Summary
Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.
Introduction
Mutagénesis mucho tiempo se ha empleado en el laboratorio para estudiar las propiedades de los sistemas biológicos y su evolución, y para producir proteínas o organismos mutantes con funciones mejoradas o novedosas. Mientras que los primeros enfoques se basaban en métodos que producen mutaciones aleatorias en los organismos, el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante permitió a los investigadores para introducir cambios en el ADN de selección de una manera específica de sitio, es decir., Mutagénesis dirigida 1,2. Con las técnicas actuales, típicamente usando oligonucleótidos mutagénicos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es relativamente fácil para crear y evaluar un número pequeño de mutaciones (por ejemplo., Mutaciones puntuales) en un gen dado 3,4. Es mucho más difícil, sin embargo, cuando los enfoques de la meta, por ejemplo, la creación de mutaciones y la evaluación de todos los posibles en un solo sitio (o de orden superior).
Aunque se ha aprendido mucho desde los primeros estudios que intentan evaluar un gran número de mutations en los genes, las técnicas utilizadas eran a menudo laborioso, por ejemplo, que requiere la evaluación de cada mutación de forma independiente mediante supresor sin sentido cepas 5-7, o estaban limitados en su capacidad cuantitativa debido a la profundidad bajo la secuenciación de Sanger 8 de secuencia. Las técnicas usadas en estos estudios han sido ampliamente suplantado por métodos que utilizan la tecnología de secuenciación de alto rendimiento 9-12. Estos enfoques conceptualmente simple implican la creación de una biblioteca que comprende un gran número de mutaciones, sometiendo la biblioteca a una pantalla o de selección de función, y luego profundo-secuenciación (es decir., Del orden de> 10 6 secuenciación lee) la biblioteca obtenida antes y después de la selección. De esta manera, los fenotípicas o la aptitud efectos de un gran número de mutaciones, representan como el cambio en la frecuencia de la población de cada mutante, puede evaluarse de forma simultánea y más cuantitativamente.
previamente hemos introducido un simp(. es decir, todo-proteína bibliotecas de mutagénesis de saturación) enfoque le para la evaluación de las bibliotecas de todas las posibles mutaciones de un solo aminoácido en las proteínas, aplicable a los genes con una longitud más larga que la secuenciación leer longitud 11,13: En primer lugar, cada posición de aminoácido es aleatorizado por PCR dirigida al sitio mutagénico. Durante este proceso, el gen se divide en grupos compuestos de posiciones contiguas con una longitud total acomodado por la plataforma de secuenciación. Los productos de PCR mutagénicos para cada grupo se combinan entonces, y cada grupo se sometieron independientemente a la selección y secuenciación de alto rendimiento. Al mantener una correspondencia entre la ubicación de las mutaciones en la secuencia y la longitud de lectura de secuenciación, este enfoque tiene la ventaja de maximizar la profundidad de secuenciación: mientras que uno puede simplemente secuenciar tales bibliotecas en ventanas cortas sin división en grupos (por ejemplo, una escopeta estándar. enfoque de secuenciación), la mayoría lee obtenido sería de tipo salvaje y por lo tanto el mayoría de rendimiento secuenciación perdido (por ejemplo, para una biblioteca de mutagénesis de saturación conjunto de proteínas de una proteína de ácido amino 500 secuenciado en 100 aminoácidos (300 pb) ventanas, como mínimo 80% de lee será la secuencia de tipo salvaje).
Aquí, un protocolo se presenta que utiliza secuenciación de alto rendimiento para la evaluación funcional de las bibliotecas de mutagénesis de saturación de toda la proteína, utilizando el enfoque anterior (descrito en la Figura 1). Es importante destacar que, se introduce el uso de cebadores ortogonales en el proceso de clonación de la biblioteca de código de barras de cada grupo de secuencias, lo que les permite ser multiplexadas en una biblioteca, se somete simultáneamente a la detección o la selección y, a continuación multiplexados DE para secuenciación profunda. Dado que los grupos de secuencias no se someten a selección de forma independiente, esto reduce la carga de trabajo y se asegura de que cada mutación experimenta el mismo nivel de selección. TEM-1 β-lactamasa, una enzima que confiere resistencia de alto nivel aantibióticos β-lactámicos (por ejemplo., ampicilina) en bacterias se utiliza como un sistema modelo 14-16. Un protocolo se describe para la evaluación de una biblioteca de mutagénesis de saturación conjunto de proteínas de TEM-1 en E. coli bajo selección en un nivel en suero aproximada para una dosis clínica de ampicilina (50 mg / ml) 17,18.
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Protocol
Nota: Véase la Figura 1 para el esquema del protocolo. Varios pasos y reactivos en el protocolo requieren medidas de seguridad (indicadas con "PRECAUCIÓN"). Consulte las hojas de datos de seguridad antes de su uso. Todos los pasos del protocolo se llevan a cabo a temperatura ambiente a no ser que otro indicó.
1. Preparar Medios de cultivo y placas
- Preparar y esterilizar en autoclave 1 L de agua purificada, 100 ml de Super Broth Optimal (SOB; Tabla 1), 1 caldo L Luria-Bertani (LB; Tabla 2) y 1 L de LB-agar (Tabla 3). Preparar separado y esterilizar tres matraces de cultivo que contienen cada uno 1 L LB.
Nota: A lo largo del protocolo de "agua" se refiere a autoclave-esterilizada agua purificada; SOB, LB y LB-agar se refieren a las soluciones de autoclave esterilizado. - Preparar una 12 mg de la / ml de Tet disolviendo 0,12 g de hidrocloruro de tetraciclina en 10 ml de 70% de etanol. Esterilizar el uso de un filtro de 0,2 micras y almacenara 4 ° C al abrigo de la luz.
- Fresco LB-agar a 50 ° C y luego agregar 1 ml de Tet Stock (concentración final de 12 mg / ml Tet). Verter en placas de Petri y enfriar a temperatura ambiente protegido de la luz. Almacenar a 4 ° C al abrigo de la luz.
2. Construcción del Todo-gen mutagénesis de saturación Biblioteca
Nota: Los cebadores; ITP ha completado, la digestión de restricción y ligaduras; y muestras de ADN purificadas se pueden almacenar a -20 ° C.
- El diseño de cebadores de mutagénesis
- Para mutar cada posición de aminoácido a todos los aminoácidos posibles, diseñar un par de cebadores de mutagénesis complementarios (sentido / antisentido hacia adelante y / retroceso) para cada posición del aminoácido con las siguientes directrices:
- Reemplazar el codón correspondiente al aminoácido que se va a mutagénesis por NNS (donde N es una mezcla de las cuatro bases de nucleótidos y S es una mezcla de citosina (C) y guanina (G)) y el centro en el primer, flanqueado por aproximadamente 15 nucleótidos a cada lado.
- Asegúrese de que el 5 'y 3' terminan en C o G y que la temperatura de fusión (T m) es aproximadamente 70 ° C 3. Utilice la secuencia de comandos NNS_PrimerDesign.m computacional (Ver archivo de código complementario) para diseñar cebadores de mutagénesis NNS acuerdo con estas directrices.
- cebadores de orden de una fuente comercial. Para facilidad de uso, los han sintetizado en formato de placa de 96 pocillos y se pre-diluido en agua a 50 M, con un conjunto de placas que contienen los cebadores de mutagénesis sentido y otro los cebadores antisentido.
- Llene un lavabo pipeta con agua y utilizar una pipeta multicanal para transferir 95 l a 263 pozos en tres placas de 96 pocillos. Diluir los cebadores 20 veces a 2,5 M utilizando una pipeta multicanal para transferir 5 l de las placas de 96 pocillos que contenían los cebadores sentido de mutagénesis a los pocillos afines de las placas que contienen agua.
- Repetir2.1.3 Protocolo de paso para diluir los cebadores antisentido de mutagénesis.
- Para mutar cada posición de aminoácido a todos los aminoácidos posibles, diseñar un par de cebadores de mutagénesis complementarios (sentido / antisentido hacia adelante y / retroceso) para cada posición del aminoácido con las siguientes directrices:
- Síntesis de NNS sub-bibliotecas para cada posición de aminoácido por PCR de dos etapas de mutagénesis dirigida al sitio
- Realizar las PCR mutagénicas de la primera ronda. Para cada cebador de la mutagénesis, preparar una 25 l de reacción de PCR utilizando pBR322_AvrII plásmido como molde y los cebadores AatII_F o AvrII_R (cebadores sentido de mutagénesis con el cebador emparejado AvrII_R, y los cebadores de mutagénesis con el cebador antisentido pares AatII_F; total de 526 PCR). Véase la Tabla de Materiales para las secuencias AatII_F y AvrII_R.
- Preparar una PCR "mezcla maestra" mediante la adición de los reactivos de la Tabla 4 a un tubo cónico de 15 ml. Transferencia a una cuenca pipeta. Usar una pipeta multicanal para transferir 15 l a 263 pozos en tres placas de 96 pocillos de PCR. Usar una pipeta multicanal para transferir 10 l de las placas de 96 pocillos que contenían los cebadores sentido de mutagénesis diluidas a los pocillos afines in las placas de PCR.
- Cubrir cada placa de PCR con un sello de placa de 96 pocillos. Centrifugar a 200 xg durante 2 min.
- La transferencia de las placas de PCR para termociclador y ejecute el siguiente programa: 98 ° C durante 30 segundos; 20 ciclos: 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min; 72 ° C durante 2 min; mantener a 4 ° C.
- Repetir los pasos protocolo 2.2.1.1 - 2.2.1.3 de las placas de 96 pocillos que contenían los cebadores de mutagénesis antisentido diluidas.
- Realizar las PCR mutagénicos de segunda ronda. Para cada posición de aminoácido, preparar una reacción de PCR de 25 l usando cebadores AatII_F y AvrII_R, y la mezcla y se diluye en la primera ronda de PCR mutagénicos productos como plantilla (un total de 263 PCR).
- Llene un lavabo pipeta con agua y utilizar una pipeta multicanal para transferir 198 l a 263 pozos en tres placas de 96 pocillos.
- Combinar y diluir 100 veces los productos de PCR mutagénicos para cada posición de aminoácido utilizando una pipeta multicanal paraprimera transferencia de 1 l de las placas de 96 pocillos de PCR que contienen los productos de PCR resultantes de los cebadores de sentido de mutagénesis a los pocillos afines de las placas que contienen agua. A continuación, repita la transferencia de los productos resultantes de la PCR de los cebadores antisentido de mutagénesis.
- Preparar una PCR "mezcla maestra" mediante la adición de los reactivos de la Tabla 5 a un tubo cónico de 15 ml. Transferencia a una cuenca pipeta. Usar una pipeta multicanal para transferir 24 l a 263 pozos en tres placas de 96 pocillos de PCR. Usar una pipeta multicanal para transferir 1 l de las placas de 96 pocillos que contienen la mezcla y se diluyó primera ronda productos de PCR mutagénicos a los pocillos afines en las placas de PCR.
- Cubrir cada placa de PCR con un sello de placa de 96 pocillos. Se centrifuga a aproximadamente 200 xg durante 2 min. placas de transferencia de termociclador y se ejecutan el mismo programa que en el paso de protocolo 2.2.1.3.
- Analizar los resultados de las PCR mutagénicos de segunda ronda por electroforesis en gel.Asegúrese de que todos los productos son del tamaño correcto y ausente de contaminación de los productos.
- Añadir 2 ml de 2x colorante de carga de gel a una cuenca pipeta y luego utilizar una pipeta multicanal para transferir 6 l de 263 pozos en tres placas de 96 pocillos. Usar una pipeta multicanal para transferir 6 l de las placas de 96 pocillos de PCR que contienen las segunda ronda productos de PCR mutagénicos a los pocillos afines de las placas de 96 pocillos que contienen colorante.
- Preparar un gel de agarosa al 1,5% con 0,2 mg / ml de bromuro de etidio (Precaución).
- escalera de ADN de carga en los carriles primero y último de cada fila. A continuación, utilice una pipeta multicanal para cargar 10 l de muestras de la etapa de protocolo 2.2.3.1.
- Correr el gel a 100 V durante 40 minutos y la imagen en un transiluminador UV.
- Repita los pasos del protocolo 2.2.3.2 - 2.2.3.4 hasta que se analizaron todas las muestras.
- Medir con precisión la concentración de cada sub-biblioteca NNS producto de PCR utilizando un reactivo de cuantificación ADN de doble cadena.
- Transferiraproximadamente 15 ml de tampón EB a una cuenca pipeta. Utilizar una pipeta multicanal para transferir 49 l de 263 pozos en tres placas de 96 pocillos de paredes negras, fondo claro de ensayo.
- Usar una pipeta multicanal para transferir 1 l de cada producto de PCR de segunda etapa (etapa protocolo 2.2.2) a los pocillos afines de las placas de ensayo de 96 pocillos.
- Preparar una curva patrón de concentración de ADN mediante la dilución de ADN de fago lambda a 2 ng / l en 300 l de tampón EB y luego hacer diez diluciones de dos veces (para un total de 11 concentraciones). Transferencia de 50 l a primeros once columnas de una fila de una de las placas de ensayo de 96 pocillos procedentes de la etapa anterior que no contiene muestra; a la duodécima columna de añadir 50 l de tampón EB (blanco de reactivo).
- Preparar el reactivo de cuantificación ADN de doble cadena mediante la adición de 75 l de reactivo (véase la Tabla de Materiales) a un tubo cónico de 15 ml, a continuación, añadir 15 ml de tampón EB. Mezclar invirtiendo el tubo y luego transferir a una cuenca pipeta. Proteger reactivo de la luz.
- Usar una pipeta multicanal para transferir 50 l de reactivo preparado cuantificación dsDNA a cada pocillo de las placas de ensayo. Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 5 min protegido de la luz.
- Medir la fluorescencia de cada muestra usando un lector de microplacas y longitudes de onda de fluoresceína estándar (excitación 485 nm, emisión 520 nm; 0,1 seg).
- Restar el valor de fluorescencia del blanco de reactivos de todas las muestras. Generar una curva estándar a partir de las mediciones de fluorescencia de muestras de fagos lambda. Calcular la concentración de cada muestra usando sus respectivas mediciones de fluorescencia y la curva estándar.
- Realizar las PCR mutagénicas de la primera ronda. Para cada cebador de la mutagénesis, preparar una 25 l de reacción de PCR utilizando pBR322_AvrII plásmido como molde y los cebadores AatII_F o AvrII_R (cebadores sentido de mutagénesis con el cebador emparejado AvrII_R, y los cebadores de mutagénesis con el cebador antisentido pares AatII_F; total de 526 PCR). Véase la Tabla de Materiales para las secuencias AatII_F y AvrII_R.
- Clonación de NNS sub-bibliotecas en vectores de selección
- Mezclar 100 ng de cada sub-biblioteca NNS producto de PCR en cinco subgrupos de biblioteca NNS. Siguiendo las instrucciones del fabricante, limpiar muestras usando un kit de purificación de ADN y luego medir la concentración utilizando un DSreactivo de cuantificación de ADN.
Nota: Cada grupo se compone de aproximadamente 53 aminoácidos contiguos posiciones espaciadas a lo largo de la secuencia de TEM-1 (grupos NNS sub-biblioteca 1-5 se componen de las posiciones 26-78, 79-132, 133-183, 184-236, y 237-290, respectivamente; numeración de acuerdo con Ambler et al 19).. - Crear vectores de clonación para cada grupo de sub-biblioteca de la SNN.
- Preparar cinco ITP 100 l de acuerdo con la Tabla 6, usando cebadores AvrII_F y AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, y los plásmidos pBR322_OP1-5 como plantilla (AatII_OP1_R emparejado con pBR322_OP1, etc.).
- Traslado al termociclador y ejecute el siguiente programa: 98 ° C durante 30 segundos; 25 ciclos: 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1,5 min; 72 ° C durante 2 min; mantener a 4 ° C. Ver T capaces de materiales para las secuencias de AatII_R y AvrII_F.
- Preparar un gel de agarosa al 1% con 0,2 mg / ml de bromuro de etidio (Precaución).
- Añadir 20 l de colorante de carga 6x gel a cada muestra de PCR. Cargar el primer carril del gel con escalera de ADN; cargar todo el volumen de cada muestra, saltando al menos un pozo entre las muestras.
- gel a 100 V una duración de 50 min.
- Visualizar en gel usando un iluminador UV de longitud de onda larga (PRECAUCIÓN). rodajas de impuestos especiales que contienen el producto de PCR en ~ 3500 pb; transferir para separar tubos de microcentrífuga. cortes de gel se pueden almacenar a -20 ° C.
- Siguiendo las instrucciones del fabricante, purificar muestras usando un kit de extracción de gel y la concentración medida usando un reactivo de cuantificación ADN de doble cadena.
- Tanto para los grupos NNS sub-biblioteca (paso protocolo 2.3.1) y vectores de clonación (paso protocolo 2.3.2), creado restricción digiere con enzimas AatII y AvrII acuerdo con la T abla 7. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora. Siguiendo las instrucciones del fabricante, limpiar muestras usando un kit de purificación de ADN y luego medir la concentración de ADN de doble cadena usando un quantitareactivo ción.
- Establecieron reacciones de ligación siguiente Tabla 8 para cada grupo de sub-biblioteca digerido por restricción con NNS afín digerido por restricción vector de clonación (NNS grupo de sub-biblioteca con 1 pBR322_OP1, etc.). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Limpiar las reacciones utilizando un kit de purificación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante; eluir el ADN con 20 l de agua.
- Transformar la totalidad de las reacciones de ligación purificados en la biblioteca de eficiencia E. células de E. coli por electroporación.
- Descongelar E. electrocompetentes coli células y luego las células de lugar y reacciones de ligación se purificó sobre hielo.
- Transferencia de 10 l descongelan las células a cada reacción de ligación purificada y luego se transfieren a la cubeta de electroporación. Electroporate en el 1,8 kV.
- Recuperar las células mediante resuspensión en 1 ml de SOB. Se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
- Resuspender 10 l de cada cultura recuperación de 990 l LB; extendido 100 l de LB-agar containing 12 mg / ml Tet. Incubar las placas O / N (~ 16 horas) a 37 ° C.
- Para cada cultivo recuperación, preparar un frasco de cultivo de 250 ml con 50 ml de LB y 50 l Tet de valores. Transferir al matraz los restantes ~ 1 ml de cultivo de recuperación. Incubar O / N (~ 16 h) a 37 ° C con agitación vigorosa (~ 200 rpm).
- Contar el número de colonias en cada placa. Calcular el número de transformantes exitosos como
, dónde 
es el número de colonias, 
es el volumen de cultivo de recuperación (1,000 l) y 
es el volumen de la cultura recuperación plateado (1 l).
Nota: Para asegurar una cobertura completa de todas las mutaciones, como regla general, el número de transformantes exitosos debe ser ≥100 veces más que el número de mutaciones esperadas. Cada sub-biblioteca NNS tiene ~ 53 posiciones, por lo que el número esperado de mutaciones es de 53 × 32 posiciones de codones / posición ≈ 1,7 × 10 3; para dar un tamaño de la biblioteca ≥100 veces (≥1.7 × 10 5) no debe haber ≥170 colonias en cada placa. - De acuerdo con las instrucciones del fabricante, aislar ADN de plásmido a partir de cultivos usando un kit de purificación de plásmido y luego medir las concentraciones usando un reactivo de cuantificación dsDNA. Mezcle 100 ng de cada plásmido. Esto crea la biblioteca de mutagénesis de saturación de todo el final de proteína.
- Mezclar 100 ng de cada sub-biblioteca NNS producto de PCR en cinco subgrupos de biblioteca NNS. Siguiendo las instrucciones del fabricante, limpiar muestras usando un kit de purificación de ADN y luego medir la concentración utilizando un DSreactivo de cuantificación de ADN.
, dónde 
es el número de colonias, 
es el volumen de cultivo de recuperación (1,000 l) y 
es el volumen de la cultura recuperación plateado (1 l). 3. Selección del Todo-proteína TEM-1 Mutagénesis de saturación Biblioteca de resistencia a los antibióticos
- Preparación de la cultura pre-selección.
- Diluir el plásmido de la etapa protocolo 2.3.7 a 0.5 ng / l en el agua y la transferencia de 20 l a un tubo de microcentrífuga. Realizar la transformación, redescubrimiento, chapado y O / N de crecimiento como se describe anteriormente en el paso de protocolo 2.3.5, a excepción de transferencia de 1 l de la cultura recuperación SOB a 999 l LB.
- Contar el número de colonias. Para asegurar una cobertura completa de todas las mutaciones no debe haber ≥ 100 colonias, lo que indica ≥ 10 6 transformantes exitosos (100 × 263 × 32 posiciones de codones / posición ≈ 10 6).
- Medir la concentración de la cultura / N 50 ml O.
- Preparar un blanco LB mediante la adición de 1 ml de LB a una cubeta de espectrofotómetro. Medir OD600 en un espectrofotómetro.
- Se diluye la S / N de cultivo de 10 veces por resuspensión en 100 l 900 l LB. Medir la DO600. Restar la lectura DO600 de la pieza en bruto y se multiplica por 10 para dar la DO600 del cultivo O / N.
- Pre-calentar los tres frascos de cultivo de la etapa de protocolo 1.1 para ~ 30 min a 37 ° C. Diluir la cultura O / N a DO600 = 0,1 y se añade 1 ml a un matraz (OD600 final = 0,001). Tla suya es la "cultura de preselección".
- Incubar la "cultura pre-selección" a 37 ° C con agitación vigorosa (200 rpm). Periódicamente controlar el crecimiento mediante la medición de DO600 como en el paso protocolo 3.1.3 (no es necesario diluir la cultura 10 veces) hasta OD600 = 0,1 (~ 2,5 h).
- Transferir 100 ml del cultivo de pre-selección a dos tubos de 50 ml cónicos. Se centrifuga a 4.000 g durante 6 min a 4 ° C. Eliminar la mayor parte de sobrenadante y se combinan en un solo tubo cónico de 15. Repita centrifugación y eliminar todo el sobrenadante. Almacenar a -20 ° C.
- La selección para resistencia a la ampicilina.
- Mientras que la cultura pre-selección está incubando, preparar una 50 mg / ml de stock de Amp en agua por disolución de 0,5 g de ampicilina de sodio en 10 ml de agua. Esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,2 micras a 4 ° C.
- Para los otros dos matraces, añadir Tet a una concentración final de 12 mg / ml y un volumen de la pre-selección de cultivo tales tha t el OD600 final = 0,001. A un matraz, añadir 1 ml de amplificador, para una concentración final de 50 mg / ml - esta es la "cultura de la selección".
- Incubar los cultivos a 37 ° C con agitación vigorosa (200 rpm). Monitor de crecimiento del cultivo para el que no se añadió la ampicilina en el paso anterior, hasta OD600 = 0,1 (~ 2,5 h). En este momento, también medir la DO600 del cultivo de selección.
- Divida la DO600 del cultivo selección en 0,1 y se multiplica por 100 ml. Transferir este volumen (~ 400 ml) a 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 4.000 g durante 6 min a 4 ° C. Eliminar la mayor parte de sobrenadante y se combinan en un solo tubo cónico de 15. Repita centrifugación y eliminar todo el sobrenadante.
- De acuerdo con las instrucciones del fabricante, aislar ADN plasmídico a partir de la pre-selección (paso protocolo 3.1.6) y la selección (paso protocolo 3.2.4) sedimentos de células de cultivo y luego medir las concentraciones usando un reactivo de cuantificación dsDNA.
- Preparación de muestras para secuenciación de alto rendimiento
- Preparar 25 l PCR para demultiplexar los grupos NNS sub-biblioteca con cebadores ortogonales
- Prepare una mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 9; transferir 23 l a diez tubos de PCR.
- Añadir 1 l de 0,5 ng de ADN plásmido / l purificado a partir del cultivo de preselección a la PCR tubos 1 - 5 y de la cultura de la selección a los tubos 6 - 10.
- Mezclar 50 l de 50 mM adelante cebadores ortogonales OP1_F - OP5_F con los respectivos cebadores inverso ortogonales OP1_R - OP5_R. En el mismo orden, la transferencia de 1 l a tubos de PCR 1 - 5 y 6 - 10. Véase la Tabla de Materiales para las secuencias de OP1_F - OP5_F y OP1_R - OP5_R.
- Transferir los tubos de PCR para termociclador. Ejecute el siguiente programa: 98 ° C durante 30 segundos; 20 ciclos: 98 ° C durante 10 s, 55 °; C durante 20 s, 72 ° C durante 1,5 min; 72 ° C durante 2 min; mantener a 4 ° C.
- Preparar 25 l PCR para aislar cada uno de los grupos sub-biblioteca NNS
- Diluir 100 veces las PCRs diez de la etapa 4.1.1.4 protocolo mediante la transferencia de 1 l de cada para separar los tubos de PCR y la adición de 99 l de agua. Mezcla, a continuación de la pipeta de 99 l y desechar.
- Mezclar 50 l de 50 mM cebadores directos Group1_F - Group5_F con los respectivos cebadores Group1_R inversa - Group5_R. En el mismo orden, de transferencia de 1 l de PCR tubos 1 - 5 y 6 - 10. Véase la Tabla de Materiales para las secuencias de Group1_F - Group5_F y Group1_R - Group5_R.
- Prepare una mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 9, la transferencia de 23 l a cada tubo de PCR. Transferir los tubos de PCR para termociclador; ejecutar el mismo programa que en el paso de protocolo 2.2.1.3.
- Llevar a cabo los últimos 25 l PCR para agregar secuencias de indexación
- dilaúd 100 veces las PCR diez de la etapa 4.1.2.3 protocolo mediante la transferencia de 1 l de cada una de separar los tubos de PCR y la adición de 99 l de agua. Mezcla, a continuación de la pipeta de 99 l y desechar.
- Prepare una mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 9, la transferencia de 23 l a cada tubo de PCR.
- Para los tubos con la plantilla procedentes de grupos sub-biblioteca NNS 1-5, transferir 0,5 l por tubo cebadores directos 501_F - 505_F respectivamente. Para tubos con la plantilla resultante de la preselección y selección culturas, transferir 0,5 l por tubo de cebadores 701_R y 702_R inversa, respectivamente. Véase la Tabla de Materiales para las secuencias de 501_F - 505_F, y 701_R y 702_R.
- Transferir los tubos de PCR para el termociclador y ejecute el programa desde el paso 2.2.1.3.
- Mezclar y purificar las muestras
- medir concentraciones usando un reactivo de cuantificación de ADNds de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar 100 ng de cada producto de PCR intOA solo tubo de microcentrífuga.
- Preparar un gel de agarosa al 2% con 0,2 mg / ml de bromuro de etidio (Precaución).
- Añadir colorante de carga de gel 6x para los productos de PCR muestra mixta. Cargar el primer carril del gel con escalera de ADN; cargar todo el volumen de la muestra.
- gel a 100 V una duración de 50 min. Visualizar en gel usando un iluminador UV de longitud de onda larga (PRECAUCIÓN). rebanada de Impuestos Especiales que contiene el producto de PCR en ~ 360 pb; transferir a microcentrífuga tubo. rebanada de gel se puede almacenar a -20 ° C.
- Siguiendo las instrucciones del fabricante, purificar muestra usando un kit de extracción de gel y medir la concentración utilizando un reactivo de cuantificación ADN de doble cadena. Esta es la muestra final para la secuenciación de alto rendimiento.
- Secuencia en una plataforma de secuenciación de alto rendimiento (véase la Tabla de Materiales para la plataforma utilizados en este protocolo).
- Calcular la concentración de la muestra en nM como
es la concentración de la muestra en ng / l y 
es la longitud de la secuencia de la muestra de ADN (~ 360 pb). Diluir la muestra a 4 nM en tampón EB. - Siga las instrucciones del fabricante para desnaturalizar la muestra y diluir a 9 pm en tampón de hibridación.
- Carga de 600 l de muestra en el cartucho de reactivo. Secuencia siguiendo las instrucciones del fabricante y las instrucciones que aparecen en pantalla.
- Calcular la concentración de la muestra en nM como
- Preparar 25 l PCR para demultiplexar los grupos NNS sub-biblioteca con cebadores ortogonales
- Análisis de los datos de secuenciación
- Descargar Flash (ajuste rápido Longitud de corto lee) 20, coloque en la carpeta junto con los archivos fastq.gz obtenidos a partir de la secuenciación.
- El uso de Flash para unirse a los archivos fastq.gz correspondientes a la gama emparejado lee para cada par de índices (directa e inversa lee para cada grupo de sub-biblioteca NNS para la preselección y selección de cultivos).
- Después de unirse a cada par de lecturas, colocar el archivo de salida out.extendedFrags.fastq en carpetas separadas para los resultados de la preselección o selección culturas. Cambie el nombre del archivo de salida out.extendedFrags.fastq según el grupo sub-biblioteca NNS a la que corresponde (es decir., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
- Ejecutar la secuencia de comandos NNS_DataAnalyzer.m computacional (Ver archivo de código complementario) de cada carpeta para calcular los recuentos para cada mutación de un solo aminoácido, y los recuentos de los de tipo silvestre, para cada grupo de sub-biblioteca de la SNN.
- Calcular el efecto de la aptitud
de cada mutación como la base diez logaritmo de la relación de los recuentos obtenidos en la selección (
) Frente a la pre-selección ( 
) Condición, en relación con la de tipo salvaje: 
.
es la concentración de la muestra en ng / l y 
es la longitud de la secuencia de la muestra de ADN (~ 360 pb). Diluir la muestra a 4 nM en tampón EB. 
de cada mutación 
) Frente a la pre-selección ( 
) Condición, en relación con la de tipo salvaje: 
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Representative Results
El mapa del plásmido para los cinco plásmidos pBR322 modificados que contienen sitios de cebado ortogonales (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) se muestra en la Figura 2A. Para probar si los cebadores ortogonales son específicos, se realizaron PCRs utilizando todos los pares de cebadores ortogonales individualmente, junto con los cinco plásmidos pBR322_OP1-5, o con todos los plásmidos menos el plásmido que coincida con el par de cebadores ortogonal. El producto se obtuvo correcta sólo cuando se incluyó el plásmido a juego, y no se obtuvo producto de cualquier tamaño en su ausencia (Figura 2B).
Un experimento representativo se realizó siguiendo el protocolo descrito en este texto (Figura 1). Tras el procesamiento (servicio de protocolo 4.2), 6.2 × 10 6 lee de la condición pre-selección y 6,3 × 10 6 lee desde la 50 g / ml conditi selección con ampicilinaen la realización de aquéllos. Los recuentos obtenidos para cada mutación amino ácido a partir de la condición de pre-selección visualizar una característica de distribución logarítmica normal (Figura 3A) 13. Al menos un recuento de la secuenciación de la cultura pre-selección para el 98,9% de las mutaciones (58 no tenía cuentas), y de más de 100 cuentas para el 91,2% (465 tenían menos de 100 cuentas) se obtuvieron. La figura 3B representa el efecto de la aptitud relativa () para cada mutación en cada posición de TEM-1; la distribución de la que se muestra en la Figura 3C. En la selección en 50 mg / ml de ampicilina, la mayoría de las mutaciones tienen un efecto físico neutro o casi neutro (≈ 0, correspondiente a píxeles blancos en la Figura 3B y el pico grande en la Figura 3C). Una pequeña fracción de las mutaciones en esta concentración tiene un efecto sustancial sobre la aptitud (<< 0, correspondiente a los píxeles de color azul en la figura 3B y la cola izquierda en la figura 3C); exp ectedly, éstas incluyen las mutaciones en los residuos del sitio activo altamente conservadas (S70, K73, S130, D131, N132, K234 y G236) 13,14. En contraste, pocas mutaciones aumentan considerablemente la aptitud sobre la de TEM-1 (>> 0, correspondiente a los píxeles de color rojo en la Figura 3B), como era de esperar ya que TEM-1 es altamente eficiente en la hidrólisis de ampicilina ( 
≈ 10 7 M -1 s -1) 14.
Figura 1. Esquema de Whole-proteína Saturación Protocolo de mutagénesis para TEM-1 β-lactamasa bajo Ampicilina Selección. Acciones como se describe en el protocolo se muestran en negrita. pasos del protocolo numeradas se muestra a la izquierda, por referencia al texto principal.k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Validación de Ortogonal Priming Sitio plásmido vectores. Mapa (A) plásmido para los cinco plásmidos pBR322 modificados que contienen sitios de cebado ortogonales (pBR322_OP1 - pBR322_OP5). Ubicación y dirección de los sitios de cebado ortogonales se indican. Ubicaciones de varios sitios de restricción están etiquetados; la biblioteca de mutagénesis de saturación de todo el proteína TEM-1 (que incluye todo el TEM-1 gen y promotor) se clona en el medio los sitios de restricción AatII y AvrII. Abreviaturas: tet gen de resistencia a tetraciclina, Ori origen de replicación (B) Cada par de cebadores ortogonales (OP1-OP5) fue probado en un PCR que contiene los cinco plásmidos pBR322_OP1-5 (+), o con todos los plásmidos menos el plásmido respectivo (. ˗). Se muestra es un bromuro de etidiogel de agarosa teñido (1% w / v) cargado con cada reacción de PCR, el tamaño separaron por electroforesis. El producto esperado es el tamaño de 1.628 pb; el primer carril es una escalera de ADN, los tamaños de las normas pertinentes se indican. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Resultados de TEM-1-proteína entera Experimento Saturación β-lactamasas. (A) Histograma que muestra la distribución de los recuentos para cada mutación de aminoácidos obtenida a partir de la secuenciación de alto rendimiento de la biblioteca de la condición de pre-selección. Por simplicidad, las mutaciones que cuenta con cero (53 mutaciones) se muestran como que tiene un recuento de uno. Efectos (B) la aptitud de todas las mutaciones de un solo aminoácido en TEM-1 bajo selección en 50 mg / ml de ampicilina. Se muestra los datosmatriz que contiene el efecto de la aptitud relativa () representado por colorimetría con el azul efecto nocivo que representa, rojo un efecto positivo y el blanco no afecta a la aptitud relativa de tipo salvaje. Las mutaciones para el cual no se obtuvieron los recuentos de la cultura pre-selección son de color negro. Las filas representan las posiciones a lo largo de la secuencia primaria y columnas indican la mutación de uno de los veinte aminoácidos o codón de parada (indicado por el código de una letra, * es codón de parada); la estructura secundaria de TEM-1 se indica en motivos izquierda y varios altamente conservadas dentro del sitio activo se indican a la derecha. (C) Histograma que muestra la distribución de los efectos de la aptitud relativa. Se muestran los resultados de esas mutaciones con> 100 recuentos obtenidos a partir de la secuenciación de la cultura pre-selección. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Masa o volumen | Comentario |
| Typtone | 2 g | |
| Extracto de levadura | 0,5 g | |
| Cloruro de sodio | 0,06 g | |
| Cloruro de potasio | 0,02 g | |
| Sulfato de magnesio | 0,24 g | |
| Agua purificada | 100 ml |
Tabla 1. Super óptimo caldo (SOB). Nombres de reactivos y las cantidades utilizadas en la preparación de 100 ml SOB (paso Protocolo 1.1).
| Reactivo | Masa o Volume | Comentario |
| Typtone | 10 g | |
| Extracto de levadura | 5 g | |
| Cloruro de sodio | 10 g | |
| Agua purificada | 1 L |
Tabla 2. Luria-Bertani caldo (LB). Nombres de reactivos y cantidades utilizadas en la preparación de 1 l de LB (paso protocolo 1.1).
| Reactivo | Masa o volumen | Comentario |
| Typtone | 10 g | |
| Extracto de levadura | 5 g | |
| Cloruro de sodio | 10 g | |
| agar | 15 g | |
| Agua purificada | 1 L |
Nombres y las cantidades de reactivos Tabla 3. LB-agar. Utilizados en la preparación de LB-agar (paso protocolo 1.1).
| Reactivo | Volumen | Comentario |
| 5x tampón PCR | 1.450 l | |
| aditivo PCR | 1.450 l | |
| dNTPs 2 mM | 725 l | 2 mM cada nucleótido |
| AatII_F 50 M o imprimación AvrII_R | 145 l | |
| 1 ng / l plásmido pBR322_AvrII | 145 l | |
| 2 unidades / l de ADN polimerasa | 72,5 l | |
| agua | 363 l |
Tabla 4. Primera ronda mutagénico de PCR Master Mix. Nombres de reactivos y cantidades para la preparación de la mezcla maestra para la primera ronda de PCR mutagénica (paso protocolo 2.2.1). cantidad total sea suficiente para 290 reacciones de 25 microlitros.
| Reactivo | Volumen | Comentario |
| 5x tampón PCR | 1.450 l | |
| aditivo PCR | 1.450 l | |
| dNTPs 2 mM | 725 l | 2 mM cada nucleótido |
| cebador 50 mM AatII_F | 145 l | |
| cebador 50 mM AvrII_R | 145 l | |
| 2 unidades / l de ADN polimerasa | 72,5 l | |
| agua | 2.973 l |
Tabla 5. Segunda ronda mutagénico de PCR Master Mix. Nombres de reactivos y cantidades para la preparación de la mezcla maestra para la segunda ronda de PCR mutagénica (paso protocolo 2.2.2). cantidad total sea suficiente para 290 reacciones de 25 l.
| Reactivo | Volumen | Comentario |
| 5x tampón PCR | 20 l | |
| aditivo PCR | 20 l | |
| dNTPs 2 mM | 10 l | 2 mM cada nucleótido |
| cebador 50 mM AvrII_F | 2 l | |
| 50 M AatII_OP1_R - cebador AatII_OP5_R | 2 l | un cebador por reacción, se combina con las respectivas plásmido |
| 1 ng / l plásmido pBR322_OP1-5 | 2 l | un plásmido por reacción |
| 2 unidades / l de ADN polimerasa | 1 l | |
| agua | 43 l |
Tabla 6. Vector de clonación de PCR. Nombres de reactivos y cantidades para la preparación de la PCR para hacer que los vectores de clonación (paso protocolo 2.3.2).
| Reactivo | Volumen | Comentario |
| tampón de enzima de restricción 10x | 5 l | |
| 4 unidades / AvrII mu l | 2,5 l | |
| 20 unidades / l AatII | 0,5 l | |
| ADN para digestión de restricción | volumen de 500 ng | |
| agua | a 50 l volumen total |
Tabla 7. digestiones de restricción. Nombres de reactivos y cantidades para la digestión de restricción de los vectores de clonación y subgrupos de la biblioteca NNS (paso protocolo 2.3.3).
| Reactivo | Volumen | Comentario |
| tampón de ligasa de ADN T4 10x | 5 l | |
| ADN purificado grupo de sub-biblioteca NNS digerido por restricción | volumen de 48 ng | |
| DNA vector de clonación digerido por restricción purificada | volumen de 52 ng | |
| 400 unidades / l T4 ADN ligasa | 1 l | |
| agua | a 20 l volumen total |
Tabla 8. Las ligaciones nombres de reactivos y las cantidades de las ligaduras de vectores de clonación con grupos sub-biblioteca de restricción digerido NNS en una relación 1: 3. Vectorial: insertar relación molar (paso protocolo 2.3.4).
| Reactivo | Volumen | Comentario |
| 5x tampón PCR | 55 l | |
| aditivo PCR | 55 l | |
| dNTPs 2 mM | 27,5 l | 2 mM cada nucleótido |
| 2 unidades / l de ADN polimerasa | 2,75 l | |
| agua | 113 l |
Tabla 9. PCR Reactivos para la preparación de muestras para secuenciación de alto rendimiento. Nombres de reactivos y cantidades para la preparación de mezclas de reacción de PCR utilizados para la de-multiplexación con cebadores ortogonales (4.1.1), el aislamiento de los grupos sub-biblioteca NNS (paso protocolo 4.1.2) y la adición de secuencias de indexación (paso protocolo 4.1.3). cantidad total sea suficiente para 11 reacciones de 25 l.
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Discussion
Aquí un protocolo se describe para la realización de la evaluación funcional de las bibliotecas de mutagénesis de saturación de toda la proteína, utilizando la tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Un aspecto importante del método es la utilización de cebadores ortogonales durante el proceso de clonación. En pocas palabras, cada posición de aminoácido es al azar por PCR mutagénico, y se mezclaron conjuntamente en grupos de posiciones cuya secuencia de longitud combinada se aloja por secuenciación de alto rendimiento. Estos grupos se clonan en vectores plasmídicos que contienen pares de sitios de cebado ortogonales, mezclados entre sí y sometidos a selección, a continuación, de-multiplexada usando los cebadores ortogonales, y posteriormente secuenciado profundo. Dado que las mutaciones están confinadas dentro de la secuenciación leen límite de longitud, este enfoque maximiza el número de útil lee que contiene mutaciones para los genes de tamaño más largo que el de secuenciación leer longitud. Además, esta técnica permite la selección simultánea o "one-batch" de todo el mutatiobiblioteca final, reduciendo la carga de trabajo, así como la posibilidad de que las mutaciones experimentan diferentes niveles de selección. En la práctica, los pasos críticos en el protocolo en gran medida la preocupación organización: durante el proceso de clonación (paso protocolo 2.3) se debe asegurar la mezcla correcta de productos de PCR mutagénicos en grupos y su posterior clonación en el vector ortogonal sitio de cebado correcta; durante la preparación de la muestra para la secuenciación (paso protocolo 4.1), los cebadores ortogonales correctas, así como cebadores para aislar cada uno de los grupos NNS sub-biblioteca y añadir secuencias de indexación, debe ser utilizado.
Los tres principales etapas del protocolo de construcción - biblioteca, selección y secuenciación - pueden ser modificados en varios aspectos. Durante una construcción de la biblioteca podría introducir mutaciones utilizando una variedad de técnicas, por ejemplo, por PCR propensa a error, o mediante la construcción de gen utilizando oligonucleótidos sintetizados por dopaje en una pequeña fracción de nucleótidos alternativa21 s. Se podría construir la biblioteca para incluir mutaciones dobles o de orden superior dentro de los segmentos de la proteína (es decir, grupos de NNS sub-biblioteca), o en fondos alternativos genotipo 22. Es importante destacar que todas las modificaciones del paso de la construcción de la biblioteca sin embargo deben satisfacer el criterio de que la correspondencia entre la ubicación de las mutaciones en la secuencia y la secuenciación leer longitud se mantiene. Por lo tanto, este criterio excluye la aplicación del protocolo para estudios completos sobre los múltiples mutaciones a través de una proteína. Modificaciones de la segunda parte del protocolo incluyen condiciones de selección alternativos: (. Por ejemplo, temperatura, niveles de nutrientes) diferentes tipos de β-lactama (o combinaciones) y concentraciones, condiciones de estrés externos, tipo de host (por ejemplo, diferentes tipos de bacterias), o diferentes tiempos de muestreo (horas o días). Por ejemplo, en trabajos anteriores hemos examinado los efectos de la aptitud de todas las mutaciones de un solo aminoácidoen TEM-1 bajo diferentes concentraciones de ampicilina, y bajo la tercera generación cefotaxima cefalosporina 13. En cuanto a la tercera etapa del protocolo, por el momento no recomendamos desviarse de la elección de la plataforma de secuenciación utilizado aquí (véase la Tabla de Materiales). Mientras la secuenciación leer longitudes son de hecho actualmente ya en otras plataformas, el número de lecturas obtenible es actualmente mucho más bajo; En general, la precisión con la cual el efecto de una mutación puede ser determinada es proporcional al número de lecturas obtenido (véase la ecuación en el paso protocolo 4.2.5).
En gran parte por la sencillez, el protocolo utiliza TEM-1 β-lactamasa como un sistema modelo, sin embargo, la metodología descrita aquí se puede extender a otros sistemas en los que una selección de alto rendimiento o ensayo de selección está en su lugar. La construcción de tales ensayos es sin embargo a menudo no trivial: En primer lugar, se debe establecer una estrategia de compartimentación de gen (mutación) y la proteína junto, Por ejemplo dentro de una célula, de gotitas de líquido (como en una plataforma microfluídica), o por presentación de fagos. En segundo lugar, y lo más importante, una conexión cuantitativa entre la función de proteínas y un fenotipo seleccionable, o aptitud, se debe establecer. Para las enzimas implicadas en el metabolismo o la resistencia a los antibióticos, la capacidad de las células para crecer en nutrientes de abandono o de los medios de antibióticos es a menudo una función directa de la actividad enzimática. Un enfoque más sintética podría ser utilizada en otros sistemas, por ejemplo mediante la vinculación de afinidad de unión al gen indicador de proteína-proteína (por ejemplo., Proteína fluorescente) expresión en bacterias o levadura 11,23, o usando un sustrato enzimático fluorogénico en un sistema de microfluídica 24 . Por último, un ensayo tal debe ser escalable, para abordar el tamaño de una biblioteca de mutagénesis todo-proteína.
En resumen, un enfoque basado en la secuenciación de alto rendimiento para la evaluación funcional de las bibliotecas de mutagénesis de saturación de todo-proteína es described aquí. Central para el enfoque es la construcción de la biblioteca de mutagénesis dentro de segmentos a lo largo del gen, y la utilización de códigos de barras de cebadores ortogonales para etiquetar cada segmento para la multiplexación y de-multiplexación la biblioteca. Anticipamos que este protocolo podría aplicarse fácilmente a otras proteínas para las que se ha desarrollado una selección o una pantalla de alto rendimiento adecuado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| Petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 ml conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3 V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University - open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC |
||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG |
||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG |
||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC |
||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC |
||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC |
||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC |
||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG |
||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC |
||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC |
||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC |
||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC |
||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC |
||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
References
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
- Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
- Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
- Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
- Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
- Fowler, D. M., et al.
- Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
- McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
- Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
- Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
- Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
- Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
- Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
- Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
- Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
- Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
- Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).
