sammen Resultatene fra flere laboratorier demonstrere in vitro selvfornyelse og multilineær differensiering av progenitorceller pankreas-liknende celler fra mus. De nåværende protokoller beskriver to metylcellulose baserte koloni analyser for å karakterisere mus bukspyttkjertelen stamfedre; en inneholder en kommersiell fremstilling av murine ekstracellulære matriksproteiner og den andre en kunstig ekstracellulære matriks-protein kjent som en laminin hydrogel. Teknikkene som vises her er 1) dissosiasjon i bukspyttkjertelen og sortering av CD133 + Sox9 / EGFP + duktale celler fra voksne mus, 2) enkelt celle manipulering av sunderstøttes celler, 3) enkelt koloni analyser ved hjelp av mikrofluid QRT-PCR og hel-mount farging, og 4) dissosiasjon av primære kolonier i encellede suspensjoner og re-plating i videregående koloni analyser for å vurdere selvfornyelse eller differensiering.
Introduction
Bukspyttkjertelen er sammensatt av tre hovedcelle linjer; acinar cellene skiller ut fordøyelsesenzymer, kanaler skiller ut mucin å avverge patogener og transportere fordøyelsesenzymer til tarmen, og endokrine cellene skiller ut hormoner, inkludert insulin og glukagon, som opprettholder glukose homeostase. I løpet av den embryoniske utviklingen av bukspyttkjertelen, de tidlige ductal cellene er kilden for tri-potent stamceller som er i stand til å gi opphav til de tre linjene i pankreata av voksne dyr 1,2. Ettersom voksne stamceller og forløperceller, slik som benmarg stamceller, er allerede med hell anvendes for å behandle ulike sykdommer 3, er det stor interesse i å finne de stamceller og forløperceller i den voksne bukspyttkjertelen. Ved isolering og manipulering av voksne bukspyttkjertelen stilk og stamceller var mulig, kan disse cellene bli brukt til behandling av sykdommer så som type 1-diabetes, hvor de insulinsekreterende cellene blir ødelagt av autoimmunitet.
in vivo CRE-lox avstamning-tracing teknikker, Inada og medarbeidere viste at voksne murine duktale celler merket med en markør, karboanhydrase II, kan gi opphav til alle tre bukspyttkjertelen linjene 4. Men ved å bruke andre duktale markører, for eksempel HNF1b 5 og Sox9 2, ble det konkludert med at ductal celler er ikke den viktigste kilden til beta-cellene i voksen mus.
For flere år siden foreslo vi at årsaken til den foran nevnte debatt kan skyldes mangel, innen 6,7, av hensiktsmessige analytiske verktøy som kan brukes til å måle selvfornyelse og multilineær differensierings to kriterier er nødvendig for å definere en stamcelle. In vivo CRE-lox avstamning-tracing teknikk nevntovenfor kan gi bevis for stamfar-avkom forhold på befolkningsnivå. Imidlertid er denne linjen tracing teknikk begrenset i sin makt for å avgjøre om enkelt stamceller kan fornye seg selv og skille ut flere linjene. Encellede analyse er viktig fordi hvis flere mono-potent stamfedre, hver med en annen avstamning potensial, ble analysert sammen, kan de kollektivt synes å ha multi-avstamning differensiering evner. I tillegg stamceller er vanligvis en mindre populasjon av en voksen organ. Virksomheten til en mindre celle befolkning kan bli maskert av den store befolkningen. Derfor ikke et negativt resultat fra en befolkningsundersøkelse ikke nødvendigvis indikerer fravær av stamceller. Til slutt, ikke cre-lox avstamning tracing for øyeblikket ikke at måling av selvfornyelse.
For å begynne å ta opp teknisk gap i feltet av pankreas stamcellebiologi, koloni 7-11 eller 12-15 organoid metoder og utstyr tabell), og den andre inneholder laminin hydrogel, en definert kunstig ECM protein 7-11. Stamceller blandes i halvfast medium inneholdende metylcellulose. Methylcellulose er et biologisk inert og tyktflytende materiale fremstilt av trefibre, og har blitt rutinemessig brukt i blodkreft koloni analyser 16. Den metylcellulose inneholdende halvfast medium begrenser bevegelsen av enkelt stamceller, slik at de ikke kan re-aggregat. Likevel er det medium myk nok til å tillate en stamceller til å vokse og differensiere til en koloni av celler i 3D-rommet. Etter tradisjonen av Hematologer, en bukspyttkjertelen stamceller som var i stand til å gi opphav til en koloni av celler var named en pankreatisk kolonidannende enhet (PCFU). PCFUs, når dyrket i murine ECM-holdige koloni analysen, gir opphav til cystisk kolonier som er navngitt "ring" kolonier 7. Ved tilsetning av en Wnt agonist, R-spondin1, inn i murine ECM-holdige kultur, noen Ring koloniene slå inn "Tett" kolonier 7. I denne artikkelen, er disse to typer av kolonier dyrket i murine ECM kultur kollektivt referert til som "Ring / tette" kolonier. Når ring / tette kolonier er dissosiert til enkelt celle suspensjon og re-belagt i kulturer som inneholder laminin hydrogel, "Endocrine / acinar" kolonier dannes 7.
Ved hjelp av enkelt koloni analyser, ble det funnet at flertallet av Ring / Tette og endokrine / acinar kolonier, enten fra voksen (2-4 måneder gamle) 7,11 eller ung (1 uke gammel) 9 murine bukspyttkjertelen, uttrykke alle tre Lineage markører. Dette tyder på at de fleste av de som kommer PCFUs er tri-potent. I murine ECM-holdige koloni analysen, voksen murine PCFUs robust selv fornye og utvide ca 500.000 ganger i løpet av 11 uker i kultur 7. Murine ECM støtter fortrinnsvis differensieringen av celler ductal enn endokrine og acinar linjene, mens i nærvær av laminin hydrogel, er murine PCFUs oppfordres til å differensiere preferensielt inn i endokrine og akinærceller og i mindre grad til den duktal avstamning 7,9,11. Viktigere, Insulin Glucagon + - mono-hormonelle celler blir generert i laminin hydrogel kulturen og utskiller insulin som svar på glukose stimulering in vitro 7,9, noe som tyder på funksjonell modenhet. Tri-avstamning differensiering potensial 7,9 og selvfornyelse 11 av individuelle PCFUs er bekreftet av encellede micromanipulation, dvs. dyrking av en celle per brønn for kolonidannelse. Sammen utgjør disse resultatene gir bevis for at det er selvfornyende, tri-pot, progenitor-lignende celler i postnatal murine bukspyttkjertelen som viser aktiviteter i 3D kultur.
De murine PCFU analysene beskrevet i denne artikkelen er hentet fra en tidligere koloni analysen designet for stamceller differensiert fra murine embryonale stamceller (mESCs) 17. At protokollen er dokumentert i detalj i en annen Jove publikasjon 18. Kultur komponenter og teknikker som er nødvendige for å utføre den murine ECM-inneholdende koloni assay for et voksent PCFUs er de samme som for Mesc-avledede stamceller 17,18. Derfor vil disse aspektene av analysen ikke bli gjentatt her; i stedet følgende prosedyrer vil bli tatt opp: 1) dissosiasjon av den voksne bukspyttkjertelen og sortering CD133 + Sox9 / EGFP + duktale celler, som beriker PCFUs fra voksen mus 7, 2) encellede manipulering av de sorterte celler, 3) single-koloni analyser ved hjelp microfluidic QRT-PCR og hel-mount farging, og 4) dissosiasjon av Colonies inn enkeltcellesuspensjon og re-plating inn murine ECM eller laminin hydrogel koloni analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk Uttalelse: Vi holder oss til de allment aksepterte etiske standarder i å drive forskning for å sikre kvalitet og integritet av resultatene. Dyreforsøk er gjennomført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité på City of Hope.
1. Forbered Single-celle Suspensjon fra Adult Murine pankreata
MERK: I tidligere publikasjoner 7,11, ble CD-en eller B6 bakgrunns mus som brukes; begge bakgrunn ga lignende resultater. En transgen muselinje (betegnet Sox9 / EGFP) med forbedret grønn fluorescens protein drevet av Sox9 loci 19,20, ble opprettet i CD-en bakgrunn.
- Avlive tre til fem voksne mus bruker gassen CO 2 for 1-2 min eller til åndedrettsstans. Deretter utfører halshugging på hver mus.
- Dissekere og Klargjør pankreata.
MERK: Skjær mus så snart som mulig etter at aktiv dødshjelp. Dette er viktig for å unngå auto-fordøyelse av pankreas pgatil post-mortem endringer.- Lag en vertikal snitt på midtlinjen av bukveggen av musen ved hjelp av saks og åpne bukhulen. Finn milten og bruke pinsett for å forsiktig løfte den. Skjær bindevev mellom milten og milt lapp i bukspyttkjertelen med saks.
- Gjenta denne praksisen for duodenal og mage lapper i bukspyttkjertelen. Plasser de pankreatiske vev i en petriskål på is inneholdende kald Dulbeccos modifiserte fosfatbufferoppløsning (DPBS), 0,1% bovint serumalbumin (BSA), og penicillin og streptomycin (P / S; komplett løsning betegnet PBS / BSA).
- Fjern fett vev fra bukspyttkjertelen under et dissekere mikroskop ved hjelp av fin-tip pinsett.
MERK: Dette er avgjørende for helsen til de dissosierte bukspyttkjertelen celler i følgende trinn.- (Valgfritt) Sjekk pankreata for grønn fluorescens under fluorescens stereo bruker 488-509 nm eksitasjon å sikreEGFP uttrykk.
- I en vevskultur hette, skyll vevet tre ganger etter hverandre i tre 100 mm petriskåler som inneholder 10 ml kald PBS / BSA.
- Lag en vertikal snitt på midtlinjen av bukveggen av musen ved hjelp av saks og åpne bukhulen. Finn milten og bruke pinsett for å forsiktig løfte den. Skjær bindevev mellom milten og milt lapp i bukspyttkjertelen med saks.
- Generere små biter av vev.
- Overfør dissekert pankreata til en tørr steril petriskål for å fjerne så mye PBS / BSA som mulig, og overføre dem til en annen tørr Petri-skål på is.
- Forbered PBS / BSA inneholdende DNase I ved tilsetning av 2 ul DNase I stamoppløsning (1 million enheter [MU] / ml) per 1 ml PBS / BSA.
NB: Denne løsningen er betegnet med PBS / BSA / DNase I. Kontroller ~ 200 ml av denne oppløsning på en gang, noe som vil dekke en sortering eksperiment. - Finhakk pankreata bruker våren saks i 2-3 min eller til vevet er i fine biter. Legg 2-3 ml kald PBS / BSA / DNase I til vevet bitene i petriskål for å suspendere dem.
- Overfør vevet stykker til et 50 ml konisk rør på is med en 10 ml pipette. Bringe det totale volum til 10 ml med PBS / BSA / DNase l etter å utvinne så mye vev som mulig.
- Fordøye bukspyttkjertelen Brikker på det meste enkeltceller.
- Legg kollagenase B (100 mg / ml stam) ved 350-450 ul / 10 ml til vevet stykker og inkuber i vevet ved 37 ° C i et vannbad i 8 min, virvlende hver 3-4 min. Bruke en 10 ml sprøyte med en 16 G nål ½ for å trekke opp og deretter spraye vevet oppløsningen ned veggen av 50 ml rør ved RT. Gjenta dette syv ganger.
MERK: Bruk nok kraft til å bryte opp cellegruppene, men unngå å generere bobler som kan drepe celler. - Returnere røret i vannbad ved 37 ° C i 8 minutter og bland ved å svinge hver 3-4 min. Sprøyten vevet opp og ned syv ganger, som nevnt ovenfor, og plassere en prøve (10 ul) av vevet løsning på en tørr Petri-skål. Observer vevet løsningen under en invertert, fase-kontrast, lys mikroskop med en 10X objektiv. Forvent enkeltceller og noen små-sized cell klynger som kan være tilstede.
- Håndtak cellene på is fra dette punktet på å bremse eller stoppe aktiviteten av kollagenase. Juster volumet til 50 ml ved hjelp av kald PBS / BSA / DNase I. Sentrifuger cellene ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og resuspender i 5 ml kald PBS / BSA / DNase ved hjelp av en pipette P1000.
- Legg kollagenase B (100 mg / ml stam) ved 350-450 ul / 10 ml til vevet stykker og inkuber i vevet ved 37 ° C i et vannbad i 8 min, virvlende hver 3-4 min. Bruke en 10 ml sprøyte med en 16 G nål ½ for å trekke opp og deretter spraye vevet oppløsningen ned veggen av 50 ml rør ved RT. Gjenta dette syv ganger.
- Filter for å gi en enkelt cellesuspensjon og Wash.
- Filtrer cellene gjennom en 70 mikrometer nylon mesh filter cup og deretter gjennom en 40 mikrometer nylon mesh filter cup.
- Resuspender cellene i 5 ml kald PBS / BSA / DNase I og telle cellene.
MERK: For 2-4 måneder gamle B6 eller CD-1 mus, kan hver bukspyttkjertelen gi ~ 5 eller 10 millioner celler, henholdsvis. Disse tallene kan variere mellom ulike experimentalists. Hvis overdreven cellerester er funnet på telling, bringe volumet til 50 ml med kald PBS / BSA / DNase I og sentrifuger cellene ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. - Juster volumet av cellesuspensjonen til en konsentrasjon på 2 x 107 celler / ml ved bruk av kald PBS / BSA / DNase I.
2. Sortere Cells å berike bukspyttkjertelen kolonidannende stamfedre
MERK: Fra B6 mus, CD133 + men ikke CD133 - cellene er anriket for PCFUs 7,9,11. CD133 + -celler representerer ~ 13% av den totale dissosierte bukspyttkjertelen celler etter at alle port parametere er påført 11. Fra CD-1 mus, CD133 + Sox9-EGFP + celler representerer vanligvis ~ 4% av totale bukspyttkjertelen celler, og denne cellepopulasjonen er beriket for PCFUs 7. Sortering av CD133 + Sox9 / EGFP + celler er beskrevet her.
- Flekk dissosierte bukspyttkjertelen celler.
- Blokkere hele pankreas enkeltcellesuspensjon for å redusere ikke-spesifikk binding ved inkubering av enkeltcellesuspensjon med anti-mus CD16 / 32 ved 10 ug / ml endelig konsentrasjon i 5 min på is.
- Fjerne en prøve av 1 x 10 6-celler (50-# 181; l) for å flekke med isotype kontroll-antistoff, biotin-konjugert rotte lgG1 ved 5 ug / ml endelig konsentrasjon, i 20 minutter på is, virvlende hver 5-7 min.
- Fjern en delmengde av 1 x 10 6 celler (50 mL) og holde på is som en unstained kontroll.
- Flekk resten av cellene med en biotin-konjugert anti-mus CD133 primær antistoff, ved 5 ug / ml endelig konsentrasjon, i 20 minutter på is, virvlende hver 5-7 min.
- Vaske Cells.
- Vask isotypekontroll og primære antistoff-farget prøver ved å bringe volumet til 1 ml med PBS / BSA / DNase I og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Gjenta dette vasketrinn.
- Resuspender isotypekontroll og primære antistoff-fargede prøver i PBS / BSA / DNase I, slik at den endelige konsentrasjonen er 2 x 10 7 celler / ml.
- Flekker på isotypekontrollantistoff og primære antistoff-farget prøvene med streptavidin (STV) -merket allofykocyanin (APC) ved 2 & #181; g / ml sluttkonsentrasjon. Inkuber i 15 min på is, virvlende hvert 5-7 min.
- Vasking av celler og 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) farging.
- Vask isotypekontroll og primære antistoff-farget prøvene to ganger med PBS / BSA / DNase I, som i trinn 2.2. Resuspender cellene i PBS / BSA / DNase I med DAPI (0,2 pg / ml sluttkonsentrasjon). Det endelige volum av isotype kontrollprøve bør være 0,5 ml.
MERK: Pass på at den endelige tettheten av det primære antistoff-farget prøven er hensiktsmessig for sorter som skal brukes. En konsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml blir rutinemessig brukt for sortering. - Juster volumet av de ufargede celler til 0,5 ml med PBS / BSA / PS / DNase I. Filter alle celler gjennom en 20 pm sikt før sortering og holde cellene på is i mørket.
- Vask isotypekontroll og primære antistoff-farget prøvene to ganger med PBS / BSA / DNase I, som i trinn 2.2. Resuspender cellene i PBS / BSA / DNase I med DAPI (0,2 pg / ml sluttkonsentrasjon). Det endelige volum av isotype kontrollprøve bør være 0,5 ml.
- Sortering av celler.
- Bruk en 80 mikrometer eller større dyse for sortering.
MERK: Murine bukspyttkjertelen endokrine celler er utsatt for fysisk stress. HoWever, trenger murine PCFUs ikke ut til å være påvirket av stress forårsaket ved å passere gjennom en sorter 7. - Acquire celle arrangementer og analyseparametere på sorter. Gate cellene for forover og sidespredningsområder for å utelukke celleavfall 7. Gate for forover og side scatter bredder for å utelukke celle dubletter. Gate for å utelukke DAPI + døde celler 7. Velg gating parametere for EGFP og CD133-APC signaler basert på verdiene fra isotype kontrollcellene (figur 1).
- Samle de sorterte cellene inn i 5 ml polystyrenrør som inneholdt 1,5 ml DMEM / F12-medium supplert med 5% føtalt kalveserum (FCS). Sentrifuger de sorterte populasjonene ved 400 xg i 5 minutter og resuspendert i et lite volum (~ 200 ul) av enten DMEM / F12 eller PBS / BSA / DNase I supplert med 5% FCS. Hold cellene på is inntil bruk.
- Bruk en 80 mikrometer eller større dyse for sortering.
- Tell antall CD133 + Sox9-EGFP + celler hentet fra sorter. ta en10 ul celleprøve og telle cellene med et hemacytometer for å bestemme den celletetthet.
MERK: hemacytometer bruk anbefales fordi maskintellinger fra sorter er ofte upålitelige.
3. Plate de sorterte cellene i kolonien analysen som inneholder Murine ECM Proteiner
MERK: Vennligst referer til de detaljerte protokoller for plating av celler inn i murine ECM-holdige koloni analysen i et annet Jove publikasjon 18.
- Forbered Culture Media.
- Fremstille et kulturmedium inneholdende DMEM / F12-medium, 1% (vekt / volum) metylcellulose, 5% (v / v) murine ECM-proteiner, 50% (v / v) kondisjonert medium fra Mesc-avledede pankreas-lignende celler, 5% (v / v) FCS, 10 mmol / l nikotinamid, 10 ng / ml human rekombinant aktivin B, 0,1 nmol / L Exendin-4, og 1 ng / ml vaskulær endotelial vekstfaktor-A. Fremgangsmåter for generering av det kondisjonerte medium er beskrevet andre steder 18.
- Legg 750 ng / ml RSPO-1 til mediethvis Tett kolonidannelse er ønsket.
- Inkuber murine ECM-proteinet kultur ved 37 ° C og 5% CO2 i 3 uker.
4. Kultur de sorterte cellene på en Cell Per Vel
MERK: Følgende prosedyrer gjelder å manipulere enkeltceller ved hjelp av hender og munn pipetter. En alternativ tilnærming er å kjøpe en micromanipulator. En typisk micromanipulator inneholder en invertert mikroskop med en joystick-opererte, motoriserte plattform.
- Forbered Glass Pasteur pipetter.
- Ved hjelp av en Bunsen-brenner, trekke ut spissen av et glass Pasteur-pipette til en fin spiss (~ 30 mikrometer ved åpningen). De glass Pasteur pipetter bør ha en bomullspropp for å skape en barriere for luftstrømmen fra operatøren.
- Autoklavere flammet glass Pasteur pipetter ved 121 ° C i 20 minutter for sterilisering.
- Forbered 96-brønners plater for kultur.
- Forbered kaldt halvfast dyrkingsmedium according til tidligere beskrevet protokoll 18.
- Tilsett medium inn i de indre brønnene til en lav-bindende flatbunnet 96-brønns plate ved 100 ul / brønn ved anvendelse av en 1 ml sprøyte. Fylle de ytre brønnene med sterilt vann for å opprettholde fuktigheten.
- Plasser kulturen fatet på is inntil bruk.
- Forbered Sortert Cells.
- Legg ~ 6.000 celler oppsamlet fra en sorterer til 2,5 ml sluttvolum av DMEM / F12 / PS inneholdende 10% FCS og 1% metylcellulose i en 5 ml polystyrenrør. Rist kraftig for å blande komponentene. Vent i 5 minutter eller inntil boblene flyte til toppen av røret. Dette trinnet trenger ikke å bli utført på is.
- Tilsett celleløsning til to 35 mm skåler ved 1 ml / skål ved bruk av en 1 ml sprøyte med en 18 G nål ½.
- Spre cellen løsningen i fatet ved å riste fatet for hånd. Ikke la halvfast medium for å nå grensen til 35 mm fatet, som enkeltceller på marginen av brønnen Cannot ses klart ved hjelp av et invertert mikroskop lys.
- Klargjør arbeidsområdet rundt et mikroskop.
- Foreta en oppløsning inneholdende DMEM / F-12 medium og 1% metylcellulose uten celler ( "no-celle" medium), og utlevere løsningen (som beskrevet i 4.3.2) i to 35 mm petriskåler (1 ml per skål) .
- Rengjør og tørk arbeidsområdet rundt en omvendt fase-kontrast mikroskop med 70% alkohol.
- Monter Pipetter med munnstykket.
- Plukk en steril glass Pasteur pipette som ble utarbeidet i trinn 4.1. Fest den store enden av en 1 ml plast pipettespissen til toppen av glass Pasteur pipette. Fest den lille enden av en plast ml pipette til en ende av et tynnvegget rør av gummi, og munnstykket til den andre enden av røret. Bruk samme glass pipette for å plukke opp flere celler av den samme gruppe.
- Utarbeide, gjennom munnen suging, et lite volum (~ 10 til 50 pl) av"No-cell" semi-faststoff-løsning i trinn 4.4.1 med glass Pasteur pipette.
MERK: semi-faststoff-løsning i den trange åpningen av glass Pasteur pipette skaper strømningsmotstand og tilveiebringer en barriere for å hindre forurensning av cellene som skal plukkes.
- Plukk en enkelt celle.
- Plasser 35 mm skål inneholdende de sorterte celler på objektbordet og ta av lokket.
- Finne celler ved anvendelse av et 10X objektiv og vekt på en egnet celle som skal plukkes.
- Finne og plassere åpningen av pipettespissen ved siden av cellen av interesse. Anvende sug gjennom munnen.
MERK: bevegelse av cellen bør være ganske sakte, slik at det ikke er fare for å miste cellen under prosessen senere. Bevegelsen av cellen inn i åpningen av pipetten skal være synlig. Hvis strømningen beveger seg for raskt, endres til en pipette med en smalere åpning.
- Deponere enkelt celle i en kultur Well.
- Når cellen er i pipetten, bruker tungen for å stoppe strømningen ved å blokkere åpningen av munnstykket. Kort pause før uttak av spissen fra halvfast medium for å sikre at halvfast medium har stoppet strømmer.
- Plassere spissen av pipetten inn i en brønn i 96-brønns plate fremstilt i trinn 4.2. Skyv celle langsomt ut ved å forsiktig blåse i munnstykket. Mark brønnen etter at cellen er satt inn, for å unngå plating to celler i en brønn.
- Kontroller at en enkelt celle er plassert i en kultur Well.
- Sett pipettespissen i "no-celle" medium fremstilt i trinn 4.4.1. Mens observere åpningen av spissen under mikroskop, presse ut den gjenværende halvfaste løsning. Forventer ingen celle til å strømme ut spissen av pipetten.
- For å dobbeltsjekke, finne plasseringen i kulturen godt hvor enkelt celle ble implantert.
- Culture de enkle celler ved 37 ° C i 5% CO2 inntiltil 3 uker.
5. Plukk individuelle kolonier fra Semi-solid kultur for mikrofluid QRT-PCR-analyse
MERK: Tre uker etter plette sortert CD133 + Sox9 / EGFP + celler inn i den murine ECM-inneholdende koloni-analysen, er ring eller tette kolonier dannet 7 (figur 2). Når ring / tette kolonier blir dissosiert til enkeltcellesuspensjon og re-platet ut laminin hydrogel kultur, Endocrine / acinar kolonier ble generert etter omtrent en uke 7 (figur 2). For å bestemme avstamning sammensetningen av hver koloni, er microfluidic QRT-PCR-analyse brukes til å oppdage uttrykk for avstamning markører 7. For pre-forsterkning, er en koloni blandet i en master mix inneholder en TaqMan probe blanding, reaksjon buffer, og Super III 21. Den 48.48 rekke chip senere brukes til microfluidic PCR reaksjoner 21.
- Forbered pre-PCRblande inneholder 48 sonder.
- Pipetter 1,5 ul av hver TaqMan probe (20x lager) i et 1,5 ml rør. Legg 78 mL av TE buffer for å justere volumet til 150 mL.
- Forbered master mix av følgende protokoller fra produsenten 21.
- Plasser 9 mL av master-blandingen i hver 0,2 ml tynnvegget reaksjonsrøret egnet for PCR, og gjenta dette trinnet for inntil 48 rør.
- Plukke enkeltkolonier fra det halvfaste kultur.
MERK: Ring / tette kolonier er større enn endokrine / acinar kolonier, med diameter fra ~ 50-400 mikrometer 9,11. Derfor er enkelt ring / tette kolonier plukket bruker en P10 pipettor utstyrt med en 10 mL pipette tips som er bøyd til en buet form. For å plukke den lille Endocrine / acinar kolonier (figur 2), se trinn 4.- Finn en koloni av interesse under høyt forstørrelse (f.eks 20X objektiv), redusere forstørrelsen, og aspirate kolonien. (Valgfritt) Ta en fasekontrastbilde av kolonien på dette trinnet for å dokumentere de synlige egenskapene til kolonien.
- Overfør kolonien inn i PCR rør som inneholder 9 mL mester mix.
- Plukk neste kolonien. Opp til 45 kolonier totalt kan analyseres per PCR-kjøring, forlater 3 spots for kontroller.
- RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese med pre-forsterkning.
- Vortex prøvene kraftig før du utfører termisk reaksjon.
- Utfør de termiske sykkel reaksjoner i henhold til produsentens instruksjoner 21. Ring / tette kolonier krever 14 sykluser, endokrine / acinar kolonier kreve 16-20 sykluser, og enkeltceller krever 22 sykluser.
MERK: Pre-forsterknings cDNA kan oppbevares ved -20 ° C før mikrofluid PCR-analyse.
- Kjør påfølgende PCR-reaksjoner, ved hjelp av en microfluidic chip, i henhold til produsentens instruksjoner 21.
- Harvest og Fix koloniene.
- Plukk opp kolonier under mikroskopet, som i trinn 4 eller 5.4, og legge dem til en 4% paraformaldehyde løsning. Inkuber O / N ved 4 ° C med forsiktig risting.
- Vask kolonier med 1 x PBS to ganger i 10-30 minutter ved romtemperatur. Lagre de faste koloniene ved 4 ° C i 1,5 ml rør forseglet med parafin.
- Flekk koloniene med antistoffer.
- Overfør kolonier til en brønn av en 96-brønns sort plate med en klar bunn inneholdende 200 ul blokkeringsbuffer (5% esel og / eller geiteserum, 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS). Inkuber O / N ved 4 ° C med forsiktig risting.
- Fortynn det primære antistoff til en forhåndsbestemt konsentrasjon (for eksempel 1: 500 for hamster anti-mucin en antistoff) ved hjelp av blokkeringsbuffer. Overfør koloniene til en ren godt med 200 ul av primær antistoff, og inkuber O / N ved 4 ° C med forsiktig risting. Waske koloniene 3 ganger med PBS inneholdende 0,1% Tween 20. Overføring av koloniene inn i en ny brønn med 200 ul av 1 x PBS / 0,1% Tween 20 i 10 minutter ved RT for hver vask.
- Fortynn det sekundære antistoff til en forhåndsbestemt konsentrasjon (f.eks, 1: 2000 for geit anti-hamster-antistoff armensk) ved hjelp av blokkeringsbuffer. Oppbevar løsningen i mørket. Overfør koloniene for å rense brønnene inneholdende 200 ul av sekundært antistoff, og inkuber i 2 timer ved RT. Vask koloniene 3 ganger med PBS / 0,1% Tween 20, som i trinn 6.2.2.
- Counter-beis kolonier med DAPI og visualisere med konfokalmikroskopi.
- Overfør koloniene i brønner med PBS inneholdende 300 nM DAPI og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
- Overfør DAPI-farget kolonier til en 35 mm glass-bottom petriskål for visualisering. Plassere et dekkglass på toppen av koloniene for å hindre fordampning.
- Bruk en konfokal mikroskop for å fange bilder. For å visualisere DAPI staining, bruker to-foton eksitasjon bølgelengde på 730-950 nm. Bruk en argon laser med en bølgelengde på 458 nm å opphisse fluorokromer med emisjonsbølgelengder av 519 og 561 nm. Bruk en helium-neon laser med en bølgelengde på 633 nm å opphisse fluorokromer med emisjonsbølgelengder av 665 nm.
7. dissociate og Re-plate Primær Ring / tette kolonier i Sekundære Colony Analyser
MERK: Alle prosedyrer skal utføres under sterile forhold. Unngå kuldesjokk til cellene i denne fremgangsmåten så mye som mulig, for eksempel å sette cellene på is eller vaske cellene med kald PBS / BSA. Slik praksis redusere levedyktigheten til re-belagt celler.
- Forbered Solutions.
- Pre-varm vaskebuffer (DMEM / F12; P / S, 0,1% BSA) i en 37 ° C vannbad.
- Forvarme en 96-brønns plate (flat bunn, lav binding) over i et 37 ° C inkubator. Tilsett 100 ul 100% FCS til en brønn på platen, og 100 ul 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning til en annengodt.
- Samle koloniene.
- Plukk og basseng totalt 20 eller flere ring / tette kolonier i primærkulturer ved hjelp av 10 pl pipettespisser, som beskrevet i trinn 5.4.
- Plasser koloniene i varm (minst RT) vaskebuffer (~ 1000 ul) i et 1,5 ml rør og sentrifugering ved 400 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten.
- Distansere koloniene i encellede utestengelse Bruke Trypsin.
- Overføre det resterende volumet (20 pl eller mindre), som inneholder kolonier, i brønnen som inneholder varm trypsin-løsning (fremstilt i 7,1).
- Inkuber platen i en 37 ° C inkubator (ikke vannbad) i 1,5 min. Ta av platen og pipetter koloniene et par ganger. Inkuber ved 37 ° C i ytterligere 1,5 min.
- Ta av platen og pipette opp og ned et par ganger for å bryte opp koloniene. Sjekk under mikroskop for å se om koloniene har blitt spredt hovedsakelig til enkeltcellesuspensjon.Unngå over-fordøyelse av koloniene.
- Stopp Trypsin reaksjonen ved å tilsette FCS.
- Overfør 100 ul av varme FCS i brønnen som inneholder cellene. Pipetter opp og ned et par ganger. Overfør cellene inn i et 1,5 ml rør inneholdende 1,000 mL varm vaskebuffer. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved RT.
- Vask to ganger med varm buffer.
- Re-suspendere cellene i ~ 200 pl buffer eller dyrkningsmediet.
- Telle antall celler ved hjelp av et hemacytometer. Hold cellesuspensjonen ved romtemperatur.
- Re-plate dissosierte celler i sekundære kolonianalyser som inneholder enten murine ECM-proteiner (5% v / v) eller laminin hydrogel (100 ug / ml) og inkuberes cellene ved 37 ° C med 5% CO2.
MERK: For å re-plating celler i murine ECM proteiner, bruke 2,500-5,000 celler per brønn og kultur i 2-3 uker. For re-opplegget til laminin hydrogel kultur, bruke 10,000-25,000 celler per brønn og kultur i 7-12 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksen bukspyttkjertelen stamceller kan bli beriket av fluorescens-aktivert celle sortering (figur 1). Den Sox9 / EGFP transgen muselinje som brukes her først ble generert som et resultat av den GENSAT Brain Atlas Prosjekt 19, og den EGFP reporteren er under kontroll av et bakterielt kunstig kromosom inneholdende ~ 75 kb oppstrøms og ~ 150 kb nedstrøms-sekvensene i Sox9 20 . I disse musene, etiketter EGFP pancreatic kanaler effektivt og spesielt 22. Pancreas ble anskaffet og dissosiert til en enkelt cellesuspensjon, og farget med anti-CD133 antistoff som er konjugert med biotin, etterfulgt av farging med sekundære antistoffer konjugert med STV-APC. De resulterende celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri med passende port parametere (figur 1). Celler oppnådd ved anvendelse av forskjellige port parametre kan sorteres og platet inn i metylcellulose inneholdende koloni-analyser forkolonidannelse. I tidligere studier, ble det bemerket at kolonidannende evne er bare funnet i den sorterte CD133 + Sox9 / EGFP + duktale celler 7.
Koloniene dannet i metylcellulose inneholdende koloni-analyser ble klassifisert i henhold til deres morfologi, som observert ved hjelp av et invertert, fase-kontrast mikroskop lys (figur 2). Deretter ble individuelle kolonier ble håndplukket og analysert ved hjelp av mikrofluid QRT-PCR-analyse for genekspresjon (figur 3), eller av hel-mount farging for protein ekspresjon (figur 4). I publiserte studier 7,9,11, ble det funnet at mange individuelle kolonier uttrykte avstamning markører for kanalen (mucin-1), acinar (amylase) og endokrine (insulin) celler, noe som indikerer at de fleste av de initierende PCFUs for disse koloniene finnes tri-potent. Andelen av de tre celle linjene i hver koloni Imidlertid var påvirket av hvilke typer og konsentrasjoner av ECM-proteiner til stede i metylcellulose inneholdende koloni-analyser 7,9. Murine ECM proteiner stimulert selvfornyelse av PCFUs og duktalt celledifferensiering mens laminin hydrogel fortrinnsvis støttet differensiering av endokrine og acinar celle linjene 7,9,11.
Figur 1. Flowcytometri analyse av dissosiert bukspyttkjertelen celler fra voksne mus som viser fargemønstre i henhold til to duktale cellemarkører, CD133 og Sox9 / EGFP transgene mus Sox9. Som inneholdt Sox9 loci-drevet EGFP reporter ble brukt. En representant sortering gate (rød boks) for bukspyttkjertel CD133 + Sox9 / EGFP + celler er vist. CD133 + Sox9 / EGFP + celler er beriket for PCFUs 7.les / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kolonier med ulik morfologi ble generert i metylcellulose holdig koloni analyser. Representative photomicrographs av Ring, er tette og endokrine / acinar kolonier fra en fasekontrastmikroskop opplyst av synlig lys vist. Ring og tette kolonier genereres når ferske sortert PCFUs sådd ut kulturmedium som inneholder murine ECM proteiner og dyrket i 3 uker 7. Endocrine / acinar kolonier dannes etter re-plating den dissosiert Ring eller Tett koloni celler i dyrkingsmedium som inneholder en laminin hydrogel og kultivert for ~ 1 uke 7. Skala barer for Ring og tette kolonier = 100 mikrometer. Scale bar for Endo / acinar kolonier = 25 μ; m. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Enkelte kolonier dyrket i murine ECM proteiner uttrykt markører for duktale, acinar og endokrine celler. Representative resultater av mikrofluid QRT-PCR analyse av enkelt Ring koloniene. Hver kolonne representerer en enkelt koloni. Uttrykket nivåer av gener som skal uttrykkes som en varme-kart her, med varmere farger som indikerer høyere uttrykk og kalde farger som indikerer lavere ekspresjon. Mange av de enkle kolonier uttrykke i det minste ett av genene i hvert panel for de markører som indikerer kanalsystem, endokrine eller acinar celle avstamning. Disse data viser at mange av de individuelle kolonier uttrykke tri-avstamning markører og antyder at det meste avopprinnelse PCFUs er tri-potent. Dette tallet er endret fra et tidligere utgitt figur 7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. To Ring koloniene uttrykte en ductal protein markør mucin 1. Representative resultatene av hel-mount farging av Ring koloniene, som viser protein uttrykk for en ductal markør mucin 1 (grønn farge). Kjernene er kontra farget med DAPI (blå farge). Mange av cellene i disse ring kolonier uttrykker mucin en protein. Dette er i samsvar med de microfluidic QRT-PCR-resultater som viser at Ring kolonier dyrket i murine ECM-proteiner uttrykker høye nivåer (varmere farger på figur 3) av mucin1 og andre ductal cellemarkører. Målestokk representerers 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Bukspyttkjertelen koloni analyser for måling av selvfornyelse og multi-avstamning differensiering av individuelle stamceller i kultur. Representant arbeidsflyt er presentert. Våre pankreas koloni assays inneholder et viskøst materiale, metylcellulose, slik at kulturmediet blir halvfast. Halvfast medium begrenser bevegelse og hindrer samling av enkelt stamceller (angitt i rødt). Imidlertid er det medium myk nok til å tillate en enkelt stamceller for å fornye seg selv og / eller differensiere, og vokse til en koloni av celler (representert ved flere røde sirkler). I motsetning til dette enkle celler som ikke har kolonidannende egenskaper, <em> dvs. ikke-stamceller (vist i blått), blir stående som enkeltceller eller dø over tid i kultur. Methylcellulose tillater også inkludering av ECM proteiner ved lave konsentrasjoner, for eksempel 5% murine ECM proteiner eller 100 mikrogram / ml laminin hydrogel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pancreatic koloni analyser og enkelt koloni analyser beskrevet her ble inspirert av metylcellulose holdige blodkreft koloni analyser som har spilt viktige roller i å tyde biologi blodkreft stamceller i de siste tiårene 23. I disse analyser (figur 5), dissosiert pankreatiske celler blir sådd ut i metylcellulose inneholdende halvfaste medier med passende vekstfaktorer og ECM proteiner som fremmer dannelsen av Ring, tett eller endokrine / acinar kolonier 7. En enkelt stamceller som er i stand til å gi opphav til en koloni av celler som kalles en PCFU. Ved å karakterisere enkelte kolonier ved hjelp av mikrofluid QRT-PCR og hel-mount farging, kan avstamning potensialer av opprinnelses PCFUs utledes. Det ble funnet at et flertall av voksne murine PCFUs er tri-potente, i stand til å gi opphav til duktal, acinar, og endokrine avstamning celler in vitro 7,9. mens murine ECM proteiner oppmuntre til differensiering av tri-potent PCFU mot kanalen avstamning, lar laminin hydrogel robust endokrine og acinar celle avstamning differensiering 7,9. For å bedømme in vitro selvfornyelse kapasiteten til PCFUs, ring eller tette kolonier dyrket i en primær murine ECM koloni analysen kan dissosiert til enkeltcellesuspensjon og re-platet inn i en sekundær murine ECM koloni analysen 7. Det ble funnet at PCFUs utvidet ~ 500.000 ganger i murine ECM proteiner over 11 uker 7. De kritiske trinn omfatter fjerning av fettvev fra dissekert pankreata, unngå over-fordøyelse av pankreatiske celler ved kollagenase, og minimere kuldesjokk til de dissosierte Ring / Tette koloni-celler før re-plating. Maste micromanipulation av enkeltceller kan ta litt tid; tålmodighet og praksis er nødvendig.
Sammenlignet med andre bukspyttkjertelen stamfar celleanalyser, inkludert 2D kultur 24, de suspension "pancreasphere" 25 og organoid analyser 12-15, de store fordelene med de metylcellulose holdige koloni analysene beskrevet her er som følger. For det første kan tilsetningen og justering av ECM-proteiner til et bredt område av konsentrasjoner kan lett oppnås. Dette er fordi metylcellulose er den substans som overfører 3D-innholdet i halvfast medium. I motsetning til dette organoid kultur metoder avhenger av størkning av de murine ECM-proteiner, som er tilstede ved 33% volum / volum eller høyere. Det skal bemerkes at så lite som 1% murine ECM-proteiner kan hemme differensiering av endokrine celler 9, og understreker viktigheten av ECM proteinkonsentrasjon i progenitor-celleanalyse. For det andre er kolonier jevnt fordelt over kulturen godt og kan telles nøyaktig. Tredje, enkeltkolonier kan lett håndplukket for nærmere analyse. For det fjerde er det metylcellulose inneholdende halvfast medium lett å vedlikeholde, og ingen mellomendring er nødvendig i løpet av kulturen. Endelig kan et stort antall celler (opp til 25.000 celler pr 24-brønns plate) bli sådd ut og undersøkt i disse koloni analyser, noe som gjør dem effektive for detektering av progenitor-celleaktiviteter, selv om de er en mindre populasjon av de pletterte celler.
Pancreatic stamcelle analysene beskrevet her er basert på funksjonelle, men ikke merketråden baserte analyser av bukspyttkjertelen stamceller. Dette betyr at bukspyttkjertelen stamceller kan studeres uten å vite hva markører de uttrykker. Dette er viktig fordi det er lite kunnskap om hvilke konkrete markører voksne bukspyttkjertelen stamceller kan uttrykke. I tillegg kan det markører for embryonale stamceller bukspyttkjertelen ikke være tilstrekkelig for å studere den voksne stamceller. Ved å bruke funksjonelle analyser, kan man begynne å identifisere spesifikke progenitor-cellemarkører ved først å bestemme den sub-populasjon som har PCFU aktivitet, slik som CD133 + </ sup> Sox9 / EGFP + celler illustrert her. Dette kan bli etterfulgt av identifikasjon, ved hjelp av RNA-seq, av gener som er differensielt uttrykt ved den PCFU holdige befolkning. Kandidaten markørene kan deretter testet og verifisert av analyser som in vitro og in vivo avstamning tracing teknikker som sporer differensiering evner av stamceller.
Begrensningene av in vitro metylcellulose holdig koloni analyser er tredelt. Første, selv om analysene etterligne in vivo mikromiljøet i bukspyttkjertelen ved å tilveiebringe ECM-proteiner og vekstfaktorer til de pankreatiske stamceller i 3D-rom i kultur, er forholdene ikke er identiske. I tillegg er strukturene til epitelceller in vivo avbrutt ved dissosiasjon inn i enkeltceller, som kan ha viktige konsekvenser. Derfor vil det være viktig å kontrollere stamceller i oppfølgingsstudier ved hjelp av in vivo 18. Disse udefinerte komponenter kan påvirke funksjonen av spesifikke vekstfaktorer på stamceller indirekte og mer arbeid er nødvendig for å skape en fullstendig definert sett av dyrkningsforhold. Til slutt, avstamning tracing eksperimenter demonstrerte acinar-til-beta celler 26,27 eller alfaceller-til-beta celler 28 konverteringer in vivo i voksne mus. metylcellulose kultur forholdene beskrevet her kan være spesifikke for duct-til-beta celle konvertering. Andre ukjente dyrkningsforhold kan være nødvendig for ikke-kanalsystem celler til å konvertere til beta-cellene i kultur.
Det er flere tilfeller der feilsøking kan være nødvendig. For eksempel, hvis dissosierte celler blir klumpet seg sammen, bruke høyere doser av DNase I i løsninger. DNase I er viktig for å forhindre sammenfiltring av dissosierte pankreatiske celler forårsaket av DNA-molecules utgitt av døde celler (se trinn 1.3.2).
Alternativt, hvis hakket vev stokk i 10 ml pipette, hakke vevet i mindre biter. Åpningen av 10 ml pipette bør være bred nok til at vev stykker kan passere gjennom etter kollagenase fordøyelse. Hvis brikkene blir sittende fast på tuppen av 10 ml pipette, indikerer dette at hakking av vevet av våren saks er ikke tilstrekkelig (se trinn 1.3.4).
Et annet problem som kan oppstå er ingen kolonivekst i murine ECM-proteiner fra dissosierte bukspyttkjertelceller (dvs. usorterte celler). Hvis dette skjer, må du ikke forsøke å bryte alle de klynger i enkeltceller i bukspyttkjertelen dissosiasjon trinnet, da dette kan føre til overdigestion og celledød. Dersom det finnes store stykker, returnere røret til 37 ° C i et par (4) minutter og sprøyte 7 ganger eller mindre. Kontroller cellene under mikroskopet. Den maksimale tid for kollagenase B-behandling er 30 min. Depending på kollagenase anvendes, kan den optimale tid for fordøyelse forskjellig (se trinn 1.4.2).
I tillegg kan klumper av murine ekstracellulære matriseproteiner i kulturbrønnene bli observert etter inkubasjon. For å unngå dette, må du kontrollere at alle kultur komponenter som kommer i kontakt med murine ekstracellulære matrix proteiner holdes kaldt på isen for å unngå for tidlig størkning før inkubasjon i 37 ° C (se trinn 3).
I tillegg kan det være vanskelig å plukke opp en celle om gangen i et glass Pasteur pipette. En løsning på dette er å redusere densiteten av de ferske sorterte cellene belagt i semi-fast medium for å sørge for at en celle har tilstrekkelig avstand fra de andre cellene. Dette vil unngå å plukke opp flere celler samtidig. I tillegg er det en fordel å plassere fokus av mikroskopet nær bunnen av den semi-fast medium, som det er lettere å plukke opp enkeltceller for hånd i nærheten av dette plan uten en mikromanipulator (se trinn 4.6.2).
I tillegg kan det være uklart hvorvidt enkelt celle manipulasjon er vellykket. En løsning er å praktisere den eneste celle micromanipulation før selve forsøket. Når cellen blir plukket opp i glass Pasteur pipette, overføres cellen til en 35 mm petriskål inneholdende 1 ml av 1% metylcelluloseløsning uten celler ( "no-celle" medium fremstilt i trinn 4.4.1). Visualisere og plassere åpningen av tuppen av Pasteur pipette i fokus under mikroskopet, og skyv cellen sakte ut. Forvent det enkelt celle for å sakte vises rundt spissen av pipetten og deretter flytte inn i "no-celle" medium (se trinn 4.8.2).
Endelig kan ingen kolonivekst skje i videregående kulturer fra dissosiert primære ring / tette kolonier. For feilsøking, sørge for at celler fra dissosiert primære kolonier holdes i romtemperatur før plating inn sekundære kulturer. For dyrking i murine ECM proteiner, leggecellene siste til rør inneholdende kaldt kulturmedium før blanding 18, for derved å minimalisere eksponering av cellene til kald temperatur, noe som kan drepe de dissosierte celler oppnådd fra primær kolonier. Imidlertid ikke re-plating av cellene inn i laminin hydrogel ikke trenger å bli utført på is før 37 ° C inkubering (se trinn 7).
Oppsummert har to metylcellulose inneholdende koloni-analyser blitt benyttet for å karakterisere progenitor-lignende celler fra pankreata av voksen 7,11 og postnatal unge mus 9,10, samt fra leveren hos unge mus 10. Fremtidige søknader vil bli rettet mot identifisering og karakterisering av de menneskelige kolonidannende stamceller fra avdød bukspyttkjertelen organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Lucy Brown og Alexander Spalla fra Analytical Cytometry Kjerne på City of Hope for å få hjelp i sortering. Dette arbeidet støttes delvis av National Institutes of Health (NIH) innvilger R01DK081587 og R01DK099734 til HTK, og U01DK089533 til ADR, og ved National Science Foundation tilskudd NSF-DMR-1206121 og California Institute for Regenerative Medicine stipend RB5-07398 til DAT Støtter fra Joseph J. Jacobs Institute for Molecular Engineering for medisin ved Caltech til DAT, og de fra Oxnard Foundation og Ella Fitzgerald Foundation til HTK er også takknemlig erkjent.
Finansiering: Dette arbeidet støttes delvis av National Institutes of Health (NIH) gir R01DK081587 og R01DK099734 til HTK, og U01DK089533 til ADR, og ved National Science Foundation tilskudd NSF-DMR-1206121 og California Institute for Regenerative Medicine stipend RB5-07398 til DAT Støtter fra Joseph J. JacobsInstitutt for molekylær Engineering for medisin ved Caltech til DAT, og de fra Oxnard Foundation og Ella Fitzgerald Foundation til HTK er også takknemlig erkjent. Forskning rapportert i denne publikasjonen inkludert arbeid utført i Analytical Cytometry Core og lysmikroskopi Digital Imaging Core støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold award nummer P30CA33572.
Study sponsor: Sponsoren deltok ikke i studien design, innsamling, analyse, eller tolkning av data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from: http://www.fluidigm.com/documents (2015).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
