Introduction
Изучение тканей, органов или систем в пробирке является попыткой упростить очень сложные отношения , существующие между несколькими сотовыми подтипов , которые включают многоклеточные организмы. Действительно, в пробирке исследования позволяют получить детальное представление о популяции отдельных клеток. Есть два основных преимущества проведения в лабораторных экспериментах: 1) уменьшение клеточных взаимодействий, и 2) способность легко манипулировать клеточной среде. Таким образом, эти два преимущества позволили ученым предсказать поведение конкретных типов клеток в живом организме , что приводит к способности регулировать результаты внешних влияний в целых организмах. В этом смысле, в пробирке культуры клеток часто работает в качестве моста , соединяющего фундаментальных и прикладных наук о жизни. Тем не менее, есть и несколько недостатков работы в лабораторных условиях , наиболее важным из них в том , что определенная оговорка может пребывать в физиологическомаль значимость наблюдаемых фенотипов. В самом деле, когда один тип клеток выращивают в сосуде, культура теряет, в разной степени, его межклеточные соединения с другими типами клеток, его вклад в гуморальной среде из ткани и организма происхождения, а также якорей в пределах ткани, что позволило ему поддерживать определенную трехмерную структуру, иногда решающее значение для функции клеток.
Вопрос о межклеточных отношений была решена развитием смешанных методов культуры. В этом способе две или более клеточных популяций выращивают вместе в той же культурального сосуда. Тем не менее, эти смешанные культуры несут важные неудобства. С одной стороны, некоторые клеточные подтипы физически не взаимодействуют друг с другом в ткани происхождения и полагаться только на паракриновых связи понесенных секретируемых растворимых факторов и соседних рецепторов. Это случай для нескольких воспалительных процессов, которые зависят от проксимального сигнализации цитокина. В смешанном Cultures, физические взаимодействия неизбежны и сделать невозможным изучение паракринной связи в отсутствие межклеточных контактов, которые могут дать измененные результаты. С другой стороны, достижение клеточно-специфической интерпретации внутри смешанной популяции становится невозможным без использования жестких методов разделения, которые могут существенно повлиять на результаты.
Для решения этих важных вопросов, использование кондиционированной среды была разработана в качестве метода, позволяющего для разобщенным культур и изучения паракринной сигнализации. Этот метод требует передачи супернатанта одного типа клеток, так назвали кондиционированной среды, в лунки, содержащие другую популяцию клеток. Тем не менее, существенным недостатком является то, что короткоживущие молекулы не достаточно долго, в кондиционированной среде, чтобы быть переданы в лунки второго популяции клеток. Даже долгоживущие молекулы будут сильно разбавленный с течением времени за счет диффузии. Кроме того, обе ячейкинаселения участвуют только в одном направлении паракринному коммуникации, а не в активной двунаправленной связи. Это приводит к отсутствию сигналов обратной связи , которая имеет жизненно важное значение в воссоздании точных многоклеточные отношения , как они существуют в естественных условиях.
Как следствие , и движимый необходимостью лучше имитировать оригинал в условиях естественных условиях в клеточной среде в пробирке, несколько методов достижения в области клеточных культур были достигнуты на протяжении многих лет. Одним из наиболее значительных достижений было использование проницаемых штативов с микропористых мембран для compartmentalizing клеточных культур, используемых в первый раз по Grobstein в 1953 году 1. Такие проницаемые опоры были адаптированы на протяжении многих лет для размещения многочисленных типов клеток , и которые будут использоваться в нескольких различных приложений. В настоящее время, эти опоры существуют в виде полых вставок, которые предназначены для отдыха в скважинах из тканевой культуры пластины многоямного или в CircuLAR блюда. В системе со-культуры, вставка содержит один тип клеток , тогда как колодец или блюдо содержит другой клеточной популяции, что позволяет изучать вклад двух различных популяций клеток на их гуморального среды (рисунок 1). В результате, клеточная полярность (базолатеральная против апикальной секреции или приема сигнала) сохраняется, таким образом, присвоение Systems вставки сокультуре важное преимущество перед смешанных культур и кондиционированную среду методов. Несколько типов мембранных материалов доступны, наиболее распространенными из которых являются полиэстер (PET), поликарбонат (PC) или коллаген покрытием из политетрафторэтилена (PTFE), и они существуют в различных размеров пор в диапазоне от 0,4 мкм до 12,0 мкм. Эти разновидности материалов и размеров пор предлагают спектр вставок воздействует переменным функции, имеющие отношение к оптическим свойствам, толщины мембраны и присоединение клеток, которые делают их практичными на различных уровнях для следующих видов применения, не ограничиваясь ими:
-studyingклеточной дифференцировки, эмбриональное развитие, метастазирование опухолей и заживлении ран путем хемотоксических анализов через проницаемые мембраны;
-evaluating проникновения наркотиков путем оценки их переноса через эпителиальные или эндотелиальные монослои культивировали на проницаемые опорах, и;
-performing клеточные сокультурах для анализа модуляций поведение клеток, индуцированные секретируемых растворимых факторов, в отсутствии межклеточного контакта.
Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать общие методические указания для выполнения третьей функции указанной выше, то есть оценить клеточные изменения, опосредованные секретируемых растворимых факторов при отсутствии межклеточного контакта, используя систему вставки совместного культивирования. Несколько различных направления исследований, систем использования вставки совместно культуры для того, чтобы ответить на вопросы, относящиеся к действию секретируемых растворимых факторов на популяции клеток. Действительно, паракринная сигнализации, который модулирует клеточный поведение на различных уровнях уместен во всех тканяхи систем, что делает вставки системы совместного культивирования незаменим для обеспечения прогресса в этих областях. С другой стороны, использование вставок может подтвердить, что преобразование сигналов является прямым контактом межклеточной и не секретируемых факторов. Одним из наиболее важных областей применения вставок в исследованиях воспаления 2-14 , где эффект секретируемых цитокинов оценивается в различных клеточных игроков иммунитета. В частности, исследование воспаления в центральной нервной системе (ЦНС) значительно выгоду от исследований вставки совместно культуры, которые позволили более четкому определению различных паракринной роли нейронов и микроглии в вождении нейровоспаления 15-21. Эти системы были разработаны также изучить противовоспалительный потенциал молекул , который зависит от их способности снижать или ингибировать секрецию провоспалительных факторов 22-26. Исследования , относящиеся к раку 27-31, в частности , механизмы , лежащие в основе ангиогенез 32-34 и inflammatiна 35-42 в онкогенеза, также извлекает выгоду из систем вставки совместного культивирования. Кроме того, растворимые факторы имеют первостепенное значение в процессах , которые управляют дифференцировка и несколько исследований использовали вставки , чтобы ответить на вопросы в этой конкретной области 43-50. В ЦНС, видя , как нервная ткань имеет очень ограниченный потенциал обновления, изучение neurotrophism и нейропротекции является фундаментальным и широко обеспечивается за счет использования стволовых клеток в системах совместного культивирования 51-56. Кроме того, вставки также используются в качестве различных областях , как нефрологии 57,58, эндотелиальных взаимодействий и ангиогенеза 59-62, 63-65 апоптоз сигнализации, воспаление ожирения и метаболического синдрома 22,23,66-67, внутреннего уха защиты волосковых клеток 68,69, и даже в вирулентности гриба 70,71 и 72,73 паразитологии.
В данной статье общие методические указания для того, чтобы создать experimлор ввиду оценки клеточных изменений, опосредованных секретируемых растворимых факторов, с использованием системы вставки сокультивирования. В частности, мы сосредоточим наше внимание на нервных клеток со-культур и их использования в учебном процессе нейрогенный. С учетом весьма обширный спектр экспериментов, которые вставляет позволяют пилоту, это невыносимо, чтобы охватить все аспекты этого метода клеточной культуры. В качестве примера, конкретный протокол для измерения эффектов цитокинов, секретируемых липополисахарида (LPS) -активированную N9 микроглии на нейрональных клетках РС12 будут подробно, предлагая конкретное понимание методологии вставки сокультуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: В каждом из следующих шагов должны быть выполнены в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха, как требуется для культуры клеток млекопитающих. Кроме того, общие принципы для оптимального выращивания стерильной клетки применяются, например., Отбрасывая Подсказок в любое время они могут привести к перекрестному загрязнению, уменьшая количество времени клетки подвергаются воздействию воздуха при выполнении целые смены носителя, должным образом, но аккуратно помешивая все клеточные суспензии, чтобы обеспечить их гомогенное пипетирования и т.д. Кроме того, вставки являются своего рода, которые требуют Пластик специальной обработки. Во-первых, всякий раз, когда вставки манипулируют, не касаясь хрупкой мембраны, которая легко рвется и, следовательно, может поставить под угрозу эксперимент. Кроме того, он не подходит для выполнения вакуум-аспирации среды культуры клеток, так как существует риск перфорации мембраны или диссоциирует прилипшие клетки. Затем вставки провисать в культуре ткани пластины многоямного и, таким образом, осторожность должна быть использована, когда моВинг в или когда из пластмассы пипеткой, чтобы избежать отделяя прилипшие клетки. Кроме того, при использовании пластин с большими размерами пор, существует вероятность того, что среда для культивирования клеток просачивается через мембрану и, следовательно, важно, чтобы часто контролировать уровень жидкости. Наконец, следует отметить, что следующий протокол предназначен для адгезивных клеток и требует незначительных модификаций для того, чтобы быть пригодным для суспензии клеток.
1. Общие рекомендации по проведению экспериментов вставки совместного культивирования
- Посев тип клеток # 1 в вкладышами
- Берем вставки из упаковки.
- Поместите вставки в пустой многоямного тканевой культуральной пластины нужного размера. Чтобы сделать это, сцепление верхний край вставки с помощью пинцета.
- Для того, чтобы улучшить прикрепление и распространение адгезивных клеток, состояние вставки с клеточной культуральной среды перед посевом. Для этого, покрывают всю поверхность мембраны с клеточной культуры mediuм с помощью микропипетки.
Примечание: Делайте это столько вставок по мере необходимости. - Установите крышку на тарелку и инкубировать в течение по меньшей мере 1 ч , или O / N в тех же условиях (обычно 37 ° C, 5-10% СО 2).
- Когда вкладыши кондиционируют, удалить все клеточной культуральной среды с использованием микропипетки. Утилизировать отработанное среду.
- Семенной тип клеток # 1 в свежей среде для культивирования клеток таким же образом, как в многоямного пластине. Для этого нарисуйте соответствующий объем клеточной суспензии с помощью микропипетки и дозирования жидкости во вставке.
Примечание: Готовят много вставок по мере необходимости. - После засева все вставки, осторожно встряхните пластину влево и вправо, а затем назад и вперед для того, чтобы равномерно распределить клетки. Избегайте круговых движений, так как это приведет к тому, клетки накапливаются в центре вставок.
- Поместите крышку на тарелку и инкубировать, как определено в соответствии с требованиями сотовой связи (обычно 37 ° С, 5-10% СО
- Посев тип клеток # 2 в многоямный культуре ткани пластин
- Семенной тип клеток # 2 в свежей среде для культивирования клеток в соответствии с разделом 1.
- Подготовьте столько скважин в соответствии с требованиями для числа вставок. Рок пластины, как на этапе 1.1.7), чтобы гарантировать, что клетки равномерно распределены в скважинах.
- Поместите крышку на тарелку и инкубировать при тех же самых условиях (обычно 37 ° C, 5-10% СО 2).
- Освежающий средних вставок
- С помощью микропипетки, удалить часть или всю среду для культивирования клеток, во вставках, содержащих типа клеток # 1. Утилизировать отработанное среду.
- Draw соответствующий объем свежей среды для культивирования клеток. Осторожно отдохнуть кончик на внутренней стенке вставки и медленно дозировать среду для культивирования клеток.
- Поместите крышку на тарелку и инкубировать в соответствии с шагом 1.1.4.
- Освежающий среда в многоямный культуре ткани пластин
- Использование micropiPette, удалить часть или всю среду для культивирования клеток в лунках, содержащих типа клеток # 2. Утилизировать отработанное среду.
- Draw соответствующий объем свежей среды для культивирования клеток. Подведите наконечник на внутренней стенке колодца и медленно дозировать среду для культивирования клеток.
- Поместите крышку на тарелку и инкубировать в соответствии с ранее установленными протоколами клеточных культур.
- Перенос вставок, содержащих тип клеток # 1 в культуральных планшетах, содержащих луночные типа клеток # 2.
Примечание: Выполните этот шаг, когда оба типа клеток достигли соответствующего этапа роста.- До переноса вставки в лунки, внесите необходимые изменения средних, как описано выше в пунктах 1.3) и 1.4).
Примечание: В этот момент очень важно распределить соответствующие объемы информации в обоих отсеках, как указано в инструкции производителя вставить в. - С помощью пинцета, захватывают верхний край вставки, содержащей Т-клетокYpe # 1 и аккуратно поместите его в соответствующем лунку, содержащую тип клеток 2 #.
- После переноса всех вставок, проверить на наличие пузырьков воздуха под мембраной вставок.
Примечание: Воздушные пузырьки предотвращают любой обмен через мембрану вставки и может поставить под угрозу весь эксперимент. - Если воздушные пузырьки присутствуют, очень осторожно поднимите вставку из скважины с использованием пинцета и погрузить обратно в среду для культивирования клеток. Пузырьки исчезнет. Если они все еще присутствуют, попробуйте пологие вставки обратно в среду для культивирования клеток под углом.
Примечание: Не стучите или размешать вставки, чтобы избежать отделяя прилипшие клетки. - После удаления всех пузырьков воздуха и проверяя, что объемы средств массовой информации в обоих отсеках, поместите крышку на тарелку и инкубировать.
- До переноса вставки в лунки, внесите необходимые изменения средних, как описано выше в пунктах 1.3) и 1.4).
- Освежающие средства массовой информации в системе сокультуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, мембрана легко позволяет обмен медиа между вставкой и хорошо, освежающий среды осуществляется вобе камеры с того времени, необходимого для достижения равновесия в верхних и нижних отсеков путем диффузии в одиночку может быть довольно долго.- Освежающие среда в вставок, содержащих типа клеток # 1 выполняется таким же образом, как на шаге 1.3).
- Для обновления среды в лунках, содержащих тип клеток # 2, аккуратно сдвиньте вставку в сторону, чтобы создать пространство, достаточно широкий, чтобы приспособить кончик пипетки. Обновите среду как на стадии 1.4).
- Проверьте наличие пузырьков воздуха и проверки тома, как в соответствии с пунктами 1.5.3) через 1.5.5).
2. Пример: измерения эффектов цитокинов , секретируемых ЛПС-активированных N9 микроглии на нейрональных клетках PC12
Примечание: Следующие шаги предназначены для конкретной колбы, ну и блюдо размеров. Тем не менее, протокол может быть настроен для любых размеров из пластмассы. Для получения информации и композиции см Материалы табл.
- Посев и дифференциации клеток РС12 в мультилуночные планшеты для культур тканей
- Теплый рутина РС12 среда для культивирования клеток, дифференцировка РС12 среда и трипсин-ЭДТА в водяной бане при 37 ° C.
- Используйте РС12 клетки при 60-80% слияния от 75 см 2 колбу.
- С 15 мм пипеткой Пастера, выполняют вакуум-аспирации всей клеточной культуральной среды в колбе.
- Осторожно полоскать клеточный монослой с 5 мл стерильного фосфатно-буферного раствора и удалить жидкость с помощью пипетки Пастера. Будьте осторожны, чтобы не диссоциируют клетки на этом этапе.
- Накройте клеточный монослой 3 мл трипсин-ЭДТА и инкубировать в течение 2-3 мин при температуре 37 ° С.
- Убедитесь, что все клетки отделяют под микроскопом. Если очень мало клеток плывут, инкубировать в течение более длительного периода в течение не более 5 мин.
- Добавьте 10 мл обычной культуральной среды клеток РС12 с целью инактивации трипсина-EDTA.
- С 10 мл пипетки, осторожно растирают в то время, убедившись, что большинство клеток диссоциируют от дна Oе колбы. Избегайте создания пузырьков воздуха в суспензии клеток.
- С помощью той же 10 мл пипетки, передачи клеточной суспензии в центрифужную пробирку на 50 мл.
- Центрифуга в течение 1 мин при 3200 XG
- Удалите супернатант с помощью пипетки Пастера, заботясь, чтобы не нарушить осадок.
- Добавьте 10 мл рутинного РС12 среды для культивирования клеток с 10 мл пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем может быть скорректирована, если осадок необычно маленький или большой. - Растирают с тем же 10 мл пипетки для гомогенизации осадок. РС12 клетки часто слипаются так, по крайней мере, 20 пипеткой и downare необходимо.
Примечание: В то время как энергичные растирания необходимо, во избежание образования пузырьков воздуха в суспензии клеток. - В 1,5 мл пробирку, готовят соответствующее разбавление суспензии клеток в трипановым синим. Граф клеток с использованием гемоцитометра в соответствии с ранее установленными протоколами 74.
- В отдельную 50 мл пробирку, разделить клеточную суспензиюс PC12 дифференциации среды для получения разбавленного клеточной суспензии , подходящие для высева скважин из 24-луночного планшета (30000 ¢ / см 2, 0,6 мл на лунку в соответствии с протоколом производителя).
Примечание: Пластина 24-скважина должна быть предварительно покрыты коллагена , как определено ранее установленными протоколами 75. - Распределить 0,6 мл клеточной суспензии на лунку с помощью микропипетки.
- Когда все лунки высевают, раскачивать пластинку как на этапе 1.1.7).
- Для того, чтобы позволить правильной дифференциации РС12 клеток, инкубировать 24-луночных планшетах в течение 7-9 дней при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в атмосфере влажного PC12 дифференцировки среды 15,16 перед проведением экспериментов с совместным культивированием.
- Выполнение среды изменяется каждый день, удаляя половину жидкости и заменить ее с равным объемом свежей РС12 дифференциации среды.
- Посев N9 микроглии во вставках и лечения с LPS
- За один день до проведения экспериментов совместного культивирования, предварительно обработать ПТФЭ 0,4 мкм порами вставки с обычной N9 среды для культивирования клеток с целью оптимизации присоединения клеток, следующие шаги 1.1.1) через 1.1.4)
- Теплый рутина среда для культивирования клеток Н9 и трипсин-ЭДТА в водяной бане при 37 ° C.
- В то же время, весит примерно 10 мг LPS в 1,5 мл трубки для последующего использования.
Примечание: Так как LPS является мощным провоспалительных эндотоксина и требует особых мер предосторожности, очки, перчатки и респиратор в виде частиц настоятельно рекомендуется. - Используйте клетки N9 на 80-90% слияния от 75 см 2 колбу.
- Выполните шаги 2.1.3) до 2.1.14). Всегда используйте обычную N9 среда для культивирования клеток вместо рутинной культуральной среды РС12 клеток. Также отметим, что N9 микроглии не слипаются столько, сколько делают РС12 клетки, поэтому меньше пипетированием вверх и вниз могут быть необходимы на этапе 2.1.13).
- В отдельную 50 мл пробирку, разделить клеточную суспензию с N9 клеточной культуральной среды к оbtain разбавленной суспензии клеток , пригодных для высева вставок , предназначенных для хранения в 24-луночные планшеты (60000 ¢ / см 2, 0,05 мл на вставку в соответствии с протоколом производителя, по площади поверхности мембраны см информацию производителя).
Примечание: Эти вставки уже покрывают коллагеном производителем и оптимизированы для клеточной адгезии. - Распределить 0,05 мл суспензии клеток на вставку с помощью микропипетки.
- Когда все вставки высевают, рок-пластинку как на этапе 1.1.7).
- Выполните серийные разведения с использованием LPS N9 среды обработки для получения 4 мкг / мл, 2 мкг / мл и / мл рабочих растворов 1 мкг.
- Пипетка 0,05 мл 4 мкг / мл рабочего раствора в одном множество вставок в того, чтобы получить окончательное разбавление 2 мкг / мл.
- Повторите шаг 2.2.10) для двух других рабочих растворов в различных комплектов вкладышей, получая конечные разведения 1 мкг / мл и 0,5 мкг / мл соответственно.
- Вcubate пластины , содержащие вставки в течение 24 ч при 37 ° С в 5% CO 2 во влажной атмосфере , чтобы позволить N9 активацию микроглии с LPS перед проведением экспериментов с совместным культивированием.
- Совместное культивирование нервных клеток РС12 с N9 микроглии
- На 7-9 дней дифференциации РС12 клеток, активации микроглии N9 через 24 часа инкубации с LPS теплой N9 обрабатывающей среды и среды обработки РС12 в водяной бане при 37 ° C.
- Произвести полную среднюю изменения для N9 микроглии, как в шаге 1.3), заменив всю используемую среду на 0,1 мл среды обработки N9. Сделайте это для каждого insert.This необходимо удалить все следы LPS, оставив только активированные микроглии N9 в вставок.
- Произвести полную среднюю изменения для нейрональных клеток РС12 как на этапе 1.4). Перенесите вставки в 24-луночных планшетах , как на стадии 1.5) .Incubate с Н9-РС12 совместное культивирование в течение 24 ч или 48 ч при 37 ° С в 5% CO 2 во влажной атмосфере.
- После того, как 24ч или 48 ч, собирают супернатант и / или клетки на цитотоксичность, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), Вестерн-блот или другие анализы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование вставных систем совместного культивирования особенно актуально при изучении нейровоспалительных процессов, которые наглядно демонстрируют паракринной взаимосвязи между различными сотовыми игроками центральной нервной системы. Иммунитет в ЦНС осуществляется преимущественно резидентных клеток , называемых микроглии , которые контролируют окружающую их среду в их покоя разветвленная положении (фигура 2А) и способны к зондированию возмущений , которые могли бы утруждаешь очень ценным гомеостаза необходимо для правильной функции нейронов 76-78. Активации микроглии, характеризуется принятием амебоидной формы (рис 2В) и умножение популяции клеток называется microgliosis (рисунок 3), а затем выделением провоспалительных медиаторов, таких как цитокины, представляет собой главный аспект нейровоспаления 79 , релиз цитокин служит благородной цели защиты нейронов от вредных нападений и КлосаEly мониторинг. Однако, когда нейровоспаления сбегает этот жесткий контроль, она принимает деструктивный характер и может серьезно повредить центральную нервную систему. Поскольку нервные ткани имеют очень ограниченный потенциал обновления, ЦНС все более восприимчивы к таким авто-деструктивных воспалительных реакций. Изучение перекрестных помех, который существует между нейронами и микроглии является обязательным условием в выяснении механизмов, лежащих в основе нейровоспаления. В отличие от смешанных культур, систем вставки совместно культуры позволяют следователю определить, какие клеточной популяции порождает токсические эффекты и того, какой из пострадавших.
Здесь, РС12 клетки, дифференцированные в течение 7-9 дней с фактором роста нервов совместно культивировали с ЛПС-активированные микроглии N9 с целью quantifyingthe вредных эффектов воспаления, полученных растворимых факторов на нейронах. Для этого нейрональные РС12 клетки культивировали в 24-луночных планшетах в то время как N9 микроглии были высеяны в вкладышами. N9 microgliобрабатывали в течение 24 ч с LPS, очень мощным провоспалительного эндотоксина, содержащегося в наружных оболочках грам-отрицательных бактерий. LPS , как известно, активирует Toll-подобный рецептор 4 , таким образом , вызывая устойчивую воспалительную реакцию в самых разнообразных иммунных эффекторных клеток, в том числе увековеченную мышиной клеточной линии Н9 микроглии 80,81. Следующие репрезентативные результаты показывают , что N9 микроглии активированные с LPS имеют тенденцию к увеличению их численности (рисунок 3) и секретировать растворимые провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 (ИЛ-6), гамма - интерферона (IFN-gamma) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), что легко проникают через мембрану вставок сокультивирования и вызывать цитотоксический повреждение нервных клеток РС12, растущих в нижнем отсеке.
Главной заботой перед передачей LPS активированные N9 микроглии в лунки, содержащие нейрональные клетки РС12 состоит в подтверждении ТНАТл PC12 правильно дифференцированы. Семидневные дифференцированные РС12 клетки должны обладать очевидными нейрональные фенотипы , такие как объемность тела клетки, которая проектирует несколько длинных невриты иногда сами отображающие варикоз (рисунок 4). После того, как эта контрольная точка выполняется, N9 вставки микроглии, содержащие свежую среду лишенные LPS могут быть перенесены в лунки, содержащие дифференцированные РС12. После инкубационного периода в 24 часа или 48 часов, супернатант в нижнем отсеке собирают и анализе на цитотоксичность, на основе лактата выпуска 15,16 дегидрогеназы, а также ELISA 15, для измерения цитокины выполняются. Важно, чтобы собрать надосадочную жидкость в нижнем отсеке для того, чтобы измерить цитокины, которые действительно пересекали проницаемую мембрану и которые могут активировать рецепторы на поверхности клеток РС12. Результаты показывают, что LPS активированные N9 микроглии из верхнего отсека генерирования дозы и времени зависит от CYTotoxic влияние на дифференцированных нервных клеток РС12 , установленных в нижнем отсеке (Рисунок 5). 0,5 мкг / мл LPS, условие, однако, не существенно цитотоксическим через 24 часа или 48 часов. были обнаружены уровни цитотоксичности достичь почти 100% в 2 мкг / мл LPS 48 ч состояние. Кроме того, результаты показывают, что концентрация провоспалительных цитокинов IL-6, IFN-гамма, и TNF-alpha в супернатанте возрастает одновременно с наблюдаемой цитотоксичности. В частности, IL-6 концентрации значительно увеличены после 24 часов только для 2 мкг состояния / мл, в то время как 1 мкг / мл LPS также дает значительно повышенные уровни цитокина после 48 часов (рисунок 6). Микроглия секретируют IFN-gamma , который достигает нижнего отсека в значительно увеличенным образом , когда они обрабатывают 1 мкг / мл и 2 мкг / мл, и инкубируют с дифференцированными нейрональных клеток РС12 для обоих 24 ч или 48 ч (рисунок 7). 0,5 мкг / млсостояние LPS еще раз не повышает уровень IFN-gamma значительно. Наконец, концентрации TNF-альфа в нижнем отсеке были определены количественно с помощью ELISA и были признаны наиболее дополненной активацией микроглии LPS, достигая уровней почти в семь раз важнее контрольной группы (рисунок 8). В частности, оба 24 ч и 48 ч периоды инкубации вызвали важные увеличение TNF-α уровней в надосадочной жидкости. Тем не менее, 1 мкг / мл LPS, состояние дало значительное повышение TNF-α уровней только через 48 часов. В целом, эти результаты показывают, что секретируемые провоспалительные цитокины являются, по крайней мере частично ответственным за цитотоксические эффекты, наблюдаемые в дифференцированных нейрональных клеток РС12 следующих 24 ч или 48 ч периода инкубации с микроглии, активированных различными концентрациями LPS.
Вставка систем совместное культивирование LPS-активированной микроглии и клеток РС12 N9, как было показанобыть особенно полезным при изучении нейровоспаления и в разработке стратегии противодействия ее. Наша группа недавно показали , что LPS-активированный Н9 микроглии выращенных в культуре клеток вставляет демонстрируют повышенную транскрипцию провоспалительных цитокинов, которые , в свою очередь , индуцирует апоптоз клеток РС12 фактор-дифференцированный роста нервов путем скрещивания микропоры вставки 15, 16. В той же парадигме, предварительная обработка на микроглии популяции с полифенольных соединением ресвератрола (0,1 мкМ, 3 ч) предотвратить транскрипцию провоспалительных цитокинов и тем самым препятствовало апоптозу дифференцированных нейрональных клеток РС12, блокируя каспазы-3 активацию и, после этого ДНК расщепление. Другая группа также продемонстрировала нейропротекторное действие витамина Е в с N9-PC12 сокультивирования 26. В дополнение к Н9-PC12 совместных культурах, различные линии иммортализованных клеток или первичные культуры также были использованы в контексте нейровоспаления. Так, например,мышиной микроглии BV2 клеточную линию культивировали совместно с нейробластомы человека SH-SY5Y клетки , чтобы показать антиапоптозную эффект полифенолов лютеолин , по- видимому , опосредованного противовоспалительному потенциальной 17. А также, bv2 микроглии , активированные травмированных клеток РС12 было показано, оказывают анти-апоптотических эффекты в мезенхимальных стволовых клеток 18. Взаимное сигнализации Было показано , что важную роль в Антиапоптозный механизмы , лежащие в первичной нейропротекции микроглии , возложенным на первичных мозжечковых зернистых нейронов 19. Кроме того, первичные нейроны гиппокампа были совместно культивируют с первичной микроглии активированного белка - предшественника амилоида секретируемый, чтобы оценить высвобождение глутамата путем обмена цистеина и последующим ослаблением синаптической функции 20. Наконец, одна группа также показала перекрестные помехи, которая существует между первичными нейронах гиппокампа и первичных микроглии, относящихся к Фракталкин сигнализации, хемокин конститутивно ЭКСПРЕССЭД нейронов в ЦНС , чей рецептор находится на поверхности микроглии 21.
Рисунок 1. Схематическое изображение системы вставки сокультуры. Верхний отсек состоит из вставки , которая содержит один тип клеток и его верхушечную гуморальный среды. Нижний отсек состоит из скважины или чашку, содержащую второй тип клеток. Вставка опирается на краях пластины многоямного для культуры ткани или блюдо. Вставка предназначена лежать чуть выше дна колодца, чтобы не прикасаться к популяции клеток растущего ниже. Среда в нижнем отсеке находится в контакте как с базальной поверхностью первого типа клеток и апикальной поверхности второго типа клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное версион этой фигуры.
Рисунок 2. Микрофотографии N9 микроглии. (A) Необработанные отдыха N9 микроглии в вставок обладают разветвленной клеточной морфологии позволяет им активно контролировать окружающую их среду. (B) N9 микроглии в вставками , обработанных липополисахаридом (LPS) в течение 24 часов отображения амебовидные формы типичны для активированного фенотипа. Эта микрофотография была взята из непосредственно перед передачей вставку , содержащую эти активированные N9 микроглии в лунки , содержащие дифференцированные РС12 клетки , как показано на рисунке 4. Шкала бар = 25 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Микрофотографии дифференцированных нейрональных клеток РС12. Семидневный фактор роста нервов дифференцированных нейронов РС12 клетки демонстрируют очевидные нейрональные фенотипы , такие как длинные невриты и варикоз. Эта микрофотография была взята из непосредственно перед передачей вставок , содержащих активированные микроглии N9 как изображено на рисунке 2. Шкала бар = 25 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. цитотоксическое действие липополисахарида (LPS) -активированную микроглии на дифференцированных нейрональных клеток РС12.N9 микроглии активировали различными концентрациями LPS в течение 24 ч, а затем переносили в лунки, содержащие дифференцированные нейрональные клетки РС12 в течение 24 ч или 48 ч. Цитотоксичность оценивали с помощью анализа высвобождения лактатдегидрогеназы проводили на супернатанта нижнего отсека. Значительные различия между группами установлено путем одностороннего анализа дисперсии, а затем после специального анализа Тьюки с программой GraphPad ИНСТАТ версии 3.06 для Windows (Сан-Диего, Калифорния; www.graphpad.com). Все данные, проанализированные на 95% доверительного интервала, выражены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего значения из 3-х независимых экспериментов, в которых были рассмотрены 6 скважин. Звездочки указывают статистические различия между лечения и контроля состояния (*** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Концентрация I nterleukin-6 (ИЛ-6) в надосадочной следующей N9 активации липополисахаридом (LPS). N9 микроглии активировали различными концентрациями LPS в течение 24 ч, а затем переносили в лунки , содержащие дифференцированные нейрональные клетки РС12 для 24 ч или 48 ч. ИЛ-6 концентрации в надосадочной жидкости нижнего отсека оценивали с помощью ELISA. Значительные различия между группами установлено путем одностороннего анализа дисперсии, а затем после специального анализа Тьюки с программой GraphPad ИНСТАТ версии 3.06 для Windows (Сан-Диего, Калифорния; www.graphpad.com). Все данные, проанализированные на 95% доверительного интервала, выражены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего значения из 3-х независимых экспериментов, в которых были рассмотрены 6 скважин. Звездочки указывают статистические различия между лечением и конусловие Троль (*** р <0,001, ** р <0,01 и * р <0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Концентрация гамма - интерферона (IFN-gamma) в надосадочной жидкости , следуя N9 активации липополисахаридом (LPS). N9 микроглии активировали различными концентрациями LPS в течение 24 ч, а затем переносили в лунки , содержащие дифференцированные нейрональные клетки РС12 в течение 24 часов или 48 ч. Концентрации IFN-gamma в надосадочной жидкости нижнего отсека оценивали с помощью ELISA. Значительные различия между группами установлено путем одностороннего анализа дисперсии, а затем после специального анализа Тьюки с программой GraphPad ИНСТАТ версии 3.06для Windows (Сан-Диего, Калифорния; www.graphpad.com). Все данные, проанализированные на 95% доверительного интервала, выражены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего значения из 3-х независимых экспериментов, в которых были рассмотрены 6 скважин. Звездочки указывают статистические различия между лечения и контроля состояния (** р <0,01 и * р <0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8. Концентрация фактора некроза опухоли альфа (TNF-alpha) в надосадочной жидкости , следуя N9 активации липополисахаридом (LPS). N9 микроглии активировали различными концентрациями LPS в течение 24 ч, а затем переносили в лунки , содержащие дифференцированные нейрональные клетки РС12 для 24 ч или 48 ч. ФНО-αКонцентрации в надосадочной жидкости нижнего отсека оценивали с помощью ELISA. Значительные различия между группами установлено путем одностороннего анализа дисперсии, а затем после специального анализа Тьюки с программой GraphPad ИНСТАТ версии 3.06 для Windows (Сан-Диего, Калифорния; www.graphpad.com). Все данные, проанализированные на 95% доверительного интервала, выражены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего значения из 3-х независимых экспериментов, в которых были рассмотрены 6 скважин. Звездочки указывают статистические различия между лечения и контроля состояния (*** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Самым важным шагом любой системы эксперимента вставка сокультуры на самом деле живет в выборе правильной вставки для использования. Размер пор и материал мембраны должен быть принят во внимание тщательной, не забывая учитывать тип клеток, которые будут посеяны и цель эксперимента. Например, хемотоксических анализы могут использовать один и тот же тип мембраны, чем клеточные сокультурах для анализа модуляций поведение клеток, индуцированные секретируемых растворимых факторов, в отсутствии межклеточного контакта. Тем не менее, оба типа экспериментов требуют различных размеров пор: более крупные из них для бывших, чтобы позволить миграцию клеток, а также более мелкие для последнего, чтобы предотвратить миграцию клеток и межклеточного контакта. Для оценки клеточных изменений, опосредованных секретируемых растворимых факторов, в отсутствии межклеточного контакта, размером пор 0,4 мкм или 3 мкм, как правило, целесообразно, поскольку они позволяют для больших молекул, таких как белки, чтобы пересечь, но предотвратить большинство клеток делать так. перепонкаматериал в значительной степени зависит от типа клеток и методы, которые будут использоваться в конце протокола для культивирования клеток. В кратком изложении, ПЭТ-мембраны обеспечивают хорошую видимость клеток, поскольку они очевидны, но не коллаген покрытием, которое может быть проблемой для адгезивных клеток, которые необходимы для поддержки, подлежащей обработке. Они также имеют лучшую химическую стойкость к фиксаторов, которые, наряду с их хорошими оптическими свойствами, что делает их идеальными для гистологических исследований. С другой стороны, PC мембраны предлагают плохой видимости клеток, поскольку они являются прозрачными и не коллаген покрытием. Тем не менее, они обладают самой высокой плотностью пор и наиболее диверсифицированных наличие размеров пор. Наконец, PTFE мембраны очевидны во влажном состоянии, но только позволяют визуализации ячейки описываются в микроскоп. В качестве основных преимуществ, они коллагена с покрытием, что также делает их немного толще. Важно отметить, что покрытие из ПЭТ или мембраны ПК вставки с коллагеном может перекрывать поры и препятствуют прохождению растворимы фактоRS. В любом случае, большинство производителей предлагают комплексные вставки направляющие, чтобы помочь исследователям в выборе правильной вставки. В нашей конкретной парадигмы, выбор плотности металлизации, средства массовой концентрации сыворотки, дни дифференцировки дней с момента активации LPS, концентрации LPS, и покрытие колбы для клеток РС12 были оптимизированы в течение многих лет работы с этими сокультуры систем 15 , 16. Стоит отметить, что была выбрана плотность металлизация N9 микроглии в вставках 60000 ¢ / см 2 , с тем , чтобы получить 40-50% сплошности в момент начала со-культуры и, таким образом, чтобы дать им пространство для умножения на их активации ЛПС. Другие условия, когда Оптимизированные могут также дать удовлетворительные результаты, такие как замена коллаген с помощью L-лизина в колбах, предназначенных для поддержания нативной РС12.
Для повышения устойчивости результатов, несколько различных элементов управления может быть выполнена. Пытаясь доказать, что растворимые факторыответственны за наблюдаемые эффекты, смешанные культуры, проявляющие прямой контакт клетка-клетка и подготовленному экспериментов среда должна проводиться параллельно. Кроме того, с использованием антител, чтобы нейтрализовать специфический фактор секретируется поможет в идентификации молекулы, ответственной за паракринной эффект, который воспринимается. Когда это возможно, блокируют рецептор или часть его сигнального пути, чтобы определить точное идентичность рецептора активации. Если молекула используется для активации одной клеточной популяции до начала сокультуры эксперимента со вторым типом клеток, таких, как в примере, описанном выше, необходимо принимать во внимание присутствие молекулы в системе. В качестве первого варианта, носитель должен быть полностью изменен до начала эксперимента с совместным культивированием с тем, чтобы гарантировать, что молекула отсутствует в системе в целом. В качестве второго варианта, условие, следует добавить, где одна молекула инкубируют со вторым типом клеток для того, чтобыоценить его эффект при отсутствии первого типа клеток. Если нет никакого эффекта молекулы на втором типе клеток, не будет никакой необходимости изменять среду до начала эксперимента сокультуры. Аналогичным образом, если оба типа клеток не выращивают в той же среде для культивирования клеток, аналогичные меры предосторожности должны быть приняты, чтобы убедиться, что различия в составе среды не влияют на одну или другую популяцию клеток. Хотя оба средства массовой информации будут отделены друг от друга вставки мембраны сначала, диффузия обязан гарантировать, что они будут смешиваться в течение длительного периода инкубации. Кроме того, некоторые проблемы могут возникнуть из аберрантных разрушения растворимых отношений фактор-рецепторов. Среди нескольких причин ошибки, чрезмерное использование ферментативной диссоциации и наличие важных концентраций сыворотки может повлиять на рецепторы клеточной поверхности. Другие причины ошибки в системах вставки сокультивирования включают, но не ограничиваются ими: 1) ненадлежащих методов клеточной культуры, такие как удаление совокупность клеткикультуральная среда в слишком большом количестве скважин, в то же время, в результате чего клетки сохнуть, 2) монослой, который слишком сливающийся во вставке, ответственный за расгерметизируя вставного мембраны и предотвращая апикально-секретируемые молекулы, чтобы достичь нижнего отсека, и 3) misadjusted стечение клеток, что приводит к избыточной или недостаточной экспрессии растворимых факторов, приводящих к физиологически нерелевантные результаты или отсутствие какого-либо эффекта.
В то время как только один сценарий вставки совместной культуры была представлена здесь, существует множество способов использования этого весьма разносторонней техники. Здесь, один тип клеток был предварительно обработан с молекулой, ответственной за индуцировать секрецию растворимого фактора, который, после переноса вставки в скважину, воздействует на поведение второго типа клеток. Кроме того, можно инкубировать в обоих типах клеток вместе в системе сокультуры перед отделением их для обнаружения повышенной уязвимости или устойчивости популяций одного или обоих клеток к скрытым лечения. эйWever, при рассмотрении вопроса о самой зачаточной форме, этот метод может использовать двух популяций клеток, инкубированных вместе без какого-либо лечения, с целью оценки базального паракринной ответную сигнализацию.
Самым важным ограничением этого метода является то, что очень короткоживущие молекулярные структуры , такие как активные формы кислорода не выдерживают расстояние, разделяющее популяции клеток , растущих в верхнем отделении и один в нижнем отсеке 82. Последние разработки в области методов совместного культивирования попытался ответить на эту проблему с помощью микроизготовленном субстрат культуры , способной поддерживать две клеточные популяции в микромасштабной близости 83. В дополнение к подшипниковой все преимущества систем вставки сокультивирования, таких как население конкретного обнаружения изменений и двунаправленной передачи сигналов, этот микроизготовленном экран было также продемонстрировано, чтобы сделать возможным обнаружение взаимодействий ближнего радиуса действия, которые не были до Detectable вследствие распада растворимых факторов на расстояниях. Эта клеточная культура платформа является последним новшеством в клеточной культуре совместно и обещает помочь разгадать механизмы между клетками, которые были пропущены перед выдачей сигнала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
References
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
- Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
- Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
- Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
- Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
- Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
- Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
- Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
- Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
- Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
- Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
- Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
- Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
- Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
- Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
- Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
- Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
- Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
- Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
- Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
- Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
- De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
- Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
- Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
- Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
- Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
- Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
- Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
- Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
- Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
- Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
- Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
- Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
- Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
- Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
- Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
- Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
- Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
- Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
- Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
- Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
- Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
- Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
- Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
- Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
- Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
- Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
- Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
- Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
- Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
- Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
- Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
- Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
- Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
- Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
- Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
- Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
- Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
- Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
- Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
- Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
- May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
- Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
- Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
- Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
- Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
- Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
- Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
- Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).
