Introduction
Выражение посттранскрипционных ген точно регулируется, начиная с транскрипции ДНК в ядре. Контролируется РНК - связывающие белки (ОДП), мРНК биогенеза и метаболизм происходят в очень динамичных частиц рибонуклеопротеидных (РНП), которые ассоциируются и диссоциируют с мРНК предшественника субстрата при прогрессировании метаболизма РНК 1-3. Динамические изменения в компонентах RNP влияют на пост-транскрипционный судьбу мРНК и обеспечения контроля качества при обработке первичных транскриптов, их оборота ядерных материалов и локализации, их деятельности в качестве шаблонов мРНК для перевода, и в конечном итоге оборот зрелых мРНК.
Многочисленные белки обозначены как ОДП в силу своих консервативных областей аминокислот, в том числе мотив распознавания РНК (RRM), двухцепочечной РНК - связывающий домен (РДО), и вытягивание основных остатков (например, аргинин, лизин, и глицин) 4. ОДП обычноизолированных стратегиями иммунопреципитационных и просеивают, чтобы идентифицировать их родственными РНК. Некоторые ОДП совместно регулируют пре-мРНК, функционально связанные, обозначенные как РНК регулонов 5-8. Эти ОДП, их родственными мРНК, а иногда и некодирующих РНК, образуют каталитические РНП, которые различаются по составу; их уникальность обусловлена различными комбинациями сопутствующих факторов, а также временной последовательности, расположения, и продолжительность их взаимодействий 9.
РНК иммунопреципитации (RIP) является мощным средством , чтобы изолировать РНП из клеток и выявления сопутствующих транскриптов с помощью анализа последовательности 10-13. Переход от кандидата к геному скрининг возможна через RIP в сочетании с микрочипов анализа 14 или высокой пропускной последовательности (Секвенирование РНК) 15. Точно так же, соосаждение белки могут быть идентифицированы с помощью масс - спектрометрии, если они достаточно обильны и отделим от совместным осаждением антителом 16,17. Здесь мы рассматриваем методику выделения RNP компонентов определенной родственным РНК из культивируемых клетках человека, хотя подход изменяемыми для растворимых лизатов клеток растений, грибов, вирусов и бактерий. Downstream анализ материала включают идентификацию кандидатов и проверку с помощью иммуноблот, масс - спектрометрии, биохимический анализ ферментативной, RT-КПЦР, микрочипов и Секвенирование РНК, как представлено на рисунке 1.
Учитывая фундаментальную роль RNPs в контроле экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне, изменения в экспрессии компонентов ОДП или их доступности к родственным РНК может быть вредно для клетки и связаны с несколькими типами расстройств, включая неврологические заболевания 18. DHX9 / РНК хеликаза А (РГА) необходимо для перевода отдельных мРНК клеточных и ретровирусных происхождения 6. Эти родственными РНК обладают структурно-родственные элементы цис-действующие в рамках своих5 'UTR, который обозначается как пост-транскрипционном управляющего элемента (PCE) 19. РГА-PCE активность необходима для эффективной кэп-зависимой трансляции многих ретровирусов, в том числе ВИЧ-1, а также гены , регулирующие рост, в том числе Джунд 6,20,21. Кодируемый геном (эссенциальной dhx9), РГА имеет важное значение для клеточной пролиферации и его понижающей регуляции исключает жизнеспособность 22 клеток. Молекулярный анализ RHA-PCE РНП является важным шагом на пути к пониманию того, почему РГА-PCE деятельность необходимо контролировать клеточную пролиферацию.
Точная характеристика компонентов RNP РГА-PCE в стационарном состоянии или при физиологической возмущения клетки требует селективного обогащения и захвата из РГА-PCE RNPs в достаточном изобилии для анализа вниз по течению. Здесь, ретровирусный РНК PCEgag был помечен 6 копий сайта цис-связывания РНК для белка оболочки MS2 (СР) в пределах открытой рамки считывания. Белок оболочки MS2 был экзоgenously экспрессируется совместно с PCEgag РНК плазмиды трансфекции для облегчения сборки RNP в растущих клетках. RNPs , содержащие белок оболочки MS2 с родственным MS2-меченой РНК PCEgag подвергали иммунопреципитации из клеточного экстракта и захватили на магнитных шариков (рис 2а). Для выборочного захвата компонентов RNP, присоединенные к PCE, иммобилизованного РНП инкубировали с олигонуклеотидом, комплементарным последовательностям дистальных к PCE, образуя гибрида РНК-ДНК, который является субстратом для активности РНКазы Н. Так как PCE позиционируется в 'терминале 5' 5'-нетранслируемой области, олигонуклеотид комплементарны последовательности РНК, смежных с ретровирусной сайта инициации трансляции (ГАГ старт-кодон). РНКазы H расщепления вблизи начала рвотным кодонов выпущен UTR комплекс 5 'от иммобилизованным RNP, который собирают в качестве элюента. После этого образец оценивали с помощью ОТ-ПЦР, чтобы подтвердить захват PCEgag и с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга, чтобы подтвердить captuповторно из белка оболочки мишени MS2. Валидация из PCE-ассоциированной РНК связывающего белка, DHX9 / РНК хеликаза А, затем выполняется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
| Буферные композиции |
| Промывочный буфер: |
| 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4 |
| 150 мМ NaCl |
| 3 мМ MgCl2 |
| С низким содержанием соли буфера: |
| 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 |
| 10 мМ NaCl |
| 3 мМ MgCl2 |
| 2 мМ ДТТ |
| 1x коктейль ингибиторов протеаз ЭДТА свободной |
| РНКазы Выход 5 мкл / мл (ингибитор РНКазы) |
| Цитоплазма лизирующего буфера: |
| 0,2 М сахарозе |
| 1,2% Тритон Х-100 |
| NETN-150 промывочного буфера: |
| 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4 |
| 150 мМNaCl |
| 0,5% NP-40 |
| 3 мМ MgCl2 |
| 10% Глицерин |
| Связывание буфера: |
| 10 мМ HEPES рН 7,6 |
| 40 мМ KCl, |
| 3 мМ MgCl2 |
| 2 мМ ДТТ |
| 5% глицерина |
Таблица 2: Буферные композиции.
1. Подготовка клеток и матрицей аффинной
- Культура клеточная линия интереса к югу от слияния (80%) в 10 см чашку. Используйте 10 см пластины для независимых иммунопреципитации (IP) флагового-меченый NLS-MS2 белка оболочки. Выполните IP с помощью антисыворотки к FLAG-эпитопа тега. Выражая флаге-меченый MS2 белка оболочки плазмиды, трансфекции клеток 24-48 ч до начала уборки урожая 20.
Примечание: Конкретный RNP может быть обогащена от ядерной или цитоплазмеIC лизаты или биохимически-фракционированного препарат, например фракций градиента сахарозы. Рекомендуется, чтобы урожай лизат от не-трансфицированных клеток параллельно возбуждать дополнительный отрицательный контроль. - Передача 60 мкл на IP белок G магнитный шарик суспензии в 1,7 мл трубки микроцентрифужных.
- Поместите пробирку на магнитной стойке для микроцентрифужных трубки, чтобы отделить шарики из раствора для хранения.
- Удалите решение для хранения данных с помощью тщательно выводили его с микропипетки.
- Снимите трубку от магнита стойки.
- Мытье и уравновешивать бусинки с 600 мкл ( в 10 раз использованную объем гранул) 1х промывочного буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 3 мМ MgCl 2, и 150 мМ NaCl) , и конец поверх конца вращения для 3 мин при комнатной температуре.
- Поместите пробирку на магнитной стойке и удалите промывочный буфер.
- Добавьте 10 томов (600 мкл) 1x промывочного буфера и иммунопреципитации FLAG антитела к уравновешенной прotein G магнитные шарики (в зависимости от суммы, рекомендованные изготовителем для иммунопреципитации) и поворачиваем конец через конец при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут, чтобы конъюгат антитело иммунопреципитации. С помощью соответствующего изотипа IgG в качестве подходящего антитело отрицательного контроля.
- Поместите пробирку на магнитной стойке, чтобы собрать шарики и для удаления супернатанта.
- Извлеките трубку от магнита стойки и моют Антитело-гранулами, конъюгированными с 10 объемами (600 мкл) 1х промывочного буфера и вращения в течение 3 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг дважды.
- Поместите пробирку на магнитной стойке и удалите промывочный буфер.
2. Сбор сайтов RNPs
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка RNPs во время инкубации после этапа 1.8.
- Удалить культуральную среду из клеток отсасыванием и промыть клетки дважды с 1-5 мл охлажденной льдом 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). С помощью мобильного скребок, чтобы сместить влажный,прилипшие клетки до сбора путем центрифугирования при 226 мкг в течение 4 мин при 4 ° С.
- Добавьте 375 мкл охлажденного на льду, с низким содержанием соли буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 3 мМ MgCl 2, 10 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ, 1x протеаза-ингибитор коктейль, ЭДТА-свободный, и 5 мкл / мл РНКазы Ингибитор) к осадку клеток и позволяют припухлость, поместив его на льду в течение 5 мин.
Примечание: портного объема низкого солевого буфера в соответствии с размером клеточного осадка. Что соответствует 1,2 × 10 6 клеток от 10 см планшета, 375 мкл буфера достаточен. - Для того, чтобы собрать цитоплазматический клеточный лизат, добавляют 125 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса (0,2 М сахарозы / 1,2% Тритон Х-100), а затем выполнить 10 ударов с помощью гомогенизатора Даунса, который был предварительно охлажденные в ведре со льдом.
Примечание: Для того, чтобы собрать общий клеточный экстракт, стандартный РИПО буфера для лизиса рекомендуется для солюбилизации нуклеоплазме / хроматина. - Спин в микроцентрифуге на максимальной скорости (16 000 XG) в течение 1 мин; это приведет к удалению супернатант мусора аго ядра.
- Передача супернатант в новую 1,7 мл микроцентрифужных трубки, которая была на льду. Определить общую концентрацию белка с помощью стандартного, лабораторно предпочтительным способом, таким как Бредфорда 23. Резервный аликвоты по крайней мере, 10% для Вестерн-блот-анализа, который будет использоваться в качестве элемента управления вводом. Используйте заготовленную клеточный лизат непосредственно для иммунопреципитации или хранить его при температуре -80 ° С для последующего анализа.
Примечание: По нашему опыту, эти образцы могут быть сохранены и использованы несколько месяцев для анализа иммунопреципитации без компромисса целостности.
3. иммунопреципитация
- Добавьте требуемый объем заготовленной лизата клеток, основанный на концентрации белка, определенной на шаге 2.5, с антителом, конъюгированным с бусинами мишеней. Использование 1x промывочного буфера, довести общий объем до 600 мкл и вращать концевую перепроизводство конец в течение 90 мин при комнатной температуре.
Примечание: Этот период времени достаточно для созданиянадежная изоляция RNP комплексов с высоким сродством при минимизации неспецифического связывания. Развести альтернативные источники RNP, такие как фракции градиенте сахарозы, по крайней мере, 1: 1 с 1х промывочным буфером, а затем инкубируют их с ранее полученными бусинка-антитело, как было упомянуто выше. - Через 90 мин инкубации поместите IP-трубку на магнитной стойке, чтобы собрать бусы. Резервный супернатант проточных.
Примечание: Этот первый проточный является важным контрольным образцом для измерения эффективности IP. Анализ иммуноблот будет обеспечивать индикацию эффективности ИС, а также специфичность исследуемых взаимодействий. Рекомендуется сохранить этот супернатант для нисходящего анализа. - Промыть RNP-Bound, антитело-гранулами , конъюгированными с 10 объемами (600 мкл) охлажденного льдом NETN-150 буфером для промывки (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 150 мМ NaCl, 3 мМ MgCl 2, 0,5% NP40, и 10% глицерина) при вращении в течение 3 мин при комнатной температуре. Повторите шаг 3 раза.
Примечание: Этот буфер отличается от буфера для лизиса и эффективно снижает слабые или неспецифические ассоциации. - После последней промывки, ресуспендируют Иммобилизованная RNP комплексы в 60 мкл охлажденного льдом 1х буфере для связывания (10 мМ HEPES, рН 7,6; 40 мМ KCl, 3 мМ MgCl 2, 5% глицерина и 2 мМ DTT) и резерв 10% иммобилизованных сложных бусинок для вестерн-блоттинга и 20% для выделения РНК.
4. Элюирование
- Отрегулировать оставшийся объем до 100 мкл охлажденного льдом буфера 1х связывания и нагревают пробирку при 70 ° С в течение 3 мин.
- Для выделения родственных РНК-белковых комплексов, добавить ~ 30 нт ДНК олигонуклеотид, комплементарный границе с 3'-последовательность РНК интереса и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре при осторожном качалки (100 нМ олигонуклеотида достаточно).
ПРИМЕЧАНИЕ: олигонуклеотид антисмысловой нуклеотидных остатков, прилегающих к переводу запуска сайт PCE конструкции, используемой в качестве examplе в этом протоколе. Соответствующая последовательность комплементарность обеспечивается ~ 40% содержанием GC. Конструкция антисмысловой олигонуклеотид для эффективной гибридизации с минимальной комплементарной области РНК-мишени. - Добавить 5-10 единиц РНКазы H в пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы расщепить РНК РНК: ДНК-гибрида. Передача супернатант в стерильном 1,7 мл микроцентрифужных трубки; Этот образец содержит захваченные RNP комплексы, представляющие интерес.
Примечание: В зависимости от доступности родственного РНК, два или более циклов обработки РНКазой H может быть полезным для увеличения численности выборки для последующих анализов. - Используйте 20% элюата в Вестерн-блот-за известных ассоциированных белков и 20% элюата для выделения РНК с последующим RT кПЦР. Остальные 60% могут быть использованы для масс-спектрометрии или для идентификации белковых компонентов.
- Параллельно, при условии аликвоты зарезервированной клеточного лизата до выделения РНК и ОТ-ПЦР. Это ассssment обеспечивает индикацию обогащения РНК внутри РНП комплекса.
Примечание: Используйте изолированный препарат белка в контрольной вестерн-блоттинга, чтобы убедиться, что расщепление РНКазы Н был эффективен в освобождении RNP от immunuoprecipitated комплекса.
5. Белок Анализ Электрофорез и Вестерн-блот
- При условии примерно 10-20% от общего объема образца SDS-PAGE и иммуноблоттинга в соответствии со стандартным лабораторным протоколом.
Примечание: Этот шаг служит для проверки эффективности и специфичности IP перед ниже по течению анализа РНК. Он также может быть использован для оценки белковой композиции изолированного RNP комплекса.
6. Сбор РНК Иммунопреципитированные
Примечание: Выделение РНК можно сделать с помощью метода Trizol или после описанного протокола.
- Ресуспендируют половину от общей выборки в 750 мкл кислотного реагента гуанидина тиоцианата и инкубировать при комнатной темпера тура в течение 5 мин до экстракции РНК из захваченных PCE-RNP комплексов.
- Добавить 200 мкл хлороформа в пробирку, энергично встряхивают в течение 10 сек, и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
- После центрифугирования при 16000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С, собирают водной фазы в заново пробирку и добавляют равный объем изопропилового спирта. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение не менее 10 мин. Добавляют 1 мкл гликоля синего к образцу и хранить его при температуре -20 ° C в морозильной камере для эффективного осаждения или обработки в будущем.
- Отцентрифугировать пробирку при 16000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Осторожно собрать и отбросить супернатант с тем, чтобы не нарушить РНК гранул; использование п-200 микропипетки наконечник рекомендуется, чтобы облегчить этот процесс.
- Добавьте 500 мкл 75% этанола в каждую пробирку, вихревые, и центрифугировать пробирки при 16000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Осторожно собрать и отбросить супернатант, как на этапе 6.4. Воздух-сухой осадок в течение 2-3 мин и ресуспендируют в 100 мкл РНКазы воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивать время, в течение пеллетах воздух сушит, чтобы избежать проблем с взмучивания. - Применить 100 мкл образца РНК на колонку очистке РНК. Процесс его с использованием протокола производителя. Элюции РНК в 30 мкл РНКазы воды и хранить при температуре -80 ° С в течение до 3-х месяцев.
Примечание: Эта изолированная РНК подходит для нисходящего анализа с помощью ОТ-ПЦР реального времени (КПЦР), микрочипов и РНК последовательности. В зависимости от избытка RNP и эффективность, с которой РНП интерес изолирована, то же лизат может быть подвергнут двум и более раундов IP для генерации достаточного количества РНК, применимый для нисходящего потока анализов.
7. обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с помощью ПЦР
- Тема выделенной РНК обратной транскрипции с помощью случайного праймера с помощью обратной транскриптазы высокого качества (RT), в соответствии с производинструкции cturer в.
- Для амплификации РНК интерес, сконструировать ген-специфического антисмыслового праймера в последовательности расщепления РНКазы Н. Используйте аналогичные количества антисмыслового олигонуклеотида, случайным праймером, или праймера олиго-дТ (см Материалы таблицу).
Примечание: олиго-дТ праймера и поли-adenylated мРНК обеспечивают положительные реакции управления для реакций ОТ-ПЦР. - Резерв 5% от реакции РТ (1 мкл) для препаративной кПЦР сделано в тандеме с негативного контроля лизата IP и образцы ДНК позитивного контрол, чтобы определить частоту среза и произвести стандартную кривую. Если значение КТ препаративной кПЦР находится вне диапазона стандартной кривой, разбавлять реакцию RT в следующих друг за другом 1: разведений 5 и повторить шаг 7.2.
Примечание: Для получения РНК-последовательности и масс-спектрометрического метода, пожалуйста, см Дополнительный файл метода. Пожалуйста , нажмите здесь , то просмотра этого файла Дополнительный метод. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты предыдущих RIP определены ретровирусных кляп РНК и выбраны клеточные РНК , которые сопреципитат с DHX9 / РГА, в том числе ВИЧ-1, 6 Джунд 6 и Хур (Fritz и Борис-Лори, неопубликованный). Ретровирусный 5 'НТО было продемонстрировано, сопреципитата с DHX9 / RHA в ядре и взаимодействовать изолируют в цитоплазме на полирибосом. Он однозначно определяется как цис - -Актерское пост-транскрипционного элемента управления (PCE) 6. Для выделения рибонуклеопротеидные комплексов PCEgag РНК-Rha (РНП), образованные в пролиферирующих клетках, мы провели FLAG-MS2 RNP иммунопреципитации в трансфицированных лизатов HEK293 клеток. Результаты показывают эффективное осаждение белка FLAG-MS2. Следует отметить, что DHX9 / РГА идентифицируется в пределах этого комплекса RNP и не в пределах контроля изотипа IgG, ни в пределах клеточного лизата негативного контроля HEK293 (фиг.2А). Матрица, содержащая RNPs инкубировали с комплементарной 30-nt олигонуклеотида, а затем РНКазы Н расщепление гибрида РНК-ДНК проводили. После РНКазы Н пищеварения, элюаты анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Продемонстрировал РНКазы Н расщепление PCEgag РНК в гибридном положении РНК-ДНК выпустила RNP комплекс специфически связывается с УТР 5 '. В DHX9 / РГА-ассоциированные RNPs были полны решимости быть обогащены элюентов. Важно отметить, что FLAG-MS2-связанные RNPs остался с антителами гранулами , конъюгированными (рис 2В). Совместное иммунопреципитации MS2 стволовых петли , содержащей РНК ретровирусов PCEgag в клетках и в элюентов была подтверждена с помощью ОТ-ПЦР и qRTPCR (фиг.2с). Результаты подтвердили , отборный ассоциацию между DHX9 / РГА и ретровирусов 5 'UTR, который был выделен в качестве уникального RNP важного для целенаправленного контроля перевода 6.
Рисунок 1: RNP изоляция и обогащение конкретных РНП, связанных с 5 'UTR из PCEgag с помощью РНКазы H расщепления. Рабочий процесс , показывающий шаги для выделения выбранного рибонуклеопротеидные сформированную De Novo в клетках, его коллекция на олигонуклеотиды наведением RNaseH расщепления, а ниже по течению анализ РНК и белковых компонентов. Резюме аффинной хроматографии с использованием взаимодействия высокого сродства между мультимеры для РНК MS2 стволовых петли и MS2 белка оболочки-ФЛАГ слитого белка для захвата PCE РНК на флаге бусинок. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: РНК PCEgag содержащий 6 MS2 РНК сайты связывания был захвачен иммобилизованным FLAG-меченый MS2 белка оболочки, а также специфические RNPs , связанные с 5 'UTR быливыпущенный помощи направленного на олигонуклеотиды РНКазы H расщепления. Клетки НЕК293 котрансфицируют с pAR200 (плазмида, содержащая PCEgag и 6х MS2 петель в интроне ВИЧ) и плазмиды, экспрессирующей FLAG эпитоп-меченый белок MS2 с последовательностью ядерной локализации (NLS). Клетки собирали и цитоплазма был выделен в 48 ч после трансфекции. Цитоплазматические лизаты подвергали иммунопреципитации с либо FLAG антителом или контролем IgG. (А) Эффективность IP - определяли с помощью иммуноблоттинга с использованием антитела анти-FLAG. DHX9 / РГА, A PCE-связывающий белок, служил в качестве положительного контроля; PCE-содержащих РНК иммунопреципитации с белком MS2. Дорожки 1-3: Входные белки, используемые для IP. Дорожки 4-5: ФЛАГ IP флаговых MS2 избыточно экспрессируется лизат и HEK293 цитоплазматического клеточного лизата. Дорожка 6: IgG IP флаговых MS2 избыточно экспрессируется лизата. Дорожки 7-9: Проточный из IP-адресов. (B) 5 'UTR-привязанные RNPs обогащались РНКазы H расщепления. Дорожки 1-3: Элюатов 5 'UTR-связанным белком РНКазой H. Переулках 4-6: белки, которые связываются с антителами с сопряженными бусин. (С) ПЦР обратной транскриптазы и в режиме реального времени количественный ПЦР - специфической РНК , связанные с различными фракциями РНП. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выделение RNP и стратегия идентификации родственным РНК, описанный здесь является выборочность средством изучения специфического взаимодействия РНК-белок и выявления кандидатов из белков совместно регулирующих конкретную RNP в клетках.
Преимущество использования олигонуклеотид-направленного РНКазы H расщепления для выделения РНП является способность захватывать и конкретно анализировать цис-РНК элемент RNP на гетерогенных RNPs связанных вниз по течению к цис-РНК интересующего элемента. Поскольку обилие родственным РНК в данной RNP является незначительная часть собранных РНП, выделенных без РНКазы H расщепления, основным недостатком этого процесса является нехватка родственного RNP. По нашему опыту, это ограничение потребовало от 5 до 10 раз больше исходного материала, чем обычные РНК IP для обнаружения в чувствительных иммуноблот и протеомики анализы. Еще одно преимущество, обеспечиваемое иммобилизации RNP является удобство повторения РНКазы H TREatment и сбора дополнительной элюата. По нашему опыту, 2-4 раундов лечения РНКазы Н было целесообразно собирать дополнительные элюата.
В этом протоколе, ключевые технические проблемы являются поддержание оптимальной температуры и обеспечения стерильной обработки реагентов. Все реагенты должны быть RNase- и протеаз бесплатно. Целостность образца РНК является потенциальной ловушкой, чтобы рассмотреть, если взаимодействие РНК-белок не обнаруживается.
Этот метод требует эффективного лизиса клеток, чтобы получить доступ к РНП в подходящем количестве для обнаружения. В то время как важный нюанс является неполной лизис клеток, активные методы лечения могут увеличить неспецифических взаимодействий с РНК. Таким образом, экспериментальные условия должны быть измерены с целью обогащения конкретных взаимодействий белок-РНК. Тем не менее, использование высокой жесткости стирок может устранить важные еще переходные взаимодействия. Таким образом, условия стирки являются еще одной переменной considэр в конкретных требований конкретного эксперимента.
Эффективность RIP является мощным средством для выделения родственных партнеров РНК-белок, но некоторые переходные или слабые взаимодействия, которые имеют физиологическое значение теряются при связывании или стадии промывки. Перекрестное связывание комплекса mRNP является вариантом для рассмотрения в анализе. Кроме того, физиологические условия роста следует иметь в виду при анализе нормативных RNPs, как уровень экспрессии родственного РНК или РБП могут быть подвергнуты физиологических колебаний при определенных условиях. Кроме того, тип вниз по течению анализа также будет играть определенную роль в выборе лизису и условия стирки во время иммунопреципитации.
Кроме того, успешное иммунопреципитации требует, чтобы лизат клеток значительно разбавить (по крайней мере, 1: 1). 1x промывочного буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,3; 3 мМ MgCl 2, и 150 мМ NaCl) , является выбранный разбавитель, в качестве его составне влияет на RNP целостность, растворимость в растворе или антитело-антиген взаимодействий.
Для получения вниз по течению масс - спектрометрии, образцы должны быть свободны от солей, в том числе Na +, Cl -, и Трис, а также некоторых моющих средств. При необходимости, компоненты буферов-ионных соединений-могут быть уменьшены с помощью диализа или ионной фильтрации обмена, а также в некоторых случаях летучие буферы полезны в конечных стадиях. В тех случаях, когда антисыворотки используют для выделения эпитоп-меченый белок, экспрессируемый трансфекцией, Вестерн-блот-проверка рекомбинантного белка с использованием первоначального клеточного лизата должны быть выполнены перед дальнейшим анализом. В случае использования эпитоп тега (т.е. FLAG, MYC, GFP и т.д.), экспозиция тега имеет решающее значение для успеха на стадии связывания антитела. Замораживание-оттаивание образцов следует избегать.
Метод RIP широко используется для выяснения различных механизмов контроля генов после транскрипции10,25. Это включает в себя идентификацию нового белка-мРНК, белка-микроРНК, и белок-белковых взаимодействий 10,25. Здесь мы предоставляем комплексный протокол для определения состава RNP в культуре клеток. Наш метод позволяет целевой и геномные оценки критических белок-РНК взаимодействий, а также для захвата редких и / или переходных RNP комплексов.
Применение этого метода способствовало нашей характеристике РНК , связанных с DHX9 / РНК геликазной А и помог нам определить критическую пост-транскрипционной регуляции ретровирусов и клеточных протоонкогенов Джунд 6,26 и Хур (Fritz и Boris-Лоури , неопубликованные данные). Мы ожидаем, что применение этой техники в будущих исследованиях, чтобы углубить наше понимание важнейших механизмов контроля генов, в том числе, опосредованные длинными некодирующих RNP комплексов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность поддержку НИЗ P50GM103297, P30CA100730 и Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F.
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
