Summary
私たちは、実験室規模の垂直フロースルーの列に先カンブリア時代含鉄海洋湧昇システムをシミュレートしました。目標は、O 2とFe（II）の方法地球化学的プロファイルを理解するシアノバクテリアの農産物O 2として進化しました。結果は、O 2を生成し、光合成によって、鉄（II）酸化にchemoclineの確立を示しています。
Abstract
いくつかの先カンブリア紀の縞状鉄鉱フォーメーション（BIF）の堆積のための従来の概念は先カンブリア紀海洋の熱水供給源からの第一鉄[鉄（II）]湧昇は、分子酸素によって酸化されたことを前提に進み、[O 2]シアノバクテリアによって生成さ。約2.4億年で前にグレート酸化イベント（GOE）に堆積最古のBIF、（グレイ）前、無酸素条件下での酸素非発生型のphotoferrotrophsによって、鉄（II）の直接酸化によって形成された可能性があります。異なる生物学的なシナリオの下で開発地球化学的および鉱物学的なパターンをテストするための方法として、我々は実験室規模でのリッチ海洋湧昇システム古代の海の代表的な無酸素のFe（II）をシミュレートするために、長さ40cmの垂直フロースルー列を設計しました。シリンダは、地球化学的勾配を安定化させるために多孔質ガラスビーズマトリックスを充填し、そして鉄定量のための液体試料は、水カラムを通して取ることができます。溶存酸素ました外部からオプトードを経由して非侵襲的に検出されました。下からのFe（II）の湧昇流束を関与生物実験、トップとは異なる光勾配、および水柱におけるシアノバクテリアの存在の結果、鉄の形成のためのショー明確な証拠（III）鉱物沈殿物とchemoclineの開発鉄（II）とO 2との間です。この列には、私たちがシミュレートされた海洋先カンブリア時代の条件の下で（と将来photoferrotrophsで）シアノバクテリアを培養したBIFの形成のための仮説をテストすることができます。浅海や湖底堆積物を含む - さらに私たちは列の概念は、様々な化学的および物理環境のシミュレーションを可能にすると仮定しました。
Introduction
先カンブリア時代（前4.6 0.541へGyの）雰囲気は、おそらく前に約2.4 Gyのでいわゆる「グレート酸化イベント」（GOE）でのステップ変化によって中断さ光合成生成された酸素（O 2）、の漸進的なビルドアップを経験し、再び大気Oなどの新原生代（1から0.541 Gyの前）で2は、現代のレベル1に近づきました。シアノバクテリアは酸素発生型光合成2のできる第一生物の進化の名残です。地球化学的証拠とモデリングの研究は、主に無酸素雰囲気3-5の下に海洋表層における局所酸素オアシスを生成し、シアノバクテリアまたは酸素発生型光合成や酸素発生光栄養生物の可能な生物のアクティブなコミュニティを保有中の浅い沿岸環境の役割をサポートしています。
鉄への先カンブリア時代ポイントを通して海水から縞状鉄鉱フォーメーションの堆積（のBIF）（II）（鉄（II））の主要な地球化学cとしてその堆積中に少なくとも局所的海水のonstituent、、。最大のBIFのいくつかは、大陸棚と斜面をオフ形成、深層水鉱床です。堆積したFeの量は、主に大陸（ すなわち 、風化）ソースとマスバランスの観点から互換性がありません。そのため、鉄の多くは苦鉄質や超苦海底地殻6の熱水変質から供給されている必要があります。鉄の速度の推定値は、沿岸環境の外側は、Fe（II）と一致している堆積湧昇7を介して表面の海に供給されます。 Feが湧昇流に輸送されるようにするために、縮小、移動体の形で存在していなければなりません - 鉄（II）として。 BIFに保存鉄の平均酸化状態は2.4 8であり、一般にBIFはFeが酸素によっておそらく、（II）の酸化された鉄の湧昇ときに形成される鉄（III）として寄託保つと考えられます。したがって、スロープenvironmeに沿ったポテンシャルのFe（II）酸化メカニズムを探索NTS BIFが形成された方法を理解することが重要です。また、海洋堆積物の洗練された地球化学的特徴付けは、Fe（II）は無酸素水柱に存在した含鉄条件は、先カンブリア紀を通じて海洋の持続的な特徴であった、とだけ時間と場所に制限されていない可能性があることを確認しましたここBIF 9を成膜しました。したがって、地球の歴史の少なくとも20億年の間、浅い海でのFe（II）とO 2との間のレドックスインターフェイスは、おそらく平凡でした。
多くの研究は、先カンブリア紀の海のさまざまな機能の化学的および/または生物学的な類似体である現代的なサイトを利用しています。良い例が光合成活性（シアノバクテリアによるものを含む）しながら、鉄（II）が10月13日に検出された太陽に照らされた地表水に安定して存在している含鉄湖です。これらの研究の結果は、無酸素/ FERに有酸素の地球化学と微生物特性への洞察を提供しますruginous chemocline。しかしながら、これらのサイトは、一般的に物理的にほとんど垂直ではなく湧昇システムで発生する化学インターフェースよりも、14を混合して層化され、先カンブリア時間4に最も酸素生成をサポートすると考えられています。
無酸素雰囲気下に海洋酸素オアシスの開発を探索するためのナチュラルアナログ、および太陽に照らされた表面水柱中のFe（II）に富む湧昇システムで、現代の地球では使用できません。したがって、含鉄湧昇ゾーンをシミュレートし、また、シアノバクテリアとphotoferrotrophsの成長をサポートすることができる実験室のシステムが必要とされています。微生物プロセスと理解を促進し、完全に古代の地球上の独特の生物地球化学的プロセスを理解するために、岩のレコードから得られた情報を補完することができる先カンブリア時代海水を表し湧昇水性媒体との相互作用の理解と識別。 そのために、実験室規模の列はその中のFe（II）に富む海水培地（中性pH）はカラムの底部に注入した設計された、と上から送り出さ。照明は上位3 cm単位でシアノバクテリアの成長を支え4センチメートルワイド」透光層」を作成するために、頂部に設けられました。自然環境は、一般的に塩分濃度や温度などの物理化学的勾配、によって層別化及び安定化されています。実験室規模での水カラムを安定化させるために、カラムシリンダが実験中に発生地球化学的パターンの確立を維持するのに役立った多孔質ガラスビーズマトリックスを充填しました。連続的なN 2 / CO 2ガス流はGOE 15の前に海の反射無酸素雰囲気を維持するために、カラムのヘッドスペースをフラッシュするために適用しました。鉄の一定のフラックス（II）が成立した後、シアノバクテリアは、列全体に接種し、そしてそのgrowtましたHは、サンプリングポートを介して除去したサンプルの細胞計数によってモニターしました。酸素は、列シリンダの内壁に酸素感受性オプトード箔を配置することによって、 その場でモニターし、測定は、カラムの外部からの光ファイバを用いて行きました。水性鉄スペシエーションは、深さ分解水平サンプリングポートからサンプルを除去することによって定量し、フェロジン法で分析しました。大気から分離して維持され、古代の水柱の実験室規模のアナログは、達成可能であること - 非生物対照実験と結果は概念実証を示しています。シアノバクテリアが成長し、酸素を生じ、およびFe（II）と酸素との反応を解決しました。海洋シアノバクテリアシネココッカス属を接種しながらここで、設計、準備、組み立て、実行、およびそのような列のサンプリングのための方法論は、カラムの84時間の実行から結果とともに、提示されています。 PCC 7002。
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Protocol
培養培地の調製
注：培地の調製のために必要な機器、化学品および消耗品に関する情報が表に記載されている1括弧内のイタリック英数字コードは、表2に箇条書きと図1に示す装置を参照してください。
- Wu らのプロトコルに従って（「媒体」と呼ぶ）海洋光合成細菌（MP）培地5 Lを準備します。16。無酸素と滅菌1 M HClまたは0.5 MのNaCO 3を使用してpHを6.8に調整します。鉄（II）の供給源としては、次のステップで培地溶液を濾過した後、500μMの最終的な鉄（II）濃度を達成するために1 M無酸素および無菌のFeCl 2 -溶液の3.5ミリリットルを追加します。
- 鉄（II）、炭酸およびリン酸塩鉱物を沈殿させるために48時間5℃の媒体液を保管してください。 pHの鉄（II）が加算とFe鉱物沈殿結果変更は、したがって、戻ってpHを6.8に再調整します。 0.22μmのフィルターユニットを通して無酸素（100％N 2）グローブボックス内の培地をフィルタリングします。無菌のブチルゴム栓で濾過グローブボックス内部の滅菌5Lのガラス瓶（E.'1）への培地、およびキャップを分注します。
- ストッパーへのガスライン、およびベントとして作用する第二の針に接続された1つの使い捨て針を挿入することにより、N 2 / CO 2（V / V、90/10）で培地ボトルの上部空間をフラッシュします。ヘッドスペースの容積を10回変更することを確認します。例えば、10ミリリットル/秒の一定のガス流と、（フンゲート＆メイシー17を比較）は、少なくとも50秒間、50ミリリットルのヘッドスペース量をフラッシュします。
- 今のFe（II）の光酸化を防止するために、暗条件下で室温でアルミホイルや店舗で使用する準備ができて中瓶（E）をカバー。培地調製のための3日間を許可します。
文化の調製
">注意：カラム実験で使用されているシネココッカス属の文化PCC 7002は、単細胞の海洋光合成従属栄養性シアノバクテリア属18として記載されているそれは博士M.アイゼン（植物生化学、デュッセルドルフ、ドイツの大学研究所）によって提供されました。 。現在の研究のためにストック培養物は、追加のFe（II）せずに無酸素MP培地上で増殖させました。- 6ミリグラム/ mlで1ミリリットル/ Lクエン酸第二鉄アンモニウムとWuら 16が、代替塩化第二鉄のプロトコルに従って、100ミリリットルMP培地を準備します。
- 無酸素条件下で（グローブボックス、100％N 2）は 、無菌のブチルゴム栓で1 120ミリリットルの滅菌血清ボトル、キャップに培地を分配し、アルミキャップで圧着します。 N 2 / CO 2にヘッドスペースを変更します（V / V、90/10）（フンゲート＆メイシー17を比較）し、ストック培養物の5％で接種します。その後酒樽から25℃、600ルクスの光インキュベーターに文化を保存gsten電球。
- シネココッカス属以来。 PCC 7002は、光インキュベータ内の最初の24時間の薄い紙タオルで血清ボトルをカバーし、転送以下、感光性です。文化は6-8日間増殖することを可能にします。光合成活性は培地とFeに適応した細胞中のFe（II）を維持するために、7日後の文化を転送するため、細胞増殖のタイムスケールの静的ではありません鉄（II）とFe（II）の酸化をもたらすであろう（II）。
- 光学密度（OD）測定のためのサンプルを取ることによって細胞密度監視：培養物の細胞密度（細胞/ mlが）750nmの19の波長で光分光器で細胞懸濁液の試料の吸光度によって決定することができます。対数期のOD 750と文化の直接顕微鏡細胞数との間に直線関係が絶対的な細胞密度20を決定します。
- すぐに10 8細胞/ mlの細胞密度に到達するように、光合成による酸素産生を停止するためにアルミホイルで血清ボトルを包みます。
- 液体培地に挿入長い（100ミリメートル）の使い捨て針に取り付けられた0.22μmの滅菌シリンジフィルターを用いて、細胞懸濁液中のO 2を削除します。ヘッドスペースとバブル5分間/ CO 2、N 2（フンゲート＆メイシー17を比較）と文化をフラッシュします。列に接種するまで暗所でサンプルを保管してください。
実験のセットアップのための項目および個別部品の調製
注意：実験のセットアップに必要な機器についての情報を、数量や仕様を表2に記載されています。 実験のセットアップに使用されるアイテムの一部が予め用意されており、個別に、表2に記載されている単一の大文字（AG）で標識されており、 図1のようにクローズアップを示しますインチ斜体英数字コードは、表2に箇条書き機器を参照し、 図1に示されています。
- 列にサンプリングポート（D）を製造するためには、タイトフィットブチルゴム栓（A.3）でポートを閉じます。ブチルゴム栓に1ステンレス鋼針（D. '）を挿入します。針の先端は、列の中央にあることを確認します。
- ゴムチューブ（D.2）に針を接続し、熱収縮チューブ（D.3）との接続をシール。 小さ なルアーロックチューブコネクタにチューブのもう一方の端を取り付けます（ 'D.5）、熱収縮チューブ（D.3）との接続をシールし、適切なプラスチックキャップ（D.6）とチューブコネクタをカバー。
注：サンプリングポートの所望の数に依存して、様々なサンプリングポートと一つのメインポートを提供することが必要である - therefoブチルゴム栓に斜めの角度でステンレス鋼針（D.1）を挿入し 、再。
- ゴムチューブ（D.2）に針を接続し、熱収縮チューブ（D.3）との接続をシール。 小さ なルアーロックチューブコネクタにチューブのもう一方の端を取り付けます（ 'D.5）、熱収縮チューブ（D.3）との接続をシールし、適切なプラスチックキャップ（D.6）とチューブコネクタをカバー。
- 次の手順に従って、ブチルゴム栓を変更し、カラムに培地および放電ボトルを接続するために：
- ブチルゴム栓（E.2）に、2つのステンレス鋼毛細管（E.4 E.3）を挿入します。これらの毛細血管への適切なゴムチューブ（E.6）を接続し、熱収縮チューブ（E.5）との接続をシール。
- 長いキャピラリー（E.3）のチューブの他端にチューブコネクタ（E.7）を追加し、また、熱収縮チューブ（E.5）でこのコネクタを固定してください。
- 、短いキャピラリー（E.4）に接続されている他の管の自由端にステンレス鋼針（E.11）を接続熱収縮チューブ（E.5）との接続をシールし、のもう一方の端を差し込みより小さいブチルゴム栓にステンレス鋼針（E.10）。 大ブチルゴム栓（G.2）に2つのステンレス鋼毛細管（G.3）を挿入し、適切なゴムチューブ（G.4; G.5）を添付。媒体排出ボトルキャピラリー（W2）に短いゴム管（G.4）の自由端を接続します。小さ なチューブコネクタ（G.6）で長いチューブ（G.5）の自由端を装備。第2の放電ボトルのための別のブチルゴム栓を準備するためにこれらのステップを繰り返します。
- 列の2つのメディア供給ラインを生成するためにブチルゴム栓（F.2）に2つのステンレス鋼針（F.3）を挿入することにより、媒体分配パネル（F）のためのストッパを準備します。それぞれ、各針にゴム管（F.4）を取り付け、ゴムチューブのいずれかに1メジウムビンキャピラリー（C1）を接続します。
- 媒体供給ラインの腺（B）を調製するために、 1メディアを接続しますゴムチューブ（B.4）と小さなチューブコネクタ（B.3）への供給毛細管（C2）。別の媒体供給腺のために、この手順を繰り返します。
- 媒体排出ラインのための腺を準備する代わりに、より長い媒体排出キャピラリ（W1）を使用し、上記の手順を実行します（ 図1中）（Bを比較）。
注：入口ラベルを付け、適切なアセンブリを支援するために、テープの異なる色でコンセントに便利です。
- 媒体排出ラインのための腺を準備する代わりに、より長い媒体排出キャピラリ（W1）を使用し、上記の手順を実行します（ 図1中）（Bを比較）。
- ゴムチューブ（C.1）にステンレス製の針（C.2）をロックして、針の先端が他の外の4センチメートルに達していることを確認してください2長いルアーを挿入することにより、ヘッドスペースガス交換パネル（C）用の部品を組み立てチューブの端。ポリマー接着剤（C. 8）でチューブを記入し、少なくとも6時間の組立乾燥させます。
- 緩く綿（C.4）を持つ2つのルアーロックのガラスシリンジ（C.3）を記入してください。
- 別に2ブチル摩擦を準備BERストッパー（C.5）、ステンレス鋼針（C.7）が挿入されたステンレス鋼針を有するもの（C.6）およびその他。まだ、ガラスシリンジに接続しないでください。
- 培地ボトルやガスパック（GP）に沿って、後で使用するために綿（E.9）を充填したガラスシリンジ（E.8）を準備します。
- ガスパックのバルブの上にゴムチューブ（gp.1）を接続することにより、10 Lガスパック（GP）のための機器を組み立てます。ゴムチューブの自由端にチューブコネクタ（gp.2）を挿入します。第10 Lガスパックについて、この手順を繰り返します。
柱と機器の4滅菌
注：材料特性に応じて、装置は、次の3つの方法のいずれかにより滅菌されます。
- 乾燥オーブン（4.25時間、180℃）でガラス製の器具を滅菌します。
- メディアを作成するための機器を滅菌する（参照
- 第二のステップで設定した列のための機器を滅菌します。アルミホイルでとそれに対応するブチルゴム栓が削除されていることを確認してください-ガラスシリンジ（ セクション3で調製し F.1; E.8 C.3）をラップします。
- ガラスビーカーにガラスビーズ（A.2）を配置し、アルミホイルでトップをカバーしています。また、アルミホイルで4×大きなチューブコネクタ（B.2）と3ウェイコネクタ（G.7）、透明なガラス板（A.4）をカバーし、すべてのものをオーブンで滅菌します。
- メディアを作成するための機器を滅菌する（参照
- オートクレーブ（120°C、10バール、20分）によりオートクレーブ可能なプラスチックや液体を殺菌：
- 最初のステップ、STEでNaHCO 3 -buffer溶液と5Lのガラス瓶2ブチルゴム栓、媒体とWiddelフラスコをrilize。
注：ブチルゴム栓が最初に超純水で3回煮沸することにより調製し、次いでアルミホイルで覆い、水のビットを有するガラスビーカーにオートクレーブ処理されます。湿ったストッパーは、ガラス瓶に挿入するのが容易です。 - 第二のステップで設定した実験の列のための機器を滅菌します。上部開口部を包む、オートクレーブ内で滅菌するためのカラムを作製するために、媒体供給口、メディア排出口、及びヘッドスペースはオートクレーブ前アルミ箔でベント。
- 適切なプラスチックキャップ（D.'6）でサンプリングポート（D.'5）をカバーし、オートクレーブの前にクランプ（D.4）を取り外してください。
- E.2（ブチルゴム栓と培地と放電ボトルに対応する毛細血管を包み、2×G.2 -準備In個のセクション3）、ガラスシリンジ用の小さいストッパー（X C.5 2; E.'10 '; F.'2 - セクション3で調製した）と媒体供給及び排出腺に接続された毛細血管（S2; W1 -アルミホイルにセクション3.4）で調製し、オートクレーブ内のすべての機器を滅菌します。
- 滅菌後、さらに4時間60℃のオーブン中で滅菌カラムおよび装置を乾燥させます。
- 最初のステップ、STEでNaHCO 3 -buffer溶液と5Lのガラス瓶2ブチルゴム栓、媒体とWiddelフラスコをrilize。
- ポンプチューブ（PT）は、オートクレーブではないので、エタノール（EtOH）中溶液（80％エタノール、20％水）でそれらを滅菌します。エタノール溶液を用いて適切なビーカーを記入し、その中にポンプチューブを配置し、チューブが完全にエタノール溶液で満たされていることを保証します。 3時間後に取り出し、予め滅菌アルミ箔（オーブン滅菌）に直接ラップし、室温で2時間乾燥させてください。
柱と機器の5組立
- 平らな表面上でのカラム（A）を配置し、実験室スタンドとクランプで安定化させます。無菌条件下で動作することを確認します（ 例えば 、ブンゼンバーナーの40センチメートル内または層流フードの下）。慎重に上部開口部からアルミホイルを除去し、滅菌ガラスビーズ（A.2）に記入。
- それは列と接触する領域に内面にポリマー接着剤（A.5）を適用することによって密閉する ために列を時計皿（A.4）を準備します。軽くしっかりと一緒に両方の部品を接着するために、列の上部に代わりに時計皿を押してください。インストールが乾燥するために少なくとも6時間を許可します。
注：容易に実験後時計皿を除去するために、カラムの縁と時計皿の間に無菌の、微細な柔軟なワイヤを配置することが可能です。
- それは列と接触する領域に内面にポリマー接着剤（A.5）を適用することによって密閉する ために列を時計皿（A.4）を準備します。軽くしっかりと一緒に両方の部品を接着するために、列の上部に代わりに時計皿を押してください。インストールが乾燥するために少なくとも6時間を許可します。
- 無菌条件下での作業中の列に次の部品を取り付けます：
- ゴムチューブ（B.1）と媒体供給及び排出ベントに対応するチューブコネクタ（B.2）を接続します （ 図1の（B）を比較）。
- 列に対応するコネクタに（ セクション3.4で調製した）媒体供給用の腺（B.3）のチューブコネクタを接続し、放電（ 図1の（B）を比較）。
- ヘッドスペースガス交換パネルを取り付けます（ 図1の（C）を比較- セクション3.5で調製した）ヘッドスペースには、列のベントと対応するステンレス製の針（C.2）とインサートにガラスシリンジ（C.3）を接続適切なブチルゴム栓（C.6; C.7 - セクション3.5.2で調製した）綿充填ガラス注射器に（C.3）。
- 放電ボトル用ブチルゴム栓を挿入し（2×G.20; - 2滅菌3リットルのガラスびん（G.1）にセクション3.2）で調製し、 そして、3ウェイコネクタ（G.7）にボトル（G.6）のチューブコネクタを接続します。
- ポンプチューブ（PT）と放電ボトルキャピラリー（W2）の自由端に媒体排出腺キャピラリー（W1）の自由端を接続します。第2の媒体排出腺キャピラリと第2の放電ボトルについて、この手順を繰り返します。
- ポンプチューブ（PT）と媒体供給腺キャピラリー（S2）の自由端に1メジウムビンキャピラリー（S1）の自由端を接続します。第2の媒体ボトル毛細管と第2の媒体供給腺キャピラリーについて、この手順を繰り返します。
- 媒体のガラスシリンジに-対応する毛細血管（ セクション3.3で調製したF.2）でストッパーを挿入することにより培地配電盤を組み立てます配電盤（F.1）。
- 培地ボトル用のブチルゴム栓のコネクタにメディア配信パネルを接続します（E.7 - 図1にFを比較）。
- ステンレス製の針をロックルアーにヘッドスペースガス交換パネルにN 2 / CO 2ガスラインを接続します（ 図1中の位置（LLF）を参照）、および低圧力でN 2 / CO 2を用いたカラムのインストールおよびキャピラリーシステムをフラッシュ（<10ミリバール）。メジウムビンキャピラリー（E.3）、3ウェイコネクタ（G. 7）、およびサンプリングポート（D.5）の開放端部でガスの流出を維持します。したがって、流出ガスの過圧を通って無菌状態を維持するために、わずかに開いたサンプリングポート（D.6）のキャップを持っていることを確認してください。
- 少なくとも20分間、完全なインストールをフラッシュします。
注：また、outgassiを閉鎖することが可能です適切なゴムチューブと完全なインストールをフラッシュの効率性を高めるために、クランプとヘッドスペースガス交換パネルのngの針（C.6）。
- 少なくとも20分間、完全なインストールをフラッシュします。
- 一方、N 2 / CO 2（V / V、90/10）で10 Lガスバッグ（GP）を満たす、（真空ポンプを使用して）充填し、脱気を10回以下のバッグを確実にするボリューム全体が完全に無酸素であります。最終充填後ガスパックのバルブを閉じていることを確認します。第二のガスパックで、この手順を繰り返しますが、脱気した後、バルブを閉じて（ すなわち 、空のままにします）。
注：N 2 / CO 2ガス充填パックは、ポンプで起因メディア損失に増加ヘッドスペース量を補償するために培地ボトルに接続されます。 N 2 / CO 2はフラッシュが、空のガスパックは、後にガスが原因で液体の吐出量を増加させることにヘッドスペースをエスケープすることを可能にするために、放電ボトルに接続されます。 - 挿入トンコットン（ - セクション3.6で調製したE. 8）を充填した滅菌ガラスシリンジに-彼は（ セクション3.2.3で製造しE.10）ゴム栓ブチル。
- 、次の培地ボトル（E.2）のストッパーに実験台に- （ セクション1で調製E）充填して閉じた培地ボトルを置きます そして、次の手順を使用して、培地ボトルに栓を接続するための準備：
- ホースクランプに対応するゴムチューブ（E.5）を閉じることによって、キャピラリー（E.3）にN 2 / CO 2ガスの流れを閉じます。
- 軽く培地ボトルオフブチルゴム栓を持ち上げて、ボトルネックに曲がって、長い金属針（1ミリメートル×140ミリメートル）で滅菌し、綿-filled注射器をぶら下げすることにより、N 2 / CO 2（50ミリバール）でヘッドスペースをフラッシュ培地瓶の（フンゲート＆メイシー17を比較）。
- 使い捨ての針に（以前にヘッドスペースをフラッシュするために使用される）注射器の長い金属針を変更します（0.9ミリメートル×45ミリメートル、広く利用可能）N 2 / COを含む培地ボトルの上部空間をフラッシュするために、ストッパーにし、注入2。
- 培地瓶の栓に接続-ガスシリンジ（ セクション5.10で組み立てE.8）の開放端にガスのわずかな流出を持っていることを確認してください。少なくとも4分間、培地瓶（E）のヘッドスペースとガラスシリンジ（E.8）をフラッシュ。
注意：必要に応じて、開きます針の開放端でのガスの流出を維持するために、再びヘッドスペースガス交換パネルのガス放出針（C.6）。
- 素早くガスパックのバルブを開き、軽く管とガスパックのコネクタをフラッシュするために、/ CO 2、N 2の流出を維持するために、袋に押してください。
- すぐに過度の圧力が培地瓶から解放されると、すぐにガラスシリンジ（E.8）の対応するコネクタにガスパック（gp.3）のコネクタを接続します。
- ガスパック（GP）のバルブを開き、放電ボトルは流出媒体でいっぱいにしながら、空気がガスパック中に放出されるように、放電ボトル（G）に接続されています。
コラムへの細菌の6接種
注：非生物対照実験のために、このステップはスキップされます。
- 細胞培養は、直接カラムの側面に沿って主サンプリングポートのブチルゴム栓を通してカラムに注入されるので、塔本体の中心に到達するために十分な長さの針で6注射器を準備しているようにしてください。
- エタノール溶液（80％）を用いたカラム（A.3）で6つの主要なサンプリングポートのブチルゴム栓の外側を滅菌します。
- 接種の準備のための培養と血清ボトルを持っている（セクション2で調製）およびEtOH溶液を数滴を燃えることにより、ブチルゴム栓を滅菌します。培養物のアリコートを取る前に、無菌のN 2 / CO 2と注射器をフラッシュします。 O 1ミリリットルを取ります無酸素細胞溶液Fとメインサンプリングポート（A.3）のブチルゴム栓を通してカラムの中心にそれを注入します。
注：細菌の増殖に応じて、ポンピング速度を調整する（あるいはポンプを停止）する必要があるかもしれない細胞の成長と発展のためのラグフェーズの最初の日の間に洗い流されるの培養を防止します。
7 。サンプリング
注：カラム内部開発化学勾配を横切ってサンプルを収集するためには、ボリュームの損失が発生するように、より深いポートの前上部サンプリングポートからのサンプリングを開始することが必要です。 （ブンゼンバーナー40 cm以内、または層流フードの下で働くことによって、例えば ）無菌状態を維持することを確認します。
- 最初のサンプルを接種後24時間を収集します。 SAへの酸素注入を回避するために、2 / CO 2滅菌Nでサンプリングするために使用されるシリンジをフラッシュmplingポート（D）。サンプリングの前に/ CO 2、N 2と注射器を記入してください。
- 迅速にプラスチックキャップ（D.6）を除去し、チューブコネクタ（D.5）にサンプリングシリンジを挿入します。シリンジとチューブコネクタとの間に小さな隙間を維持します。シリンジからガスを放出し、N 2 / CO 2でチューブコネクタをフラッシュします。
- しっかりとチューブコネクタに注射器を接続します。クランプ（D.4）を取り外し、約1ミリリットルのサンプルを取り始めます。
- サンプルを描画した後、シリンジを取り外す前に、クランプ（D.4）を添付。そして、サンプリングシリンジを取り外し、しっかりと対応するプラスチックキャップ（D.6）とチューブコネクタ（D.5）を閉じます。
- すぐにすべてのポートからのサンプリングのためのステップ7.1から7.3を繰り返します。
- サンプルの次のセットごとに24時間を収集します。
注：異なる時間ステップで追加のサンプルについては、小さなAMを除去する必要があります試料のount（ 例えば 、0.2〜0.4 ml）を、最初にサンプルの前には、サンプリングチューブ内の残留培地を除去し、カラム内から代表的なサンプルを得るために、取ることができます。
分析の8.方法
- 酸素定量化：
注：フロースルー媒体と列のヘッドスペース内の酸素濃度を非侵襲的に定量し、非破壊光学酸素センサと0.5×0.5 cmの（いわゆるオプトード）の酸素感受性蛍光箔のパッチを使用して、に沿って接着シリコン接着剤（A.6）を用いたカラムの内側のガラス壁。これは、酸素感受性箔パッチは信頼できる測定値を得るために鉄種に鈍感であることを確認しました。- 列で使用されているオプトードのための適切な較正パラメータを用いてコンピュータ・ソフトウェアを校正することを確認します。光学式酸素センサーは、特定のセイが付属して対応するPC制御光ファイバー酸素計を用いて測定するイオン。
- 測定を開始し、カラムの透明なガラスの壁の内側に接着されている酸素感受性箔に対して直角に酸素計のポリマー光ファイバを保持するように注意してください。
- 列全体で一つ一つのO 2測定点の測定を繰り返します。
- 鉄（II）、水性サンプルの全Fe分析：
- 鉄（II）が急速に中性pHで空気中の酸素によって酸化されるので、1 M HCl溶液で直ちに水のFe（II）の定量のために液体試料を安定化させます。 1の最終試料体積についてミリリットル0.5ミリリットルの2M HClで0.5ミリリットルの液体試料を混ぜます。
- 30分間（1 M HCl中の10％重量/体積）ヒドロキシルアミン塩酸塩と1 M HClを安定化試料のアリコートをインキュベートした後、全Feを定量化します。この試薬は、次いで、フェロジンのアッセイによって定量することができるのFe（II）へのすべてのFe（III）を減少させます
- マイクロタイタープレートリーダーを用いてフェロジンアッセイを行います。 562ナノメートルの波長で吸光度を測定します。検出可能な鉄（II）と全Fe濃度についての範囲内で基準を持っていることを確認してください。
注：液体試料中のFe濃度が標準較正を超える場合は、1 M HClで安定化されたサンプルを希釈することが必要です。- 全FeとFe（II）との差でのFe（III）の濃度を計算します。
- マイクロタイタープレートリーダーを用いてフェロジンアッセイを行います。 562ナノメートルの波長で吸光度を測定します。検出可能な鉄（II）と全Fe濃度についての範囲内で基準を持っていることを確認してください。
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Representative Results
対照実験
非生物的対照実験（10日）は一貫して低い酸素濃度を示した（O 2 <-profile湧昇水柱全体でのFe（II）に有意な変動には0.15mg / L）。 10日間の媒体貯蔵および440μMまで500μMから全体的な鉄（II）濃度がわずかに減少中の析出物の形成（おそらく鉄（III）（oxyhydr-）酸化物）は、ゴム製の接続を介して、いくつかの酸素の拡散を示しています22;（ 例えば 、E.6 図 1のgp.1）この実験のために、合理的に達成した最低酸素濃度が≤0.15mg / Lであったと敏感な酸素定量化のためにとの検出限界より上の範囲です。 0.03 mg / Lで。 0.15 mg / Lで以下の酸素値は、rのためのものですこの論文のemainderは「無酸素」と呼ばれます。
生物実験
可視パラメータ、細胞増殖、及び水柱の変化
前0日目に接種しない析出物が（ 図 2 A）見えませんでした。これは、列が正しく設定したことを示したと（ 図 3 Aを比較）鉄（II）の酸化とFeの形成（III）沈殿物になりかねない、それに酸素が 存在しないこと。それは、図4（a）のプロファイルに示されている結果として、鉄（II）濃度が湧昇水柱全体で一定であった。 図 2 のAは光勾配が内上位6センチ狭くなったことを示しています列シリンダ内のガラスビーズマトリックスを用いて、水柱。
接種後の水柱84時間のトップ2.0センチメートル内の緑の色は、シアノバクテリア（ 図 2 B）の成長を示しています。 （ 図 2 のBの矢印で強調）-3センチの深さに顕著な明るいオレンジ色の帯 緑の帯の下にシアノバクテリアによって生成分子酸素によって鉄（II）酸化中に形成されたFe-沈殿物、によるものです。同様の沈殿物はまた、水柱の表面上に見えました。シアノバクテリアによってO 2の産生を示す接種（ 図 2 B）後84時間水柱の表面に形成された淡橙色発泡体。おそらくでガス抜きされた酸素に形成された水柱の表面に析出物表面。残余のFe（II）は、最終的に表面に酸化し、ガラスビーズマトリックスに析出物を形成しました。
酸素勾配
0日目に接種する前に、液体培地中の初期の O 2濃度を測定した。 図 3Aを明らかに全体の水柱全体にO 2濃度は一貫して対照実験中の濃度の存在下にあったことを示しています。接種前のO 2 -concentrationは0.13ミリグラム/ LO 2（O 2、平均 = 0.099±0.002 mg / Lで）の値を超えることはなかったです。これは、カラムは、接種前に無酸素であったことを示します。
図 3 のBは 、O 2濃度の増加を示していますシアノバクテリアの接種後84時間。これは、目に見える緑のバイオマス（ 図 2 B）と一緒に光合成生産とカラム内のO 2の蓄積と一致しています。 84時間後のO 2濃度が水柱の表面の下-0.5センチの深さにO 2 = 29.87 mg / Lでの最大濃度を達成しました。 図 3 のBでO 2値は、O 2レベルは水柱（O 2> 0.15 mg / Lで）内の上位8.5センチメートルにバックグラウンド濃度の上に常にあったことを示しています。著しく高いO 2濃度（> 0.50 mg / Lでは）水柱表面下-0.5 -5.5センチメートルの深さから検出されました。 O 2の最安測定値と一緒に0.15 mgの-10.5センチメートル以下の深さで/ L、≤O 2のためのより低い濃度 = 0.09ミリグラム/ -20.5センチメートルの深さでLは、thesということを示していますE領域は無酸素でした。
鉄（II）の勾配
図 4 Aは = 282.6±6.8μMを意味する前にシアノバクテリアの接種を0日目のFe（II）濃度は、（II）のFeの平均濃度と水柱を通して一定であったことを示しています。 0日目に媒体貯蔵中の濃度は、Fe（II） 貯水池 = 320.4±11.6μMでした。
シアノバクテリアの接種後84時間のFe（II）濃度が水柱内で上位9センチメートルに大幅に減少した。 図 4 Bは、Fe（II）の濃度は、上面に減少する明確な鉄（II）の勾配を示し、水柱。しかし、鉄（II）の水柱の表面に依然として検出可能でした。目電子最低のFe（II）濃度検出は-0.9センチメートルの深さで直接液体培地表面の下にありました。鉄（II）の濃度は、Fe（II）からの深さとともに増加しました = Feに対する-0.9センチで9.9±2.8μM（II） = -8.9センチメートルの深さで258.6±3.1μM、深さ以上の鉄（II）は勾配急な正の線形を形成する（[鉄（II）D] =（D + 1.278）∙0.031 -1; D：深さ（cm） ; R 2 = 0.9694）上位6.8センチメートルに制限されています。以下-9 cm奥行き液体培地中の分野は著しく一定のままと0日目のFe（II）のためにそれらの初期値（T検定; P> 0.05）に比べて鉄（II）のためにそれらの濃度の有意な低下を示しません。
図 1。回路図の実験は、設定します。項目のための英数字コードは、表2に記載されている部品を指します。href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54251/54251fig1large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2。列の前にシリンダーとシアノバクテリアで接種後84時間を通して、ガラスビーズマトリックスで目に見える変化。ピンクの四角は酸素センサです。 （A）クローズ接種前に設定列内の上位6センチアップ。液体は、可視光の勾配を示すカラムを満たしました。ガラスビーズのマトリックスは、上位6 cmの可視光の勾配を狭めます。 閉じる接種後の上位6センチメートル84時間のアップ（B）。緑色の光強度が最も高い塔の頂部でより密な、目に見えるバイオマスを示しています。鉄の形成に起因するかすかに見えるオレンジ色のバンド、矢印のポイント（III）が原因でシアノバクテリアによって産生される分子O 2によって鉄（II）酸化に沈殿します。水柱の表面の上にかすかに見えるオレンジ色の泡は、Fe（III）もそこに沈殿されていることを示します。 O面を通る2アウトガスは、Fe（III）沈殿物の発泡が発生します。充填したカラムシリンダ（C）の概要。シアノバクテリアの目に見える成長は、深さの制限された光の在庫状況により上位4 CMに制限されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3. 酸素の前に水柱内のプロファイルと シアノバクテリアで接種後 84 時間。y軸上の深さゼロのCMは、水coluを示し、MN面。負の値は水柱内の深さを表すのに対し、深さのための正の値は、液体培地レベル上のヘッドスペースを参照してください。 x軸上のO 2濃度を対数目盛に注意してください。垂直の破線は無酸素状態（O 2≤0.15 mg / Lで）のためのしきい値を示しています。 接種前（A）酸素プロファイル[0H]。 O 2の値は常に0.13 mgの水柱を通して/ L未満でした。 （B）酸素プロファイル接種後84時間。 O 2は、水の塔の上方5.5センチメートルでは0.5mg / L以上でした。 O 2濃度が-8.5センチの深さ以上の領域におけるバックグラウンド濃度（≥0.15 mg / Lで、破線）よりも高かったです。より深い領域は0.15 mg / Lで≤O 2と無酸素であった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図 4. 鉄（II）水柱内のプロファイルの前および シアノバクテリアで接種後 84 時間注記：エラーバーはフェロジンアッセイにおける一つのサンプルの3回の測定から推定される技術的反復を表します。接種前（A）鉄（II）のプロフィール[0H]。 （II）のFeの値は、Feの平均値と水柱全体で一定であった（II） 平均 = 282.6±6.8μM。単一のサンプルのFe（II）の定量化からのFe（II）は、プロファイル結果の変化。サンプル三重上のFe（II）の定量化は、おそらくあまり変化をもたらすであろう。 （B）鉄（II）プロファイル接種後84時間。水柱内の上位6.8センチメートルで著しく低いのFe（II）濃度。 -8.9センチの深さ以下のFe（II）の値が高い鉄を表示します（II）大幅シアノバクテリアの接種前の初期のFe（II）値と異なるない濃度（T検定; P <0.05）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 装置 | 量 | アイテム説明 | 情報の詳細 | ||
| ブランド | 注文番号。 | 参考住所 | |||
| 1 | Widdelフラスコ（5L） | オークス | 110015 | labor-ochs.de | |
| 2 | ガラスびん（5 L） | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com | |
| 3 | ガラスピペット（5ミリリットル） | 51714 | labor-ochs.de | ||
| 1 | 0.22μmのSteritopフィルターユニット（0.22μmのポリエーテルスルホン膜） | ミリポア | X337.1 | carlroth.com | |
| 0.5メートル2 | アルミホイル | - | |||
| 用品 | - | N 2 -グローブボックス（100％N 2） | - | ||
| - | / CO 2、N 2 -ガス（90/10、v / v、50ミリバール） | - | |||
| 1 | 綿で満たされた無菌ルアーロックのガラスシリンジ、 | C681.1 | carlroth.com | ||
| 1 | ルアーロックステンレス鋼の針（150ミリメートル、1.0ミリメートルのID） | 201015 | labor-ochs.de | ||
| 化学品 | 4.8 L | MQ-水 | - | ||
| 5 L培地溶液について | 100グラム | NaClを | 433209 | sigmaaldrich.com | |
| 34グラム | 硫酸マグネシウム | 208094 | sigmaaldrich.com | ||
| 7.5グラム | CaCl 2 | C4901 | sigmaaldrich.com | ||
| 1.25グラム | NH 4 Clで | A9434 | sigmaaldrich.com | ||
| 0.34グラム | KH 2 PO 4 | P5655 | sigmaaldrich.com | ||
| 0.45グラム | KBrを | P3691 | sigmaaldrich.com | ||
| 3.3グラム | 塩化カリウム | P9541 | sigmaaldrich.com | ||
| 200ミリリットル | 無酸素のNa 2 HCO 3 -buffer溶液（22 mM）の | - | |||
| 15 mgの | セレン及びタングステン酸塩溶液（COMP。Wuら 、2014） | - | |||
| 5ミリリットル | Na 2 S 2 O 3水溶液（1 M） | - | |||
| 2.5ミリリットル | 海洋光合成細菌（MP）ビタミン溶液（COMP。Wuら 、2014） | - | |||
| 5ミリリットル | MP微量元素のolution（COMP。Wuら 、2014） | - | |||
| 参照 | |||||
| 呉、W.、Swanner、ED、ハオ、LK、Zeitvogel、F.、OBST、M.、パン、YX、＆Kappler、A.（2014）。含意先カンブリア時代の鉄（II）の酸化のための - 海洋酸素非発生型の光合成のFe（II）酸化剤Rhodovulumのiodosumの生理および細胞 - ミネラル相互作用のキャラクタリゼーション。 FEMS微生物生態学、88（3）、503から515まで。 | |||||
表 1 中の準備。機器リスト、培地の調製のための物資や化学物質。
| 数量。 | 参考文献。 | アイテム説明 | 情報の詳細 | ||||
| ために | 1 | （A） | ガラス円筒 | Y310.1 | carlroth.com | *カスタムガラス製造設備によって変更 | |
| 2グラム | （A.1） | グラスウール | 7377.2 | carlroth.com | |||
| 1.03 L | （A.2） | ガラスビーズ（0.55ø - 0.7ミリメートル） | 11079105 | biospec.com | |||
| 6 | （A.3） | ブチルゴム栓（1.2センチメートルø） | 271024 | labor-ochs.de | |||
| 1 | （A.4） | ペトリ皿、グラス（ø8.0センチメートル） | T939.1 | carlroth.com | |||
| 40ミリリットル | （A.5） | ポリマー接着剤 | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |||
| 11 | （A.6） | 光学酸素センサ箔（酸素分析のために、下記参照） | - 要求に応じて - | presens.de | |||
| ために | 4 | （B） | ミディアム腺 | ||||
| 4 | （B.1） | ゴム管（35ミリメートル、7ミリメートルのID） | 770350 | labor-ochs.de | |||
| 4 | （B.2） | ルアーロックチューブコネクタ（3.0ミリメートル、ルアーロックのオス= LLM） | P343.1 | carlroth.com | |||
| 4 | （B.3） | ルアーロックチューブコネクタ（3.0ミリメートル、ルアーロックメス= LLF） | P335.1 | carlroth.com | |||
| 4 | （B.4） | ゴム管（25ミリメートル、0.72ミリメートルのID） | 2600185 | newageindustries .COM | |||
| ために | 1 | （C） | ヘッドスペースガス交換パネル | ||||
| 1 | （C.1） | ゴム管（50ミリメートル、7ミリメートルのID） | 770350 | labor-ochs.de | |||
| 2 | （C.2） | ルアーロックステンレス鋼針（150ミリメートル、の1.0mm ID） | 201015 | labor-ochs.de | |||
| 2 | （C.3） | ルアーロックガラスシリンジ（10ml）で | C680.1 | carlroth.com | |||
| 2グラム | （C.4） | ルースコットン | - | ||||
| 2 | （C.5） | ブチルゴム栓（1.75センチメートルø） | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 1 | （C.6） | ステンレススチール針（40ミリメートル、1.0ミリメートルのID） | Sterican | 4665120 | bbraun.de | ||
| 1 | （C.7） | ルアーロックステンレス鋼針（150ミリメートル、1.5ミリメートルID） | 201520 | labor-ochs.de | |||
| （LLF） | 位置：ルアーロックメスコネクC.7のR部分 | ||||||
| 10ミリリットル | （C. 8） | ポリマー接着剤 | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |||
| ために | 1 | （D） | サンプリングポート | ||||
| 1 | （D.1） | ステンレススチール針（120ミリメートル、0.7ミリメートルのID） | Sterican | 4665643 | bbraun.de | ||
| 1 | （D.2） | ゴム管（40ミリメートル、0.74ミリメートルのID） | 2600185 | newageindustries .COM | |||
| 2 | （D.3） | 熱収縮チューブ（35ミリメートル、3ミリメートルのIDの縮小） | 62から541458 | conrad.de | |||
| 1 | （D.4） | チューブクランプ | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |||
| 1 | （D.5） | ルアーロックチューブコネクタ（1.0ミリメートル、LLF） | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | （D.6） | ルアーロックプラスチックキャップ（LLM） | CT69.1 | carlroth.com | |||
| ために | 1 | （E） | 中瓶 | ||||
| 1 | （E.1） | ガラスびん（5 L） | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com | ||
| 1 | （E.2） | ブチルゴム栓（GL45用） | 444704 | labor-ochs.de | |||
| 1 | （E.3） | ステンレス製のキャピラリー（300ミリメートル、0.74ミリメートルのID） | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 1 | （E.4） | ステンレス製のキャピラリー（50ミリメートル、0.74ミリメートルのID） | 56737 | sigmaaldrich.com | |||
| 4 | （E.5） | 収縮チューブ（35ミリメートルは、3ミリメートルIDが縮ん） | 62から541458 | conrad.de | |||
| 2 | （E.6） | ゴム管（100ミリメートル、0.74ミリメートルのID） | 2600185 | newageindustries .COM | |||
| 1 | （E.7） | ルアーロックチューブコネクタ（1.0ミリメートル、LLF） | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | （E.8） | ルアーロックガラスシリンジ（10ml）で | C680.1 | carlroth.com | |||
| 1グラム | （E.9） | ルースコットン | - | ||||
| 1 | （E.10） | ブチルゴム栓（1.75センチメートルø） | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 1 | （E.11） | ステンレススチール針（40ミリメートル、0.8ミリメートルのID） | Sterican | 4657519 | bbraun.de | ||
| ために | 1 | （F） | ミディアム配電盤 | ||||
| 1 | （F.1） | ルアーロックガラスシリンジ（5ml）中 | <TD>C679.1 | carlroth.com | |||
| 1 | （F.2） | ブチルゴム栓（1.75ミリメートルø） | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 2 | （F.3） | ステンレス鋼針（40ミリメートル、を0.8mm ID） | Sterican | 4657519 | bbraun.de | ||
| 2 | （F.4） | ゴム管（40ミリメートル、0.74ミリメートルのID） | 2600185 | newageindustries .COM | |||
| ために | 2 | （G） | 放電ボトル | ||||
| 2 | （G.1） | ガラスボトル（2 L） | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com | ||
| 2 | （G.2） ブチルゴム栓（GL45用） | 444704 | labor-ochs.de | ||||
| 4 | （G.3） | ステンレス製のキャピラリー（50ミリメートル、0.74ミリメートルのID） | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 2 | （G.4） | ゴムチューブ（30ミリメートルX 0.74ミリメートルID） | 2600185 | newageindustries .COM | |||
| 2 | （G.5） | ゴム管（100ミリメートルX 0.74ミリメートルID） | 2600185 | newageindustries .COM | |||
| 2 | （G.6） | ルアーロックチューブコネクタ（1.0ミリメートル、LLF） | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | （G.7） | ルアーロック3ウェイコネクタ（LLF、2倍LLM） | <TD>6134 | cadenceinc.com | |||
| 追加装備 | |||||||
| 1 | （L） | 光源 | サムスン | SI-P8V151DB1US | samsung.com | ||
| 1 | （P） | 蠕動ポンプ | Ismatec | EW-78017から35 | coleparmer.com | ||
| 4 | （PT） | ポンピングチューブ（0.89ミリメートルID） | EW-97628から26 | coleparmer.com | |||
| 4 | （S1 / 2） | ステンレス製のキャピラリー（200ミリメートル、0.74ミリメートルのID） | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 4 | （W3 / 4） | スタイnless鋼毛細管（400ミリメートル、0.74ミリメートルのID） | 56737 | sigmaaldrich.com | |||
| 2 | （GP） | Supel-不活性フォイル（テドラー - PFC）ガスパック（10 L） | 30240-U | sigmaaldrich.com | |||
| とともに | 2 | （gp.1） | ゴムチューブ（30ミリメートル、6ミリメートルのID） | 770300 | labor-ochs.de | ||
| 1 | （gp.2） | ルアーロックチューブコネクタ（3.0ミリメートル、LLM） | P343.1 | carlroth.com | |||
| 1 | （gp.3） | ルアーロックチューブコネクタ（3.0ミリメートル、LLF） | P335.1 | carlroth.com | |||
| 用品 | 2 | - | / CO 2、N 2 -ガスライン（90/10、v / v、50ミリバール） | - | |||
| 2 | - | ガスタイトシリンジ（20ml）で | C681.1 | carlroth.com | |||
| 1 | - | ブンゼンバーナー | - | ||||
| 1 | - | 酸素定量化のための光ファイバ酸素計 | Presens | TR-FB-10-01 | presens.de | ||
| 1 | - | 真空ポンプ | - | ||||
| 1 | - | 酸素オプトード用シリコーン接着剤 | Presens | PS1 | presens.de | ||
| - ：（ - ）されている一般的に利用可能とされないなどのアイテムはダッシュでマークpecificアイテム | |||||||
表 2 列のセットアップ。数量、英数字の参照番号および実験セットアップのための機器の項目の記述。
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Discussion
先カンブリア時代海洋における微生物群集はによって規制、またはそれらの活性の結果と支配的な地球化学的条件のように変更されました。 BIFの起源を解釈する際に、研究者は、一般的に堆積学またはBIFの地球化学、 例えば 、Smithら 23およびJohnsonら 24に基づいて、微生物の存在または活性を推測します。古代の環境への地球化学的類似体を持っている現代の環境では、現代の生物の研究でも、貴重なアプローチ、 例えば、クロウら 11とKoeksoy らである。14。第三のアプローチは、先カンブリア紀の海で行われているプロセスをシミュレーション工学研究室のシステム、 例えば、Krepski らに生物を利用している。25。このタイプのアプローチは、特定の仮説を検証し、現代のシステムに存在する可能性のある化学的または生物学的要因を除去するのに有用であるが、ありませんでした先カンブリア紀の海（ 例えば、水生植物や動物）の一部。したがって、我々は、（シアノ）細菌や地球化学的プロファイルを得られた上で、その影響力の活性が制御された実験室条件の下で評価することができる動的な、実験室の湧昇システムのための概念実証の方法を提示します。我々の列は、生物およびBIFの堆積に寄与プロセス、BIFに保持biosignaturesについての仮説をテストするために使用することができます。
アセンブリが分かり、容易に導通可能となるように、我々は、列の設定のためのプロトコルを最適化しました。しかしプロトコルにおけるいくつかの手順は慎重に対処し、理想的に支援する人の助けを借りて実施する必要があります。具体的には、カラムシリンダに培地ボトルの接続は、酸素と媒質液の汚染を回避するために迅速に行う必要があります。非滅菌装置の使用または非滅菌実験室条件の下での作業は、私をもたらすであろう実験と信頼できない結果の汚染をn個。そのため、機器を殺菌し、実験を設定し、サンプルを収集しながら、（ブンゼンバーナーの隣の層流フードまたは40 cm単位での作業）無菌状態を維持するために絶対に必要です。また、カラム材料のいくつかの物理化学的パラメータは、カラム実験で長時間セットアップオーバー化学変化を引き起こしました。ゴム管で作られている部品が大幅媒体貯蔵瓶に影響を与え、媒体液中のFe（II）の酸化および鉱物沈殿につながるするのに十分な高さに酸素のための拡散係数を持っているようです。 10日間の非生物実験中による降水量に> 10％のFe（II）の非生物消費量は（比較： 代表的な結果を ）将来の長期的な実験のために考慮する必要があります。現在の研究で使用した光源は、上位6 cm以内沈降光のグラデーションを作成しました列の。光スペクトルはシネココッカスでクロロフィルa、bの光合成アクティブ波長をカバーし、成長と光合成活動を可能にしました。 、光の質と量の両方が非常に光合成細菌11,13に影響を与えることができるので、実際には、光源は、光合成生物に関する最も重要なパラメータの一つです。また、先カンブリア紀の間に高いUV放射を考慮した波長とスペクトル範囲の変動は、さらに光依存生物地球化学的反応への洞察を可能にすることができます。光インキュベーション実験の間、我々は、サンプリングポートを介して、およびカラムの底部で発光、光が列のガラス壁を通して行われたことに気づきました。将来の実験のために、列の一番上にあるガラスは、光非導電性ガラス製品に置き換える必要があります。内の光の勾配を測定するのは容易かつ安価な方法がなかったように、光の勾配は、モックセットアップで測定する必要があります。カラムシステムが利用可能に閉鎖しました。我々は、細胞やミネラルによる光の吸収による光の最大侵入深さの経時有意な変化を前提としています。実験中に、その場の光の勾配を測定することは将来の実験のために対象としています。ガラスビーズマトリックスと外からの散乱光の定量化における光散乱ビーズの使用は、時間をかけて一定の深さでの相対的な光の可用性を定量化する可能性があるかもしれません。更なる改善が糊付けされている必要はありませんカバーを含むことになるが、簡単に取り付け、フランジと取り囲むクランプで除去することができました。 4点媒体供給及び排出口は、カラム内のより均一な流れ場をもたらします。液体試料のための主要なサンプリングポートの狭い位置決めは列内の生物学的及び地球化学的勾配のサンプルのより高い解像度をもたらします。
それにもかかわらず、最初の結果は、垂直フロースルーカラムを湧昇システム中の微生物プロセスおよび地球化学的変化を調査するための適切な実験設定とみなすことができるD。我々は、この列は、システムの全体的な機能性を証明するために、プロトタイプとして役立つと主張しています。シアノバクテリアは、Fe（II）に富む湧昇システム20に存在している場合さらに、我々の結果は、酸素とFe（II）の結果との間にchemoclineこと堆積岩地球化学から広く支持された仮定、モデル化の結果、および推論を検証します。接種前に無酸素状態は、シアノバクテリアまたは酸素発生型光合成が可能な生物によるコロニー形成の前に先カンブリア紀の海を反映しています。表層水中の酸素の上昇に伴って、湧昇流のFe（II）が酸化されたFe（III）のようなchemoclineやミネラル形成のBIF 26【選択設立の堆積中に発生したなどのミネラルは、地球化学を推定するために評価することができるように沈殿するようになります大規模環境へのプロセス秒。しかし、自然（古代）環境に評価結果をアップスケーリングするために、追加的な物理過程を考慮する必要があります。移流横方向の輸送は、例えば、表層水中の風による乱流と同じchemoclineの確立を、乱す可能性があります。
鉄（II）、全Feの測定、および非侵襲性のO 2の定量のための水柱から液体試料の抽出は、簡単、迅速、かつ信頼性の高い方法でこれらの化学種との反応フロントの進化を追跡することができました。非生物対照実験で設定した列から採取した試料中の低鉄（III）濃度は明らかにいくつかの酸化がメディアボトルに発生しているが、列自体が外部O 2流入に密閉されたことを示しています。さらに、これらの結果は、我々のサンプリングプロトコルは、Fe（II）の定量化のために無酸素のサンプルを維持していることを示しています。 pHの変化は、列experimen中に記録されませんでしたトンとFe-分化に支配的な影響を与える可能性があります。しかし、現在のフロースルーシステムは、ヘッドスペース中の無酸素N 2 / CO 2の雰囲気と平衡状態にあり、少なくとも84時間、外接-中性pHを維持することを可能にする22 mMの炭酸水素ナトリウムによって緩衝させました。それにもかかわらず、pH値のその場定量化は、完全に潜在的な長期の実験および（古代）外洋システムへの外挿で地球化学的プロセスを理解するための重要なパラメータです。列シリンダ内確立地球化学的勾配を安定化するために使用されるガラスビーズのマトリックスは、水柱の表面下でのFe-沈殿物の蓄積をもたらしました。私たちは、蓄積された沈殿物は私たちの84時間の実験に支配的な影響を持っていないと仮定しました。しかし、劣化バイオマスは、FeサイクリングにつながるのFe-析出物上の酸化還元プロセスを誘発する可能性があります。これは、潜在的な長期的（<84時間）の実験について検討する必要があります。実際には、光誘導されたFe-酸化還元サイクルと第一鉄プールへのFeのリリースでは、複製、長期（21日）の実験（呉、W.、Maisch、M.、Kappler、A.、パン、Yに観察し、定量化することができました、＆Swanner、ED光化学鉄（III）の減少は、始生代酸素オアシスでのFe（II）を安定化。 地質。（準備インチ））。
将来の列実験は、培地組成物中に種々の微生物および変形の両方を組み込むことになります。これは、先カンブリア紀の海の変換中にさまざまな段階を代表する多様な環境条件のシミュレーションを可能にします。例えば、シリカは、先カンブリア海水27中に存在して0.67〜2.2ミリモルの濃度をシミュレートするために培地に添加することができます。さらに、媒体液中の硫酸の濃度は、先カンブリア紀海水の組成の変化に対処するために変更することができました。培養培地のバリエーションは、おそらくPに影響を与えますhysiologyと現在の列の設定は、私たちはその場で調査することを可能にする水柱19における地球化学的パターン上の微生物の影響。それに加えて、予想される実験は、このような光合成のFe（II）-oxidizing細菌（ 例えば、Kappler ら ）28、微好気性のFe（II）-oxidizing細菌（ 例えば 、Krepski ら ）29などのより複雑な微生物群集を含むであろうそして、シアノバクテリア。カラム実験は、縞状鉄鉱フォーメーションの堆積にこれらの微生物プロセスの個々の寄与を離れていじめるのに役立ちます。しかし、古代の（と現代）環境への解釈と外挿のために非常に慎重に導出する必要があります。垂直のFe（II）フラックス、透光層光勾配、無酸素雰囲気とシアノバクテリア：潜在的な先カンブリア湧昇海洋水柱の基本的な機能の現在の研究モデルでシミュレートされている微生物の生息地。広告でditionは、人工湧昇システムにおける条件は、潜在的に2濃度は、その後、より高い鉄（II）酸化速度につながる高架Oに対し、原因潜在的により高いO 2生成速度につながる一定の温度と24時間の明条件に、シアノバクテリアの成長を好みます。従って、本研究では、一つの実験万能BIFの起源に関する仮説として解釈されないことがあります。
それにもかかわらず、セットアップは様々な地球化学的プロセスの現場調査と特定の境界条件（光の可用性、培地組成、フラックス）の変動やシミュレーションを可能にします。ラボ・制御された条件下で、単一のパラメータと地球化学的相互作用の定量化は、古代と現代の環境への洞察を与えることができます。また、カラムシステムは、私たちは地球化学的条件は、微生物の活性を調節する方法についての仮説をテストすることができます。例えば、それは仮定されています先カンブリア時代湧昇システムにおける高鉄（II）濃度が原因で太陽に照らされ、酸素環境20中のFe（II）の毒性のために限られた光合成酸素産生を有することができるD。将来の研究は、さらに化学的フラックスと人工水柱における反応速度の定性的および定量的な化学量論的な計算を可能にする容積率を組み込む予定。単一の観察は、個々の環境のシミュレーションのためのモデルを評価するためにリンクされます。列を設定すると、我々は今、海洋初期の地球条件20を表し、 その場で湧昇システムにおける高鉄（II）と光の束に（シアノ）細菌の直接のストレス応答を調査することができます。列には、鉄（II）はCzaja ら 、例えば （酸化されている湧昇システムに沿って鉄の同位体組成の進化例えば、微生物活動によって生成地球化学署名に関する仮説をテストするために使用することができますアル。）30。また、カラム内の化学勾配を安定させるガラスビーズ砂や堆積物と置き換えることができます。微生物（ 例えば、メルトンら。）31が生息し、海洋や淡水堆積物中に開発する場合もあり地球化学的勾配のシミュレーションのために、このコラムを適用することも可能です。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
マークノードホフは、配管接続部の設計と実装を支援します。エレン・シュトルーヴェが使用される機器を選択して取得するのに役立ちました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Widdel flask (5 L) | Ochs | 110015 | labor-ochs.de |
| Glass bottles (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| Glass pipettes (5 ml) | 51714 | labor-ochs.de | |
| 0.22 µm Steritop filter unit (0.22 µm Polyethersulfone membrane) | Millipore | X337.1 | carlroth.com |
| Aluminum foil | |||
| Sterile Luer Lock glass syringe, filled with cotton | C681.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock stainless steel needles (150 mm, 1.0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |
| NaCl | Sigma | 433209 | sigmaaldrich.com |
| MgSO4 | Sigma | 208094 | sigmaaldrich.com |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | sigmaaldrich.com |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | sigmaaldrich.com |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | sigmaaldrich.com |
| KBr | Sigma | P3691 | sigmaaldrich.com |
| KCl | Sigma | P9541 | sigmaaldrich.com |
| Glass cylinder | Y310.1 | carlroth.com | |
| Glass wool | 7377.2 | carlroth.com | |
| Glass beads (ø 0.55 - 0.7 mm) | 11079105 | biospec.com | |
| Butyl rubber stopper (ø 1.2 cm) | 271024 | labor-ochs.de | |
| Petri Dish, glass (ø 8.0 cm) | T939.1 | carlroth.com | |
| Polymers glue | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| Optical oxygen sensor foil (for oxygen analysis, see below) | – on request – | presens.de | |
| Rubber tubing (35 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock male = LLM) | P343.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock female = LLF) | P335.1 | carlroth.com | |
| Rubber tubing (25 mm, 0.72 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Rubber tubing (50 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock glass syringe (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |
| Loose cotton | – | ||
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel needle (40 mm, 1.0 mm ID) | Sterican | 4665120 | bbraun.de |
| Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.5 mm ID) | 201520 | labor-ochs.de | |
| position: Luer Lock female connector part at C.7 | |||
| Polymers glue | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| Stainless steel needle (120 mm, 0.7 mm ID) | Sterican | 4665643 | bbraun.de |
| Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Heat shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) | 541458 - 62 | conrad.de | |
| Tube clamp | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock plastic cap (LLM) | CT69.1 | carlroth.com | |
| Glass bottle (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| Butyl rubber stopper (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel capillary (300 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) | 541458 - 62 | conrad.de | |
| Rubber tubing (100 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock glass syringe (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |
| Loose cotton | – | ||
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Stainless Steel needle (40 mm, 0.8 mm ID) | Sterican | 4657519 | bbraun.de |
| Luer lock glass syringe (5 ml) | C679.1 | carlroth.com | |
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 mm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Glass bottle (2 L) | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com |
| Butyl rubber stopper (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Rubber tubing (30 mm x 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Rubber tubing (100 mm x 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock 3-way connector (LLF, 2x LLM) | 6134 | cadenceinc.com | |
| Light source | Samsung | SI-P8V151DB1US | samsung.com |
| Peristalic pump | Ismatec | EW-78017-35 | coleparmer.com |
| Pumping tubing (0.89 mm ID) | EW-97628-26 | coleparmer.com | |
| Stainless steel capillary (200 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Stainless steel capillary (400 mm, 0.74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) gas pack (10 L) | 30240-U | sigmaaldrich.com | |
| Rubber tube (30 mm, 6 mm ID) | 770300 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLM) | P343.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLF) | P335.1 | carlroth.com | |
| Gas-tight syringe (20 ml) | C681.1 | carlroth.com | |
| Bunsen burner | – | ||
| Fiber optic oxygen meter for oxygen quantification | Presens | TR-FB-10-01 | presens.de |
| Vacuum pump | – | ||
| Silicone glue for oxygen optodes | Presens | PS1 | presens.de |
References
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