Abstract
De isolatie van reusachtige virussen is van groot belang in dit nieuwe tijdperk van virologie, vooral omdat deze reusachtige virussen worden gerelateerd aan protists. Giant virussen kunnen potentieel pathogene voor vele soorten van protisten zijn. Ze behoren tot de onlangs beschreven volgorde van Megavirales. De nieuwe lijn Faustovirus dat is geïsoleerd uit rioolwater monsters is ver verwant aan de zoogdieren pathogeen virus van Afrikaanse varkenspest. Dit virus is ook specifiek voor de amoebal gastheer, Vermamoeba vermiformis, een protist gebruikelijk in de gezondheidszorg watersystemen. Het is van cruciaal belang om te blijven isoleren van nieuwe Faustovirus genotypes om de genotype collectie te vergroten en te bestuderen zijn pan-genoom. We ontwikkelden nieuwe strategieën voor het isoleren van aanvullende stammen door een beter gebruik van antibiotica en antifungale combinaties om bacteriële en fungale verontreiniging van de amoebe co-kweek te voorkomen en het bevorderen van de virusvermenigvuldiging. We hebben ook geïmplementeerd een nieuw starvation middellange tot V. behouden vermiformis in optimale omstandigheden voor virussen co-cultuur. Uiteindelijk, met flowcytometrie plaats van microscopische waarneming, hetgeen tijdrovend, het cytopathogene effect detecteren. We kregen twee isolaten uit rioolwater monsters waaruit de efficiëntie van deze werkwijze en daarmee de verbreding verzameling Faustoviruses, beter te begrijpen hun omgeving gastheerspecificiteit en genetische inhoud.
Introduction
De ontdekking van gigantische virussen, in het bijzonder die welke behoren tot de Megavirales orde, compleet veranderde de wereld van virussen in termen van deeltjesgrootte en genoom complexiteit. Virussen werden eerder gedacht kleine entiteiten en de mimivirus bleek alle regels overtreden. 1 Metagenomic gegevens suggereren de alomtegenwoordigheid van grote virussen niet alleen in het milieu, 2-5 maar ook bij mensen. 6 Derhalve bestaat er nog steeds behoefte zoeken naar deze virussen op grote schaal. De diversiteit van deze reusachtige virussen werd bepaald door middel van steekproeven niet alleen een verscheidenheid van het aquatisch milieu en de bijbehorende sedimenten wereldwijd, 7-11, maar ook door het screenen van een verscheidenheid van menselijke monsters 12,13 en milieu monsters. 7,9 de Acanthamoeba polyphaga mimivirus was geïsoleerd door middel van co-cultuur met behulp van fagocytische protisten, voornamelijk Acanthamoeba spp. 14-16 Een hele collectie van reuze virussen waren dan ookgeïsoleerd uit dit gespecificeerde protist gastheer, waardoor de wetenschappelijke gemeenschap haar onderzoek en isolatie procedure voor Acanthamoeba spp beperken. Dit duidelijk afhankelijkheid van één gastheersoort heeft geleid tot een groot deel virussen het hoofd gezien. Dat de reus virus, CroV, werd geïsoleerd met de zeer beweeglijke Zeewaterprotozoa cafetaria roenbergensis, 17,18 aantoont dat een breder scala van protozoa gebruiken om nieuwe geslachten of families van grote virussen ontdekt. Reteno et al. Heeft andere protozoa als gastheercellen die nooit eerder werd gebruikt selecteren en die de nieuwe Asfar gerelateerde lijn van grote virussen (de nieuwe naam Faustovirus). 19
In een poging om nieuwe Faustovirus genotypes isoleren om de leden van deze virale stam breiden wij onze gemodificeerde isolatieprocedures en gebruikten ze om monsters milieu kunnen oogsten nieuwe Faustoviruses screenen. Wij danbeschreef de gehele protocol bij de nieuwe isolaten karakteriseren. Onderzochten we Vermamoeba vermiformis, de meest voorkomende vrijlevende protist in menselijke omgevingen 20-22 reeds bij het isoleren van de eerste Faustovirus prototype E12. 19 Dit protist is nog steeds gastheerspecifiek voor Faustovirus gebruikt. We wisten dat geen van de bekende reus virussen pathogeen was voor deze amoebe, omdat er geen pogingen groeien andere grote virussen in ons laboratorium toonden amoebe lysis of virale groei. Om deze reden zijn wij van mening dat V. vermiformis is de beste en meest unieke Celdrager bekend om nieuwe Faustoviruses isoleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sample Collection
- Verzamel 70 monsters van verschillende omgevingen en regio's. In dit geval gebruikt u de volgende: 5 vuil water monsters uit het dorp van Saint Pierre de Meyzoargues (Frankrijk), 15 monsters van het meer in Parc Borély in Marseille (Frankrijk); 15 zee watermonsters met sediment uit de kreken op Samena in Marseille (Frankrijk), 25 rivierwater monsters van de Alpen (Frankrijk), en ten slotte, 10 monsters van rioolwater in La Ciotat (Frankrijk).
- Vortex monsters vóór homogenisering inoculeren gedurende één minuut bij kamertemperatuur zonder enige behandeling.
2. Isolatie Procedure
- Host Voorbereiding voor Blind Cultuur Procedures en Sample Inenting
- Gebruik V. vermiformis (stam cdc19) als Celdrager voor co-cultuur.
- Handhaaf de amoeben bij 28 ° C, in een 75 cm 2 celkweek kolf met 30 ml protease-pepton-gistextract-glucose medium (PYG). Controleer PYG samenstelling in tabel 1.
Opmerking: Na 48 uur worden amoeben gekwantificeerd door een normale telling behulp van het tellen slides (bijvoorbeeld Kovaslides). - Oogst cellen bij een concentratie van 5 x 10 mei-10 juni cellen / ml, en amoeben pellet door centrifugeren bij 720 xg gedurende 10 min.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en resuspendeer de amoeben pellet in 30 ml amoebal zoutoplossing steriele Pagina's (PAS) Tabel 1. Herhaal deze spoelprocedure.
- Resuspendeer amoeben in 30 ml uitputtingsmedium met een antibioticum en schimmelwerende mengsel bij een concentratie van ongeveer 10 6 amoebe / ml. De honger medium is een survival medium voor de amoebe, waardoor het in leven te blijven zonder encystment of vermenigvuldiging. Check samenstelling in tabel 1.
Opmerking: Het antimicrobiële middel mengsel bevatte 10 ug / ml vancomycine, 10 ug / ml imipenem, 20 ug / ml ciprofloxacine, 20 μg / ml doxycycline en 20 ug / ml voriconazol. Deze mix diende om de bacteriële en schimmel besmetting die kan verminderen of veranderen virale vermenigvuldiging te verminderen. - Direct inoculeren 25 pi van elk monster op de 200 ul amoebe monolaag in een 96-well plaat met vlakke bodem begunstiging amoeben hechting en incubeer bij 30 ° C in een vochtige omgeving (een vochtige omgeving bestaat uit het plaatsen van een natte kompres in de zak met de plaat om verdamping te voorkomen). Dit is de primo-cultuur. Laat twee putjes van amoeben zonder monster enting; Deze fungeert als negatieve controle. Incubeer dit primo-cultuur voor drie dagen.
- Drie dagen na de eerste inoculatie, subcultuur de primo-kweekplaat verse amoeben zoals boven beschreven zonder enige microscopische waarneming. Incubeer de nieuwe plaat voor drie dagen onder dezelfde voorwaarden als de primo-cultuur.
- Voer de uiteindelijke kweek na drie dagen incubatie net als vooe primo- en sub-cultuur. Incubeer de uiteindelijke kweek gedurende twee dagen. Ga dan naar detectie.
- Detectie van Lysis door geautomatiseerde flowcytometrie
Opmerking: Blind cultuur combinatie met flowcytometrie verschilt van de vorige standaardsysteem van isolatie. Het gevoeliger, nauwkeuriger en geautomatiseerd. Voor detectiedoeleinden, pasten we een nieuwe techniek ontwikkeld om lysis detecteren de hoogste snelheid en zonder microscopische waarneming. Deze techniek is voordelig voor het screenen van monsters en heeft een betere gevoeligheid dan oudere technieken. 7-9- Gebruik de 96-well plaat van de laatste co-cultuur lysis detecteren.
- Schakel de cytometer en uitvoeren van een schoon en spoeling om lagere achtergrondgeluid te verkrijgen volgens het protocol van de fabrikant.
- Start de High Throughput Sampler (HTS) in combinatie met flowcytometer monsters van de 96-well plaat automatisch laden en uitvoeren van een volledig geautomatiseerd verwerving in 40 min according het protocol van de fabrikant.
- Stel de HTS als volgt: monster volume 150 ul, mengen volume 50 pi, het mengen snelheid 180, aantal mixen 5, wassen volume tussen elk monster 400 ul, debiet 2,5 gl / sec, het aantal geregistreerde gebeurtenissen 10.000.
- Beoordeel de negatieve controle wells van de laatste co-cultuur microplaat eerste om poort amoeben populatie en het percentage van deze gastheercellen te bepalen afhankelijk van hun fysieke kenmerken. Zorg ervoor dat u een homogene amoebe bevolking en een tweede populatie van een lagere gebeurtenissen die overeenkomt met puin en lawaai.
Opmerking: Deze gating procedure onderscheidt subcellulaire puin en klompen van enkelvoudige cellen op grootte, geschat door voorwaartse verstrooiing. Het is daarom belangrijk om nauwkeurig bepalen van het percentage van elke populatie met de best mogelijke gating procedure. Deze percentages kunnen variëren, vooral als vele soorten protozoa worden gebruikt, dus is het belangrijk altijd een negativ hebbene controle, die kan worden gebruikt als referentiepopulatie voor de rest van de monsters. - Start de gating door te klikken verwerven monster.
- Noteer het aantal gebeurtenissen ten minste 10.000 gebeurtenissen.
- Lokaliseren amoebe bevolking van belang met behulp van de pijl. Dit is hoe je de poorten te definiëren.
- Na de gating, laat de HTS plaatse of zoek de plaat door te klikken op 'Home', dan is de hele plaat automatisch uitgevoerd. Voer data-acquisitie en analyse op basis van de omvang en structuur parameters (respectievelijk FSC (voorwaartse verstrooiing) en SSC (zijwaartse verstrooiing)).
Opmerking: Het detecteren van het verlies van de amoebe-gated bevolking signaleert de aanwezigheid van een pathogeen agens verantwoordelijk voor amoebe lysis. Protozoa lysis geassocieerd met virus infectie gedetecteerd met een willekeurig gemaakt drempel van 50% lysis van de amoebe bevolking afgesloten door de analyzer en vergeleken met dezelfde niet-geïnfecteerde als een betrouwbare negatieve controle.
- Voorlopige kleuring om de aanwezigheid van Giant Virussen Reveal
- Na lysis met behulp van flow cytometrie, pipet de gelyseerde co-culturen naar resterende amoeben opschorten. Vervolgens direct cytocentrifuge 50 pl van de suspensie bij 800 xg gedurende 10 min.
- Na centrifugeren, bevestig de dia's met een pure methanol oplossing. Vlekken op de dia's met behulp van een commercieel snelle kleuring van Eosine / blauw Azur en DAPI kleuring en observeren onder een lichtmicroscoop bij 1000x om te controleren op de aanwezigheid van het virus fabrieken.
- Voor snelle kleuring, dompelen de dia's in de eerste eosine-oplossing (4 sec driemaal herhaald) leid rechtstreeks dia duik in de tweede fixeeroplossing met blauwe Azur voor 6 seconde, en tenslotte spoel de glaasjes voor 45 sec met een fosfaatbufferoplossing pH 7,2. Laat de dia's drogen bij kamertemperatuur, ga dan naar observatiop.
- Voor DAPI kleuring, aanbetaling van 15 ul van de DAPI commerciële voorraad oplossing op de vaste droge glijbaan. Beschermen tegen licht ga dan naar waarneming.
- Elektronenmicroscopie
- Na de eerste identificatie op de glijbaan, beoordeelt de aanwezigheid van de grote virus via elektronenmicroscopie waarneming supernatant culturen.
- Borg 5 pi van de positieve monster op de gloed ontladen raster. Wacht gedurende ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Droog het rooster aandachtig en borg op het een kleine daling van 1% ammoniummolybdaat gedurende 10 sec. Laat het rooster drogen 5 min.
- Ga verder met elektronenmicroscopie bij 200 keV.
- Plaats het rooster op de houder; invoering van de houder in de microscoop. Controleer het vacuüm overzicht door te klikken op de bijbehorende icoon. Sluit kleppen en beginnen observatie op een plek maat 5, en vergroting van x 25.000.
- Meet de reus virus met behulp van ImageJ of directly op de microscoop met behulp van de maatregel instrument van de microscoop op de overname scherm.
Opmerking: Deel het monster in de Faustovirus groep met een capside grootte van ongeveer 200 nm.
- Moleculaire biologie
Opmerking: Na deze identificatie moleculaire biologie testen waren cruciaal voor de bevestiging om Faustovirus onderscheiden van marseillevirus, die dezelfde capside grootte en het uiterlijk onder elektronenmicroscopie heeft, hoewel zij niet dezelfde gastheerspecificiteit hebben. De marseillevirus kan niet groeien op Vermamoeba, de Faustovirus is specifiek voor Vermamoeba en alle pogingen om het te groeien op andere amoebe, zoals Acanthamoeba hebben gefaald to-date. Het ontwerp en de uitvoering van de specifieke in de werken van Reteno et al vermeld primer / probe-systemen. kon een nauwkeuriger voorlopige classificatie van de nieuw geïsoleerde virussen door middel van amplificatie en sequencing van de virale genen.- Extract DNA van de positieve kweekmonsters een geautomatiseerd extractie volgens het protocol van de fabrikant.
- Voer real-time PCR met behulp van een thermocycler zoals beschreven Reteno et al. 19
- Sequentie met dezelfde primers die werden gebruikt voor amplificatie. Met de primers gericht DNA gerichte RNA polymerase subunit 1 gen: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT CAC GAT GGT ATA G-3 '(voorwaarts) en 5'-Fstv_S2R TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (omgekeerde) met de Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA probe.
4. Virus Productie, zuivering en Genome Sequencing
- Subcultuur de enkel virus amoebe cultuur eindpunt verdunning klonen.
- Voor de productie: bereid 20 kolven met 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis en 5 ml van het geïsoleerde virus reeds overgedragen van putten kleine kolven.
- Incubeer bij 30 ° C tot vollediglysis van de amoebe. Observeer elke dag door omgekeerde optische microscopie totdat alle amoebe worden gelyseerd.
- Na volledige lysis, bundelen alle kolven in een ontvanger. Filter met een 0,45 urn filter om afval te elimineren.
- Start de zuivering door ultracentrifugatie bij 89.800 xg gedurende 75 min. Zorg ervoor dat het gewicht van de buizen te kalibreren voordat centrifugeren.
- Na het centrifugeren, de bovenstaande vloeistof van elke buis door aspiratie en resuspendeer de pellet in PAS met hetzelfde volume wordt gebruikt voor de kalibratie, voordat u opnieuw centrifugeren.
- Zoals hierboven, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Zuiver het virus dat wordt geproduceerd met behulp van 25% sucrose (27,5 g sucrose in 100 ml PBS, gefiltreerd over een 0,22 urn filter).
- Gebruik 8 ml sucrose en 2 ml van de virale suspensie. Centrifugeer bij 89.800 g gedurende 1 uur 15 min. Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS. Bewaar bij -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het systeem bestudeerd in dit manuscript gevalideerde zijn proof of concept door het isoleren van twee nieuwe Faustoviruses. Van de geteste 70 monsters werden twee episoden van lysis waargenomen, in tegenstelling tot onze betrouwbare negatieve controles. De negatieve controle voor lysis bevatte een 86% amoebe bevolking. Daarentegen is de positieve monsters (ST1 voor Saint Pierre de Meyzoargues), en (LC9 voor de La Ciotat Sample 9) toonde een dramatische daling in een gesloten amoebae; meer dan 60% van amoeben werden gelyseerd met het hoogste percentage vuil. Deze robuuste resultaten van de detectietrap van onze werkwijze zijn weergegeven in Figuur 1. Eosine / blauw Azur en DAPI kleuring bevestigde de aanwezigheid van virus fabrieken in de amoeben, figuur 2. Elektronenmicroscopie onthulde het typische uiterlijk van Megavirales een icosahedraal capside , 200 nm in grootte en gebrek fibrillen (figuur 3). Een specifieke PCR voor grote virussen, particularly voor Faustovirus, bevestigden onze eerdere bevindingen. Het moet worden gecontroleerd door middel van PCR om dubbelzinnige resultaten of verontreinigd isolaties elimineren. Virussen werden gekloond, geproduceerd en gezuiverd voor het gehele genoom sequencing. De genomen van de nieuw geïsoleerde Faustoviruses worden ingediend onder de volgende Bioproject: PRJEB11169. De primo-, sub-, en laatste-cultuur toonde geen schimmel of bacteriële besmetting, ten gunste van deze virale vermenigvuldiging. Vermamoeba vermiformis getolereerd de anti-schimmel en antibiotische mengsel. Dit was duidelijk in de negatieve controle van amoeben waarna drie dagen, de uiteindelijke kweek bevatte meer dan 80% levend amoebe. Vermamoeba eveneens een goede celgastheer isolatie, waardoor een belangrijke virale lading na lysis.
Figuur 1: Lysis detectie door geautomatiseerde flowcytometrie De gegevens vertegen.t de twee monsters, die Faustovirus geoogst en liet amoebe lysis. Een levend amoebe populatie werd gebruikt als een negatieve controle. Twee poorten werden ontworpen in de FSC-SSC plot, mogelijk overeenkomen met de cellen en afval. Na de laatste co-cultuur, een grote populatie van vuil toonde de aanwezigheid van een mogelijke infectie in de monsters (ST1 en LC9) (B), vergeleken met de negatieve controle die geen wezenlijke verandering in de gesloten populaties (A) vertoonde. Zoom klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Virus fabrieken typisch voor een aantal gigantische virussen in Eosine / blauw Azur kleuring en DAPI kleuring Negatieve controle met de V.. vermiformis kern met behulp van Eosine / blauw Azur kleuring(A) en DAPI kleuring (D) (pijlen wijzen naar de kern van de amoebe). Vergroting van 1000x. (B, C): Eosine / blauw Azur vlekken op 1000x V. vermiformis besmet met Faustovirus LC9. Pijlen wijzen naar de kern van het circulair besmette amoebe, worden virus fabrieken gemarkeerd met een sterretje. (E, F) DAPI kleuring bij 1000x V. vermiformis besmet met Faustovirus LC9. Pijlen virus fabrieken in 8 uur na infectie (E), en 12 uur na infectie (F). Schaal bar 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Negatieve kleuring MICRograph. Negatieve kleuring van het virale schorsing na lysis detectie, waarop de nieuw gedetecteerde Faustovirus met het typische uiterlijk van Megavirales, met een icosahedrale capside en een totale grootte van 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| PYG samenstelling | hoeveelheden |
| proteosepepton | 20 g |
| Gist extract | 2 g |
| MgSO4. 7H 2 O | 0.980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| citraat natrium. dihydraat | 1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2 x 6 H 2 O | 0,02 g |
| Glucose | 18 g |
| gedestilleerd water voor | 1 L |
| Pas de pH op 6,8 met HCl of KOH. | |
| Autoclaaf 15 minuten bij 121 ° C. | |
| verhongering medium | hoeveelheden |
| Gist extract | 2 g |
| Glucose | 18 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6 H2O | 0,02 g |
| PAS (hieronder) | 1 L |
| Gefilterd op 0,22 mm | |
| PAS oplossing A | hoeveelheden |
| KH 2 PO 4 | 0,136 g |
| Na 2 HPO 4 | 0,142 g |
| PAS oplossing B | hoeveelheden |
| 4 MgSO .7H O 2 | 4.0 mg |
| CaCl 2 .2H O 2 | 4.0 mg |
| NaCl | 0,120 g |
| 10 ml van elke oplossing A en B, worden toegevoegd aan 1 liter gedestilleerd water. | |
Tabel 1: Solution recepten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mogelijkheid dat Faustovirus het eerste lid van een nieuwe familie Megavirales nabij ASFV kon werd eerst door Reteno et al., 19 maar verschillen nog te onderscheiden. Het lijkt onduidelijk of Faustovirus moet toetreden tot de familie Asfarviridae of dat het in plaats daarvan zou moeten vormen van een nieuw vermeende virale familie. Deze kwestie zal verder onderzoek, in het bijzonder een uitgebreidere karakterisering van de morfologie, gastheer range, replicatiecyclus en gen repertoire vereisen. Meer Faustovirus genotypes moet worden geïsoleerd met het oog op de pan-genoom uit te breiden en beter inzicht in de oorsprong en verwanten van deze virale groep of familie. De techniek die we gebruiken konden we verder isoleren van nieuwe leden van deze potentiële nieuwe familie. Deze techniek gaat gepaard met enigszins gewijzigde gezamenlijke kweek techniek, die werkt als een verrijkingsstap voor betere detectie. De tijd die nodig is door middel van flowcytometrie voor de verwerving van de gegevens voor hundreds monsters niet meer dan een half uur, wat een groot voordeel vergeleken met de vorige standaard co-kweeksysteem. 9 De techniek is veel beter dan de vorige standaard systeem, met name wat de hogere gevoeligheid en nauwkeurige kwantificatie.
Van de 70 monsters gelanceerd, die we nog twee Faustoviruses van afvalwater, die informatie over de milieu-specificiteit of ecosysteem van dit virus zou kunnen bieden. Inderdaad, de specificiteit van Faustovirus voor protist Vermamoeba vermiformis, 19 en de nieuwe indeling van HcDNAV onder Asfarviridae 23 en het feit dat dit virus infecteert vele stammen van dinoflagellate Heterocapsa spp maar is niet in staat te infecteren andere soorten fytoplanktons 24 suggereert aanwezigheid van gastheer-specificiteit onder Asfarvirus of zijn naaste familieleden.
Deze bevindingen impliceren het gebruik van nieuwe mobiele dragers acteren eens specifieke of niet-specifieke gastheren, die dit soort virussen kunnen herbergen. De techniek kan worden aangepast aan andere soorten protisten in verschillende omstandigheden. Onze methode merken vooruitgang op het gebied van virale isolatie en kweektechnieken. Samenvattend verrijking stappen bij de meest geschikte antibacteriële en schimmelwerende mengsel zijn cruciaal voor de eliminatie van mogelijke bacteriële of fungale besmetting. Onze honger medium was de beste oplossing voor het behoud van de amoebe in de beste omstandigheden voor de co-cultuur, terwijl de PAS medium dat wordt gebruikt in de routine cultuur lijkt ongeschikt voor Vermamoeba spp zijn, want snel encystment werd waargenomen na 24 uur incubatie. Dit was een grote stap op weg naar een optimale kweekomstandigheden, waar vorige technieken tot nu toe had gefaald. Om de beste resultaten met de kweekmethode protocollen beschreven te verkrijgen, wordt aanbevolen om verse amoeben staat fagocytose gebruiken. Het antibioticum en schimmelwerende mengsel moet niet-toxisch voor protists zijn ; vandaar, is het raadzaam om de levensvatbaarheid van de gebruikte protozoon over het mengsel te testen. Alle gebruikte materialen moeten worden gesteriliseerd. De werkzaamheden moeten in een microbiologische beveiligd bericht klasse II worden uitgevoerd voor eventuele besmetting te voorkomen. Incubatietijden en de drie fasen van de cultuur moet worden geëerbiedigd zoals beschreven. De verwerkingstijd van doorstroomcytometrie detectie kan worden gekalibreerd afhankelijk van de bestudeerde organismen. Een kleine verschuiving in de populatie van de oorspronkelijke gating kan worden waargenomen, maar dit is afhankelijk van de betrouwbare negatieve controle gebruikt als referentiepopulatie.
Multi-resistente bacteriën die gevonden kunnen worden in de cultuur en zijn ziekteverwekkers voor de amoebe kan een of andere manier onze virale isolatie methode beperken, waar we de groei van bacteriën maskeren vermenigvuldiging de virussen 'kan hebben. Het variëren van de antibiotisch mengsel of filtreren van de kweek om de bacteriën van meer dan 200 nm gedimensioneerd moet deze beperking soms beheren elimineren.
"> Al deze aangepast voorwaarden bieden een nieuwe optimale isolatiewerkwijze, welke virale vermenigvuldiging ondersteunt. Deze techniek biedt een aanzienlijk voordeel in de ontdekking van nieuwe virussen, met name Megavirales, beter te begrijpen hun verscheidenheid, oorsprong en potentiële pathogeniciteit.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al.
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
