Summary
Het ontwerpen en ontwikkelen van een aptameer-gouden nanodeeltjes colorimetrische assay voor de detectie van kleine moleculen in-het-veld toepassingen onderzocht. Bovendien, een smart-inrichting colorimetrische applicatie (app) werd gevalideerd en langdurige opslag van de test werd voor gebruik in het veld.
Abstract
Het ontwerp en de ontwikkeling van een aptameer-gouden nanodeeltjes (AuNP) colorimetrische test voor de detectie van kleine moleculen voor in-het-veld toepassingen onderzocht. Target selectieve AuNP gebaseerd kleur testen zijn ontwikkeld in gecontroleerde laboratorium instellingen proof-of-concept. Echter, deze regelingen niet zijn uitgeoefend om een point of failure om hun praktisch gebruik buiten het laboratorium instellingen bepalen. Dit werk beschrijft een generieke aanpak voor het ontwerpen, ontwikkelen, en het oplossen van een aptameer-AuNP colorimetrische assay voor kleine moleculen te analyseren stoffen en het gebruik van de test voor in-het-veld instellingen. De test is voordelig omdat geadsorbeerd aptameren passiveren de nanodeeltjes oppervlakken en een middel te verminderen en te elimineren vals positieve reacties op niet-doelanalyten. Overstappen dit systeem om praktische toepassingen vereist het definiëren van niet alleen de houdbaarheid van de aptameer-AuNP assay, maar vaststelling van methoden en procedures voor de uitbreiding van de opslag op lange termijn capabilteiten. Ook een van de erkende problemen met colorimetrische uitlezing is de belasting van analisten vaak subtiele veranderingen in kleur nauwkeurig te identificeren. De verantwoordelijkheid analisten in het veld te verminderen, werd een kleuranalyse protocol ontworpen om de kleuridentificatie taak zonder de noodzaak van het uitvoeren van deze taak laboratoriumkwaliteit apparatuur. De werkwijze voor het maken en testen van de gegevensanalyse protocol wordt beschreven. Echter begrijpen of de opzet van geadsorbeerde aptameer assays, de interacties geassocieerd met de aptameer, doel en AuNPs verder bestudeerd. De opgedane kennis kan leiden tot op maat aptameren voor een verbeterde functionaliteit.
Introduction
Colorimetrie is een van de oudste technieken van analytische chemie. Voor deze techniek wordt een kwalitatieve of kwantitatieve bepaling van de analyt gemaakt op basis van de productie van een gekleurde verbinding 1. Gewoonlijk kleur assays reagentia die een kleurverschuiving in aanwezigheid van het analyt species, waardoor een waarneembare of waarneembare kleurverandering in het zichtbare lichtspectrum ervaren. Colorimetrie is gebruikt bij de detectie van targets variërend van atomen, ionen en kleine moleculen tot complexe biologische moleculen zoals deoxyribonucleïnezuren (DNA), peptiden en eiwitten 2-4. In de afgelopen twee decennia nanomaterialen de detectiehoek assays revolutie, met name kleur gebaseerde testen 5-6. Het combineren van de unieke chemische en fysische eigenschappen van nanomaterialen met een element doelwit selectieve herkenning, zoals antilichamen, aptameren oligonucleotide of peptide aptameren, heeft geleid tot de opleving in het ontwerpen en ontwikkelen van colorimetrische detectie assays 7.
Metaal nanodeeltjes een grootte aangetoond afhankelijke kleurverandering eigenschap, die benut is bij het ontwerpen van talrijke colorimetrische assays. Gouden nanodeeltjes (AuNPs) zijn van bijzonder belang als gevolg van een distinctief rood naar blauw kleurverschuiving, wanneer de gedispergeerde oplossing deeltjes geïnduceerd om te aggregeren 8, kenmerkend door nauwkeurige toevoeging van zout. De mogelijkheid om de overgang van de verspreide (rood) controleren om de geaggregeerde (blauw) staten heeft geleid tot de oprichting van colorimetrische sensoren voor ionische, kleine moleculaire, peptide, eiwit en cellulaire doelwitten 2-4,9. Veel van deze sensoren gebruiken aptameren als motief beeldherkenning.
Aptameren zijn DNA of ribonucleïnezuur (RNA) moleculen gekozen uit een willekeurige verzameling van 10 12 -10 15 verschillende sequenties 10-11. Het selectieproces identificeert doel recognitie elementen bindingsaffiniteiten in het lage nanomolaire regime, en de systematische ontwikkeling van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is de meest bekende werkwijze 12-13. Voordelen van de oligonucleotide gebaseerd aptameren voor sensing toepassingen zijn onder meer het gemak van de synthese, controleerbare chemische modificatie, en chemische stabiliteit 14-15.
Een benadering voor het creëren van een colorimetrische assay combineert met nanomaterialen herkenningselementen, bestaat uit deze twee soorten combineren door fysische adsorptie van DNA-moleculen aan aptameer AuNP oppervlakken. Door target-bindende aptameer, de aptameer ervaart een structurele verandering 16-18 dat de interactie van de aptameer met de AuNP oppervlak, wat leidt tot een induceerbare rood naar blauw kleurrespons 19 met de toevoeging van zout verandert. Deze verbazingwekkende eigenschap van AuNPs biedt een waarneembare colorimetrische reactiemechanisme voor aptameergebaseerde apparaten die kunnen worden gebruikt om even teteken colorimetrische assays voor verschillende analyten.
Kleur assays ontworpen met behulp van niet-covalente, fysisch geadsorbeerd DNA aptameren op AuNP oppervlakken hebben het stigma van een zwakke sensor platform te wijten aan problemen met robuustheid, een neiging voor het niet buiten de gecontroleerde laboratorium instellingen, en het gebrek aan informatie beschikbaar voor gebruik in de praktijk instellingen. Echter, de aptameer-AuNP gebaseerde colorimetrische bepaling was in de belangstelling vanwege de eenvoud van bediening en waarneembare kleur reactie. Het doel van dit werk is om een protocol voor het ontwerp, de ontwikkeling, de exploitatie, de vermindering van de oppervlakte gerelateerde vals positieve reactie, en langdurige opslag van DNA-AuNP gebaseerde colorimetrische assays het gebruik van cocaïne als de vertegenwoordiger te analyseren. Verder stelden we deze geadsorbeerde aptameer assay benadering (figuur 1) als voordelig vanwege eenvoud en gebruiksgemak die resulteerde in minder stappen dan de conventionele benadering voor deze aptameer-AuNP assegen. Voor deze test werd de aptameer eerst toegevoegd aan de AuNPs, die mochten adsorberen aan het oppervlak voor langere tijd. Een bijkomend voordeel van deze aanpak is de verlaging van de respons op niet-doelanalyt moleculen soortgelijk aan AuNP oppervlakte interacties. De vermindering van vals positieve reactie ten koste van assaygevoeligheid. Dus een evenwicht tussen oppervlaktebescherming en analyt toegankelijkheid moet goede test blijft werken. Bovendien is een belangrijk gebrek analyseren kleur assays met andere middelen dan met instrumentatie die de resultaten vaak subjectief en voor interpretatie van analist tot analist, vooral wanneer het proberen om subtiele verschillen in kleur onderscheiden. Omgekeerd zijn er een aantal problemen met het maken van laboratorium op basis van instrumentatie bruikbaar buiten het laboratorium, zoals de beschikbaarheid van de macht, zakelijkheid met draagbaarheid, enz. In dit werk werd een kleuranalyse protocol ontwikkeld voor more draagbaarheid en om een deel van het giswerk vaak geassocieerd met kleur gebaseerde test interpretatie 20-21 te elimineren. In vergelijking met eerdere benaderingen die inspanning naar gestreefd om deze assays bewegen hun grenzen voor toepassingen buiten het laboratorium instellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese via Citrate Vermindering van Gold nanodeeltjes (AuNP) en karakterisering
- Reinig een erlenmeyer (500 ml) en grote roerstaaf met 5 ml geconcentreerd salpeterzuur en 15 ml geconcentreerd zoutzuur in chemische beschermkap.
- Bevochtig het gehele oppervlak van de kolf met het zuur wassen, spoel de kolf met nuclease gratis water, en laat de kolf te drogen.
- Voeg 100 ml van 1 mM goud (III) chloride; Gebruik een vel aluminiumfolie om de top van het zuur gereinigde Erlenmeyer kolf nog onder voortdurend roeren betrekking op een hete plaat tot koken.
- Voeg 10 ml 38,8 mM natriumcitraat. De kleur verandert van helder / grijs, donkerblauw / zwart, en tenslotte donker rood over enkele minuten. Blijf roeren met de hitte af voor 10 min.
- Laat de AuNP suspensie afkoelen tot kamertemperatuur en voeg 110 pl diethylpyrocarbonaat (DEPC) onder voortdurend roeren.
- Bedek de hele fles metaluminiumfolie en laat de DEPC behandeling 's nachts broeden. Bewaar alle AuNPs in het donker, in amber opslagcontainers of bedekt met aluminiumfolie.
- Autoclaaf de AuNP schorsing, afkoelen tot kamertemperatuur, en filteren door middel van een 0,22 pm porie celluloseacetaat membraan. Bewaar de gefiltreerde, geautoclaveerde AuNP voorraadoplossing in het donker bij 4 ° C.
OPMERKING: Behandeling met DEPC, sterilisatie via autoclaaf en opslag bij 4 ° C wordt de houdbaarheid van de aptameer-AuNP assay verbeteren. Opslag op deze manier zal de test functioneel blijven langer dan 2 maanden. - Bereken de AuNP concentratie door het verkrijgen van Ultra Violet-Visible absorptie bij 520 nm, en het gebruik van de extinctiecoëfficiënt (Ɛ) 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 met de wet van Beer door het berekenen van de concentratie (c). De concentratie werd bepaald 10 nM met een grootte van 15 nm bepaald met dynamische lichtverstrooiing zijn.
LET OP: De concentraties zullen variëren frOM batch-to-batch. Verdun de AuNP aandelen met nuclease gratis water als nodig is om het gewenste 10 nM AuNP suspensie te houden.
2. DNA-aptameer, Buffer, Solution, en Assay Voorbereiding
- Aanschaffen of synthetiseren de volgende cocaïne bindende aptameer sequenties met behulp van standaard fosforamidiet chemie 22:
MN4 19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
MN6 19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 ' - Zuiver het aptameren met standaard ontzouting 23. Reconstitueer oligonucleotiden in nuclease-vrij water op ofwel 100 pm of 1 mM voorraad oplossingen. Aliquot en bewaar bij -20 ° C gedurende enkele maanden.
- Aankoop of bereiden voorraden steriele 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) pH 7,4, 100 mM magnesiumchloride (MgCl2) en 1 M natriumchloride (NaCl).
- Bereid 50 ml van buffer in nuclease-vrij water with concentraties van 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,4 en bewaar bij kamertemperatuur gedurende maanden.
- Incubeer het DNA met de voorraad AuNP oplossing (10 nM) gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht. Variëren van het volume van AuNPs wens om genoeg monster voor de uit te voeren testen (2,5-7,5 ml).
- Hier, gebruik beladingsdichtheid van 90, 120, 150, en 180 DNA-moleculen / AuNP in dit werk. Variëren van het volume en de concentraties van DNA dienovereenkomstig. Stem de DNA dekking onbedoelde AuNP oppervlakte gerelateerde kleur reacties van non-target analyten te verminderen.
OPMERKING: verhogen van het DNA dekking zal de assay gevoeligheid verminderen. De beladingsdichtheid worden berekend uit kennis van de concentratie van de AuNP voorraad en berekening van het totale aantal AuNPs in de gewenste voor gebruik in experimenten volume. Als de werkelijke dekking dichtheden gewenst, protocollen bestaan deze waarden 7 te verkrijgen. De dekking DNA werd bepaald onder toepassing van een 50 kDa molecular gewicht cutoff spin-kolom aan de AuNP gebonden DNA te scheiden van de vrije DNA. De AuNPs zijn te groot om door de spin kolom te passeren, terwijl de vrije DNA gemakkelijk zal passeren. De volgende stap is het vrije DNA verzameld met absorptiemetingen of enkelstrengs DNA fluorescerende kleurstof kwantificeren.
- Hier, gebruik beladingsdichtheid van 90, 120, 150, en 180 DNA-moleculen / AuNP in dit werk. Variëren van het volume en de concentraties van DNA dienovereenkomstig. Stem de DNA dekking onbedoelde AuNP oppervlakte gerelateerde kleur reacties van non-target analyten te verminderen.
- Voeg een gelijk volume van 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,4 buffer en plaats het monster bij 4 ° C in het donker overnacht. Het aptameer-AuNP assay was in een 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,4 (bepalingsbuffer).
3. Zout Titratie en Assay Setup
- Bepaal de initiële zoutconcentratie die nodig is om de test kleur reactie van zout titratie met de assayblanco induceren. Voeg 20 pl methanol (blanco) voor 180 gl aliquots van aptameer-AuNP assay in een 96-wells plaat. Titreer de monsters met toenemende volumes voorraad NaCl-oplossing (1 M of 2 M) en bepaal de gelijkwaardigheid punt (figuur 2 OPMERKING: De test kan worden geschaald tot kleinere volumes door het houden van de verhouding van methanol plano (of opgelost analyt) voor aptameer-AuNP assay hetzelfde.
- Hier, bepalen de NaCl volume nodig is om de geringste kleurverandering door visuele waarneming veroorzaken. De beginconcentratie van het assay was 75 mM en 130 mM voor MN4 en MN6, respectievelijk een 60 DNA-molecuul / AuNP dekking dichtheid.
OPMERKING: Voor een kwantitatieve bepaling van de initiële zoutconcentratie, het middelpunt van de titratie curve vormt een goed uitgangspunt. Ook zal gebruikte concentraties variëren, afhankelijk van het aptameer DNA dekking dichtheden van dag tot dag prestaties en batch-to-batch.
- Hier, bepalen de NaCl volume nodig is om de geringste kleurverandering door visuele waarneming veroorzaken. De beginconcentratie van het assay was 75 mM en 130 mM voor MN4 en MN6, respectievelijk een 60 DNA-molecuul / AuNP dekking dichtheid.
- Het optimaliseren van het assay reactie, voeg 20 gl analysemonstermoleculen verdund in methanol om 180 gl aliquots van aptameer-AuNP assay in een 96-puts plaat bij kamertemperatuur. voeg geeft de NaCl-concentratie in het voorgaande stap om de analyse kleurrespons initiëren.
NEETE: Maak gebruik van een multichannel pipet om meerdere experimenten tegelijk uit te voeren. - Het verkrijgen van de grootste kleurverandering mogelijk door het verhogen of verlagen van de NaCl concentratie en het vergelijken van de beoogde reactie op de blanco reactie. Gebruik de NaCl concentratie die de grootste respons verschil biedt.
- Let op of het meten van de test respons 150 sec na NaCl toevoeging. Analyseer de absorptie bij 650 nm en 530 nm met een spectrometer of een digitale camera foto van de assay respons (zie hoofdstuk 4 van de foto analyseprotocol) te verkrijgen.
OPMERKING: een microplaat reader werd gebruikt bij het verkrijgen van de metingen voor dit werk. - Zet de resultaten als de verhouding van de absorptie verkregen bij 650 nm en 530 nm (E 650 / E 530) als functie van de analytconcentratie. Normaliseren van de assay reactie op het blanco signaal zoals bij dit werk.
4. Foto en Digital Image Color Analysis Protocol Analyse
- prepare de test monsters zoals beschreven (delen 3,2-3,3). Plaats de 96-well plaat op een transilluminator.
OPMERKING: Een standaard laboratorium transilluminator is meestal te licht om bruikbare digitale beelden voor deze analyse te verkrijgen. Deze transilluminators veroorzaken regelmatige afstand "donkere lijnen" weergegeven in het digitale beeld door de intensiteit van de lichtbron. Het maken van een transilluminator van een licht-emitterende diode (LED) op basis van lichte doos en een stuk van ondoorzichtige plastic werkt goed. - Verkrijgen's van de 96-well plaat bij 150 sec na NaCl Bovendien importeert de afbeeldingen in beeldanalysesoftware en bereken het gemiddelde rode, groene en blauwe (RGB) waarden middels een incrementele gemiddelde techniek, zoals weergegeven in formule 1 24:
(1)
- Converteren de RGB-waarden van standaard RGB (sRGB) kleurruimte aan de kleursoort diagram (CIExyY) kleurruimte, met behulp van de volgende vergelijkingen 24:
(2)
(3)
(4)
- Zetten de exponentiële RGB waarden lineaire RGB-waarden met vergelijking 2. De matrix aangegeven in formule 3 wordt gebruikt om de X-, Y- en Z-waarden van de CIE kleurruimte 24 berekenen.
- Bereken de x- en y kleurkwaliteit waarden met formule 4 die de gemiddelde kleur van de pixels in het gebied geselecteerd voor analyse 24.
- Voer de analyse in elke put en plot de chromaticiteitswaarden een ijkgrafiek (Figuur 4) te genereren. Haal de standaardfout door analyse van de kleur van de verschillende gebieden van dezelfde put.
5. Invriezen Aptamer-AuNP Test voor langdurige opslag
- Bereid de aptameer-AuNP assay componenten zoals beschreven in de paragrafen 2.4 en 2.5. Voeg afzonderlijke oplossingen die 1 g / ml trehalose en 1 g / ml sucrose in nuclease-vrij water aan de cryogene oplossing.
OPMERKING: Hoge concentraties van trehalose en sucrose werden gebruikt om de verdunningsfactor verminderen bij de voorbereiding van de test voor bevriezing. Verwarm de suikeroplossingen op een hete plaat in een beker water om de suikers zorgvuldig te lossen voor gebruik. - Voeg een oplossing die 19,2 mg / ml trehalose en 4,8 mg / ml sucrose met 60 MN4-DNA / AuNP assay in een eindvolume van 200 ul in 1,5 ml microcentrifugebuizen bevat. Uiteindelijke cryogene oplossingsconcentraties varieert met DNA dekking.
Opmerking: De monsters worden bevroren mag niet meer dan 300 pl. Grotere volumes mogelijk niet goed bevriezen. - Flash bevriezen de monsters met een -146 ° C vriezer of in vloeibare stikstof. Bewaar de ingevroren tot gebruik samples. Opslag kan in een -80 ° C of -20 ° C eenmaal Snelkoeling voltooid.
- Voor dit werk, laat de monsters in de -146 ° C vriezer bovennacht en vervolgens overbrengen naar een -20 ° C vriezer voor langdurige opslag.
OPMERKING: Flash bevriezing kan het aptameer-AuNPs te aggregeren. Test de integriteit van het vriesproces het volgen van de absorptieprofiel en te vergelijken met een bevroren monster. Als aggregatie wordt waargenomen, vergroot de hoeveelheid cryogeen ter compensatie voor dit probleem. - Ontdooi de monsters bij kamertemperatuur en alleen genoeg monsters nodig voor experimenten. Het verkrijgen van de absorptie spectra van ontdooide monsters en te vergelijken met de basislijn spectra van een bevroren cryogeen oplossing behandelde monster. Meet de absorptie van 400 nm tot 700 nm.
- Voer het zout titratie (paragraaf 3.1), het testen van de assay (paragraaf 3.2), en de plot van de resultaten (paragrafen 3.3 en 3.4), zoals eerder beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het primaire doel van dit werk was het ontwikkelen en onderzoeken van de stabiliteit en robuustheid van aptameergebaseerde AuNP colorimetrische assays voor gebruik in het veld. Zoals in een voorgaande publicatie werden twee verschillende strategieën voor het creëren van de test onderzocht 7. De testen werden genoemd het vrije aptameer Assay en de geabsorbeerde aptameer Assay. De geadsorbeerde Aptameer assay was meer aantrekkelijk met het oog op een fieldable detectietest (figuur 1).
. Figuur 1. Schematische weergave van de geadsorbeerde aptameer assay De aptameer werd gemengd met AuNPs en gedurende de nacht geïncubeerd; analysemonstermoleculen opgelost in methanol toegevoegd Opgenomen aptameer Assay, onmiddellijk gevolgd door de toevoeging van natriumchloride (NaCl) aan AuNP aggregatie induceren wanneer het doel werd toegevoegd.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit was te wijten aan de vermindering van valse positieven te nontarget analyten, relatieve eenvoud en het gebruiksgemak van de geabsorbeerde aptameer Assay. Om de geadsorbeerde aptameer Assay bereiden, werd het DNA-aptameer gemengd met AuNPs en overnacht geïncubeerd in testbuffer. Hierdoor kon de aptameer gemakkelijk adsorberen op het oppervlak AuNP die de gevoeligheid van de test verminderd vals positieve reacties op nontarget analysemonstermoleculen zoals maskerende of versnijdingsmiddelen. Slechts de voorgevormde structuur van de MN4 cocaïne aptameer was actief in de aanwezigheid van cocaïne (doel) in dit testontwerp. De assay werd gebruikt door toevoegen analyt oplossing gevolgd door onmiddellijke toevoeging van de juiste concentratie van NaCl. Zoutoplossingen werden gebruikt om de waarneembare en mea initiërensurable kleurverandering van de test. De test werd uitgevoerd binnen 2-3 min. na de toevoeging van de te analyseren oplossing.
Een kritische optreden bij de uitvoering van deze fysisch geadsorbeerd DNA gebaseerde colorimetrische assays is de geïnduceerde kleurrespons, door toevoeging van de geschikte concentratie zout. De toevoeging van zouten is bekend dat AuNP schorsingen resulteert in aggregatie van de deeltjes te destabiliseren door het maskeren van de negatieve ladingen van het citraat laag die de AuNPs te stabiliseren, en dan vermindert de interparticle elektrostatische interacties. Het resultaat is de waarneembare rood naar blauw kleurverandering. Hetzelfde effect wordt waargenomen met DNA behandeld AuNPs. Bij DNA-aptameren, analist, het gehalte aan zout moet minimaal waarneembare AuNP destabilisatie (blauwkleuring) te veroorzaken. Met de toevoeging van een, is de stabilisatie van de AuNPs door het DNA-aptameer aanzienlijk verminderd als gevolg een observable, meetbare doelstelling dosis-respons kleurverandering. Deze kleurverandering kan alleen worden waargenomen met de toevoeging van de geschikte vooraf bepaalde hoeveelheid zout.
Evenzeer belangrijk is het proces waarbij de geschikte zoutconcentratie werd bepaald. Dit werd bewerkstelligd door het uitvoeren van een titratie curve door toevoeging van toenemende concentraties natriumchloride oplossing tot een reeks assay blanco (figuur 2).
Figuur 2.-Salt geïnduceerde titratie curve. Citraat-gestabiliseerd (rood), MN4 cocaïne bindende aptameer (groen) en MN6 cocaïne bindende aptameer (paarse) behandeld AuNP monsters werden getitreerd met natriumchloride (NaCl). De aanvankelijke zoutconcentraties visueel verkregen werden met overeenkomstige gekleurde pijlen voor elke curve aangegeven. Foutbalken zijn gedefinieerd door de standaardafwijkingdrievoud metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hier is de initiële zoutconcentratie gebruikt werd bepaald door visuele inspectie, en werd naar de zoutconcentratie die de geringste blauwe kleuring waargenomen met de assayblanco is veroorzaakt. Maar voor een kwantitatieve benadering, onderzoekers nieuw voor dit gebied van onderzoek kan het middelpunt van de titratie equivalentiepunt te gebruiken als een beginnend zoutconcentratie. Voorbij dit punt is de kleur respons snel begint te stijgen. Bovendien is de zoutconcentratie die bij de uitvoering van de test werd op het kleurverschil tussen de assayblanco en cocaïne respons te maximaliseren. Dit werd bewerkstelligd door het verhogen en verlagen van de zoutconcentratie van de door titratie wordt gebruikt. Het zout titratieprocedure werd dagelijks uitgevoerd omvertegenwoordigen dag tot dag variabiliteit van de test. De batch variabiliteit in zoutconcentratie nodig is voor de test was niet meer dan 20%. Figuur 2 heeft drie verschillende AuNP monsters, citraat gestabiliseerd (geen DNA), MN4 (DNA-aptameer gestabiliseerd) en MN6 (DNA-aptameer gestabiliseerd). De DNA dekking voor de MN4 en MN6 monsters werden 60 DNA-moleculen / AuNP en elke titratie curve een andere titratie equivalentiepunt en middelpunt basis van de stabiliteit door de oppervlaktebehandeling. Citraat verstrekt weinig stabiliteit, MN4 (dubbelstrengs achtige structuur) verstrekt meer stabiliteit en MN6 (enkelstrengs achtige structuur) op voorwaarde dat de meest stabiliteit aan de AuNPs. De initiële zoutconcentraties gebruikt in dit werk was vastbesloten om ~ 50 mm ~ 90 mm, en ~ 130 mm visueel zijn. De trend is het eens met de conventionele begrip van de DNA-structuur en het stabiliserend effect op AuNPs 24-25. Bij het uitvoeren van deze test visueel, de assay blanco vertoonde een lichte blauwe Colora werking met de zoutconcentraties zoals aangegeven in figuur 2 met pijlen, die sterk lijken op de middens zoals besproken zijn. De zoutconcentraties voorafgaand aan scripties punten bieden weinig of geen waarneembare kleurverandering, en dan deze punten de kleur snel toeneemt. Voor dit werk, werd de oorspronkelijke concentratie zout visueel bepaald en vervolgens verfijnd met behulp van microplaatlezer meting vergelijkingen van assayblanco en cocaïne samples.
Met de Free aptameer Assay aanpak, vals-positieve reacties waren een probleem. Oppervlakte interacties van analysemonstermoleculen zijn een bron voor dit probleem, zoals beschreven in een eerdere publicatie 7. Een onbedoeld kleur reacties vanwege aspecifieke AuNP oppervlakinteracties voorkomen, de DNA dekking dichtheden van het doelwit bindende aptameer werd gecontroleerd (Figuur 3).
jpg "/>
Figuur 3. Geabsorbeerde aptameer assay reactie met variërende DNA dekking dichtheid. Aggregatie respons op cocaïne (rood, doel), EME (groen, controle) en procaïne (blauw), een AuNP oppervlakteactieve molecuul, voor de 90, 120, 150, en 180 DNA / AuNP dekking dichtheden werden getoond. Alle geanalyseerde monsters werden opgelost in methanol bij 1 mg / ml. Error bars worden gedefinieerd door de standaardafwijking in drievoud metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In het algemeen, de valse positieve respons van niet-doel analysemonstermoleculen door AuNP interacties werd gereduceerd met toenemende DNA dekking dichtheden. Echter, de assaygevoeligheid verlaagd ten gevolge van de toegenomen DNA dekking. In dit werk, DNA dichtheden van 60, 90, 120, 150, 180, en 300 DNA / AuNP waren ONDERZOEKted. Dichtheden van 60 en 300 werden uitgebreid beschreven in eerdere werkzaamheden 7. Figuur 3 toont additionele DNA dichtheden bestudeerd. Procaïne was een van de hoger oppervlakteactieve nontarget analyten onderzocht. Voor elk van de afzonderlijke DNA dekkingen, werd de assay respons geoptimaliseerd door de zoutconcentratie beschreven. In het algemeen als DNA bereik toeneemt, de respons verschil tussen controle (EME) en cocaïne reactie afneemt. Ook de assay reactie in aanwezigheid van procaïne daalt tot achtergrondniveaus met toenemende dekkingen. De 180 DNA / AuNP dichtheid geëlimineerd oppervlak gerelateerd vals positieve reactie voor procaine, met behoud van een hoog doel respons. Deze evaluatie beschrijft een werkwijze voor het afstemmen van deze kleur assays voor het verminderen oppervlaktegerelateerde vals positieve reacties, met behoud doelrespons zoveel mogelijk. Verbeterde gevoeligheid kan worden bereikt door het verminderen van DNA dekking. Echter, valse positieve reacties kan een probleem worden, afhankelijk van de toepassing.
Colorimetrische assays worden gebruikt voor skiërs vaak vermoedelijke kwalitatieve en kwantitatieve zelfs proeven. Veelvoorkomende problemen met colorimetrische bepalingen zijn de persoonlijke aard van de kleur onderscheiding, in het bijzonder met subtiele en borderline kleurverschillen. Het oordeel gesprekken die moeten worden gemaakt door de analist kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de gegevens. Metingen aan laboratoriumapparatuur verminderen van de onzekerheid en besluiteloosheid in verband met de evaluatie van de testresultaten. Maar in dit werk, de bedoeling was om een gebied klaar assay die onmiddellijke resultaten die aan de analist te verstrekken. Als zodanig werd een beeld foto analysetechniek vastgesteld dat een beslissende kleurresultaat (figuur 4) voorzien.
Figuur 4.
Met toenemende concentraties van cocaïne, de assay kleur geleid tot meer blauwe kleur. Digitale foto's van de kalibratie werden verkregen met behulp van twee verschillende smartphones, en voor analyse met behulp van ImageJ software om een standaard laptop computer geïmporteerd. De kleursoort waarden werden gebruikt om de c plottenalibration curven zoals weergegeven in figuur 4. De beeldanalyse verschaft een lineaire reactie op toenemende cocaïneconcentratie met beide reeksen smartphone beelden zoals aangegeven door de R 2-waarden. Deze methode werd overgebracht naar een Smart-apparaat app voor de analist te helpen in het veld. Een gedetailleerde evaluatie van de app werd uitgevoerd in een eerdere publicatie 7. De app geëlimineerd veel van de onzekerheid en besluiteloosheid in verband met subtiele kleurverandering resultaten van de laagste concentraties cocaïne.
Langdurige opslag van fysisch geadsorbeerd DNA-testen van dit type zijn niet onderzocht in groot detail en een van de doelstellingen van dit werk was aan de voorwaarden en de test houdbaarheid te verlengen vinden. Behandeling van de assay componenten voor opslag bij 4 ° C werd beschreven in een eerdere publicatie 6. Voor dit werk, lyofilisatie van de bereide testcomponenten werd geacht voor langdurig gebruik en opslag of de test. Het vriesdrogen testcomponenten heeft het duidelijke voordeel van het houden en opslag van de monsters bij kamertemperatuur, waarbij de noodzaak van een koelkast of vriezer zou uitschakelen. De eerste stap in het vriesdrogen proces is eerst het monster te bevriezen. Controleren van de AuNP monsters overleven het vriesproces, het uitvoeren van een vergelijking tussen de absorptiespectra van de assay voor het invriezen aan die van het ontdooide monster. De scans moeten exact overeenkomen. Indien de monsters niet het invriesproces overleeft, wordt de ontdooide monster spectrum toegenomen absorptie in het gebied boven 525 nm. Dit betekent dat de AuNPs geaggregeerde tijdens het vriezen en het ontdooide monster wordt aangetast. De levensvatbaarheid van de ontdooide assay werd getest met cocaïne en EME (figuur 5).
Figuur 5. Geabsorbeerde Aptamer Assay reactie shelf-life studie. Quantificatie van de assay reactie op EME (groen, controle) en cocaïne (rood, doel) uitgevoerd met bevroren en vervolgens ontdooid Geabsorbeerde aptameer Assay monsters gedurende vier weken. Error bars worden gedefinieerd door de standaardafwijking in drievoud metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De ontdooide assay blancomonsters bleef op hetzelfde waarde over de studie periode als monsters die werden gemaakt en gebruikt onmiddellijk (geen opslag). De reacties van de cocaïne en EME monsters waren consistent met typische reacties waargenomen bij monsters onmiddellijk en gebruikt (geen opslag). De ingevroren monsters werden gedurende de periode van 4 weken zonder veranderingen in de assayprestaties vergeleken met monsters bewaard bij 4 ° C gedurende dezelfde periode 7 of assay monsters gemaakt en gebruikt immediately. Cocaïne reacties waren relatief constant gedurende de 4 weken, wat ook werd waargenomen voor de 4 ° C monsters 7. De daling EME signaal van 1 week tot week 2 wordt vaak waargenomen bij kamertemperatuur en 4 ° C opslag en. Een fenomeen dat we toegeschreven aan rijping van de test in de eerste week. Deze aanpak versterkt de beschikbare opties voor de lange termijn opslag van de geadsorbeerde DNA colorimetrische assays, en voorzien van een toegangspoort tot extra opties voor opslag op lange termijn, namelijk vriesdrogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het afgelopen decennium, hebben nanodeeltjes gebaseerde colorimetrische assays ontwikkeld voor de detectie van doelen omvatten kleine moleculen, DNA, eiwitten en cellen 2-4. Testen die DNA-aptameren te gebruiken met nanodeeltjes hebben gewonnen belang. Meestal worden deze colorimetrische assays uitgevoerd door het mengen van de DNA-aptameer met analysemonstermoleculen gevolgd door toevoeging aan AuNPs 9-10. Echter, deze tests zijn gebruikt in proof-of-concept demonstraties met een gecontroleerde laboratorium instellingen en met een beperkte, geselecteerde controles. Recente ontwikkelingen om de overgang van deze technologie in het veld zijn gemaakt 7. In deze benadering wordt de DNA-aptameer werd geadsorbeerd aan AuNP oppervlakken voorafgaand aan toevoeging van de analyt te testen moleculen (Figuur 1). De ontwikkeling van zowel aptameer-goud nanodeeltjes gebaseerde colorimetrische assays vereist optimalisatie in verschillende stadia van de fabricage / analyseproces. Dus degenen die nieuw zijn de schijfipline moet zich bewust zijn van de nuances in verband met raffineren en het oplossen van deze assays succesvol zijn.
De geadsorbeerde aptameer-gouden nanodeeltjes assays vereisen zorgvuldige optimalisatie voor elke aptameer / target paar. Echter, na de stappen uitgelegd biedt een consistente protocol aan het uitvoeren van de optimalisatie van deze colorimetrische assays. De bepaling en aanpassing van de zoutconcentratie die resulteert in de maximale waarneembare of meetbare kleurverandering tussen het doel en assayblanco is een van de meer kritische optimalisatiestappen (figuren 2 en 3). Voor sommige aptameer / doelparen, hebben we waargenomen dat het gebruik van hoge zoutconcentraties nabij het eindpunt van de titratie curve levert een blauwe naar rode kleurverschuiving 18. Dit geeft een stabilisatie van de AuNPs de aptameer na toevoeging van het doel en zout.
Andere factoren die van invloed kunnen zijn op de test performance omvatten buffercomponenten en concentraties hoeveelheid DNA-aptameer dekking, oplosmiddelen, temperatuur, aptameer-sequentie en structuur, doel-assay incubatietijd (tijdstip doelstelling wordt toegevoegd aan de test vóór zouttoevoeging) en kleurontwikkeling tijd ( tijd die de kleur ontwikkelen na toevoeging zout). Een 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 pH 7,4 buffer was assaybuffer keuze in veel van de doel / aptameer paren die in ons werk. Echter, deze buffer niet ideaal voor alle aptameren zijn. Om juiste vouwing van het aptameer te verkrijgen, kan de testbuffer onderdelen moeten worden aangepast, en bleef zo dicht mogelijk bij de samenstelling gebruikt in de aptameer selectie buffer. Bij het gebruik van een buffer met AuNPs, moeten buffercomponenten en concentraties worden beschouwd, met name ionogene stoffen. Hoge concentraties van ionische verbindingen kon voortijdig aggregatie van de AuNPs veroorzaken. DNA / AuNP dekking werd aangetoond in figuur 3. Als DNAdekking verhogingen 90-180 DNA / AuNP de doelanalyt respons verlaagd waardoor verminderde gevoeligheid van de test. Daarom is een compromis noodzakelijk dat afhangt elke aptameer, wegens de bijzondere vouwen en mate van interactie met de AuNP oppervlak.
Bovendien kunnen oplosmiddelen nodig analysemonstermoleculen lossen leiden tot onbedoelde aggregatie van de AuNPs. Water, testbuffer en methanol zijn allen toegepast zonder probleem. Gebruikt zonder verdunning, acetonitrile en dimethylsulfoxide (DMSO) adsorberen aan de AuNP oppervlak waardoor onbedoelde aggregatie. Acetonitril was problematisch, zelfs bij verdunningen van minder dan 1% (eindvolume). Oplosmiddelen moeten worden getest met AuNPs voor gebruik met de colorimetrische test. De temperatuur waarbij de test wordt uitgevoerd kan van invloed zijn op de vraag of een respons waargenomen met de assay. Dit heeft meer te maken met de aptameer structuur en smelttemperatuur of stabiliteit van de aptameer structuur bij een bepaalde temperatuur, danmet de nanodeeltjes. In ons werk hebben we vastgesteld dat er een delicaat evenwicht tussen de aptameer met een voorgevormde structuur met het DNA in een gevouwen vorm, en ook niet volledig in een enkelstrengs structuur. Dit is het geval voor de geadsorbeerde aptameer assay vorm van deze colorimetrische assays (figuur 1). Bij het overwegen structuur, moet de aptameer-sequentie ook worden overwogen omdat veel van de aptameer structuur is het resultaat van de afzonderlijke oligonucleotidesequenties. Echter, verder onderzoek naar dit aspect nodig.
In het algemeen is de benadering die wij in het ontwikkelen van een aptameer-AuNP gebaseerde colorimetrische bepaling is hetzelfde voor alle aptameer / doelparen. Ten eerste, het verkrijgen van een aptameer voor een doelwit van belang. Dit kan worden bereikt door het doorzoeken van de literatuur of de selectie van een aptameer voor een molecuul van interesse. Op dit moment is er geen manier om te weten of het aptameer is een goede kandidaat voor het maken van een colorimetrischeassay. Dit kan alleen worden vastgesteld door middel van experimenten. Vervolgens wordt de aptameer geïncubeerd met AuNPs nachts de geadsorbeerde aptameer assay (figuur 1) te fabriceren. De standaard aanpak is om te beginnen met het testen met 60 aptameren / AuNP; worden echter meerdere dekkingen voorbereid voor de volgende fase van het testen. Wanneer de assays ter beproeving, voert de titratie curve onderzoeken zoals beschreven (figuur 2). Het middelpunt van de titratiekromme dient als een betrouwbare begint zoutconcentratie worden gebruikt voor het doel, assayblanco en controleproeven. De zoutconcentratie is afgestemd op maximaal kleurverschil tussen het doel en assay blanco monsters. Om te testen het antwoord is echt en wordt veroorzaakt door aptameer-target binden en niet te wijten aan niet-specifieke doelgroep / oplosmiddel interacties, voert u de test met controles. Tegelijkertijd worden testontwikkeling kleur tijden onderzocht op 5 min intervallen. Gevolgd door target-assay incubatietijd op 5 min intervals, worden in eerste instantie 15+ min incubatietijd keer gebruikt totdat deze stap is geoptimaliseerd. Afhankelijk van de resultaten, kan verdere optimalisatie van de zoutconcentratie, aptameer dekking, incubatietijd en kleur ontwikkeling tijd nodig (figuur 3) zijn. Deze aanpak beschrijft een protocol voor het ontwerp en de ontwikkeling van de aptameer-AuNP colorimetrische assays voor een doel / aptameer pair. Verder onderzoek naar de aptameer-sequentie en structurele effecten op de verbetering van de geadsorbeerd aptameer colorimetrische assays zijn van groot belang. Er is behoefte aan het begrijpen van de interactie geassocieerd met de aptameer, doel en AuNPs. Deze kennis kan leiden tot het afstemmen aptameren betere functionaliteit en zelfs voorspellen die aptameren actief in de geadsorbeerde aptameer testformaat zal zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
- Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P.
- Mayer, G.
- Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
- Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
- Iliuk, A., Hu, L., Tao, W.
- Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
- Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
- Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
- Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
- Mayer, G.
- Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
- Lee, J., Stovall, G., Ellington, A.
- Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C.
- Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
- Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
- Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
- Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
- Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
- Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).
