Summary
Detta protokoll beskriver den snabba och mycket känsliga kvantifiering av Förster resonansenergiöverföring (FRET) sensordata med hjälp av en skräddarsydd bärbar FRET analysator. Anordningen användes för att detektera maltos inom ett kritiskt temperaturområde som maximerar detektionskänslighet, vilket möjliggör praktisk och effektiv bedömning av sockerinnehåll.
Abstract
De senaste förbättringarna i Förster resonans energiöverföring (FRET) sensorer har möjliggjort deras användning för att upptäcka olika små molekyler inklusive joner och aminosyror. Men den inneboende svag signalintensiteten av FRET sensorer en stor utmaning som förhindrar deras tillämpning inom olika områden och gör användningen av dyra, high-end fluorometrar nödvändigt. Tidigare byggde vi en kostnadseffektiv, högpresterande FRET analysator som specifikt kan mäta förhållandet mellan två emissionsvåglängdsband (530 och 480 nm) för att uppnå hög detektionskänslighet. På senare tid har det visat sig att FRET sensorer med bakteriell periplasmatiska bindningsproteiner upptäcka ligander med maximal känslighet i det kritiska temperaturområdet 50-55 ° C. Denna rapport beskriver ett protokoll för att bedöma sockerinnehåll i kommersiellt tillgängliga dryckes prover med hjälp av våra bärbara FRET analysator med en temperatur specifik FRET sensor. Våra resultat visade att den ytterligare förvärmningFörfarandet enligt FRET sensorn ökar avsevärt FRET förhållandesignalen, för att möjliggöra mer noggrann mätning av sockerinnehåll. Den skräddarsydda FRET analysator och sensor har framgångsrikt tillämpats för att kvantifiera sockerhalten i tre typer av kommersiella drycker. Vi räknar med att ytterligare storleksminskning och förbättring av utrustningen kommer att underlätta användningen av handhållna analysatorer i miljöer där high-end utrustning inte är tillgänglig.
Introduction
Förster resonansenergiöverföring (FRET) har i stor utsträckning används som en biometrisk sensor för att detektera små molekyler såsom sockerarter, kalciumjoner och aminosyror 1-4. FRET biosensorer innehåller fluorescerande proteiner, cyan fluorescerande proteiner (CFPS) och gula fluorescerande proteiner (YFPs), vilka är kondenserade till båda ändar av periplasmatiska bindande proteiner (PBP). Sockerarter binder till PBP är belägna i mitten av FRET sensorn, vilket orsakar strukturella förändringar av sensor som därefter förändra avståndet och övergång dipol orienteringen av de två fluorescerande proteiner vid vardera änden av PBP. Denna förändring möjliggör kvantitativ analys av sockerinnehållet genom att mäta förhållandet mellan emissionsvåglängder på EYFP (530 nm) och ECFP (480 nm). På grund av den höga känslighet, specificitet, övervakning i realtid kapacitet, och snabb svarstid FRET biosensorer, är dessa sensorer används ofta i miljö, industriella och medicinska tillämpningar 5. Dessutom ratiometric mätning med FRET biosensorer har viktiga praktiska fördelar, eftersom det kan användas för att mäta komponenter i komplexa biologiska prover där givaren koncentrationen inte kan lätt kontrolleras och bakgrundsfluorescens är alltid närvarande.
Trots dessa fördelar med FRET-baserade sensorer för kvantitativ visualisering, små strukturella förändringar med ofullständig domänrörelse överföring till fluorescerande proteiner producerar sig svag signalstyrka. Den svaga signal begränsar tillämpningen av FRET-baserade sensorer för in vitro eller in vivo analys 6. Således kan flertalet FRET biosensorer kräver användning av dyra och mycket känslig utrustning. Tidigare har vi utvecklat en billig och portabel FRET analysator med funktioner som liknar de hos existerande fluorescensanalys 7. I denna anordning, billig 405-nm band ultraviolett ljus-emitterande diod (LED) användes som ljuskälla för att orsaka excitation av the fluorescenssignal, som ersätter en dyr lampa eller laser. Systemet med analysatorns detektions fokuserar effektivt den avledande fluorescenssignalen på två fotodetektorer med en kiselfotodiod. I en senare studie visade vi att optimering av detektionstemperatur på 50-55 ° C avsevärt skulle kunna förstora ratiometrisk FRET signalen 8. Denna temperatur-specifika signalförstärkning, tillsammans med skräddarsydd FRET analysator, möjliggör användning av FRET sensorer i mer allmänna diagnostiska tillämpningar med snabb och hög känslighet.
I detta protokoll, visade vi den allmänna tillämpligheten av FRET analysatorn under optimala förhållanden FRET temperaturskillnader genom att kvantifiera halten av kommersiellt tillgängliga drycker socker. Detta protokoll ger detaljerna i FRET enhetens funktion, samt en kort beskrivning av sensorn och provberedning. Vi räknar med att denna rapport kommer att främja den potentiella tillämpningen av den bärbaraanalysator i småskaliga laboratoriemiljöer och ge en grund för vidare utveckling av en billig på plats diagnosanordningen med FRET-baserade biosensorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Biosensor
- Konstruera plasmiden pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 genom att följa den tidigare etablerade protokoll 2.
- Inokulera 5 ml Luria-buljong (LB) med en enda koloni av en Escherichia coli-DE3-stammen och inkubera vid 37 ° C under 16 h med skakning.
- Överföring 1 ml av O / N-kulturen till en 500-ml kolv innehållande 100 ml LB och inkubera vid 37 ° C i ett skakande inkubator tills den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600) når 0,5 (omkring 3 h).
- Skörda cellerna i en 50-ml koniskt rör genom centrifugering vid 1000 x g under 20 min vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten snabbt i varje rör med 50 ml iskallt destillerat vatten (DW) och centrifugera vid 1000 x g under 20 min vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten i 50 | il iskall DW med 10% (volym / volym) glycerol genom att försiktigt virvla tills lösningen (elektrokompetenta celler) når ett OD 600
- Placera blandningen av elektrokompetenta celler (50 ul av cellerna vid en OD 600 av 100) och 10 ng av plasmiden pET21a (+) - GFP-MBP-YFP-His6 i en iskall elektroporationskyvett i en elektroporation anordning och elektroporera blandningen (18 kV / cm, 25 iF).
- Snabbt tillsätt 1 ml SOC-medium till kyvetten och återsuspendera cellerna försiktigt, följt av återvinning vid 37 ° C under 1 h under försiktig skakning i en 15 ml rundbottnad tube.
- Sprida cellerna på en LB-platta innehållande 100 pg / ml ampicillin och inkubera vid 37 ° C under 12 h.
- Isolera en enda koloni med hjälp av en slinga och inokulera kolonin i 10 ml LB innehållande 100 ug / ml ampicillin vid 37 ° C i en skakanordning under 12 h.
- Tillsätt 5 ml av ympkulturen till 500 ml LB innehållande 100 ug / ml ampicillin och inkubera kulturen i ett 37 ° C skakande inkubator.
- Tillsätt 0,5 mM isopropyl β-D-tiogalaktosid (IPTG), när OD 600 når0,5 och inkubera kulturen i ett 37 ° C skakande inkubator under 24 timmar.
- Centrifugera cellerna vid 4500 x g under 20 min (4 ° C) och försiktigt bort supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 5 ml bindningsbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA och 1 mM DTT).
- Sonikera cellerna på is med sex 10-sek skurar på 200-300 W, efter varje skur med 10 sekunder av kylning.
- Centrifugera lysatet vid 10000 x g under 30 min vid 4 ° C för att pelletera cellrester. Överför supernatanten (lösligt protein) i en ny kollektion tub.
- Att uppnå affinitetsrening av de FRET sensorproteiner, belastning 4 ml av den rensas cellysatet på en Ni-NTA-affinitetskolonn (5-ml volym) och utför en kromatografi-analys med hjälp av snabb protein-vätskekromatografi (FPLC) 18.
- Tvätta kolonnen en gång med fem kolonnvolymer av tvättbuffert I (50 mM fosfatbuffert, 300 mM natriumklorid, 10 mM imidazol, pH 7,0).
- Upprepa tvättsteg med fem kolonnvolymer av tvättbuffert II (50 mM fosfatbuffert, 300 mM natriumklorid, 20 mM imidazol, pH 7,0).
- Eluera sensorprotein med fem kolonnvolymer av elueringsbuffert (50 mM fosfatbuffert, 300 mM natriumklorid, 500 mM imidazol, pH 7,0).
- Att koncentrera och avsalta det eluerade provet, fylla koncentratorn (membranstorlek av 10000 MW) med upp till 20 ml prov och centrifugera i 10 min vid 3000 x g. Fylla koncentratorn med 0,8% fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upprepa detta steg två gånger, först fylla anrikningsverket med 20 ml prov, och sedan påfyllning med PBS.
- Återskapa den koncentrerade och de saltade sensor protein och förvara den vid -80 ° C.
2. Mätning av sockerhalt använder FRET Analyzer
OBS: Detaljerna i FRET analysator konstruktion har beskrivits i vårt tidigare arbete 7.
- Bered en upptäckt lösning av 0,8% PBS innehållande 0,2iM av sensor proteiner.
- Slå på FRET analysatorn. Tryck på knappen "UP" för två sekunder för att kalibrera den optimala temperaturen. Ställ in temperaturen till 53 ° C med hjälp av "UPP" och "NER" knapparna och tryck på "SET" -knappen.
- För kalibrering, tryck och håll "UPP" och "NER" knapparna samtidigt i 2 sekunder. Kontrollera att LED-bildskärmar "CALIB" och tryck på "SET" -knappen.
- Placera en 12,5 × 12,5 × 45 mm (längd x bredd x höjd) rektangulär parallellepiped kärlet (kyvetten) innehållande endast PBS-buffert i en kyvetthållare av analysatorn och tryck på "SET" -knappen.
- Byt kuvetten med en som endast innehåller lösningen detektering (se 2.1) utan socker (maltos / sackaros) och tryck på "SET" -knappen för att kalibrera baslinjen.
- Byt kuvetten med en som innehåller upptäckt lösning med 10 mM socker och tryck på "SET"knapp.
- Att bestämma innehållet i en dryckesprov socker, sätta en ml dryck provet i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 16.000 x g under 1 min.
OBS: FRET sensorbaserade fluorescensmätning har fördelen att den inte kräver speciell förbehandling av provet eftersom endast 1% (volym / volym) för provet är inkluderad i den totala volymen. Vi rekommenderar dock att ta bort något material som kan påverka fluorescensmätning (t.ex. celler, olösliga partiklar, lipid, fett, eller vilket material som helst med autofluorescens). Dessutom, om en stark syra, stark bas, rengöringsmedel (detergent), eller emulgermedel (emulgermedel) är närvarande i en hög koncentration och kan påverka egenskaperna hos den FRET biologisk sensor, det bör avlägsnas med användning av ett organiskt lösningsmedel eller en neutraliseringsmedel. Till exempel, när mjölkfett och emulgeringsmedel elimineras från frysta snacks proverna centrifugerades i ett mikrofugrör vid 16.000 x g under 30 min, och det flytande between bottensedimentet och det översta lagret av mejerifett extraheras. En lika stor mängd hexan tillsätts sedan, följt av centrifugering vid 15000 x g under 30 min för att eliminera lipider. - Avlägsna supernatanten med en 1-ml spruta och filtrera den genom ett sprutfilter (porstorlek 0,2 ^ m).
- Placera 0,1 ml filtrerad dryck provet i en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 0,9 ml PBS och skaka försiktigt.
OBS: Det är viktigt att späda drycken provet ordentligt. I detta fall var 1000-faldig spädning utförs så att koncentrationen av socker skulle falla inom det dynamiska området för anordningen. Vi rekommenderar att uppskatta koncentrationen målet socker i förväg genom att hänvisa till sockerhalten på etiketten av drycken. - Tillsätt 5 | il av det utspädda drycken provet (1%, volym / volym) till en kuvett innehållande 0,495 ml av den upptäckt lösning.
- Placera kuvetten i en kyvetthållare av FRET analysatorn och förvärma provlösningen till 53 ° C.
- Tryck på "SET" för att mäta sockerhalten.
Notera Det är möjligt att utvärdera FRET mätning med användning av en Multilabel plattläsare eller en fluorescensspektrofotometer försedd med en Peltier-anordning för temperaturkontroll genom att läsa av förhållandet vid 488/535 nm 7,8. För sackaros upptäckt, följ steg från 1,1 till 2,12 med en CSY-LH sensor 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utföra kvantitativ analys av sockerinnehåll använda FRET-analysator, är det nödvändigt att bygga en anpassad kurva uppskatta mål-sockerkoncentrationen från det observerade FRET ratio. Låt r definiera förhållandet mellan emissionsintensiteten hos GFP vid 480 nm och emissionsintensiteten för YFP som genereras vid 530 nm (Ekv. 1).
Dos-responskurvan för den FRET biosensor (CMY-BII vid 53 ° C) kan genereras genom att observera den FRET-förhållande, r, vid olika sockerkoncentrationer. Kurvan kan sedan uttryckas som en S-formad sigmoidal kurva på följande sätt:
r max och r min representera signalen förhållande med sockerkoncentrationer av 0 och mättad (1000 pM), respektive; x 0 representerar den koncentration socker till 50% svar; och p representerar lutningen av svaret, vilket är nära 1 eller -1. I föreliggande studie, r max, r min, x 0, och p är 4,256, 2,672, 71,779, och en, respektive. Koncentrationsområdet från 1 pM till 1000 pM användes i modellanpassningen.
Med användning av ekvationerna 1 och 2, har innehållet i finns i handeln drycker socker kvantifieras med FRET analysatorn. Två maltos FRET sensorer undersöktes för att testa signalen r, beroende på olika temperaturer 2,8. Den första FRET sensor, CMY-0, är en grundläggande FRET-baserad sensor bestående av CFP, maltosbindande protein (MBP), och YFP, med no linkerpeptider. Den andra sensorn, CMY-BII, har en Ser-Arg länk mellan MBP och de två fluorescensproteinerna 2. Som figur 1A visar, är CMY-0 inte observerats vid mätnings temperaturer under 50 ° C, eftersom det inte finns någon signal skillnad mellan 0 och 1 mM maltos koncentration. Signal skillnader i både FRET sensorer maxim mellan 50 och 55 ° C (Figur 1) 8. För att kvantifiera halten av de tre typerna av kommersiellt tillgängliga drycker socker, var en dos-responskurvan för CMY-BII sensorn vid 53- ° C genereras (Figur 2A) och maltos innehållet i de tre proverna identifierades genom omvandling av FRET-förhållande in i maltos koncentration.
Som prov A är gjord av korn som ris och korn, som är viktiga maltos källor provet förväntas innehålla relativt hög maltoshalt (genomsnitt 11,892 g / 235 ml) ( 
Figur 1. FRET Signal Skillnaden mellan 0 och 1 mM Maltos använda FRET-Analyzer vid olika temperaturer. (A) Den CMY-0 sensor visade ingen signalskillnad vid olika maltos koncentrationer vid temperaturer under 50 ° C. (B) Den CMY-BII sensorn var i stånd att skilja FRET signalskillnaden mellan 0 och 1 mM maltos i ett brett spektrum av temperaturer. I båda fallen, den signalskillnad ökat dramatiskt i ett visst temperaturområde (50 - 55 ° C). error staplar representerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2. maltos kvantifiering Tre Kommersiellt tillgängliga drycker. (A) En dos-responskurva för CMY-BII. (B) Maltos innehållet i tre dryckes prover kvantifieras. Notera att "Totalt socker" indikerar kvantiteten av allt socker (inklusive maltos) rapporterats av dryckestillverkaren på drycken etiketten. Felet stapel anger standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll möjliggör snabb och effektiv kvantifiering av sockerhalten i dryckes prover, med hjälp av en skräddarsydd FRET analysator 7 vid en optimal temperatur för FRET sensorer. Analysatorn har utformats med en nyligen utvecklad, billig 405 nm band ultraviolett LED som ljuskälla och två fotodetektorer med en kiselfotodiod. Denna enhet är mer kostnadseffektiv än andra jämförbara fluorometrar. Anordningen visade hög detektionskänslighet, särskilt vid mätning av förhållandet mellan två emissionsvåglängdsband (530 nm och 480 nm) på ett optimalt temperaturområde för FRET sensorer. Dess känslighet och intensiteten i att upptäcka olika sockerarter var överlägsna dem av en fluorescensspektrofotometer anordning 7.
Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att stödja den breda tillämpligheten av FRET-baserade sensorer med skräddarsydd FRET analysatorn. Medan analysatorn mäter indirekt sockerhalt via FRET sensorer it är uppenbart att anordningen innehåller ett antal av fördelarna med FRET sensorer, inklusive allmänt utdrag genetiskt modifierade ligand specificitet, modulär design, koncentrationsoberoende signaler sensor och korrekt inriktning av subcellulära små molekyler. FRET sensorer är faktiskt används för att detektera ett brett spektrum av små molekyler, inklusive joner 9, heme 10 och andra. Dessutom kan mer än 20 typer av FRET konstruktioner vara lätt att hitta och beställas via den ideella förvar Addgene 11.
Trots den breda tillämpligheten av FRET analysator, finns det två huvudsakliga problem med driften av anordningen. Först, eftersom driften av anordningen är relativt enkel, är prov förbehandling det kritiska steget som påverkar kvaliteten på upptäckt, utom i fall av enheten inte fungerar. I detta protokoll, ett steg (prov utspädning) var tillräckligt för att behandla vätskeprover som var klart transparent och innehöll inga olösliga partilarna. Emellertid kan andra prover kräva ytterligare bearbetning för att avlägsna olösliga material, såsom cellulära eller lipidkomponenter. Eventuella autofluorescerande partiklar som kan påverka FRET signal bör också tas bort, som noterades efter steg 2,7. För det andra, kvalitetskontroll och anslutning samverkar med sjukhus informationssystem måste åtgärdas, som med alla typer av point-of-care testning (POCT) verktyg 12. Eftersom signalkvaliteten för FRET analysatorn beror till stor del på kvaliteten på FRET sensorn och förbehandlingsstegen, är regelbundna kvalitetskontroller som krävs för att säkerställa att mätningarna ligger inom standardsignalområde för regelbunden kvalitetskontroll dataanalys. FRET sensorstabilitet och lagringstiden, som båda är viktiga för ytterligare pålitliga applikationer, bör utredas under kvalitetskontroller. Skapa riktlinjer och utveckling av lämplig programvara kan också ta itu med begränsning anslutning. Aktuella versioner avFRET analysator är utrustade med RS232-anslutning för fjärrkommandoraden Control, men trådlös kommunikation kan vara ett inslag i nästa version av analysatorn, som kommer att ha ett förbättrat gränssnitt för sjukhusinformationssystem.
Emellertid har FRET sensorer konstruerats för substratspecificitet, en metod som normalt tillåter bredare specificitet 2. Följaktligen kan FRET signalen möter oavsiktlig störning från andra ingredienser, inklusive andra typer av socker i kommersiella drycker. Ytterligare undersökningar bör undersöka hur FRET sensorer reagerar på olika sockerblandningar att exakt kvantifiera mängden socker. Samverkan med företag som producerar drycker kommer att hjälpa att bekräfta att sockerhalten kalibrera av FRET analysatorn.
Man räknar med att den föreslagna bärbara FRET anordning med olika FRET sensorer kommer att användas i POCT tillämpningar. POCT används för att bedöma graviditet, blodglukosnivåer, biomarkörer proteiner, infektiösa bakterier och smittsamma virus. POCT metoder har snabba handläggningstider och i allmänhet uppvisar låg felprocent på grund av det låga antalet processteg. Detta är viktiga fördelar med POCT över den centrala strategin laboratorietester. Handhållna bärbara POCT-enheter, såsom anordningen beskriven häri, har uppmärksammats allt mer på grund av deras potentiella tillämpningar inom utvärdering av livsmedel och blodsocker övervakning. I synnerhet glukosövervakning av blodprover från patienter med diabetes kräver en snabb, exakt och kostnadseffektiv POCT metoden 13. Efter Ames forskargrupp utvecklat den första blodglukosteststickan 1965 (med en remsa som innehåller glukosoxidas), har flera tekniker föreslagits för blodglukosövervakningssyfte 12. FRET-analysatorn är också tillgänglig för att detektera glukos i blodprover med lämplig förbearbetning av blod och periplasmiska glukosbindande protein (MglB) 14 -baserad FRET protein.
Det behövs enkla, snabba metoder för bedömning av livsmedelskvalitet. Förbrukningen av sockerhaltiga drycker är förknippad med en rad olika sjukdomar och syndrom, såsom ökad BMI under barndomen 15, pediatrisk fetma 16, och risken för stroke 17. Att förstå detta sammanhang kräver noggrann mätning av sockerkomponenter i drycker. Därför glukos och fruktos koncentrationer av drycker är av intresse för berörda med människors hälsa forskare. Detta protokoll demonstrerar den mycket känsliga prestanda FRET analysator med optimal temperaturkontroll. Enheten kan användas med olika FRET sensorer för att upptäcka olika små molecules- inklusive glukos och fruktos 14,15. Vår bärbara och laddningsbara anordning, som har en batteritid på 10 till 20 timmar, beroende på uppvärmningsprotokoll, är tillämplig för POCT. Dess enkla driftsprotokoll makes enheten enkel att använda och eliminerar behovet av komplicerade personalutbildning. Med tekniska förbättringar, bland annat en minskning av utrustningens storlek, minimering av förbehandlingssteg, och identifiering av praktiska krav för fältbruk, kommer den här enheten att främja FRET-baserad forskning och utveckling i småskaliga laboratoriemiljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats med bidrag från Intelligent Syntetisk biologi Center of Global Frontier Project (2011-0031944) och KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).
