Abstract
تراجع في الذاكرة واضحة تعتمد على الحصين (ذاكرة للوقائع والأحداث) هو واحد من أقرب أعراض سريرية لمرض الزهايمر (AD). ومن الثابت أن فقدان المشبك وما تلاها من التنكس العصبي هي أفضل تنبئ عن ضعف الذاكرة في ميلادي. وقد أكدت أحدث الدراسات دور أعصاب من الأوليغومرات اميلويد بيتا القابلة للذوبان (Aβo) التي تبدأ تتراكم في الدماغ البشري ما يقرب من 10 إلى 15 سنة قبل أن تصبح الأعراض السريرية واضحة. وتشير العديد من التقارير أن ذوبان Aβo ترتبط مع العجز في الذاكرة في نماذج م والبشر. كان التنكس العصبي الناجم عن Aβo الملحوظ في الثقافات شريحة العصبية والدماغ أكثر تحديا لإعادة إنتاج في العديد من النماذج الحيوانية. نموذج ضخ Aβo المتكررة هو موضح هنا التغلب على هذه المسألة، والسماح معالجة اثنين من المجالات الرئيسية لتطوير علاجات جديدة المرض تعديل: تحديد العلامات البيولوجية لتشخيص مبكر م، وتحديد ميكا الجزيئيnisms التي تقوم عليها العجز في الذاكرة الناجم عن Aβo-في بداية م. منذ مجموع Aβo ذوبان سريع نسبيا في الألياف غير القابلة للذوبان Aβ التي ترتبط بشكل سيئ مع الدولة السريرية للمرضى، تعد قابلة للذوبان Aβo الطازجة وحقن مرة واحدة يوميا لمدة ستة أيام لإنتاج موت الخلايا ملحوظ في قرن آمون. كنا قنية تصميم خصيصا للدفعات في وقت واحد من Aβo واستمرار تدفق Aβo الضد (6E10) في قرن آمون باستخدام مضخات التناضحي. هذا مبتكرة في طريقة الجسم الحي يمكن أن تستخدم الآن في الدراسات قبل السريرية للتحقق من كفاءة العلاجات م جديدة قد منع ترسب والعصبية من Aβo مرضى قبل الخرف.
Introduction
واقترح في البداية كان أن تراكم الأنواع Aβ غير قابلة للذوبان في الدماغ المركزي لم المرضية. 1،2 ومع ذلك، تم الكشف عن اللويحات النشوانية أيضا في بعض وضعها الطبيعي معرفيا كبار السن. 3-7 للتغلب على ضعف العلاقة القائمة بين ترسبات البلاك والعجز المعرفي في ميلادي، وقد أظهرت أحدث التقارير وجود Aβo قابل للذوبان سامة في بداية المرض، الذي ربط أفضل بكثير مع الدولة السريرية للمرضى. 8-14 منذ عملية Aβ oligomerization وديناميكية للغاية، واقترح أن العصبية يسببها مختلف Aβo بدلا من نوع واحد محدد فقط من قليل وحدات 14-16 منذ أظهرت العديد من الدراسات أن Aβo يمكن بدء الاختلالات المشبك قبل المشبك وفقدان الخلايا العصبية، 17-24 النظريات الحالية تشير إلى أن المعاملة المتعلقة Aβ-قد تكون فعالة في م في وقت مبكر بدلا من في مراحل لاحقة كما تم اختبارها حتى الآن في التجارب السريرية.
واحدة سمة مميزة لم المرضية هي القتل الجماعي وعلى نطاق واسع الخلية لوحظ في مراحل متأخرة من المرض، والمشبك كبير وفقدان الخلايا العصبية التي لوحظت في مناطق الدماغ المترجمة عندما تصبح العجز في الذاكرة للكشف على المستوى السريري. وأقلقت مسار الثاقب أن المشاريع من القشرة المخية الأنفية الداخلية (EC) إلى التلفيف المسنن (DG) بشكل ملحوظ في وقت مبكر من بداية م. 25،26 خلال الدولة البادري ميلادي عندما الضعف الادراكي المعتدل (MCI) يصبح واضحا موت الخلايا كبيرا تم الكشف في المفوضية الأوروبية، فضلا عن فقدان متشابك في المديرية العامة. 25،26
على الرغم من أن مجموعة كبيرة من الأدلة قد حددوا للعمل السامة من Aβo قابل للذوبان في أوائل م، 8-14 التنكس العصبي الناجم عن Aβo-لوحظ في ثقافة العصبية أو عضوي النمط ثقافة شريحة الدماغ كان أكثر تحديا لإعادة إنتاج في النماذج الحيوانية. 27 معظم المعدلة وراثيا م نماذج overexpressing وβ يكون لويحات الأميلويد، hyperphosphorylation تاو، ونقص متشابك والعجز في الذاكرة. 27 ومع ذلك، فإن هذه النماذج أقل نجاحا كبيرا في موت الخلايا النمذجة التي لوحظت في الحصين من المرضى ميلادي. للتغلب على هذه المسائل التقنية وضعنا نموذج يقوم على ضخ داخل المخ من Aβo قابل للذوبان. نحن ذكرت في وقت سابق أن تكرار الحقن الحصين من Aβo قابل للذوبان تحفز فقدان الخلايا العصبية تدريجية وhyperphosphorylation تاو، وهما بصمات المرضية المرتبطة تراجع الذاكرة في ميلادي 28 هنا، فإننا نبين طريقة رواية لاختبار علاجات م باستخدام قنية تصميم خصيصا للدفعات في وقت واحد من Aβo واستمرار تدفق Aβo الضد (6E10) مع مضخات التناضحي.
توفر مضخات التناضحي طريقة فريدة لاختبار في الجسم الحي كفاءة أي الأجسام المضادة (أو غيرها من المركبات) ضد التنكس العصبي الناجم عن Aβo مباشرة في الموقع ضخ Aβo. وهكذا، وهذه المضخات reprESENT أداة ملائمة لإنشاء إثبات صحة مفهوم صلبة فيما يتعلق بآليات عمل وكلاء العلاجية المحتملة في م. منذ التقارير الأخيرة تشير إلى الأهمية الحاسمة التي Aβo قابل للذوبان في المراحل المبكرة من الميلاد، هي في الواقع يجري اختبار العديد من العلاجات الموجهة نحو Aβo من قبل مختبرات الأكاديمية والمستحضرات الصيدلانية. هذا نموذج حيواني رواية يسمح محاكاة فقدان متشابك والعصبية التي لوحظت في وقت مبكر م، وتستخدم مضخات التناضحي للبث بشكل مستمر وكلاء العلاج تحديدا في موقع الحقن Aβo. إخفاقات المتكررة من العلاجات م اختبارها على مدى السنوات القليلة الماضية في خفيفة الى معتدلة المرضى كما دفعت الباحثين إلى بدء المحاكمات في المرضى قبل الخرف قبل Aβo تبدأ تتراكم بكثرة وتوليد تلف في الدماغ لا رجعة فيه. في هذا السياق، واختبار المركبات الجديدة التي تمنع ترسب وبالتالي العصبية من Aβo قد تكون ذات فائدة للمرضى ما قبل السريرية.
Protocol
الأخلاق البيان: إن بروتوكول الحيوان لهذا المشروع الحصول على موافقة من لجنة رعاية الحيوان من مستشفى دو القلب الأقدس في مونتريال وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان.
1. إعداد القسطرة قبل جراحة التجسيمي
- قطع القسطرة PE50 (6 سم في الطول) التي سيتم استخدامها لتوصيل قنية مع مضخات التناضحي (انظر الشكل 1A). ملء القسطرة PE50 مع السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) وختم طرفي القسطرة. إبقاء القسطرة في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.
2. قنية زرع عن طريق جراحة التوضيع التجسيمي
- إجراء عملية جراحية في ظروف معقمة. تعقيم جميع الأدوات والمواد الجراحية قبل التعقيم. تنظيف جهاز التجسيمي ومنطقة العمل بدقة، وتطهيرها بمحلول الإيثانول 70٪. ارتداء قناع جراحي، بونيه الشعر وقفازات معقمة.
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) حل الكيتامين وزيلازين (100 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم، على التوالي). تأكيد التخدير عن طريق فحص الحركة بعد قليل اصبع القدم لطيف.
- حقن غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات (ميلوكسيكام، 1 ملغ / كلغ) تحت الجلد (SC) إلى حيوان تخدير 30 دقيقة على الأقل قبل الجراحة.
- حلق رأس الحيوان باستخدام كليبرز وتطهير الجلد بمحلول جلوكونات الكلورهيكسيدين 2٪ والإيزوبروبيل 2٪ ثلاث مرات. تطبيق مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- وضع الحيوان على إطار التجسيمي مع قضبان الأذن. إصلاح قنية واحد على ذراع حامل الإطار التجسيمي. حقن (الشوري) وكيل مخدر موضعي (بوبيفكين (1.5 ملغ / كلغ) والليدوكائين (1.5 ملغ / كلغ) على الجزء العلوي من الرأس. التخدير هو يحافظ خلال الإجراء بأكمله عن طريق وضع مخروط الأنف تسليم 3٪ الأيزوفلورين. باسرها وينبغي أن يكون الجراحي الميدانيرايات قبالة، ولكن لم يحدث ذلك هنا لإظهار أفضل تقنية.
- إجراء شق من 3 سم في الجزء العلوي من الرأس مع مشرط. تثبيت 4 المشابك حول شق لمغادرة الجمجمة واضح. باستخدام مقص مستديرة الحافة، وجعل جيب (2 × 2 سم 2) تحت الجلد بين عظام الكتف للحيوان.
- تتخلص من السمحاق من الجمجمة مع شفرة. تطبيق الشاش على الجمجمة إذا النزيف.
- تحقق من أن الجمجمة مسطح والانحياز بشكل جيد على الإطار التجسيمي. للتأكد من أن الجمجمة هي مسطحة، والتحقق من ارتفاع ينسق في bregma وفي امدا. أخذ إحداثيات bregma التي سيتم استخدامها كنقطة مرجعية.
- بدءا من bregma، وحساب إحداثيات دليل قنية اللذين سيتم زرعها ثنائيا في قرن آمون (الأمامي الخلفي: - 0.42 سم؛ الناصف الوحشي: ± 0.30 سم؛ ظهري بطني: - 0.28 سم وفقا لأطلس دماغ الفئران باكينوس واتسون) 29 . بيانموقف قنية مع علامة.
- حفر حفرة (0.5 ملم) في الجمجمة عند نقطة غرس كل قنية. حفر اثنين من الثقوب الأخرى حوالي 5 ملم فوق وتحت هذه النقاط لادخال المسامير التي سوف يصلب قنية عند تطبيق الاسمنت الأسنان.
- قطع واحدة من نهاية القسطرة شغل سابقا مع ACSF مع مشرط، وأدخله في الذراع زاوية قنية. إصلاح قنية الأولى مع الاسمنت الأسنان. تجنب وضع الاسمنت الأسنان حول الموقف من قنية الثانية.
- اسمحوا الجافة الاسمنت الأسنان ل2-3 دقائق، ثم إزالة ذراع حامل من قنية الأولى، وإصلاح قنية الثانية في ذلك. كرر الخطوات من 2.11 و 2.12. وضع قنية همية على كل قنية دليل. تأكد من أن دمية ودليل قنية هي من نفس الطول لمنع تسلل الأنسجة ومنع قنية.
- إدراج نهاية خالية من كل من القسطرة في الجيب بها سابقا بين الكتف من الحيوان. إزالة المشابك وغرزة الجلد معخيوط الجروح 4-0.
ملاحظة: بالنسبة للشركات قنية دليل يجب أن تكون في متناول للدفعات Aβo القادمة. - إزالة الحيوان من الإطار التجسيمي ووضعها مرة أخرى في قفصه. خلال فترة الانتعاش بعد العمليات الجراحية، ووضع القفص على بطانية تسخين المياه حتى يستيقظ الحيوان تصل. يجب أن يكون القفص جزئيا على لوحة حتى الفئران يمكن أن تتحرك بعيدا عن الحرارة إذا لزم الأمر. مراقبة الحيوانات باستمرار حتى يستعيد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
- عودة الفئران إلى منشأة الحيوان للتعافي من الجراحة لمدة 10 يوما تحت المراقبة الدقيقة.
ملاحظة: لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. وتعطى ميلوكسيكام (1 ملغ / كلغ) مرة واحدة يوميا خلال اليومين التاليين لعملية جراحية لعلاج الألم.
تركيب 3. الأسموزي مضخة
- قبل يوم واحد التثبيت، ملء مضخات التناضحي مع 6E10 الأجسام المضادة (1 ملغ / مل، 100 ميكرولتر) والسيطرة IgG1الأجسام المضادة (1 ملغ / مل، 100 ميكرولتر) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة تحت ظروف معقمة. الحفاظ على مضخات في الماء المقطر المعقم عند 37 درجة مئوية خلال الليل لتفعيل المضخات.
- تخدير الفئران مع isoflurane 3٪ لتثبيت مضخات التناضحي (0.5 ميكرولتر / ساعة لمدة 7 أيام). يحلق بين الكتف وتطهير الجلد بمحلول جلوكونات الكلورهيكسيدين 2٪ والإيزوبروبيل 2٪. إجراء شق من 2 سم مع مشرط بين الكتف لتحديد موقع القسطرة PE50 متصلا قنية دليل.
- قطع نهاية القسطرة PE50 تحتوي على الاسمنت الأسنان مع مشرط. ربط مضخات التناضحي لالقسطرة PE50، وإضافة بعض الاسمنت الأسنان في مضخة والقسطرة تقاطع لتأمين الاتصال.
- غرزة الجلد بإحكام بخيط خياطة 4-0. وضع الظهر الحيوان في قفصه على وسادة تسخين المياه. مراقبة أعقاب الحيوان تصل بسرعة من التخدير الأيزوفلورين (حوالي 5 دقائق).
ملاحظة: عملية جراحية تستغرق APPROximately 5-10 دقيقة.
4. الحقن Aβo في استيقظ والفئران تتحرك بحرية
- إعداد الحل Aβo (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر) كما ذكرت سابقا. 28،30 السماح Aβo لتجميع حيوي وتلقائي لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل الحقن في الوريد.
- تثبيت اثنين من 10 المحاقن ميكرولتر على مضخة التسريب. ملء المحاقن مع 5 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. قطع اثنين القسطرة PE50 إلى حوالي 60 سم في الطول مع مشرط. ملء كل من القسطرة بالماء المقطر المعقم باستخدام 1 مل المحاقن والإبر 21G.
- حافظ على 1 مل الحقن في واحدة من نهاية القسطرة وتوصيل الطرف الآخر إلى الحقن هاميلتون. إزالة 1 مل الحقن وتحقق من عدم وجود فقاعات الهواء داخل القسطرة.
- إدراج قنية الداخلية في نهاية القسطرة PE50. استخدام الماء المقطر المعقم، وملء قنية الداخلية متصلة القسطرة PE50 يصل to1 ميكرولتر في الحقن هاميلتون. جعل فقاعة الهواء التي كتبها pulling العودة المكابس لتصل إلى 2 ميكرولتر.
- مزيج الحل Aβo pipetting صعودا وهبوطا باستخدام غيض من الحد الأدنى من الالتزام. تجنب تشكيل فقاعات أثناء الخلط. ملء كل من قنية الداخلية مع 1.5 ميكرولتر من محلول Aβo من الانسحاب المكابس يصل إلى 3.5 ميكرولتر.
- جعل خطوط مع علامة قبل وبعد فقاعة الهواء القيام به في كل من القسطرة. وهذا بمثابة نقطة تفتيش التسريب المستمر. للتسريب، وجلب قفص بالقرب من مضخة التسريب وإزالة غلافها.
- وضع الفئران في تكبب وكشط بإحكام ذراع تكبب حول عنقه لشل حركة الرأس من الفئران. إزالة قنية همية من قنية اثنين من الدليل. إدراج قنية الداخلية أعدت مسبقا في قنية دليل. تحقق من أن يتم إدراجها بشكل كامل وثابت تماما لقاعدة قنية دليل.
- الافراج عن الفئران من تكبب ووضعها مرة أخرى في قفصه للحد من التوتر خلاف. مراقبة عن كثب للتأكد من أن القسطرة لا يلوون togetويتم لها والتسريب صحيح.
- بدوره على مضخة التسريب. حقن 1 ميكرولتر من حل Aβo بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة (10 دقيقة). خلال التسريب، تأكد من أن التحركات حقنة المكبس من 3.5 ميكرولتر 2.5 ميكرولتر، وأن فقاعة الهواء في كل من القسطرة PE50 تتحرك باستمرار.
- ترك قنية الداخلية في المكان لمدة 5 دقائق أخرى بعد ضخ للسماح للنشر الفعال للحل Aβo. جعل الفئران مرة أخرى في تكبب لإزالة قنية الداخلية وتوج قنية دليل لمنع ارتداد من الحل حقن. استخدام قنية همية أن تتوقف فقط قبل الذراع زاوية قنية. عودة الحيوان في قفصه.
- كرر Aβo ضخ مرة واحدة يوميا على مدى 6 أيام متتالية. الموت ببطء الحيوان بقطع الرأس.
Representative Results
تم دراسة تأثير أعصاب من Aβo في الفئران طويل ايفانز من خلال زرع قنية في المدير العام للقرن آمون. تم حقن للذوبان Aβo كل يوم على مدى ستة أيام متتالية. كنا قنية تصميم خصيصا للدفعات في وقت واحد من Aβo واستمرار تدفق 6E10 أو السيطرة IgG1 الضد في قرن آمون باستخدام مضخات التناضحي (الشكل 1A). لتم تخدير الفئران المناعية، perfused transcardially مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم، والعقول مغمورة في 4٪ حل لامتصاص العرق لمدة 48 ساعة و 15٪ محلول السكروز لمدة 24 ساعة. وعولج العائمة خالية أقسام الاكليلية (40 ميكرون) مع 0.3٪ H 2 O 2 لمدة 30 دقيقة، ومنعت في 1٪ مصل الماعز لمدة 1 ساعة، وحضنت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة المعادية للعموم Aβ. وعولج المقاطع مع حمض الفورميك 70٪ لمدة 3 دقائق قبل تطبيق الأجسام المضادة. تم إجراء الكشف باستخدام مجمع ABC و 0.05٪ من محلول 3،3-diaminobenzidine. وقد شنت أقسام على الشرائح المغلفة الجيلاتين الزجاج، والمجفف في الهواء 2 ساعة، المجففة (30، 70، 95، و 100٪ كحول)، المحتضنة في التولوين 5 دقائق، وcoverslipped. لالكريزيل البنفسجي تلطيخ، وحضنت أقسام 10 دقيقة في 0.5٪ محلول الكريزيل البنفسجي، حضنت 1 دقيقة في محلول حامض الخليك 0.5٪، decolored (70، 95، و 100 الكحول٪)، منغمسين في التولوين 5 دقائق، ومغطاة ساترة الزجاج.
أظهرت النتائج المعروضة هنا ترسب Aβo في المديرية العامة في محيط موقع التسريب، وموت الخلايا المرتبطة بهذا التراكم. لقد وجدنا أن مستوى Aβo وقد انخفضت بشكل كبير عن طريق 6E10 العلاج بالاجسام المضادة (الشكل 1B). وقد لوحظ التنكس العصبي تتميز بالقرب من موقع الحقن من Aβo، والموهن من قبل 6E10 العلاج بالاجسام المضادة (الشكل 1B). هذه النتائج متسقة مع Aβo تراكم أننا لاحظنا في DGبعد تكرار الحقن Aβo في الفئران. 28 إزالة ترسبات الأميلويد من العلاج المناعي مع 6E10 الضد يظهر هنا يتماشى مع تقرير آخر القيام به في نموذج م الماوس المعدلة وراثيا. 31
تم حقن الفئران في مستيقظا ويتحرك بحرية (مرة واحدة في اليوم لمدة 6 أيام) باستخدام القسطرة PE50 متصلة قنية الداخلية؛ الشكل 1. صورة من الحيوان مع قنية الثنائية خلال Aβo تسريب محلول من Aβo. (1 ميكرولتر 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر) إدراجها في دليل قنية. وقد غرست العلاج مع التحكم (CTL) IgG1 أو 6E10 الأجسام المضادة مباشرة في موقع الحقن Aβo باستخدام مضخات التناضحي الموجود تحت الجلد بين لوحي الكتف للحيوان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.
هو تخفيف الشكل 2. تخفيف العصبية المستحث بواسطة Aβo ترسب بواسطة 6E10 الجسم المضاد علاج A، Aβo (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر، 1 ميكرولتر). تم حقن مرة واحدة يوميا خلال 6 أيام متتالية، وتعامل مع CTL (IgG1) أو 6E10 الأجسام المضادة في موقع التسريب باستخدام مضخات التناضحي باء، تراكم الممثل من Aβo في المديرية العامة على القسم على الفور بجانب إدخال قنية، وتلطيخ التمثيلي مع البنفسجي الكريزيل تبين فقدان الخلية. أشرطة النطاق: 50 ميكرومتر (ن = 4) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هناك خطوات حاسمة في هذا البروتوكول التي تتطلب اهتماما خاصا. عندما غرس قنية، وتجنب وضع الاسمنت الأسنان عندما يكون السائل أيضا لمنع عرقلة ثقب في قنية الثانية. من المهم أن تضع الاسمنت الأسنان في نهاية خالية من القسطرة P50 تعلق على مضخة لمنع تهيج والاستجابة الالتهابية الممكنة. في يوم من الجراحة التجسيمي، واستخدام قنية همية التي هي نفس طول دليل قنية لتجنب عرقلة قنية. ومع ذلك، بعد تثبيت تستخدم مضخات أقصر قنية همية أن تتوقف قبل الذراع زاوية قنية للسماح ضخ السليم من الحل من المضخة إلى الحصين. تراقب عن كثب ضخ Aβo والتحقق من أن فقاعة الهواء عمله في القسطرة يتحرك بشكل مستمر خلال ضخ. تأكد من أن قنية الحقن يتم إدخال تماما في قنية دليل خلال ضخ دائما.
إذا كانت المشكلة هي لقاء خلال Aβ ضختحقق من أن قنية الداخلية لا يتم حظر. إذا كان هذا هو الحال، تدفق الماء المقطر المعقم خلال قنية الداخلية. وإذا تم حجب قنية دليل، وتحويل قنية الداخلية في قنية دليل. خلاف ذلك نقل قنية الداخلية صعودا وهبوطا. خلاف في تكبب يمكن أن تكون مرهقة بالنسبة للفئران، وخاصة في اليوم الأول. لتقليل الإجهاد من الحيوان، ونحن نوصي للتلاعب وروض الفئران إلى تكبب قبل الجراحة التجسيمي.
ويمكن أن يعزى العديد من المزايا لهذه الرواية ومرونة في نهج الجسم الحي. والواقع أن طبيعة Aβo ضخت يمكن التحكم بدقة قبل التسريب، ونوع مختلف من الاستعدادات Aβ (على سبيل المثال الاصطناعية مقابل حلول Aβ المستمدة من الدماغ) يمكن حقن لتقييم السمية العصبية في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن هذا النموذج أن تستخدم للتحقيق في الآليات التي الأنواع المختلفة Aβ (على سبيل المثال، أحادية، المنخفضة وارتفاع الوزن الجزيئي رأigomers، protofibrils) يمكن أن تحدث التأثيرات السمية العصبية في الجسم الحي، وكيف العلاجات مثل العلاج المناعي قد يقاوم تأثير ضار في الدماغ. منذ ضخ وأداء في مستيقظا، والحيوانات التي تتحرك بحرية، وعدم وجود آثار الخلط بين وكلاء مخدر والحل Aβo على مسارات إشارات، كما هو مبين في الدراسات السابقة. صبغ 32،33 في نقل الحيوانات بحرية وأيضا متوافقة مع الاختبارات السلوكية أي الوقت قبل وبعد الحقن.
دفعات من Aβo وتركيب مضخة يمكن القيام به في الحيوانات من مختلف الأعمار لتحديد آثار Aβo والعلاجات أثناء الشيخوخة. منذ يحدث التنكس العصبي في محيط موقع التسريب، المشبك وفقدان الخلايا العصبية يمكن أن يتسبب في مختلف المناطق والمحلية الدماغ. ضخ جانبية من Aβo والتحكم (سيارة أو التدافع Aβ) يسمح السيطرة على أي تغيير في نفس الحيوان. على العكس من ذلك، Aβo أو السيطرة سولutions يمكن حقن ثنائيا في اليمين واليسار الحصين، على سبيل المثال عند اختبار الحيوانات في المهام السلوكية. ضخ Aβo والعلاج يمكن أن يتم في وقت واحد أو بدلا من ذلك مضخات يمكن تركيبها بعد Aβo ضخ لتقييم ما إذا كان العلاج فعال بعد Aβ الترسيب. ويمكن أيضا أن البروتوكول نفسه هو موضح هنا أن تستخدم عند القيام ضخ intracerebroventricular من Aβo. تأثير Aβo على مسارات الإشارات بين الخلايا يمكن تقييم قبل وبعد فقدان الخلايا العصبية في غضون فترة زمنية قصيرة معقولة. الجرعة وعدد من ضخ Aβ كما يمكن تعديلها للحصول على أكثر أو أقل حدة Aβ المرضية.
على الرغم من شديد التنوع، وهذا الأسلوب له بعض القيود. قنية زرع ينتج اضطراب الميكانيكية للأنسجة وneuroinflammation في الأيام القليلة الأولى بعد الجراحة. وبالتالي، لا بد من الانتظار أسبوع واحد على الأقل بعد عملية جراحية قبل البدء Aβo infuسيون، وإضافة ضوابط سليمة (حقن سيارة أو التدافع غير نشط Aβ) أن تأخذ في الاعتبار هذه الأحداث. أيضا، فقط كمية صغيرة من Aβo يمكن غرست للحد من انتشار الحل.
تمثل مضخات التناضحي وسيلة لتوصيل مريحة وفريدة من نوعها من أجل التحقق من قبل السريرية وكلاء تهدف إلى منع التنكس العصبي الناجم عن Aβ. منذ وقد تبين العلاج المناعي مع الأجسام المضادة 6E10 سابقا لتقليل تراكم Aβ في الدماغ، 31 استخدمنا الأجسام المضادة 6E10 كمفهوم إثبات صحة للتحقق من صحة لدينا في الجسم الحي نهج جديد. وتستخدم مضخات التناضحي في هذا النموذج قد الآن أن تستخدم لتطوير المرض تعديل العلاجات الجديدة التي يمكن أن تمنع ترسب والعصبية من Aβo في المرضى الذين يعانون م ما قبل السريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
| PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Meloxicam (5 mg/ml) | Norbrook | 215670I01 | |
| Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
| Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
| Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
| Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
| Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
| Hamilton syringe (10 µl) | Fisher Scientique | 14815279 | |
| Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Needle 21 G | Terumo | NN-2125R | |
| Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |
References
- Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
- Selkoe, D. J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer's disease. Hypothesis: Alzheimer's disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).
- Terry, R. D., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).
- Giannakopoulos, P., et al. Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer's disease. Neurology. 60, 1495-1500 (2003).
- Price, J. L., Morris, J. C. Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).
- Reiman, E. M., et al. Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).
- Aizenstein, H. J., et al. Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly. Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).
- Mc Donald, J. M., et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia. Brain. 133, 1328-1341 (2010).
- Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer's disease brain and correlate with cognitive dysfunction. Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).
- Naslund, J., et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA. 283, 1571-1577 (2000).
- Hardy, J.
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).
- McLean, C. A., et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
- Hepler, R. W., et al. Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands. Biochemistry. 45, 15157-15167 (2006).
- Martins, I. C., et al. Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J. 27, 224-233 (2008).
- Lesne, S., et al. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440, 352-357 (2006).
- Hung, L. W., et al. Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity. J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).
- Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B.
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
- Shankar, G. M., et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory. Nat. Med. 14, 837-842 (2008).
- Shankar, G. M., et al. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).
- Cleary, J. P., et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).
- Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J. Physiol. 572, 477-492 (2006).
- Gomez-Isla, T., et al. Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer's disease. J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).
- Brouillette, J. The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer's Disease. Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).
- Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. New York. Fourth edition (1998).
- Broersen, K., et al. A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer's disease. PEDS. 24, 743-750 (2011).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).
- Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E.
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
