Abstract
Tempo real Polymerase Chain Reaction também conhecido como PCR quantitativa (Q-PCR), é uma ferramenta amplamente utilizada em ecologia microbiana para quantificar a abundância de genes de grupos taxonómicos e funcionais em amostras ambientais. Utilizado em combinação com uma reacção de transcriptase reversa (RT-Q-PCR), que também podem ser empregues para quantificar os transcritos do gene. Q-PCR faz uso de produtos químicos fluorescentes de detecção altamente sensíveis que permitem a quantificação dos produtos de amplificação de PCR durante a fase exponencial da reaco. Portanto, os desvios associados com "ponto final" de PCR detectados na fase de patamar da reacção de PCR são evitados. Um protocolo para quantificar genes e transcrições bacterianas 16S rRNA de sedimentos costeiros através de PCR em tempo real é fornecido. Em primeiro lugar, um método para a co-extracção do DNA e RNA a partir de sedimentos costeiras, incluindo os passos adicionais necessários para a preparação de RNA isento de DNA, é descrito. Em segundo lugar, um passo-a-passo, para a quantificação de genes de rRNA 16S e transcripts a partir dos ácidos nucleicos extraídos através de Q-PCR e RT-PCR-Q é descrita. Isto inclui detalhes para a construção de curvas padrão de ADN e ARN. As principais considerações para a utilização de ensaios de RT-Q-PCR em ecologia microbiana estão incluídos.
Introduction
Os microrganismos são a pedra angular da função biosfera condução ecossistema. A maioria dos microrganismos permanecem uncultured 1. Portanto abordagens baseadas moleculares são fundamentais para avançar nossa compreensão da diversidade e função de microorganismos no ambiente. No centro destas abordagens é a extracção de ácidos nucleicos a partir de amostras ambientais e a subsequente amplificação de genes alvo utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR).
O primeiro passo de extracção de ADN / ARN visa lisar a parede celular da presente microbiana comunidade, remover moléculas de ácido nucleico não desejados (por exemplo, substâncias, orgânicos e inorgânicos) e reter de ADN / ARN em solução para análise posterior a jusante. Entre as várias opções disponíveis na literatura 2,3,4,5, incluindo uma gama de kits de extração comercial, o método de Griffiths 6 é amplamente utilizado 7,8,9. É rentável e particularly bem adequado para os sedimentos uma vez que utiliza um passo de bater grânulo para lisar as células e incorpora passos para minimizar a co-extracção de inibidores de PCR, tais como os ácidos húmicos, enquanto, simultaneamente, recuperar o ADN e ARN.
O segundo passo utiliza a reacção em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar genes alvo, tais como o marcador taxonómico 16S rRNA, a partir dos ácidos nucleicos extraídos. Esta abordagem tem e continua a facilitar a exploração do uncharacterized microbiana 10,11 caixa preta. No entanto, os métodos de ponto final baseado em PCR sofrem de várias limitações que podem influenciar a caracterização de comunidades microbianas 12. Para quantificar com precisão a abundância de genes / transcritos, PCR em tempo real, também conhecida como PCR quantitativa (qPCR) deve ser usado. qPCR explora sistemas de corante repórter fluorescente que rastreiam acumulação amplicon após cada ciclo da PCR. Isto é significativo, uma vez que significa que a quantificação pode ocorrer durante a fase exponencial precoce, em vezdo que o ponto final, a fase da reacção de PCR, quando o rendimento de amplicão ainda é directamente proporcional à abundância inicial do gene alvo.
Dois sistemas repórter são comumente utilizados: uma mancha de ácido nucleico de intercalação 13 e o 5 actividade '3' exonuclease da polimerase de ADN 14. Uma vez que o antigo sistema repórter se liga indistintamente a todos DNA de cadeia dupla, que pode levar a uma superestimação da sequência alvo, se ocorrer amplicons não específicos indesejados ou dímeros de primers de produtos. A fim de contornar esta, pode ser necessária optimização extensiva de amplificação. Neste último sistema, amplificação molde é controlada usando uma combinação de uma actividade de nuclease 5 'de Taq polimerase, que cliva um fluoróforo a partir de uma sonda interna. Esta característica aumenta a especificidade do ensaio, devido à utilização de uma sonda fluorogénico que se liga apenas a sequenc específicos do alvo complementarde e entre o par de iniciadores. Com ambas as químicas de quantificação é obtida por meio da determinação do ponto de cruzamento (Cp), onde a acumulação de produtos de amplificação de PCR, tal como medido por um aumento na fluorescência, é significativamente acima do fundo de fluorescência.
qPCR tem sido amplamente utilizada na ecologia microbiana para determinar abundâncias de genes em diferentes ambientes de 15. Além disso, a transcrição reversa do ARN para ADNc é combinado com qPCR e RT-qPCR para quantificar a expressão do gene. Assim, qPCR e RT-qPCR representam rápidas e eficazes métodos para a quantificação dos números de genes e / ou transcritos nas amostras ambientais.
Microrganismos em sedimentos costeiros conduzir vários processos do ecossistema, incluindo a mineralização da matéria orgânica, a degradação de poluentes eo ciclo biogeoquímico de macronutrientes como nitrogênio 16,17,18. A compreensão exaustiva dessas transformações requer um accoun abrangentet das populações microbianas que contribuem, incluindo dados quantitativos sobre abundâncias de genes e transcritos. Aqui nós introduzimos uma série de exaustivamente testados protocolos, simplificadas e padronizadas para a quantificação de abundâncias bacterianas genes e transcritos 16S rRNA em sedimentos. O protocolo descreve a coleta de amostras, DNA simultânea e extração de RNA, a preparação de ARN livre de DNA, verificação de ácidos nucleicos extraídos qualidade, geração de rRNA 16S-DNA e normas -rna e quantificação de amostras ambientais. Os dados quantitativos derivados dos métodos descritos aqui são necessários para lançar luz sobre as comunidades microbianas condução ecossistemas costeiros.
Protocol
1. DNA e RNA Extração de Marine sedimentos costeiros
- Preparação de ribonuclease (RNase) de material -livre e espaço de trabalho
- Prepare água destilada isenta de ARNase (dH 2 O) por tratamento com 0,1% de dietilpirocarbonato (DEPC) e incubar a 37 ° CO / N. Remover DEPC residual por autoclavagem com dH 2 O a 121 ° C durante 15 min. Use DEPC tratados dH2O para fazer todas as soluções.
- Asse todos os vidros a 180 ° CO / N. Remover tampas de plástico e aros, mergulhe-os em uma solução de 2 M NaOH O / N, e lavá-los com DEPC tratados dH2O antes do uso.
- Prepara-se uma solução tampão de fosfato-CTAB como na Tabela 1.
- Preparar a solução de precipitação PEG-NaCl conforme Tabela 2.
- Limpe todas as superfícies de trabalho (ou seja, banco, microcentrífuga, fume-Hood) e micropipetas usando a solução RNAse-descontaminação antes de começar. Usar luvas durante todo o procedimento. Use plasticware livre de RNAse junto com pontas com filtro micropipeta para evitar a contaminação cruzada de amostras.
- coleta de amostras ambientais e de armazenamento
- Recolha sedimentar durante a maré baixa usando um 50 ml tubo Falcon estéril a partir do topo 2,5 cm. Recolha de aproximadamente 15-20 g de sedimentos. Feche cuidadosamente a tampa após a coleta da amostra. Transporte de imediato para o laboratório em um refrigerador a 4 ° C para processamento imediato.
- Homogeneizar a amostra por mistura com uma espátula e estéril alíquota de 0,5 g de sedimento húmido em peso de 2 ml talão tubo de batimento. Alíquotas repetições adicionais, flash-congelamento, colocando em nitrogênio líquido. alíquotas armazenar a -80 ° C. Cuidado: Usar luvas de protecção e óculos de segurança ao manusear nitrogênio líquido.
Nota: Se o site campo não está localizado perto de um laboratório, alíquota de 0,5 g de sedimentos em 2 ml microtubos estéreis no local campo. Flash-congelar os tubos, colocando-os imediatamente em liazoto quid e transporte para o laboratório. Armazene as amostras a -80 ° C até o processamento.
- Co-Extracção de DNA e RNA a partir de sedimentos
Nota: O protocolo seguinte é uma versão modificada do método de Griffiths 6.- Adicionar 500 ul de tampão CTAB-fosfato e 500 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) para o tubo 2 ml de grânulo de lise contendo 0,5 g de sedimento e inverter o tubo 5-10 vezes para homogeneizar a amostra.
Atenção: Execute esta etapa em um usando equipamento de protecção adequado (ou seja, bata de laboratório, luvas e óculos de segurança) em todos os momentos fume-capa. - Vortex a toda a velocidade para 2,5 min. Centrifuga-se a 16000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Num capuz de fumos-extrair a camada aquosa superior e transferir para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml estéril. Manter as amostras em gelo, adicionar 500 mL de clorofórmio arrefecido em gelo: álcool isoamílico (24: 1).
- Gire várias vezes até que uma emulsão é visible. Centrifugar durante 10 minutos a 16000 xg, a 4 ° C.
- Em um fume-hood extrair a camada aquosa superior e colocá-lo em um novo tubo de 1,5 ml estéril. Precipitar os ácidos nucleicos por adição de dois volumes de solução de PEG-NaCl a 30% e misturar bem.
- Incubar em gelo durante 2 hr ou deixar as amostras a 4 ° CO / N.
- No final da incubação as amostras de centrifugação a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
Nota: Um sedimento pode ser visível na parte inferior do tubo. - Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta, certifique-se de não perturbar o sedimento. Deixar cerca de 10 ul de solução de PEG no tubo e adicionar 1 ml de gelo-etanol frio a 70%.
- Centrifugar durante 20 minutos a 16000 xg, a 4 ° C. Remova lentamente etanol com uma micropipeta tomando cuidado para não tocar a pelota.
- Centrifugar durante 5 segundos e remover o etanol residual utilizando uma micropipeta. Deixar secar o sedimento ao ar durante cerca de 5 min.
- Re-suspender o sedimento em 50 mL DEPC tratados comH 2 O. Examinar a qualidade e o rendimento de ADN / ARN por electroforese em gel de agarose a execução 5 uL num gel de agarose a 1% 19. Dividir os ácidos nucleicos em duas alíquotas de 15 ul, para o ADN e 30 uL de ARN.
- Armazenar o ADN à temperatura de -80 ° C até ser necessário. Isolar RNA, conforme descrito na próxima seção.
- Adicionar 500 ul de tampão CTAB-fosfato e 500 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) para o tubo 2 ml de grânulo de lise contendo 0,5 g de sedimento e inverter o tubo 5-10 vezes para homogeneizar a amostra.
2. Preparação de RNA e de Verificação da Qualidade de RNA livre de DNA
- A digestão do DNA
- Adicionar 3 ul de tampão de ADNase I e 1,5 ul de ADNase I a 30 ul de volume de ácidos nucleicos, incuba-se a 37 ° C durante 30 min.
- Misture o reagente de ADNase A inactivação por vortex durante 30 seg. Adicionar 4,8 mL da solução para a amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min, ocasionalmente bata no fundo dos tubos para misturar a solução.
- Centrifugar a 10000 xg durante 90 seg, à TA, transferir o sobrenadante (ARN) para um novo tubo, tomando cuidado para não transferir precipitado que podem inibir reacções de jusante.
- verificação de qualidade RNA
- Adicionar 2 mL de RNA a 18 mL de estéril dH livre de RNAse 2 O para diluir 1:10.
- Em reacções de PCR separadas, adicionar 1 ml de solvente ou uma diluição de 1:10 de ARN a um tubo de PCR de 0,5 ml estéril. Adicionar os componentes da reacção de PCR para amplificar o gene de rRNA 16S como na Tabela 3. Incluir um (por exemplo., O ADN extraído a partir de uma cultura bacteriana pura), um "PCR inibidor de" controlo "positivo" (ou seja, 1 ul de DNA cultura positiva pura e 1 ml de RNA extraído puro) e um controle de "negativo" de estéril livre de RNAse dH 2 O.
- Definir o termociclador com os seguintes parâmetros de amplificação: 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 seg, 57 ° C 30 seg, 72 ° C 1 min) x 35 ciclos, 72 ° C 10 min.
- Executar 10% do produto de PCR num gel de agarose a 1%, a 85 V durante 40 min. Repetir o tratamento com DNAse I, se um produto de PCR é formada na RN ambientalA amostras.
- Adicionar 2 mL de RNA a 18 mL de estéril dH livre de RNAse 2 O para diluir 1:10.
3. Geração de primeira cadeia de ADNc a partir de ARN
- Adicionar os reagentes de acordo com a Tabela 4 para uma RNAse / DNAse livre 0,2 ml tubo de PCR.
- Incubar a amostra a 65 ° C 5 min. Colocar em gelo durante pelo menos 1 min e, em seguida, incuba-se a 25 ° C durante 10 min.
- Para o mesmo tubo de adicionar os reagentes listados na Tabela 5.
- Incubar a amostra a 55 ° C durante 50 min. Inactivar a reacção a 72 ° C durante 10 min.
- ADNc Armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
4. Quantitative PCR
- Geração de padrões de ADN para qPCR
- Amplificar sequência de ARNr 16S bacteriano 20 (ou qualquer outra sequência de interesse) a partir de ADN genómico extraído de uma cultura pura com iniciadores Q-PCR (1369F & 1492R 21).
- Purifica-se o produto de PCR, utilizando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante.
- Clone da PCR purificadoproduto em uma saliência 3'-t sistema de vector de clonagem de acordo com as instruções do fabricante.
- Transformar o vector contendo a inserção de PCR em Escherichia coli JM109 competentes células de acordo com as instruções do fabricante.
- Placa 50 ul de transformação Onto ampicilina (100 ug / ml), de X-gal (20 ug / mL) e IPTG (0,5 mM) de Luria Bertani placas de agar (triptona 10 g / L, extracto de levedura 5 g / L, NaCl a 10 g / L, agar 15 g / L). Incubar O / N a 37 ° C.
- Selecione um único transformante branco positivo a partir da placa. Inocular o transformante positivo em 50 ml de caldo LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubar O / N com agitação a 250 rpm a 37 ° C.
- A partir da cultura D / N, isolar e purificar o plasmídeo utilizando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante.
- Linearizar o plasmídeo com uma enzima de restrição apropriada que é capaz de cortar o plasmídeo uma vez (por exemplo, EcoRI).
- Determinar a concentração de ADN de plasmídeo por absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro de 19.
Nota: Em alternativa, a exactidão da quantificação pode ser melhorado pelo uso de um corante de ligação a ADN fluorescente utilizado em conjunto com um fluorómetro. - Sequência do plasmídeo inserir para confirmar o tamanho do alvo, em bases. Calcular a quantidade (isto é, percentual) de inserção de ADN no plasmídeo (por exemplo, num vector de 3000 pb, um fragmento de ADN de 123 pb é de 3,9% de ADN total) e multiplicá-la por a concentração obtida em 4.1.10, para determinar o concentração de ADN de alvo (inserção).
- Use a seguinte equação para calcular as cópias do alvo por ul:
carga / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - Calcular o alvo molecular Peso (TMW) através da multiplicação do número de pares de bases do ADN alvo por o peso molecular médio de ADN de cadeia dupla (dsDNA, 660 Daltons por par de bases).
- Dilui-se o ADN alvo numa gama de 10 10 a 10 2 cópias utilizando 2 ul de ADN e 18 uL de dH 2 O. estéril Misture bem cada diluição e girar brevemente antes de fazer a próxima diluição.
- Geração da curva padrão de ARN para qPCR
- A partir do passo 4.1.5, ecrã um número de colónias brancas (cerca de 5) por PCR de colónias 19 utilizando o iniciador reverso alvo (isto é, R1492) e o iniciador para a frente vector plasmídico M13F.
Nota: Esta combinação de iniciadores amplificará insertos clonados na orientação com sentido correcto com um local promotor de T7 a montante. - Purifica-se o produto de PCR, utilizando um kit comercial seguindo as instruções do fabricante. Quantificar o purificado PCR produto a 260 nm utilizando um espectrofotómetro.
- Adicionou-se 200 ng de produto de PCR num volume final de 20 ul com 7,5 mM de cada ribonucleótido, um tampão de reacção de polimerase de T7 e uma enzima de T7 para a transcrição in vitro de reacção em.
- Incubar a mistura reaccional durante 4 h a 37 ° C. Adicionar 1 unidade de RNase DNase I para a reacção, incubar durante 15 minutos a 37 ° C para remover o molde de ADN.
- Recuperar o ARN transcrito in vitro por precipitação com etanol e 19 quantificar os rendimentos de ARN utilizando um fluorímetro ou por absorvância a 260 nm.
- Calcular número transcrição por ul de ARN. Adicionar o número de pares de bases no ARN alvo (por exemplo, 123 bases) para o comprimento do promotor de T7 (153 bases) e multiplicando pelo peso molecular médio de ARN, 340 Daltons por base.
- Adicionar 500 ng de ARN alvo quantificada a uma reacção de transcriptase inversa (RT) como descrito na secção 3. Serially diluir o ADNc como descrito em 4.1.13 para usocomo a curva padrão.
- A partir do passo 4.1.5, ecrã um número de colónias brancas (cerca de 5) por PCR de colónias 19 utilizando o iniciador reverso alvo (isto é, R1492) e o iniciador para a frente vector plasmídico M13F.
- PCR em Tempo Real
- DNA ambiental Thaw / amostras de cDNA, padrões e reagentes qPCR no gelo. Proteger a sonda fluorogênico da luz.
- Dilui-se os padrões para a curva padrão como descrito em 4.1.14. Faça 1:10 diluições do DNA ambiental / cDNA a partir de puro a 10 -3 pela adição de 2 mL de amostra a 18 mL de dH 2 O. estéril
- Adicione uma reacção mestre mistura para o número total de reacções, mais de 10% de acordo com a Tabela 6 (iniciadores e sonda) e Quadro 7 (mistura de reacção). Misturar bem e centrifuga-se brevemente.
- Adicionar 19 ul de mistura principal e 1 ul de molde (padrão, amostra ambiental ou de água para controlo negativo) a cada poço numa placa de 96 poços qPCR óptico. Execute cada reacção (padrões, amostras ambientais e controlos negativos) em triplicado.
- Cobrir a placa de 96 poços com uma tampa óptico Q-PCR. Centrifugar a placa brevemente. carregar ochapa para o bloco de aquecimento da máquina de qPCR e fechar a tampa.
- Abra o software gerenciador de qPCR. Clique na guia "protocolo", clique em "Criar novo", adicione as seguintes condições de amplificação: 3 min 95 ° C, (10 seg 95 ° C, 30 seg 60 ° C) x 40 ciclos. Definir o volume de amostra para 20 l, clique em "OK" e guardar o protocolo.
- Clique na guia "Plate". Em "Editar selecionado" clique "selecionar fluoróforo", adicione o corante relatório para a sonda adequada, por exemplo, fluoresceína. Clique em "OK".
- Realce poços contendo os padrões, selecione "padrão" do menu "tipo de amostra". Clique em "replicar série" para mudar "replicar tamanho" a 3, clique em "aplicar". Clique em "série de diluição" para adicionar concentração inicial calculada para o padrão 1, indicam o fator de diluição (10), selecione "diminuir" ou "aumentar", dependendo do fim da curva padrão foi adicionadapara a placa. Clique em "Aplicar".
- Destaque também posições que contêm as amostras desconhecidas, selecione "desconhecido" do "tipo de amostra" no menu suspenso. Clique em "replicar série" e alterar "replicar tamanho" para 3. Clique em "Aplicar". Editar nomes de amostra em "nome da amostra". Repita o procedimento para nenhum controle de modelo poços (NTC).
- Clique em "OK" na caixa editor de placa e salvar o arquivo. Clique em "Iniciar run".
- Na conclusão da execução, a janela de análise de dados será aberta. Clique na guia "quantificação" para exibir a curva padrão, descritores padrão de curva (Tabela 8) e parcelas de amplificação.
- Clique na guia "Dados quantificação" para valores de PB e de partida correspondente quantidade de gene (SQ) de amostras desconhecidas. Exportar tabela para o software de planilha, se necessário.
- abundâncias de genes se multiplicam a partir de amostras desconhecidas pelo fator de diluição, a quantidade de sedimentos extracTed partir e os ácidos nucleicos totais foram eluídas de volume em obter cópias do gene por grama de peso húmido do sedimento.
Nota: ADN Eluir a partir de 0,5 g de sedimento em 50 ul, dilui-se 1/10, adicionar 1 ul como molde para uma reacção de Q-PCR; calcular cópias do gene g -1 sedimentos multiplicando: cópias do gene pi de DNA x diluição volume de eluição com Factor X x 2.
Representative Results
A extracção de ADN de boa qualidade e de ARN a partir de sedimentos é o primeiro passo na quantificação abundância de genes e transcritos. Um sucesso rendimentos de extracção de bandas de ADN e ARN límpida indicada na Figura 1 para a amostra de AC, onde bandas nítidas de rRNA 23S e 16S são visíveis em adição à banda de ADN genómico de elevado peso molecular.
Figura 1. DNA / extração de RNA. Os resultados típicos de extração de DNA / RNA de triplicado (ABC) 0,5 g sedimentos costeiros. 5 ul de DNA / RNA foi executado em uma de agarose a 1,4%, a 85 V durante 40 min. Foi utilizado um marcador molecular no intervalo 10,037-200 pb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Um protocolo de reacção qPCR é descrita a segmentação de ADN do ARNr 16S. Para 16S rRNA transcrições substituir o cu padrãorve e modelo com cDNA. Dado que as amostras desconhecidas são quantificadas em relação à curva padrão, é imperativo para assegurar que a curva padrão é de boa qualidade. A Figura 2 mostra a preparação de (A), as curvas de padrão e diluições de ADN ambiental, (B), a amplificação da curva padrão e amostras ambientais (C) conversão de curva padrão para uma regressão linear e cálculo do número de cópias do gene. Quando uma série de diluições de 10 vezes é correctamente preparada amplificado e uma diferença de 3,3 ciclo entre cada diluição padrão é visto (demora 3,3 ciclos para um aumento de dez vezes no molde na eficiência de amplificação de 100%) (Figura 2BI). Descritores curvas padrão, incluindo os valores de r 2 de 0,99 e eficiências de PCR dentro da gama de 90 a 110% (Figura 2C) são desejados. É importante relatar valores Cp do nenhum controle modelo (NTC) se presente. Se isso ocorrer um corte de Cp para padrões e amostras desconhecidas 3,3 ciclos (<em> ou seja, uma dobra log) superior ao valor Cp do NTC é imposta 20 (Figura 2Cii). Molde Desconhecido extraída a partir do ADN do sedimento foi quantificada a partir puro, 10 -1, 10 -2 e -3 diluições 10 (B). A amostra pura não amplificar, os valores de Cp de 10 -1 a 10 -3 diluições foram 24,12, 26,02 e 28,40, respectivamente. A NTC Cp foi de 30,5, foi imposto um corte NCT de 27,2. Convertendo abundância de genes para g -1 molhada sedimentos de peso resultou em 2,5 x 10 7 e 7,1 x 10 7 para 10 -1 e -2 10, respectivamente, para a gama de diluição. 10 -3 Cp diluição estava abaixo do cutoff NTC, e foi, portanto, não utilizado. Neste caso, a 10 -2 foi seleccionado como o modelo óptimo de diluição.
Figura 2. gene 16S rRNA QPCAmplificação R de normas e DNA ambiental extraído de sedimentos costeiros. Preparação de (A) i) curva padrão de ADN e de ii) diluições de ADN ambiental para a amplificação qPCR, (B) de amplificação de qPCR i) curva padrão de ADN e amostras ambientais II), Cp para cada amostra são apresentados. (C) i) A regressão linear da curva padrão com descritores da curva padrão; ii) cálculo da abundância de genes a partir de amostras ambientais. NTC:. Controle de modelo negativa Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Quantidade |
| CTAB | 5 g |
| K 2 HPO 4 2 O x3H | 2,58 g |
| KH 2 PO 4 | 0,1 g |
| NaCl | 2,05 g |
| dH2O | até 100 ml |
Tabela 1. Preparação do tampão de fosfato-CTAB.
| Reagente | Quantidade |
| PEG 6000 | 30 g |
| NaCl | 9,35 g |
| dH2O | até 100 ml |
| Nota: adicionar PEG 6000 lentamente sob aquecimento moderado e agitação de 50 ml de dH 2 O. | |
Tabela 2. Preparação da solução de precipitação PEG-NaCl.
| Reagente | Quantidade |
| RNA não diluído / 01:10 RNA diluída | 1.0 ul |
| Tampão de PCR 10x | 5,0 ul |
| dNTPs 10 mM | 1.0 ul |
| 63F iniciador directo | 1.0 ul |
| CAG GCC TAA CAC ATG GTC CAA | |
| 518R iniciador inverso | 1.0 ul |
| ATT ACC GCG GCT GCT GG | |
| Taq polimerase | 0,4 ul |
| DH livre de RNAse 2 O | 40,6 ul |
Tabela 3. qualidade RNA PCR Master Mix de seleção livre de DNA.
| Reagente | Quantidade |
| RNA | 0,5-5 ug |
| dNTPs 10 mM | 1 ul |
| Iniciador inverso 10 uM / Random hexâmeros 50 uM | 1 ul |
| DEPC-H2O | Até 13 ul |
Tabela 4. ADNc mistura reaccional síntese A.
| Reagente | Quantidade |
| tampão 5x | 4 ul |
| DTT | 1 ul |
| RNAse Inhibitor | 1 ul |
| Transcriptase reversa | 1 ul |
Tabela 5. ADNc de mistura de reacção de síntese B.
| Alvo | nome do iniciador | Seqüência | O recozimento T (° C) | Referência |
| bactérias 16S rRNA | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TCY CGG | 56 | Suzuki et al., 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (sonda) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| Reagente | Quantidade |
| 2x Master Mix | 10 ul |
| iniciador directo (10 mM) | 0,8 ul |
| iniciador de sentido reverso (10 pM) | 0,8 ul |
| Sonda (10 pM) | 0,4 ul |
| água | 7,0 ul |
| O volume final | 19 ul |
Tabela 7. em tempo real de mistura de reacção PCR.
| descritor | Significado |
| O coeficiente de correlação (R2) | Uma medida da linearidade da curva padrão. Idealmente, deve ser de R 2 = 1. Valor de R 2 = 0,98-0,99 são aceitáveis. |
| Inclinação (α) | Uma medida da eficiência da reacção. Idealmente, deve ser equivalente a -3,32. Valor no intervalo entre -3,58 e -3,1. |
| Eficiência (= 10 (-1 / inclinação) -1) | Se é 100%, os modelos duplica após cada ciclo térmico durante a amplificação exponencial. Uma boa variedade eficiência é entre 90 e 110%. |
| Y Intercept (β) | O limite teórico de detecção da reacção. Apesar de não ser utilizada para quantificar a sensibilidade de reacção, que é importante quando se comparam diferentes curvas padrão do mesmo alvo. |
Tabela 8. QPCR descritores de reacção.
Discussion
A combinação de DNA extração / RNA com qPCR fornece um método rápido, preciso, relativamente de baixo custo para a quantificação sensível da abundância de genes e transcritos a partir de uma gama de amostras ambientais, tais como sedimentos costeiros.
A extração inicial de ácido nucleico é o passo fundamental para garantir uma visão representativa da microbiana presente comunidade é alcançado 22. Um certo número de limitações devem ser considerados para o protocolo de extracção: a) a realização de lise celular total, b) co-extracção de compostos inibidores (por exemplo, ácidos húmicos ou polifenóis), c) o ADN contaminante na fracção de ARN, d) rápida degradação dos ácidos nucleicos extraídos quando armazenado. Devem ser tomadas precauções a fim de contornar essas limitações. Por exemplo, um cuidado especial tem de ser tomadas medidas para assegurar que a extracção de ácidos nucleicos é optimizada para o tipo de amostra (por exemplo, sedimentos, terra, águas residuais, etc.). Melhorias significativas na produtividade de ácido nucleico e de qualidade tanto para o ADN e ARN podem ser alcançados através da realização de experiências preliminares 23. Para minimizar o efeito dos compostos inibitórios sobre os pedidos baseados em PCR 24, testar uma gama de diluições do ADN extraído e ARN. Para contornar a rápida degradação do ADN / ARN extraído de vários ciclos de congelamento-descongelamento e evitar a possível perda de informação genética, várias aliquotas de pequeno volume armazenar a -80 ° C.
Quando cuidadosamente projetado, qPCR é um método robusto, altamente reprodutível e sensível. Notavelmente, os métodos de amplificação e de construção curva padrão descritas neste protocolo pode ser adaptado para qualquer gene alvo de interesse, incluindo outros marcadores filogenéticas (isto é, de arqueia 16S rRNA de fungos, 18S rRNA) ou genes envolvidos em funções importantes do ambiente. limitações conhecidas na utilização de qPCR são: a) geração de alta qualidade reprodutível-scurva tandard para a quantificação absoluta, b) a escolha de iniciadores / sondas e optimização das condições de ensaio de Q-PCR, c) a utilização de baixa qualidade / ácidos nucleicos cortadas, d) a escolha da diluição de trabalho de ADN / ARN para evitar a inibição . Além disso, tem que ser considerado que a técnica de qPCR fornece abundância de genes / transcritos que podem não igualam a célula contagens: isto é particularmente o caso quando os genes 16S e 18S rRNA são segmentados, como microorganismos têm diferentes números de cópias do gene ribossomal no seu genoma 25.
Pobres curvas padrão de qualidade irá resultar em quantificação imprecisa do gene de interesse. É uma boa prática para armazenar um estoque de padrões elevados de concentração em pequenas alíquotas a partir do qual podem ser feitas curvas padrão frescos. Não guarde curvas padrão, sempre fazer diluições frescas de um balanço da maior concentração de cada vez. Para a quantificação precisa de amostras ambientais assegurar a gama de concentrações do Stancurva dard abrange os valores Cp esperados das amostras desconhecidas. Ao quantificar transcritos, a curva padrão a partir de RNA não ADN de cadeia dupla. Quando possível, a quantificação de amostras a ser comparadas diretamente deve ser concluída dentro de um único ensaio para evitar a variação inter-ensaio 20. Isto pode não ser sempre possível. Por conseguinte, para comparar a abundância de genes geradas entre ensaios é aconselhável ter um sub-conjunto aleatório de amostras replicadas entre ensaios. Uma ampla seleção de Iniciador e Sonda conjuntos estão atualmente disponíveis para qPCR segmentação taxa microbiana e grupos funcionais 15. A consideração cuidadosa é necessária quando selecionar estes para garantir tanto a cobertura máxima e especificidade para o grupo-alvo. Se a eficiência da reacção de um ensaio de qPCR não é satisfatória, resolução de problemas começa com testando diferentes condições de ciclos térmicos (como tempo de recozimento e / ou temperatura) e / ou condições de reacção, por exemplo, variando as concentrações de iniciador-sonda. ONCE as condições de ensaio e de reacção de Q-PCR são optimizadas, sempre conduzir um teste inicial de uma gama de diluições de DNA / cDNA para determinar a concentração de molde apropriado. Selecione o intervalo de diluição resultando em maior número de cópia como a diluição modelo ideal para mais ensaios.
Atualmente, tecnologias de sequenciamento de próxima geração lançar eficiente luz sobre a estrutura da comunidade microbiana e funções em uma infinidade de ambientes 26,27,28. No entanto, esses conjuntos de dados baseiam-se frequentemente de ponto final bibliotecas fragmento amplificado pela PCR e, portanto, fornecer apenas avaliações semi-quantitativas da abundância de determinada taxa. Assim, a capacidade da técnica baseada em PCR em tempo real para atingir marcadores taxonómicos específicos (da mais elevada até ao nível do domínio de estirpe) permite a validação eficiente dos resultados obtidos por sequenciação de última geração. Além disso, qPCR foi usado com sucesso em combinação com outros métodos moleculares ecologia microbiana, tais como iso estáveltope sondagem (SIP) ou / microarrays funcionais filogenéticas. Combinado com o primeiro ferramenta, qPCR pode ser utilizado para quantificar a comunidade metabolicamente activa 29,30. Quando combinado com a análise de microarray, qPCR fornece interpretação quantitativa chave da filogenéticas baseadas em marcador e gene funcional pesquisas de ambientes 31,32.
Portanto, utilizado isoladamente ou em combinação com outros (muitas vezes baseadas em processos) avaliações da função do ecossistema, PCR quantitativa é uma ferramenta essencial para os ecologistas microbianas na exploração da ligação elusiva entre comunidades microbianas e funções do ecossistema.
Acknowledgments
Esta publicação emanava de pesquisa realizada com o apoio financeiro do Meio Ambiente Conselho de Pesquisa Natural (NERC), sob número de concessão NERC NE / JO11959 / 1 e Science Foundation Ireland & a Marie-Curie Acção COFUND sob Grant Number 11 / GRIC / B2159awarded para CJS ea Academic Research Consortium Oriental (Eastern ARC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
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