Introduction
전사 후 유전자 발현 정확하게 핵에있는 DNA의 전사를 시작으로 조절된다. RNA는 단백질 (RBPs)를 결합에 의해 제어, mRNA의 생합성과 대사는 RNA 대사 1-3의 진행 동안 기판 전구체의 mRNA와 해리 동료와 매우 역동적 인 리보 핵산 단백질 입자 (RNP들)에서 발생한다. RNP 구성 요소의 동적 변화는 mRNA의의 전사 후 운명에 영향을 미칠 및 기본 증명서, 핵 인신 매매 및 현지화, 번역 mRNA의 템플릿으로 자신의 활동과 성숙의 mRNA의 최종 매출을 처리하는 동안 품질 보증을 제공합니다.
수많은 단백질은 RNA 인식 모티브 (RRM)를 포함하여 자신의 보존 아미노산 도메인 덕분에 RBPs로 지정되며, 이중 가닥 RNA 결합 도메인 (RBD) 및 염기성 잔기의 스트레치 (예컨대, 아르기닌, 리신, 글리신) 4. RBPs 일상적이다면역 전략에 의해 고립과 동족의 RNA를 식별하기 위해 상영된다. 일부 RBPs는 RNA의 regulons 5-8로 지정 기능적으로 관련되는 사전의 mRNA를 공동 조절한다. 이러한 RBPs 그들의 동족의 mRNA, 때로는 비 - 코딩 RNA는 조성물 다양 RNP들 촉매를 형성하고; 고유성 인해 관련된 요인의 다양한 조합으로뿐만 아니라 상호 작용 (9)의 시간적 순서, 위치 및 지속 기간이다.
RNA의 면역 침전 (RIP)는 RNP들에서 세포를 분리 및 서열 분석 (10-13)을 사용하여 관련 증명서를 식별 할 수있는 강력한 기술이다. 후보에서 이동 게놈 넓은하는 검사는 마이크로 어레이 분석 (14) 또는 높은 처리량 시퀀싱 (RNAseq) (15)와 결합 RIP를 통해 가능하다. 그들은 공동 침전 항체 (16)로부터 충분히 풍부하고 분리 가능한 경우에 마찬가지로, 공 침전 단백질, 질량 분석에 의해 식별 될 수 있고,17. 접근 방법은 식물 세포, 진균, 바이러스 및 박테리아의 가용성 용 해물에 대한 변경 가능하지만 여기에서는, 배양 된 세포로부터 RNA의 특정 동족 RNP 성분을 분리하기위한 방법을 다룬다. 그림 1에 요약 된 바와 같이 재료의 다운 스트림 분석, 후보 식별 및 검증 면역에 의해, 질량 분석, 생화학 적 효소 분석, RT-qPCR에, 마이크로 어레이 및 RNAseq을 포함한다.
사후 전사 수준에서 유전자 발현을 제어 RNP들의 기본적인 역할이 주어 성분 RBPs 또는 보조 기능의 발현의 변화는 RNA를 셀에 대한 유해 할 수 있고, 신경계 질환 (18)을 포함한 질환의 여러 유형과 연관된 동족한다. DHX9 / RNA 헬리 A (RHA)는 셀룰러 및 레트로 바이러스의 기원 (6)의 선택의 mRNA의 번역이 필요합니다. 이 동족의 RNA는 내부 구조적으로 관련 시스 - 작용 요소를 나타내는 자신이후 전사 제어 요소 (PCE) (19)로 지정되어 5 'UTR. RHA-PCE 활성은 HIV-1을 포함하는 많은 레트로 바이러스의 효율적인 캡 - 의존적 번역을 위해 필요하며, junD 6,20,21 포함 성장 조절 유전자들의. 필수 유전자 (dhx9)에 의해 암호화, RHA는 세포 증식과 하향 조절에 필수적인 세포 생존 능력 (22)을 제거한다. RHA-RNP들 PCE의 분자 분석 RHA-PCE 활성이 세포 증식을 조절하는 데 필요한 이유 이해하는데 필수적인 단계이다.
정상 상태에서 또는 세포의 생리 학적 섭동시 RHA-PCE의 RNP 구성 요소의 정확한 특성은 다운 스트림 분석을위한 충분한 풍요의 RHA-PCE의 RNP들의 선택적인 농축 캡처가 필요합니다. 여기에, 레트로 바이러스 PCEgag RNA는 오픈 리딩 프레임 내에서 MS2 코트 단백질 (CP)의 시스 - 작용하는 RNA 결합 부위의 6 사본 태그되었습니다. MS2 코트 단백질 엑소시켰다genously 공동 발현 플라스미드로 형질 감염 RNA PCEgag으로 성장 세포에서 RNP 어셈블리를 용이하게한다. 동족 MS2 태깅 PCEgag RNA와 MS2 코트 단백질을 포함 RNP들에는 세포 추출물로부터 면역 침전 및 자성 비드 (도 2a)에 포획 하였다. 선택적 PCE에 결합 된 RNP 성분을 캡처하기 위해, 고정화는 RNP의 RNase H 활성 용 기판 인 RNA-DNA 하이브리드를 형성 PCE에 말단 서열에 상보적인 올리고 뉴클레오티드와 함께 배양 하였다. PCE가 번역 영역, 5 '말단의 5'에 위치되기 때문에, 올리고 뉴클레오티드는 레트로 바이러스 번역 개시 사이트 (개그 개시 코돈)에 인접하는 RNA 서열에 상보 적이다. 용리액으로 수집 된 고정화 RNP에서 발표 된 5 'UTR 단지 코돈 개그 시작 근처의 RNase H 절단. 그 후, 샘플은 captu을 확인 PCEgag 및 SDS PAGE 및 면역 블롯에 의해 캡처 확인 RT-PCR에 의해 평가 하였다대상 MS2 코트 단백질의 재. PCE 관련된 RNA 결합 단백질의 검증 DHX9 / RNA 헬리 케이즈 A는 다음을 수행 하였다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
| 버퍼 조성물 |
| 세척 버퍼 : |
| 50 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의 |
| 150 mM의 NaCl을 |
| 3 밀리미터의 MgCl2 |
| 낮은 소금 버퍼 : |
| 20 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5 |
| 10 mM의 염화나트륨 |
| 3 밀리미터의 MgCl2 |
| 2 mM의 DTT |
| 1X 프로테아제 억제제 칵테일 EDTA 무료 |
| 의 RNase 아웃 5 μL / ㎖ (의 RNase 억제제) |
| 세포질 용해 버퍼 : |
| 0.2 M 자당 |
| 1.2 % 트리톤 X-100 |
| NETN-150 워시 버퍼 : |
| 20 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의 |
| 150 밀리미터염화나트륨 |
| 0.5 % NP-40 |
| 3 밀리미터의 MgCl2 |
| 10 % 글리세롤 |
| 버퍼를 바인딩 : |
| 10 mM의 HEPES pH가 7.6 |
| 40 mM의 KCl을 |
| 3 밀리미터의 MgCl2 |
| 2 mM의 DTT |
| 5 % 글리세롤 |
표 2 : 버퍼 조성물에 관한 것이다.
세포 및 선호도 매트릭스 1. 준비
- 문화 10cm의 접시에 하위 합류 (80 %)에 대한 관심의 셀 라인. 플래그 태그가 NLS-MS2 코트 단백질의 독립적 인 면역 침전 (IP)에 대한 10cm 플레이트를 사용합니다. 국기 - 에피토프 태그에 항혈청을 사용하여 IP를 수행합니다. 국기 - 태그 MS2 코트 단백질 플라스미드를 표현하면, 수확 20 미리 세포를 24 ~ 48 시간을 형질.
참고 : 특정 RNP는 핵이나 세포질에서 농축 될 수있다이러한 자당 기울기의 분수로 IC에서 해물 또는 생화학-분획 제제. 추가 음성 대조군을 제기 병렬로 비 형질 감염된 세포에서 해물을 수확하는 것이 좋습니다. - 전송 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 단백질 G 자성 비드 슬러리의 IP 당 60 μL.
- 마이크로 원심 튜브는 스토리지 솔루션에서 구슬을 분리하는 자석 랙에 튜브를 놓습니다.
- 조심스럽게 마이크로 피펫으로 그것을 그림으로써 스토리지 솔루션을 제거합니다.
- 자석 랙에서 튜브를 제거합니다.
- 워시 1X 세척 완충액 600 μL와 비드 (비드의 10 배 사용 볼륨) 평형화 (20 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의 3 밀리미터의 MgCl 2, 150 mM의 염화나트륨) (3)과 엔드 오버 엔드 회전 실온에서 분.
- 자석 랙에 튜브를 놓고 세척 버퍼를 제거합니다.
- 평형화 홍보에 1X 세척 버퍼와 immunoprecipitating FLAG 항체의 10 권 (600 μL)를 추가immunoprecipitating 항체 공역 적어도 30 분 동안 실온에서 및 회전 엔드 오버 엔드 (은 An 면역 제조업체에서 권장하는 양에 따라) otein G 자석 구슬. 적절한 항체 음성 대조군으로 대응하는 이소 타입의 IgG를 사용합니다.
- 구슬을 수집하고 뜨는을 제거 자석 랙에 튜브를 놓습니다.
- 자석 랙에서 관을 제거하고 실온에서 3 분 동안 1X 세척 완충액 회전의 10 볼륨 (600 μL)를 항체가 접합 된 비드를 세척 하였다. 두 번이 단계를 반복합니다.
- 자석 랙에 튜브를 놓고 세척 버퍼를 제거합니다.
2. 수확 RNP들
참고 : 단계 1.8 이후의 배양 시간 동안 RNP들을 준비합니다.
- 흡인 세포로부터 배양 배지를 제거하고 빙냉 1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)로 두 번 세포를 씻어. 젖은 꺼 내려 셀 스크레이퍼를 사용하여,4 ° C에서 4 분 동안 226 XG에 원심 분리하여 이전 컬렉션에 부착 세포.
- 3 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 NaCl을 2 mM의 DTT, 1X 프로테아제 억제제 칵테일, EDTA 무료, 5 μL / ㎖ 얼음처럼 차가운, 저염 완충액 (20 mM 트리스 - 염산, 산도 7.5의 375 μl를 추가 된 RNase 세포 펠렛을 억제)와 5 분 동안 얼음 상에 배치하여 팽윤 허용한다.
주 : 세포 펠렛의 크기에 따라 저염 완충액 용적 맞춤. 10 센티미터 판에서 1.2 × 10 6 세포의 경우, 버퍼의 375 μL 충분하다. - 상기 세포질 세포 용 해물을 수집 빙냉 용해 완충액 125 μL를 추가하는 (0.2 M 수크로오스 / 1.2 % 트리톤 X-100) 한 다음 얼음 통에서 미리 냉각시키고 다운스 균질 10 스트로크를 수행한다.
참고 : 전체 세포 추출액을 수집하려면, 표준 RIPA 용해 버퍼는 핵질 / 염색질을 가용화하는 것이 좋습니다. - 1 분 최고 속도 (16,000 XG)에서의 microfuge에 스핀; 이 파편 (a)의 상층 액을 취소합니다차 핵.
- 얼음에왔다 새로운 1.7 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 예 브래드 포드 분석법 (23)과 같은 표준 실험실 바람직한 방법에 의해 총 단백질 농도를 결정한다. , 웨스턴 블롯 분석을 위해, 적어도 10 %의 분취 량을 예약 입력 대조군으로 사용한다. 면역 즉시 수확 된 세포 용 해물을 사용하거나 향후 분석을 위해 -80 ° C에서 보관합니다.
참고 : 우리의 경험에 의하면,이 샘플이 저장 될 수 및 무결성의 타협없이 면역 분석을 위해 몇 달 후 사용.
3. 면역 침전
- 대상 항체에 접합 비드 단계 250에서 판정 된 단백질 농도에 기초하여 수확 된 세포 용 해물의 원하는 양을 추가. 1X 세척 완충액을 사용하여 600 μL까지 총 부피를 가지고 실온에서 90 분 동안 엔드 오버 엔드 돌린다.
참고 :이 시간이 발생하기에 충분하다비 특정 바인딩을 최소화하면서 높은 친 화성 RNP 단지의 강력한 격리. 전술 한 바와 같이, 이전에 제조 된 비드 - 항체 복합체로 배양 한 다음, 1X 세척 완충액으로 1 : 그리고 이러한 크로스 구배 분획을 적어도 하나의 대안으로서 RNP 소스를 희석. - 인큐베이션 90 분 후, 비드를 수집하는 자석 IP 선반에 튜브를 놓는다. 흐름을 통해 같은 뜨는를 보유합니다.
참고 :이 첫 번째 흐름을 통해이 IP 효율을 측정하는 중요한 제어 샘플입니다. 면역 분석은 IP 효율의 표시뿐만 아니라, 조사 상호 작용의 특이성을 제공한다. 다운 스트림 분석을 위해이 뜨는을 유지하는 것이 좋습니다. - 150 mM의 NaCl을, 3 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 % NP40, 얼음처럼 차가운 NETN-150 세척 완충액 (20 mM 트리스 - 염산, 산도 7.4의 10 권 (600 μL)와 RNP 바인딩, 항체 - 복합 구슬을 씻고 실온에서 3 분 동안 회전 미만 10 % 글리세롤). 단계 3 번 반복합니다.
참고 :이 버퍼는 용해 버퍼 다르다 효과적으로 약하거나 특정 연결을 줄일 수 있습니다. - 예약 및 10 %의 최종 세척 후, 빙냉 1X 결합 완충액 (40 mM의 KCl을 3 밀리미터의 MgCl 2, 5 % 글리세롤, 2 mM의 DTT 10 mM의 HEPES, pH를 7.6) 60 μL에 고정화 RNP 복합체를 재현 탁 웨스턴 블롯 및 RNA 분리에 대한 20 %의 고정 된 복잡한 구슬.
4. 용출
- 얼음처럼 차가운 1X 결합 완충액 100 μL에 남아있는 볼륨을 조정하고 3 분 동안 70 ° C에서 튜브를 가열한다.
- 동족 RNA 단백질 복합체를 분리하기 위해, 관심의 RNA의 3 '서열 경계 상보 ~ 30 NT의 DNA 올리고 뉴클레오티드를 추가 흔들 부드럽게 실온에서 30 분 동안 배양한다 (올리고 뉴클레오티드 100nM의 충분하다).
참고 : 올리고 뉴클레오티드가 시작 현장 exampl로 사용되는 PCE 구조의를 번역에 인접한 염기 잔류 물에 안티센스입니다이 프로토콜에서 전자. 적절한 서열 상보성은 ~ 40 %의 GC 함량에 의해 제공된다. 표적 RNA의 상보 적 영역에 최소 효과적인 혼성화 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 설계한다. - 튜브에의 RNase H의 5 ~ 10 단위를 추가하고 RNA의 RNA 절단 할 실온에서 1 시간 동안 품어 : DNA 하이브리드를. 멸균 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송; 이 샘플은 관심의 캡처 RNP 단지를 포함한다.
주 : 동족 RNA의 접근성에 따라,의 RNase H 처리 둘 이상의 라운드 다운 스트림 분석 용 샘플 다량을 증가하는 것이 유용 할 수있다. - 알려진 관련 단백질 및 RT qPCR에 다음 RNA 분리의 용출액의 20 %에 대한 웨스턴 블롯에 용출액의 20 %를 사용합니다. 나머지 60 %는 질량 분석법에 사용할 수있는 단백질 또는 구성 요소를 식별하기.
- 병렬에서 RNA 분리 및 RT-PCR 분석에 예약 된 세포 용 해물의 분취 량을 대상. 이 ASSEssment는 RNP 단지 내 RNA의 농축의 표시를 제공합니다.
참고 :의 RNase H 절단이 immunuoprecipitated 복잡한에서 RNP 방출에 효과적임을 확인하기 위해 제어 웨스턴 블롯에서 분리 된 단백질 제제를 사용합니다.
5. 단백질 전기 영동 및 웨스턴 블롯 분석
- 실험실 표준 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 및 면역 블롯 분석에 총 시료의 약 10 내지 20 %의 제목.
주의 :이 단계는 하류 RNA 분석에 앞서 IP 효율 및 특이성을 검증하는 역할을한다. 또한 격리 된 RNP 복합체 단백질 조성물을 평가할 수있다.
면역 RNA의 6. 컬렉션
참고 : RNA 분리는 설명 프로토콜 다음 트리 졸 방법 또는하여 수행 할 수 있습니다.
- 방 t에서 재현 탁 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약 750 μL의 전체 시료의 절반 부화5 분 전에 촬영 된 PCE-RNP 단지에서 RNA를 추출에 럼 온.
- 튜브에 클로로포름 200 μl를 추가, 10 초 동안 격렬하게 흔들어, 3 분 동안 실온에서 품어.
- 4 ℃에서 15 분 동안 16,000 × g으로 원심 분리 후, 새로이 튜브로 수성 상을 수집하고, 이소프로판올 동량을 추가한다. 잘 혼합하고, 적어도 10 분 동안 실온에서 배양한다. 샘플에 글리콜 블루의 1 μl를 추가하고 미래의 날짜에 효율적으로 침전 또는 처리를 위해 냉장고에서 -20 ° C에서 보관합니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 조심스럽게 수집하고 RNA 펠렛을 방해하지 않도록 상층 액을 제거한다; p 형 마이크로 피펫 팁 (200)의 사용은이 프로세스를 촉진하기 위해 추천된다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 16,000 XG에서 각 튜브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 튜브를 75 % 에탄올 500 μl를 추가합니다. 조심스럽게 수집 단계 6.4에서와 같이 상층 액을 버린다. 공기-의 RNase없는 물 100 ㎕에 2 ~ 3 분,에 resuspend의 펠렛을 건조.
주 : 부유 문제를 방지하기 위해 타임 펠릿 공기가 건조 연장하지 않는다. - RNA를 청소 컬럼에 RNA 샘플의 100 μl를 적용합니다. 제조자의 프로토콜을 사용하여 처리한다. 최대 3 개월 동안 -80 ° C에서의 RNA 분해 효소가없는 물을 저장 30 μL의 RNA를 용출.
참고 :이 고립 된 RNA는 RT-실시간 PCR (qPCR에), 마이크로 어레이 및 RNA 서열에 의해 다운 스트림 분석에 적합합니다. RNP 및 관심 RNP 격리되어있는 효율의 풍부에 따라 동일한 파쇄물은 하류의 분석에 적용 할 충분한 RNA를 생성하는 IP 둘 이상의 라운드를 실시 할 수있다.
PCR에 의해 cDNA를 7. RNA 역전사 및 증폭
- manufa의 항에있어서, 고품질의 역전사 (RT)와 랜덤 프라이머가 역전사하는 단리 된 RNA 대상cturer의 지시.
- 관심의 RNA를 증폭하는 상기의 RNase H 절단 시퀀스 내에서 특정 유전자의 안티센스 프라이머를 설계한다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 임의의 프라이머 또는 올리고 DT 프라이머 비슷한 금액을 사용 (재료 표 참조).
참고 : 올리고 DT 프라이머 및 폴리 adenylated의 mRNA는 RT-PCR 반응에 대한 긍정적 인 제어 반응을 제공한다. - 예약 차단을 정의하고, 표준 곡선을 생성하기 위하여 네거티브 컨트롤 용 해물 IP 및 포지티브 컨트롤 DNA 샘플을 직렬로 이루어 예비 qPCR에 대한 RT 반응 (1 μL)를 5 %. qPCR을 위해 준비의 CT 값이 표준 곡선의 범위를 벗어나면, 연속 된 하나의 RT 반응 희석 : 5 희석하고, 단계 7.2를 반복한다.
참고 : RNA 서열 및 질량 분석 기술의 경우, 보충 방법 파일을 참조하십시오. t 여기를 클릭하십시오오이 보충 방법 파일을 볼 수 있습니다. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이전 RIP 결과 레트로 바이러스 개그 RNA를 식별하고 공동 침전물 세포의 RNA를 DHX9 / RHA와, HIV-1 6, junD 6과 훌 (프리츠와 보리스 - 로리, 게시되지 않은) 포함을 선택했습니다. 레트로 바이러스 5 'UTR이 핵 DHX9 / RHA와 공동 침전 및 polyribosomes의 세포질에서 공동으로 분리하는 것으로 입증되었다. 이것은 고유 시스 -acting 전사 후 제어 요소 (PCE) (6)으로 정의된다. 증식 세포에서 형성 PCEgag RNA-RHA의 리보 핵산 단백질 복합체 (RNP들)을 분리하기 위해, 우리는 형질 전환 된 HEK293 세포 용 해물에 FLAG-MS2 RNP의 면역을 시행 하였다. 결과는 FLAG-MS2 단백질을 효율적으로 침전을 나타낸다. 특히 DHX9 / RHA이 RNP 복합체 내에 아닌의 IgG 아이소 타입 컨트롤 내에 식별 않으며, 네가티브 컨트롤 HEK293 세포 용 해물 내 (도 2A). RNP들을 포함하는 매트릭스 (30)와 상보 배양-nt 올리고 뉴클레오티드, 및이어서 RNA-DNA 하이브리드의 RNase H의 절단을 수행 하였다. 된 RNase H 소화 후, 용출액을 웨스턴 블롯에 의해 분석 하였다. RNA의-DNA 하이브리드 위치에 PCEgag RNA의 입증 된 RNase H 절단는 특히 5 'UTR에 결합 된 RNP 단지를 발표했다. DHX9 / RHA 관련 RNP들은 용리액 농축 수를 측정 하였다. 중요한 것은, FLAG-MS2 바인딩 RNP들은 항체 - 복합 비드 (그림 2B)로 남아 있었다. 세포 용리액 PCEgag 레트로 바이러스 RNA를 함유하는 MS2 스템 - 루프의 동시 면역은 RT-PCR 및 qRTPCR (도 2c)에 의해 확인되었다. 결과는 DHX9 / RHA 및 대상 변환 제어 6 중요한 고유 RNP으로 강조되어있는 레트로 바이러스 5 'UTR 사이의 선택 연결을 확인했다.
그림 1 : RNP 격리와의 RNase H 절단에 의해 PCEgag의 5 'UTR과 관련된 특정 RNP들의 농축. 단계를 나타내는 플로 드 노보 셀 형성 선택된 리보를 분리하고, 그 올리고 뉴클레오티드 유도 RNaseH를 절단에 의해 수집하고, RNA, 단백질 성분의 하류 분석. MS2의 RNA 스템 - 루프와 FLAG 구슬 PCE의 RNA를 캡처 MS2 코트 단백질 - FLAG 융합 단백질을 다량 사이의 높은 친 화성 상호 작용을 이용하여 친 화성 크로마토 그래피의 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : PCEgag RNA는 6 MS2 RNA 결합 부위를 포함는 고정화 FLAG-태그 MS2 코트 단백질에 의해 포착하고 5 'UTR과 관련된 특정 RNP들이었다 하였다올리고 뉴클레오티드 지시 된 RNase H 절단에 의해 발표했다. HEK293 세포 pAR200합니다 (PCEgag 및 6X MS2를 포함하는 플라스미드는 HIV 인트론에 루프) 및 핵 이행 서열 (NLS)와 FLAG 에피토프 태그가 MS2 단백질을 발현하는 플라스미드와 함께 공동 형질 감염시켰다. 세포를 수집하고, 세포질은 48 시간 후 - 형질 감염에서 단리 하였다. 세포질 해물 FLAG 항체 또는 IgG를 제어하거나 함께 면역을 실시 하였다. (A)가 IP 효율은 항 FLAG 항체를 이용하여 면역 블롯에 의해 결정 하였다. DHX9 / RHA하는 PCE 결합 단백질은 양성 대조군으로 제공; MS2 단백질과 면역 PCE 함유 RNA. 레인 1-3 : IP에 사용되는 입력 단백질. 레인 4-5 : FLAG MS2의 FLAG IP는 해물과 HEK293 세포질 세포 용 해물을 과발현. 레인 6 : FLAG MS2의 IgG의 IP가 해물을 과발현. 레인 7-9 : IP에의 플로우를 통해. (B) 5 'UTR 바인딩 RNP들은의 RNase H 절단에 의해 강화되었다. 레인 1-3:의 RNase H. 레인 4-6으로 5 'UTR - 결합 단백질의 용출액 : 항체 - 복합 비드에 결합하는 단백질. RNP들 상이한 분획에 결합 된 특정 RNA의 (C) 역전사 PCR 및 실시간 정량적 PCR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 RNP 절연 및 RNA 동족 인식 전략은 특정 RNA - 단백질 상호 작용을 조사 및 공동 조절 후보 단백질들을 발굴 셀 특정 RNP를 선택하는 수단이다.
RNP들을 분리 올리고 뉴클레오티드 지시 된 RNase H 절단을 사용하는 장점은 캡처 특별히 관심있는 시스 - 작용 RNA 소자에 하류에 결합 된 이종 RNP들 위에 RNP 시스 - 작용 RNA 요소를 분석하는 능력이다. 주어진 RNP의 동족 RNA의 풍부가의 RNase H 절단하지 않고 고립 수집 된 RNP들의 작은 부분이기 때문에,이 워크 플로의 주요 단점은 동족 RNP의 부족이다. 우리의 경험에 의하면,이 제한은 민감한 면역 및 분석 프로테오믹스의 탐지를 위해 기존의 RNA IP보다 10 배 이상 출발 물질로 5- 필요로. RNP 고정화에 의해 제공된 다른 장점은의 RNase H의 트레 반복의 편리atment 추가 용출액을 수집. 우리의 경험에서의 RNase H 치료의 2-4 라운드는 추가 용출액을 수집하는 것이 좋습니다했다.
이 프로토콜에서, 주요 기술 문제는 최적의 온도를 유지하고, 시약의 멸균 처리를 보장하고 있습니다. 모든 시약은 RNA 분해 효소와 단백질 분해 효소가없는해야합니다. RNA의 샘플의 무결성은 RNA - 단백질 상호 작용을 검출 할 수없는 경우 고려해야 할 가능성 함정이다.
이 기술은 검출을 위해 적절한 양의 RNP들에 액세스하는 셀의 효율적인 용해를 필요로한다. 중요한 단서가 불완전 세포 용해이지만, 격렬한 치료는 RNA와의 비특이적 상호 작용을 증가시킬 수있다. 따라서, 실험 조건은 특정 단백질 RNA 상호 작용을 풍부하게하기 위해 측정한다. 그러나, 고 엄격 세척의 사용은 중요하면서도 과도 상호 작용을 없앨 수있다. 따라서, 세정 조건 consid 다른 가변적특정 실험의 특정 요구 사항에 어.
RIP 효율은 동족 RNA 단백질 파트너를 분리 할 수있는 강력한 기술이다, 그러나 생리 학적 중요성 일부 일시적인 또는 약한 상호 작용은 바인딩 또는 세척 단계에서 손실됩니다. mRNP 복합체의 가교는 분석에서 고려해야 할 옵션입니다. 또한, 규제 RNP들 분석하면서 생리적 성장 조건은 동족 RNA의 발현 량으로서, 명심해야한다 RBP 또는 특정 조건 하에서 생리 변동될 수있다. 또한, 하류의 분석 유형은 또한 면역시 용해 및 세정 조건을 선택하는 역할을한다.
또한, 성공적인 면역이 파쇄 상당히 희석 될 것을 요구한다 (적어도 1 : 1). 1X 세척 완충액 (20 mM 트리스 - 염산은 pH가 7.3, 3 밀리미터의 MgCl 2, 150 mM의 염화나트륨)는 그 조성물로서, 상기 선택된 희석제 인RNP 무결성 솔루션 용해도, 또는 항체 - 항원 상호 작용에 영향을주지 않습니다.
및 트리스뿐만 아니라 일부 세제 - 다운 스트림 질량 분석의 경우, 샘플 나 +, CL을 포함 염이 없어야한다. 필요한 경우 버퍼 - 이온 성 성분의 투석이나 이온 교환 여과에 의해 감소 될 수있다 - 화합물, 경우에, 휘발성 버퍼 최종 단계에 유용하다. 항혈청은 형질 발현 에피토프 태그가 부착 된 단백질을 분리하는 데 사용되는 경우, 초기 세포 용 해물을 사용하여 재조합 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 또한 검증 전에 실행되어야한다. 경우에 에피토프 태그가 사용된다 (즉, FLAG, MYC, GFP 등), 태그의 노출은 항체 결합 단계의 성공에 중요하다. 샘플의 동결 - 해동은 피해야한다.
립 기술은 널리 전사 후 유전자 조절의 다양한 메커니즘을 해명하기 위해 사용되어왔다10.25. 이 새로운 단백질의 mRNA, 단백질 마이크로 RNA, 단백질 - 단백질 상호 작용 10.25의 식별을 포함한다. 여기서, 우리는 세포 배양액 내에서 RNP 조성물의 결정을위한 종합적인 프로토콜을 제공한다. 우리의 방법뿐만 아니라 희귀 및 / 또는 과도 RNP 단지의 캡처, 중요한 단백질 RNA 상호 작용의 대상 및 게놈 넓은 평가를 할 수 있습니다.
이 기술의 적용은 DHX9 / RNA 헬리 카제 (A)에 의해 결합 된 RNA를 우리의 특성화에 기여하고 레트로 바이러스의 중요한 전사 후 조절 및 세포 프로토 암 유전자 junD 6,26과 훌 (프리츠와 보리스 - 로리를 정의하는 데 도움이되었습니다 , 게시되지 않은 데이터). 우리는 긴 비 코딩 RNP 복합체에 의해 매개을 포함한 유전자 조절의 중요한 메커니즘에 대한 우리의 이해를 촉진하기 위해 향후 연구에서이 기술의 적용을 기대합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
저자는 감사 NIH P50GM103297, P30CA100730 및 종합 암 P01CA16058에 의해 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F.
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
