Introduction
O estudo de tecidos, órgãos ou sistemas in vitro é uma tentativa para simplificar os relacionamentos existentes muito complexas entre os vários subtipos celulares que compreendem organismos multicelulares. De facto, estudos in vitro tornam possível adquirir uma compreensão detalhada das populações de células individuais. Existem duas grandes vantagens da realização de experiências in vitro: 1) reduzidas interacções celulares, e 2) a capacidade de manipular facilmente o ambiente celular. Cientistas Assim, estas duas vantagens permitiram prever o comportamento de tipos específicos de células in vivo, levando a capacidade para regular os resultados de influências extrínsecos em organismos inteiros. Nesse sentido, em cultura de células in vitro muitas vezes funciona como uma ponte de ligação entre ciências básicas e aplicadas de vida. No entanto, também existem várias desvantagens de se trabalhar in vitro, o mais importante sendo que uma certa reserva pode habitar na fisiológicoal relevância dos fenótipos observados. Com efeito, quando um único tipo de célula é cultivada num vaso, a cultura perde, em graus diversos,, as suas ligações célula-célula com outros tipos de células, a sua contribuição para o ambiente humoral a partir do tecido e organismo de origem, e as âncoras dentro o tecido que lhe permitiu manter uma estrutura tridimensional em particular, por vezes crucial para a função da célula.
A questão da relação célula-célula foi abordada pelo desenvolvimento de técnicas de cultura mista. Neste método, duas ou mais populações de células são cultivadas em conjunto no mesmo vaso de cultura. No entanto, estas culturas mistas suportar inconvenientes importantes. Por um lado, alguns subtipos de células não interagem fisicamente com o outro no tecido de origem e depender unicamente das comunicações parácrinos sustentadas por fatores solúveis secretados e receptores nas proximidades. Este é o caso de vários processos inflamatórios que dependem da sinalização de citocina proximal. Em c mistaultures, interações físicas são inevitáveis e torná-lo impossível estudar comunicações parácrinos na ausência de contatos célula-célula que podem produzir resultados alterados. Por outro lado, a realização interpretações específicos de células a partir de uma população mista torna-se inviável sem o uso de técnicas de separação duras que poderiam afectar de forma significativa os resultados.
Para resolver estes problemas importantes, a utilização de meios condicionados foi desenvolvido como uma técnica que permite culturas compartimentadas e o estudo da sinalização parácrina. Este método exige a transferência do sobrenadante de um tipo de células, o meio condicionado assim nomeados, às cavidades contendo outra população de células. No entanto, uma desvantagem importante é que as moléculas de vida curta não sobreviver o tempo suficiente no meio condicionado para ser transferida para os poços da segunda população de células. Mesmo moléculas de longa vida será muito diluídas ao longo do tempo devido à difusão. Além disso, tanto celularpopulações só participam na comunicação parácrina unidirecional e não em comunicação bidirecional ativa. Isto conduz à ausência de sinalização de feedback que é vital para recriar relações precisas multicelulares como elas existem in vivo.
Em consequência e motivado pela necessidade para melhor simular o original em condições in vivo no ambiente celular in vitro, a vários avanços nas técnicas de cultura de células foram obtidos ao longo dos anos. Um dos avanços mais significativos foi o uso de suportes permeáveis com membranas microporosas para compartimentar culturas de células, utilizadas pela primeira vez por Grobstein em 1953 um. Tais suportes permeáveis foram adaptados ao longo dos anos para acomodar vários tipos de células e para ser utilizada em várias aplicações diferentes. Hoje em dia, estes suportes existem inserções como ocos que são destinadas para descansar em poços de uma placa de cultura de tecido de poços múltiplos ou em circupratos Lar. Em um sistema de co-cultura, a inserção contém um tipo de célula ao passo que o poço ou prato contém a outra população celular, permitindo estudar a contribuição de duas populações diferentes de células no seu meio ambiente humoral (Figura 1). Como resultado, a polaridade celular (basolateral vs secreção apical ou a recepção do sinal) é preservada, conferindo, assim, sistemas de co-cultura inserir uma vantagem importante sobre as culturas mistas e técnicas de meio condicionado. Vários tipos de materiais de membrana estão disponíveis, as mais comuns sendo de poliéster (PET), policarbonato (PC) ou revestidos com colagénio de politetrafluoretileno (PTFE), e existem em diferentes tamanhos de poros variando de 0,4 um a 12,0 um. Estas variedades de materiais e tamanhos de poros oferecer um espectro de inserções exercendo características variáveis relevantes para propriedades ópticas, a espessura da membrana e adesão celular que tornam prático a níveis diferentes para as seguintes utilizações não limitados a:
-estudandoa diferenciação celular, o desenvolvimento embrionário, a metástase tumoral e reparação de feridas por ensaios de quimiotaxia através de membranas permeáveis;
-evaluating penetração da droga, avaliando o seu transporte através de monocamadas epiteliais ou endoteliais cultivadas em suportes permeáveis, e;
-performing celulares co-culturas para analisar modulações comportamento celular induzida por factores solúveis segregadas na ausência de contacto célula-célula.
O objetivo deste artigo é descrever orientações metodológicas gerais para cumprir a terceira função dito acima, que é o de avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula usando um sistema de co-cultura de inserção. Vários campos diferentes de pesquisa fazem uso de sistemas de co-cultura de inserção, a fim de responder a questões relevantes para o efeito de fatores solúveis secretados em populações de células. Com efeito, a sinalização parácrina que modula o comportamento celular em vários níveis é pertinente em todos os tecidose dos sistemas, o que torna os sistemas de co-cultura de inserção indispensável para garantir avanços nestes domínios. Por outro lado, a utilização de inserções pode confirmar que a transdução de sinal é por contacto directo célula a célula e não por factores segregados. Uma das utilizações mais importantes de inserções é em estudos de inflamação 2-14, onde o efeito de citocinas secretadas é avaliada em vários agentes celulares de imunidade. Em particular, o estudo da inflamação no sistema nervoso central (SNC) tem muito lucraram com estudos co-cultura de inserção, que têm permissão para definir melhor os papéis parácrinos distintos de neurônios e microglia na condução neuroinflamação 15-21. Estes sistemas também foram concebidos para estudar o potencial anti-inflamatório de moléculas que se baseia na sua capacidade de reduzir ou inibir a secreção de factores pró-inflamatórias 22-26. Investigação referentes ao câncer de 27-31, em particular os mecanismos subjacentes a angiogênese 32-34 e inflammatiem 35-42 na tumorigênese, também se beneficia de sistemas de co-cultura de inserção. Além disso, fatores solúveis são de primordial importância nos processos que impulsionam diferenciação e vários estudos têm usado as inserções para responder às perguntas em que determinado campo de 43-50. No SNC, visto que o tecido neural tem um potencial de renovação muito limitado, o estudo de neurotrophism e neuroprotecção é fundamental e tem sido amplamente assegurada pela utilização de células estaminais em sistemas de co-cultura de 51-56. Além disso, inserções também são utilizados em diversos campos como a nefrologia 57,58, interacções endoteliais e angiogênese 59-62, apoptose sinalização 63-65, inflamação na obesidade e síndrome metabólica 22,23,66-67, ouvido interno protecção das células ciliadas 68,69, e até mesmo em fungos virulência 70,71 e parasitologia 72,73.
Este artigo oferece orientações metodológicas gerais, a fim de criar um experiment, tendo em vista avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados usando um sistema de co-cultura de inserção. Em particular, vamos concentrar a nossa atenção em co-culturas de células nervosas e seus usos em estudar processo neuroinflamatória. Dada a muito vasto espectro de experiências que insere tornar possível piloto, é insuportável para cobrir todos os aspectos desta técnica de cultura de células. Como um exemplo, um protocolo específico para medir os efeitos de citocinas secretadas por lipopolissacárido (LPS) -activated microglia N9 em células PC12 neuronais será detalhado, oferecendo uma compreensão concreta da metodologia de co-cultura de inserção.
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Protocol
Nota: Cada um dos seguintes passos devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar, conforme necessário para a cultura de células de mamífero. Além disso, as orientações gerais para a cultura de células estéril optimizada aplica-se, por exemplo., Descartando dicas qualquer momento que eles podem levar à contaminação cruzada, reduzindo a quantidade de células de tempo são expostos ao ar ao realizar mudanças de suporte inteiras, adequadamente, mas que se agitava suavemente todos suspensões de células para garantir a sua pipetagem homogênea, etc. Além disso, as inserções são uma espécie de plasticware que requerem um tratamento especial. Em primeiro lugar, sempre que as inserções são manipulados, evite tocar a membrana frágil, que rasga facilmente e poderia, portanto, comprometer o experimento. Além disso, não é adequado para realizar a aspiração de vácuo do meio de cultura celular, como existe o risco de perfurar a membrana ou dissociar células aderentes. Em seguida, insere pendurado na placa de cultura de tecido de poços múltiplos e, assim, cuidado deve ser empregue quando MODEIXANDO O utensílios de plástico ou ao pipetar para evitar a dissociação de células aderentes. Além disso, quando utilizando inserções com tamanhos de poros grandes, há uma possibilidade de que o meio de cultura de células se infiltra através da membrana e, por conseguinte, é importante para monitorizar frequentemente o nível de líquido. Finalmente, note que o seguinte protocolo é concebido para células aderentes e requer pequenas modificações, a fim de ser adequado para as células em suspensão.
1. As orientações gerais para a realização de inserção experiências de co-cultura
- Sementeira tipo de célula # 1 em inserções
- Desembrulhar as inserções da sua embalagem.
- Coloque as inserções em uma placa de cultura de tecido de poços múltiplos vazios de dimensão adequada. Para fazê-lo, prender a borda superior da inserção utilizando pinças.
- Para melhorar o anexo e disseminação de células aderentes, condicionar as inserções com meio de cultura de células antes da semeadura. Para fazer isso, cobrir toda a superfície da membrana de cultura de células com medium utilizando uma micropipeta.
NOTA: Faça isto para o maior número de inserções, conforme necessário. - Substituir a tampa da placa e incubar durante pelo menos 1 hora ou O / N sob as mesmas condições (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO 2).
- Quando as inserções são condicionadas, remover todo o meio de cultura de células utilizando uma micropipeta. Descartar o meio utilizado.
- Tipo de Semente célula # 1 em meio de cultura celular fresco da mesma maneira como em uma placa com múltiplas cavidades. Para fazê-lo, desenhar um volume apropriado da suspensão de células com uma micropipeta e distribuir o líquido no inserto.
NOTA: Prepare o maior número de inserções, conforme necessário. - Após semear todas as inserções, agite levemente a placa de esquerda e direita, em seguida, frente e para trás, a fim de distribuir as células uniformemente. Evitar fazer movimentos circulares, como isso vai fazer com que as células que se acumulam no centro das inserções.
- Colocar a tampa sobre a placa e incubar, tal como especificado por como por exigências celulares (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO
- Sementeira tipo de célula # 2 em placas de cultura de tecidos com vários poços
- tipo de célula semente # 2 em meio de cultura de células frescas de acordo com a Seção 1.
- Preparar de muitos poços como necessário para o número de inserções. Balance a placa como no passo 1.1.7) para assegurar que as células estão uniformemente distribuídas nos poços.
- Colocar a tampa sobre a placa e incubar sob as mesmas condições (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO 2).
- meio refrescante na inserções
- Usando uma micropipeta, remover parte ou a totalidade do meio de cultura celular, em que contêm as inserções tipo de célula # 1. Descartar o meio utilizado.
- Desenhar um volume apropriado de meio de cultura de células fresco. Suavemente descansar a ponta sobre a parede interna da inserção e lentamente dispensar o meio de cultura celular.
- Colocar a tampa sobre a placa e incuba-se de acordo com o passo 1.1.4.
- meio refrescante em placas de cultura de tecidos com vários poços
- Usando um micropipette, remover parte ou a totalidade do meio de cultura de células nos poços contendo tipo de célula # 2. Descartar o meio utilizado.
- Desenhar um volume apropriado de meio de cultura de células fresco. Colocar a ponta na parede interior do poço e lentamente dispensar o meio de cultura celular.
- Colocar a tampa sobre a placa e incuba-se de acordo com protocolos de cultura de células previamente estabelecidos.
- Transferência de inserções contendo tipo de célula # 1 a placas de cultura de tecidos de múltiplos poços contendo tipo de célula # 2.
NOTA: Execute esta etapa, quando ambos os tipos de células atingiram a fase de crescimento adequado.- Antes de transferir os insertos em poços, fazer quaisquer alterações médias necessárias, como anteriormente descrito nas etapas 1.3 e 1.4)).
NOTA: Neste ponto, é importante para dispensar os volumes apropriados de meios de comunicação em ambos os compartimentos, tal como especificado por instruções do fabricante da pastilha. - Com uma pinça, segure a extremidade superior de uma inserção contendo células TYpê # 1 e gentilmente colocá-lo no apropriado poço contendo tipo de célula 2 #.
- Depois de transferir todas as inserções, verificar a presença de bolhas de ar abaixo da membrana de inserções.
NOTA: As bolhas de ar evitar um intercâmbio entre a membrana da peça inserta e pode pôr em perigo todo o experimento. - Se bolhas de ar estão presentes, muito delicadamente levantar a inserção do poço usando uma pinça e mergulhar de volta para o meio de cultura celular. As bolhas vão desaparecer. Se eles ainda estão presentes, tente suavemente mergulhando pastilhas de volta para o meio de cultura de células em um ângulo.
NOTA: Não bata ou mexa inserções para evitar dissociar as células aderentes. - Depois de remover todas as bolhas de ar e a verificação de que os volumes de meios de comunicação em ambos os compartimentos, coloque a tampa sobre a placa e incubar.
- Antes de transferir os insertos em poços, fazer quaisquer alterações médias necessárias, como anteriormente descrito nas etapas 1.3 e 1.4)).
- media refrescantes em um sistema de co-cultura
NOTA: Embora a membrana permite fácil troca de mídia entre inserção e bem, refrescando o meio é feito emambos os compartimentos desde o tempo necessário para atingir o equilíbrio nos compartimentos superior e inferior por difusão por si só pode ser bastante longo.- meio refrescante em pastilhas contendo tipo de célula # 1 é feito da mesma maneira como no passo 1.3).
- Para atualizar meio em poços contendo tipo de célula # 2, deslize suavemente a inserção para o lado para criar um espaço grande o suficiente para acomodar uma ponteira. Refrescar o meio como no passo 1.4).
- Verificar a presença de bolhas de ar e verificar os volumes como por etapas 1.5.3), através 1.5.5).
2. Exemplo: medir os efeitos das citocinas secretadas pela microglia N9 LPS-ativados nas células neuronais PC12
NOTA: Os passos seguintes são projetados para balão específico, bem e tamanhos de prato. No entanto, o protocolo pode ser personalizado para quaisquer dimensões plasticware. Para a mídia e composição ver Tabela Materiais.
- Semeadura e diferenciação de células PC12 em múltiplosse placas de cultura de tecidos
- meio de cultura de células PC12 rotina de aquecimento, a diferenciação de PC12 e meio tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C.
- Use células PC12 a 60-80% de confluência de um balão de 2 75 centímetros.
- Com uma pipeta de Pasteur a 15 mm, realizar a aspiração de vácuo de todo o meio de cultura celular no balão.
- Lave a monocamada de células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril e remover o líquido com uma pipeta de Pasteur. Tenha cuidado para não dissociar as células nesta etapa.
- Cobrir a monocamada de células com 3 ml de tripsina-EDTA e incubar durante 2-3 min a 37 ° C.
- Certifique-se de que todas as células são separadas sob um microscópio. Se muito poucas células estão flutuando, incubar por um período mais longo para um máximo de 5 min.
- Adicionam-se 10 ml de meio de cultura de células PC12 de rotina, a fim de inactivar a tripsina-EDTA.
- Com uma pipeta de 10 ml, triturar suavemente ao se certificar de que a maioria das células são dissociadas do fundo of o balão. Evitar a criação de bolhas de ar na suspensão de células.
- Com a mesma 10 ml de pipeta, transferir a suspensão celular num tubo de centrifugação de 50 ml.
- Centrifugar por 1 min a 3.200 xg
- Descartar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, tendo o cuidado para não perturbar o sedimento.
- Adicionam-se 10 ml de meio de cultura de células PC12 rotina com uma pipeta de 10 mL.
NOTA: Este volume pode ser ajustado se o pellet é extraordinariamente pequeno ou grande. - Tritura-se com a mesma pipeta de 10 ml para homogeneizar o sedimento. As células PC12, muitas vezes se aglutinarem assim, pelo menos 20 pipetando para cima e downare necessário.
NOTA: Enquanto trituração vigorosa é necessário, evitar a criação de bolhas de ar na suspensão de células. - Em um tubo de 1,5 ml, preparação de uma diluição apropriada da suspensão de células em azul de tripano. Contar as células utilizando um hemocitómetro de acordo com protocolos previamente estabelecidos 74.
- Num tubo separado de 50 ml, dividir a suspensão de célulascom meio de diferenciação de PC12 para se obter uma suspensão de células diluída apropriada para semear poços de uma placa de 24 poços (30000 ¢ / cm2, 0,6 ml por poço de acordo com o protocolo do fabricante).
NOTA: A placa de 24 poços devem ser previamente revestida com colagénio tal como especificado por protocolos previamente estabelecidos 75. - Distribuir 0,6 ml da suspensão de células por poço usando uma micropipeta.
- Quando todos os poços são semeadas, balance a placa como no passo 1.1.7).
- Para permitir a diferenciação de células PC12 adequada, incubar as placas de 24 poços durante 7-9 dias a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% húmida em meio de diferenciação de PC12 15,16 antes de realizar as experiências de co-cultura.
- Realizar as mudanças de meio a cada dois dias, removendo metade do líquido e substituindo-o com um volume igual de meio de diferenciação de PC12 fresco.
- Sementeira microglia N9 nas inserções e tratamento com LPS
- Um dia antes de realizar os experimentos de co-cultura, pré-tratamento de PTFE de 0,4 mm inserções de poros com meio de cultura celular N9 rotina para otimizar a adesão celular, seguindo os passos 1.1.1), através 1.1.4)
- meio quente N9 rotina de cultura de células e de tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C.
- Entretanto, pesar aproximadamente 10 mg de LPS em um tubo de 1,5 ml para uso posterior.
NOTA: Desde LPS é um potente endotoxina pró-inflamatório e exige precauções especiais de segurança, óculos, luvas, e um respirador particulado são fortemente recomendados. - Use células N9 a 80-90% de confluência de um balão de 2 75 centímetros.
- Siga os passos 2.1.3) para 2.1.14). Sempre use meio de cultura celular N9 rotina em vez de meio de cultura de células PC12 rotina. Observe também que microglia N9 não se agregam tanto quanto células PC12 fazer, então menos pipetagem cima e para baixo pode ser necessário no passo 2.1.13).
- Num tubo separado de 50 ml, dividir a suspensão de células com meio de cultura de células para o N9btain uma suspensão diluída de células apropriada para semear inserções destinadas a reter em placas de 24 poços (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml por inserção de acordo com o protocolo do fabricante, para a área de superfície da membrana ver informação do fabricante).
Nota: Estas inserções já são revestidos com colagénio pelo fabricante e são otimizados para adesão celular. - Distribuir 0,05 ml da suspensão de células por pastilha utilizando uma micropipeta.
- Quando todas as inserções são semeadas, balance a placa como no passo 1.1.7).
- Efectuar diluições em série de LPS com o meio de tratamento para obter N9 4 ug / mL, 2 ug / ml e 1 ug / ml de soluções de trabalho.
- Pipetar 0,05 ml do / ml Solução de trabalho de 4 ug de um conjunto de inserções, a fim de se obter uma diluição final de 2 ug / ml.
- Repetir o passo 2.2.10) para as outras duas soluções de trabalho em diferentes conjuntos de inserções, obtendo-se diluições finais de 1 ug / mL e 0,5 ug / ml, respectivamente.
- DentroCubate as placas contendo as inserções de 24 h a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% de humidade para permitir a activação da microglia N9 com LPS antes de realizar as experiências de co-cultura.
- Co-cultura de células neuronais PC12 com microglia N9
- Em 7-9 dias de diferenciação de células PC12, ativar as microglia N9 Após 24 horas de incubação com LPS por meio de tratamento N9 quente e meio de tratamento PC12 em um banho de água a 37 ° C.
- Realizar uma mudança médio total para microglia N9 como no passo 1.3), a substituição de todo o meio utilizado por 0,1 ml de meio de tratamento N9. Faça isso para cada insert.This é necessário remover todos os vestígios de LPS, deixando microglia N9 única ativadas nas inserções.
- Realizar uma mudança médio total para células PC12 neuronais como no passo 1.4). Transferir os insertos em placas de 24 poços como no passo 1.5) .Incubate o N9-PC12 co-culturas durante 24 h ou 48 h a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% de humidade.
- Depois de 24h ou 48 h, a colheita do sobrenadante e / ou as células quanto à citotoxicidade, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), transferência de Western ou outros ensaios.
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Representative Results
O uso de sistemas de co-cultura de inserção é particularmente pertinente no estudo de processos neuroinflamat�ios que mostram relações parácrinos entre diferentes jogadores celulares do CNS. Imunidade no SNC é realizado principalmente por células residentes chamadas microglia que monitoram seu ambiente em seu estado de repouso ramificada (Figura 2A) e são capazes de distúrbios sentindo que poderia incomodar a homeostase muito precioso necessário para a função neuronal adequada 76-78. Activação da microglia, caracterizado por a adopção de uma forma amebóide (Figura 2B) e a multiplicação da população de células denominadas microgliose (Figura 3), seguindo-se a libertação de mediadores pró-inf lamatórios, tais como citocinas, constitui o aspecto principal da neuroinflama�o 79 . liberação de citocinas serve o propósito nobre de proteger os neurônios contra ataques nocivos e é closEly monitorizada. No entanto, quando a neuroinflamação escapa este controlo apertado, ele adota uma natureza destrutiva e pode ferir gravemente o SNC. Na medida em que os tecidos neurais têm um potencial de renovação muito limitado, o SNC é tudo o mais susceptível a tais respostas inflamatórias auto-destrutiva. Estudando o crosstalk, que existe entre os neurônios e microglia é imperativo para elucidar os mecanismos subjacentes da neuroinflamação. Ao contrário das culturas mistas, os sistemas de co-cultura de inserção permitir ao investigador para identificar qual a população de células está a gerar os efeitos tóxicos e que uma está a ser afectado.
Aqui, as células PC12 diferenciadas durante 7-9 dias com factor de crescimento do nervo foram co-cultivados com LPS a microglia N9-activada com o objectivo de quantifyingthe efeitos nocivos de factores solúveis derivados de inflamação sobre os neurónios. Para fazer isso, as células neuronais PC12 foram cultivadas em placas de 24 poços enquanto N9 microglia foram semeadas em inserções. N9 microglium foram tratados durante 24 h com LPS, uma endotoxina pró-inflamatória muito potente composto nas membranas exteriores de bactérias gram-negativas. LPS é que se sabe activar o receptor 4 do tipo Toll provocando assim uma resposta inflamatória forte em uma ampla variedade de células efectoras imunitárias, incluindo a linha celular de murinos imortalizada microglia N9 80,81. Os seguintes resultados representativos mostram que a microglia N9 activados com LPS têm uma tendência para aumentar a sua população (Figura 3) e a secreção de citoquinas pró-inflamatórios solúveis, tais como a interleucina-6 (IL-6), interferão gama (IFN-γ) e factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), que atravessam facilmente a membrana das inserções co-cultura e causar danos citotóxicos para as células neuronais PC12 em crescimento no compartimento inferior.
A principal preocupação antes de transferir a microglia activada N9-LPS para os poços que contêm as células PC12 neuronais consiste em confirmando THAt o PC12 estão devidamente diferenciadas. As células PC12 diferenciadas de sete dias deve apresentar fenótipos neuronais óbvios, como um corpo celular mais plana, que projeta vários neurites longas, por vezes, eles próprios exibindo varicosities (Figura 4). Uma vez que este ponto de verificação é realizada, inserções microglia N9 contendo meio fresco isento de LPS podem ser transferidos para os poços que contêm células PC12 diferenciadas. Após um período de incubação de 24 h ou 48 h, o sobrenadante no compartimento inferior é colhida e um ensaio de citotoxicidade, com base na libertação de lactato desidrogenase 15,16, bem como um ELISA 15, para medir as citocinas são realizados. É importante para colher o sobrenadante no compartimento inferior, a fim de medir as citocinas que, de facto, cruzaram a membrana permeável e que podem activar receptores na superfície de células PC12. Os resultados demonstram que o LPS-activados microglia N9 do compartimento superior gerar um cit dose e dependente do tempootoxic efeito em células neuronais PC12 diferenciadas estabelecidas no compartimento inferior (Figura 5). A 0,5 ug condição / mL de LPS no entanto não é significativamente citotóxico em 24 h ou 48 h. Os níveis de citotoxicidade foram encontradas para atingir quase 100% na / ml condição hr 2 ug de LPS 48. Além disso, os resultados mostram que a concentração de citocinas pró-inflamatórias de IL-6, IFN-y e TNF-a no sobrenadante aumenta concomitantemente com a citotoxicidade observada. Especificamente, a IL-6 As concentrações são significativamente aumentado após 24 horas apenas para a condição de 2 ug / mL, enquanto que 1 ug / ml de LPS também produz elevou significativamente os níveis da citoquina após 48 h (Figura 6). Microglia secretar IFN-γ que chega ao compartimento inferior de uma forma significativamente aumentada quando são tratados com 1 ug / mL e 2 ng / ml, e são incubados com as células PC12 neuronais diferenciadas, quer para 24 h ou 48 h (Figura 7). A 0,5 ug / mLcondição de LPS mais uma vez não aumenta os níveis de IFN-y de forma significativa. Finalmente, as concentrações de TNF-a no compartimento inferior foram quantificados por ELISA e verificou-se ser o mais aumentado pela activação por LPS da microglia, atingindo níveis quase sete vezes mais importante do que a condição de controlo (Figura 8). Em particular, ambos os períodos de 24 h e 48 h de incubação, foram observados aumentos importantes nos níveis de TNF-α no sobrenadante. No entanto, o / mL de LPS condição 1 ug produziu um aumento significativo dos níveis de TNF-α apenas após 48 h. Como um todo, estes resultados mostram que segregaram citoquinas pró-inflamatórias são pelo menos parcialmente responsável pelos efeitos citotóxicos observados em células neuronais PC12 diferenciadas após um período de incubação de 24 h ou 48 h com microglia activados por diferentes concentrações de LPS.
Inserir sistemas de co-cultura de células da microglia e PC12 N9 LPS-activados foram mostrados paraser particularmente útil no estudo da neuroinflamação e na elaboração de estratégias para combatê-los. O nosso grupo mostraram recentemente que o LPS-activado microglia N9 crescido em cultura de células insere exibem aumento da transcrição de citocinas pró-inflamatórias, os quais por sua vez induzem a apoptose de células PC12 diferenciadas pelo factor de crescimento do nervo e atravesse os poros do inserto 15, 16. No mesmo paradigma, pré-tratamento da população microglial com o resveratrol composto polifenólico (0,1 | iM, 3 hr) impediu a transcrição de citocinas pró-inflamatórias e apoptose, portanto, impedido de células PC12 neuronais diferenciadas, bloqueando a caspase-3 de activação e, depois disso , clivagem de ADN. Um outro grupo também demonstraram os efeitos neuroprotectores de vitamina E numa co-cultura PC12 N9-26. Além N9-PC12 co-culturas, as diferentes linhas de células imortalizadas ou culturas primárias também têm sido utilizados num contexto de neuroinflama�o. Por exemplo, aA linha de células da microglia BV2 murino foi co-cultivadas com células de neuroblastoma SH-SY5Y humanas para mostrar o efeito anti-apoptótico da luteolina polifenólica aparentemente mediada pelo seu potencial anti-inflamatório 17. Assim, a microglia bv2 activados por células PC12 foram lesadas mostrado exercer efeitos anti-apoptóticos em células estaminais mesenquimais 18. Sinalização recíproca demonstrou ser importante nos mecanismos de anti-apoptóticos subjacente neuroproteção microglia primária conferidas primários neurônios granulares do cerebelo 19. Além disso, os neurónios do hipocampo primários foram co-cultivadas com microglia primária activada pela proteína precursora de amilóide segregada, a fim de avaliar a libertação de glutamato por permuta de cisteína e o enfraquecimento subsequente da função sináptica 20. Finalmente, um grupo também mostrou a crosstalk que existe entre os neurônios do hipocampo primárias e microglia primários relativos à fractalcina sinalização, uma quimiocina expres constitutivamentesed pelos neurónios no sistema nervoso central cujo receptor é encontrado na superfície da microglia 21.
Figura 1. Representação esquemática de um sistema de co-cultura de inserção. O compartimento superior é composta da inserção que possui um tipo de célula e do seu ambiente humoral apical. O compartimento inferior é constituída por um poço ou recipiente com o segundo tipo de célula. A inserção repousa sobre as bordas da placa de cultura de tecido de poços múltiplos ou prato. A inserção é concebida para estar um pouco acima do fundo do poço, de modo a não tocar a população de células em crescimento abaixo. O meio no compartimento inferior está em contacto com a superfície basal do primeiro tipo de célula e a superfície apical do segundo tipo de célula. Por favor clique aqui para ver uma vers maioresion desta figura.
Figura 2. Microfoto- de microglia N9. (A) não tratados descansando microglia N9 em inserções apresentam uma morfologia celular ramificada que lhes permite monitorar ativamente seu ambiente. (B) microglia N9 em inserções tratadas com lipopolissacárido (LPS) durante 24 h visor uma forma típica amebóide do fenótipo activado. Esta microfotografia foi tomada imediatamente antes de transferir a inserção contendo estes microglia N9 ativados aos poços contendo células PC12 diferenciadas conforme ilustrado na Barra de escala Figura 4. = 25 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Microfoto- de células PC12 neuronais diferenciadas. Crescimento do nervo de sete dias fator diferenciado células PC12 neuronal mostram fenótipos neuronais óbvios, tais como neurites longas e varizes. Esta microfotografia foi tomada imediatamente antes de transferir as inserções contendo microglia N9 ativados como retratado na Barra de escala Figura 2. = 25 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Efeito citotóxico de lipopolissacárido (LPS) -activated microglia em células PC12 neuronais diferenciadas.N9 microglia foram activados com diferentes concentrações de LPS durante 24 h, em seguida, transferidos para poços contendo células PC12 neuronais diferenciadas durante 24 h ou 48 h. A citotoxicidade foi avaliada usando um ensaio de libertação de lactato desidrogenase executada no sobrenadante do compartimento inferior. diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por análise unidireccional da variância, seguida de análise de Tukey post-hoc com o programa GraphPad Instat, versão 3.06 para Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Todos os dados analisados, no intervalo de confiança de 95%, são expressos como média ± erro padrão da média de 3 experiências independentes em que foram consideradas 6 poços. Os asteriscos indicam diferenças estatísticas entre a condição de tratamento e de controlo (*** p <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. A concentração de Eu nterleukin-6 (IL-6) no sobrenadante após a activação N9 por lipopolissacárido (LPS). N9 microglia foram activados com diferentes concentrações de LPS durante 24 h, e depois transferidas para cavidades contendo células PC12 neuronais diferenciadas para 24 h ou 48 h. IL-6 em concentrações do sobrenadante do compartimento inferior foram avaliadas utilizando um ensaio ELISA. diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por análise unidireccional da variância, seguida de análise de Tukey post-hoc com o programa GraphPad Instat, versão 3.06 para Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Todos os dados analisados, no intervalo de confiança de 95%, são expressos como média ± erro padrão da média de 3 experiências independentes em que foram consideradas 6 poços. Os asteriscos indicam diferenças estatísticas entre o tratamento e concondição de controle (*** p <0,001, ** p <0,01 e * p <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. A concentração de interferão gama (IFN-γ) no sobrenadante após a activação N9 por lipopolissacárido (LPS). N9 microglia foram activados com diferentes concentrações de LPS durante 24 h, e depois transferidas para cavidades contendo células PC12 neuronais diferenciadas durante 24 hr ou 48 h. As concentrações de IFN-y no sobrenadante do compartimento inferior foram avaliadas utilizando um ensaio ELISA. diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por análise unidireccional da variância, seguida de uma análise post-hoc de Tukey com o programa GraphPad Instat, versão 3.06para Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Todos os dados analisados, no intervalo de confiança de 95%, são expressos como média ± erro padrão da média de 3 experiências independentes em que foram consideradas 6 poços. Os asteriscos indicam diferenças estatísticas entre a condição de tratamento e controle (** p <0,01 e * p <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Concentração de factor de necrose tumoral alfa (TNF-α) no sobrenadante após a activação N9 por lipopolissacárido (LPS). N9 microglia foram activados com diferentes concentrações de LPS durante 24 h, e depois transferidas para cavidades contendo células PC12 neuronais diferenciadas para 24 h ou 48 h. TNF-αAs concentrações no sobrenadante do compartimento inferior foram avaliadas utilizando um ensaio ELISA. diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por análise unidireccional da variância, seguida de análise de Tukey post-hoc com o programa GraphPad Instat, versão 3.06 para Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Todos os dados analisados, no intervalo de confiança de 95%, são expressos como média ± erro padrão da média de 3 experiências independentes em que foram consideradas 6 poços. Os asteriscos indicam diferenças estatísticas entre a condição de tratamento e de controlo (*** p <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O passo mais crítico de toda a experiência do sistema de co-cultura inserção realmente habita em escolher a inserção correta de usar. O tamanho dos poros e material de membrana tem de ser tida em conta completa, sem deixar de considerar o tipo de células que irão ser semeadas e o objectivo da experiência. Por exemplo, ensaios de quimiotaxia podem utilizar o mesmo tipo de membrana de co-culturas de células para analisar modulações comportamento celular induzida por factores solúveis segregadas na ausência de contacto célula-célula. No entanto, ambos os tipos de ensaios diferentes requerem tamanhos de poros maiores: para o primeiro, para permitir a migração de células, e os menores para o último, para impedir a migração de células e o contacto célula-célula. Para a avaliação das alterações celulares mediadas por factores solúveis segregadas na ausência de contacto célula-célula, tamanhos de poro de 0,4 uM ou 3 micrómetros são geralmente apropriada uma vez que permitem para moléculas grandes, tais como proteínas, de atravessar mas evitar a maioria das células de fazer assim. Membranamaterial depende largamente do tipo de célula e as técnicas para ser usado no final do protocolo de cultura de células. Resumidamente, membranas de PET oferecer uma boa visibilidade da célula em que são claros, mas não são revestidos de colagénio, que pode ser um problema para as células aderentes que a necessária para o suporte a ser tratada. Eles também têm a melhor resistência química aos fixadores que, ao lado de suas boas propriedades ópticas, os torna ideais para estudos histológicos. Por outro lado, as membranas de células PC oferecer visibilidade pobre como eles são translúcidas e não são revestidos de colagénio. No entanto, eles possuem a maior densidade de poros e a disponibilidade mais diversificada de tamanhos de poro. Finalmente, membranas PTFE são claras quando molhado, mas apenas permitir a visualização de células descreve no microscópio. Como uma grande vantagem, eles são o colágeno revestido, que também os torna um pouco mais grosso. É importante notar que o revestimento de pastilhas de PET ou de membrana PC com colagénio pode obstruir os poros e impedir a passagem de facto solúveisrs. Em qualquer caso, a maioria dos fabricantes de pastilhas oferecem guias abrangentes para ajudar os investigadores a selecionar o inserto correcto. Em nosso paradigma específico, as opções de densidade de revestimento, meios, concentração de soro, dias de diferenciação, dias de ativação LPS, as concentrações de LPS, e revestimento de frascos para células PC12 foram otimizados ao longo de anos de trabalho com estes sistemas de co-cultura 15 , 16. Digno de nota, a densidade de revestimento de microglia N9 nas inserções foi escolhida a 60.000 ¢ / cm 2, a fim de se obter 40-50% de confluência no momento de iniciar a co-cultura e, assim, dar-lhes espaço para multiplicar sobre a sua activação por LPS. Outras condições, quando otimizados também pode produzir resultados satisfatórios, como a substituição de colágeno pela L-lisina nos frascos destinados à manutenção PC12 nativa.
A fim de aumentar a viabilidade dos resultados, vários controlos diferentes pode ser realizada. Ao tentar provar que os fatores solúveissão responsáveis pelos efeitos observados, culturas mistas manifestando contato direto célula-célula e experimentos meio condicionado devem ser realizadas em paralelo. Além disso, fazendo uso de anticorpos para neutralizar um factor secretado específica irá ajudar na identificação da molécula responsáveis pelo efeito parácrino que é percebido. Quando possível, bloquear um receptor ou uma porção da sua via de sinalização para identificar a identidade exacta do receptor seja activado. Se uma molécula é utilizado para activar uma população de células antes da experiência de co-cultura com um segundo tipo de célula, tal como no exemplo descrito anteriormente, é importante levar em consideração a presença da molécula no sistema. Como uma primeira opção, o meio deve ser completamente mudado antes da experiência de co-cultura, a fim de assegurar que a molécula está ausente do sistema completo. Como segunda opção, uma condição deveria ser adicionado quando a molécula sozinho é incubada com o segundo tipo de célula, a fim deavaliar o seu efeito na ausência do primeiro tipo de célula. Se não houver nenhum efeito da molécula no segundo tipo de célula, não haverá necessidade de alterar a forma antes da experiência de co-cultura. Da mesma forma, se ambos os tipos de células não são cultivados no mesmo meio de cultura celular, devem ser tomadas precauções semelhantes para certificar-se que as diferenças na composição do meio de não afectar uma ou a outra população celular. Embora ambos os meios serão separados pela membrana, à primeira inserção, a difusão é obrigado a assegurar que eles vão misturar durante períodos de incubação mais longos. Além disso, vários problemas podem surgir a partir de perturbações de relações aberrante do receptor de factor solúvel. Entre as várias causas de erro, a utilização excessiva de dissociação enzimática e a presença de concentrações importantes de soro podem interferir com receptores da superfície celular. Outras causas de erro nos sistemas de co-cultura de inserção incluem, mas não estão limitados a 1) as técnicas de cultura de células impróprias, tais como a remoção da totalidade da célulameio de cultura em muitos poços ao mesmo tempo fazendo com que células de secar, 2) uma monocamada que é demasiado confluentes no inserto, responsável por vedar a membrana inserção e prevenção de moléculas apicalmente-secretadas para chegar ao compartimento inferior, e 3) misadjusted confluência celular, o que faz com que uma expressão sub-super ou de factores solúveis que conduzem a resultados fisiologicamente irrelevantes ou ausência de qualquer efeito.
Enquanto apenas um cenário de co-cultura inserção foi apresentado aqui, existem inúmeras maneiras de fazer uso desta técnica muito versátil. Aqui, um tipo de células foi pré-tratada com uma molécula responsável por induzir a secreção de um factor solúvel que, mediante a transferência do inserto para o poço, afecta o comportamento do segundo tipo de célula. É também possível incubar ambos os tipos de células em conjunto um sistema de co-cultura antes separando-os para detectar o aumento da vulnerabilidade ou resistência de populações de células de um ou ambos os a um tratamento ulterior. HoWever, quando se considera a sua forma mais rudimentar, esta técnica pode fazer uso de duas populações de células incubadas em conjunto, sem qualquer tratamento, com o objectivo de avaliar a sinalização recíproca parácrina basal.
A limitação mais importante desta técnica é que as entidades moleculares de vida muito curta, tais como espécies de oxigénio reactivas não sobrevivem a distância que separa a população de células em crescimento no compartimento superior e um compartimento inferior na 82. O mais recente desenvolvimento das técnicas de co-cultura tem tentado responder a este problema utilizando um substrato de cultura microfabricated capaz de manter duas populações de células em proximidade microescala 83. Além de rolamento de todas as vantagens dos sistemas de co-cultura de inserção, tais como detecção específico da população de alterações e de sinalização bidireccional, esta tela microfabricado também foi demonstrada para tornar possível a detecção de interacções de curto alcance que não eram antes detectable devido à deterioração de fatores solúveis em distâncias. Esta plataforma de cultura de células é a mais recente inovação em co-cultura de células e promete ajudar a desvendar mecanismos de sinalização entre as células que foram negligenciados antes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
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