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Biochemistry

Détection de l'activité dépendant du pH de Published: October 23, 2016 doi: 10.3791/54527
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Summary

Cette étude décrit les techniques biophysiques, biochimiques et moléculaires permettant de caractériser l'activité de chaperon d'Escherichia coli HdeB dans des conditions de pH acides. Ces méthodes ont été appliquées avec succès pour d'autres chaperons acide de protection tels que HdeA et peuvent être modifiés pour travailler pour d'autres chaperons et des conditions de stress.

Abstract

Les bactéries sont fréquemment exposés à des changements environnementaux, tels que les modifications de pH, de la température, de l'état redox, exposition à la lumière ou de force mécanique. Beaucoup de ces conditions provoquer le dépliement des protéines dans la cellule et avoir un impact négatif sur la survie de l'organisme. Un groupe de, chaperons moléculaires spécifiques de stress non apparentés ont été montré à jouer un rôle essentiel dans la survie de ces conditions de stress. Bien que complètement plié et chaperon inactif avant stress, ces protéines se dérouler rapidement et devenir chaperon active dans des conditions de stress spécifiques. Une fois activé, ces chaperons conditionnellement désordonnés se lient à un grand nombre de protéines différentes de l'agrégation sujette, de prévenir leur agglomération et de faciliter, soit directement, soit indirectement repliement des protéines lors du retour à des conditions non stressantes. La principale méthode pour obtenir une compréhension plus détaillée sur le mécanisme de leur reconnaissance d'activation et le client implique la purification et subsequent caractérisation de ces protéines en utilisant dans des essais in vitro chaperons. Suivi in vivo des tests de stress sont absolument essentiels pour confirmer indépendamment l'obtenu dans les résultats in vitro.

Ce protocole décrit in vitro et in vivo des méthodes pour caractériser l'activité de chaperon de E. coli HdeB, un chaperon activé par un acide. Les mesures de diffusion de la lumière ont été utilisées comme une lecture commode pour la capacité de HdeB pour empêcher l' agrégation induite par l' acide d'une protéine cliente du modèle établi, MDH, in vitro. expériences d'ultracentrifugation analytique ont été appliquées pour révéler la formation complexe entre HdeB et son LDH de protéine de client, de faire la lumière sur le sort des protéines clientes à leur retour à des conditions non stressantes. des dosages d'activité enzymatique des protéines clientes ont été réalisées pour évaluer les effets de l'inactivation HdeB sur le client et la réactivation induite par le pH. Enfin, des études de survie ont été utilisés pour monitor l'influence de la fonction de chaperon de HdeB in vivo.

Introduction

Un environnement naturel commun dans lequel les agents pathogènes microbiens expérience protéines conditions qui se déroulent à l' acide induite est l'estomac des mammifères (plage de pH 1-4), dont le pH acide sert une barrière efficace contre les agents pathogènes d'origine alimentaire 1. Dépliement des protéines et de l' agrégation, qui est causée par la protonation de la chaîne latérale d'acides aminés, affectent les processus biologiques, endommage les structures cellulaires et provoque finalement la mort cellulaire 1,2. Etant donné que le pH du périplasme bactérien s'équilibre presque instantanément le pH de l' environnement due à la diffusion libre des protons à travers la membrane externe poreuse, les protéines de la membrane périplasmique et internes des bactéries Gram-négatives sont des composants cellulaires les plus vulnérables dans des conditions acides au stress 3. Pour protéger leur protéome périplasmique contre les dommages induits par l'acide rapide, les bactéries Gram-négatives utilisent les chaperons périplasmiques activés par un acide et HdeA HdeB. HdeA est un chaperon conditionnellement désordonné 6,7. L' activation de HdeA nécessite de profonds changements structurels, y compris sa dissociation en monomères, et le dépliement partiel des monomères 6-8. Une fois activé, HdeA se lie aux protéines qui se déroulent dans des conditions acides. Il empêche efficacement leur agrégation à la fois au cours de l'incubation à faible pH, ainsi que sur la neutralisation du pH. Lors du retour à pH 7,0, HdeA facilite le repliement de ses protéines clientes de manière ATP-indépendante et reconvertit en son dimère, conformation chaperonner-inactive 9. De même, le chaperon HdeB homologue est également chaperon inactif à un pH de 7,0. Contrairement à HdeA, cependant, l'activité de chaperon de HdeB atteint son maximum apparent à pH 4,0, les conditions dans lesquelles HdeB est encore largement plié et dimères 10. De plus, abaissant encore les caus de pHes l'inactivation de HdeB. Ces résultats suggèrent que, malgré leur grande homologie, HdeA et HdeB diffèrent dans leur mode d'activation fonctionnelle qui leur permet de couvrir une large gamme de pH avec leur fonction protectrice de chaperon. Une autre protéine chaperon qui a été impliquée dans la résistance à l' acide de E. coli est la Hsp31 cytoplasmique, qui semble stabiliser les protéines clientes dépliés jusqu'à des conditions neutres soient rétablies. Le mode précis de l'action de Hsp31, cependant, est resté énigmatique 12. Étant donné que d' autres bactéries entéropathogènes telles que Salmonella manquent l'opéron hdeAB, il est très probable que d' autres chaperons périplasmiques non encore identifiés pourraient existent qui sont impliqués dans la résistance aux acides de ces bactéries 11.

Les protocoles présentés ici permettent de surveiller l'activité de chaperon dépendant du pH HdeB in vitro et in vivo , 10 et peuvent être appliqués pour étudier d' autres chaperonstelles que Hsp31. En variante, le réseau complexe de facteurs de transcription qui contrôlent l'expression des hdeAB peut potentiellement être étudiée par le test in vivo du stress. Afin de caractériser la fonction de chaperon de protéines in vivo, les différentes configurations expérimentales peuvent être appliquées. Une voie est d'appliquer la protéine dépliage des conditions de stress et de caractériser les souches mutantes phénotypique que soit surexpriment le gène d'intérêt ou de porter une délétion du gène. Des études protéomiques peuvent être menées pour identifier les protéines qui ne sont plus globale dans des conditions de stress lorsque le chaperon est présent, ou l'influence d'un chaperon sur une enzyme spécifique peut être déterminée dans des conditions de stress à l' aide de dosages enzymatiques 14-16. Dans cette étude, nous avons choisi de surexprimer HdeB dans une souche rpoH de suppression, qui n'a pas le choc thermique facteur sigma 32. rpoH contrôle l'expression de tous les principaux E. chaperons coli et sa suppression est connu pour augmenter sensibilité à des conditions de stress environnementaux qui causent le dépliement des protéines 15. L'activité in vivo dans le chaperon de HdeB a été déterminée en surveillant sa capacité à supprimer la sensibilité au pH de la souche Δ rpoH. Au total, les protocoles présentés ici fournissent une méthode rapide et simple pour caractériser l'activité d'un chaperon activé par un acide in vitro ainsi que dans le contexte in vivo.

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Protocol

1. Expression et purification de périplasmique HdeB

REMARQUE: HdeB a été exprimée dans E. cellules de E. coli hébergeant le plasmide pTrc- hdeB 10, et purifié à partir du périplasme lors de la lyse polymyxine.

  1. Préparer une culture de nuit de E. cellules de E. coli hébergeant le plasmide pTrc- hdeB 10 dans 30 ml de LB contenant 200 ug / ml d' ampicilline (LB Amp). Inoculer quatre cultures 1 L de LB Amp et les cultiver à 37 ° C et 200 rpm jusqu'à OD 600nm de 0,7 soit atteint. Ensuite, ajouter 300 uM d'IPTG pour induire l'expression de HdeB et de diminuer la température de croissance à 30 ° C.
  2. Au bout de 5 h d'expression de la protéine à 30 ° C, récolter les cellules par centrifugation à 8000 g pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Laver le culot cellulaire avec 100 ml de tampon A (Tris / HCl 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) et centrifuger les cellules à nouveau à 8000 g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Par la suite, resuspendrele culot cellulaire dans 80 ml de tampon A contenant 1 mg / ml de sulfate de polymyxine. Pour perturber l'efficacité de la membrane externe, remuez doucement la suspension pendant 1 heure à 4 ° C.
  5. Pour enlever la fraction cytoplasmique et les débris cellulaires, centrifuger la suspension pendant 20 min à 15 000 xg à 4 ° C. Cela se traduit par ~ 60 ml de surnageant contenant le HdeB soluble.
  6. Dialyser le surnageant contenant l'extrait périplasmique par rapport au volume pendant une nuit 150x de tampon B (Tris / HCl 20 mM, EDTA 0,5, pH 8,0) en utilisant une membrane de dialyse de 6 kDa MW de coupure. On concentre les protéines de 15 ml en utilisant des unités de filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure de 3 kDa. Filtrer la solution de protéine en utilisant un filtre de 0,2 um pores.
  7. Appliquer la protéine sur une colonne de chromatographie échangeuse d'anions (volume de colonne de 5 ml) qui a été équilibrée avec 5 volumes de colonne de tampon B avec un débit de 2,5 ml / min. Une fois que la protéine est chargée sur la colonne, laver la colonne avec du tampon B pendant 10 min àun débit de 2,5 ml / min. Éluer HdeB avec un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de NaCl dans le tampon B sur une période de temps de 50 min avec un débit de 2,5 ml / min 6 écoulement.
  8. Identifier les fractions contenant HdeB en utilisant une SDS-PAGE à 15%. Mélanger 20 pi d'échantillon avec 5 pi de 5x tampon de chargement SDS réduite. Charge 10 pi sur le gel et fonctionner dans un tampon Tris-glycine (14,4 g / L de glycine, 2,9 g / L de Tris, 1 g / L de dodécyl sulfate de sodium, pH 8,3). Exécuter le gel à 150 V jusqu'à ce que la bande de bromophénol ait migré à proximité du fond du gel (~ 45 min).
  9. Piscine all fractions HdeB contenant, on dialyse à 4 ° C pendant une nuit contre 4 litres de tampon de stockage de HdeB (50 mM de Tris / HCl, 200 mM de NaCl, pH 8,0) et on concentre la protéine à environ 300 um en utilisant des unités de filtre centrifuge ayant un poids moléculaire coupure de 3 kDa. Déterminer la concentration de HdeB à 280 nm en utilisant le coefficient d' extinction ε 280nm = 15595 M -1 cm -1. Préparer des aliquotes de 100 pi et sans flashze aliquotes dans l'azote liquide.
    REMARQUE: HdeB peut être conservé à -70 ° C pendant au moins 6 mois.

2. Chaperone Essai d'activité utilisant Thermiquement dépliage Malate déshydrogénase (MDH)

NOTE: L'influence de HdeB purifiée sur l'agrégation de dépliage thermique porcine malate déshydrogénase mitochondriale (MDH) à différentes valeurs de pH a été contrôlé comme décrit ci-dessous. Toutes les concentrations de protéines citées, se référer à la concentration du monomère.

  1. Pour préparer MDH dialyser MDH à 4 ° C pendant une nuit contre 4 litres de tampon C (mM de phosphate de potassium 50 mM, NaCl 50, pH 7,5) et on concentre la protéine à environ 100 uM en utilisant des unités de filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure de 30 kDa.
    REMARQUE: la dialyse attentive de MDH est nécessaire que MDH est livré sous forme de solution de sulfate d'ammonium.
  2. Pour éliminer les agrégats, centrifuger la protéine pendant 20 min à 20 000 xg à 4 ° C. Déterminer la concentration MDH par absorbance à 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7,950 M -1 cm -1). Préparer 50 aliquotes pi de MDH et flash-geler les aliquotes pour le stockage.
  3. Placer 1 ml cuvette de quartz dans un spectrophotomètre à fluorescence équipé avec porte et agitateur d'échantillons à température contrôlée. Définir ex λ / em à 350 nm.
  4. Ajouter des volumes appropriés de préchauffée (43 ° C) du tampon D (150 mM de phosphate de potassium, 150 mM de NaCl) aux valeurs souhaitées de pH (ici: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 et pH 5,0) à la cuve et fixé la température dans le support de cuvette à 43 ° C. Le volume total est de 1000 pi.
  5. Ajouter 12,5 uM HdeB (ou en variante le même volume de tampon de stockage HdeB pour le contrôle du tampon) dans la mémoire tampon, suivi par l'addition de 0,5 uM MDH. Commencez la surveillance diffusion de la lumière. Incuber la réaction pendant 360 secondes pour permettre suffisante déploiement de MDH.
  6. Soulever le pH à 7 en ajoutant 0,16 à 0,34 volume de 2 M unbuffered K 2 HPO 4 et continuer reCording diffusion de la lumière pour un autre 440 sec.
  7. Réglez le degré d'agrégation MDH qui est enregistré en l'absence du chaperon à un point de temps défini après neutralisation (ici après 500 secondes, lorsque maximale diffusion de la lumière du MDH a été observée) à 100%. Normaliser l'activité de HdeB au signal de dispersion de la lumière de la MDH en l'absence de HdeB à chaque valeur de pH indiquée.

3. Détection de HdeB-LDH Formation complexe par ultracentrifugation analytique (Auc)

NOTE: Sédimentation expériences de vitesse de HdeB seul ou en complexe avec dépliage thermique lactate déshydrogénase (LDH) ont été effectuées en utilisant une ultracentrifugation analytique.

  1. Pour préparer la LDH dialyser LDH à 4 ° C pendant une nuit contre 4 litres de tampon C (mM de phosphate 50 de potassium, 50 mM de NaCl, pH 7,5) et on concentre la protéine à environ 200 um en utilisant des unités de filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure de 30 kDa.
    NOTE: la dialyse attentive de la LDH est nécessaire que LDH est fournie sous forme de solution de sulfate d'ammonium.
  2. Pour éliminer les agrégats, centrifugeuse LDH pendant 20 min à 20 000 xg à 4 ° C. Déterminer la concentration de LDH par absorbance à 280 nm (280 nm ε = 43680 M -1 cm -1). Préparer 50 aliquotes ul de LDH et flash-geler les aliquotes pour le stockage.
  3. Incuber 3 uM de LDH en présence et en l'absence de 30 pM HdeB dans du tampon D (pH 4 et 7, respectivement) pendant 15 min à 41 ° C.
    NOTE: L'incubation de la LDH à des résultats plus élevés des températures dans son agrégation complète, et aucun effet chaperonne de HdeB peuvent être observées.
  4. Laissez les échantillons refroidir à la température ambiante. Ensuite, des échantillons de charge dans des cellules contenant secteur norme en forme de centres de 2 canaux avec 1,2 cm de trajet. Charger les cellules dans le ultracentrifugation et équilibrer à 22 ° C pendant au moins 1 heure avant la sédimentation.
  5. Des échantillons de Spin à 22 ° C et 167.000 xg dans le rotor respectif pendant 12 heures, et surveiller la sedimentation de la protéine en continu à 280 nm. Comme il est démontré précédemment, le rapport signal sur bruit est amélioré lorsque l'intensité lumineuse transmise de chaque canal est mesurée plutôt que l'absorbance. Ceci améliore également la qualité du montage ultérieur des données.
  6. Procéder à l' analyse des données avec SEDFIT (version 15.01b, Décembre 2015), en utilisant le modèle c continu (s) de distribution 17. Un tutoriel décrivant comment utiliser SEDFIT peut être trouvé dans la référence 18.
    1. Réglez le niveau de confiance pour la régularisation ME (Maximum Entropy) à 0,7.
  7. Calculer la densité du tampon ainsi que la viscosité en utilisant SEDNTERP 19. Pour estimer la quantité de protéine client agrégée, comparez les intégrales de LDH sédimenté dans pH 4 à pH 7 comme une référence.
    NOTE: L'intégration des parcelles de distribution de sédimentation peut être fait directement dans SEDFIT. Logiciel alternatif pour analyser les données de vitesse de sédimentation peut être trouvée dans une étude récente 20. </ Li>

4. Suivi MDH Inactivation et Réactivation en présence de HdeB

NOTE: L'influence de HdeB purifiée sur le repliement de pH-déplié MDH a été déterminée en surveillant l'activité de MDH lors de la neutralisation.

  1. Incuber 1 uM dans du tampon D MDH aux valeurs souhaitées de pH (ici: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 et pH 5,0) pendant 1 heure à 37 ° C en l'absence ou en présence de 25 pM HdeB. Ensuite, faire passer la température à 20 ° C pendant 10 min.
    NOTE: Aucune MDH repliement a été observée, même en présence de HdeB lorsque MDH a été incubée à des températures supérieures à 37 ° C.
  2. Pour amorcer le repliage de l'acide dénaturé MDH, de neutraliser les échantillons à pH 7 par addition de 0,13 à 0,42 volume de phosphate de sodium 0,5 M, pH 8,0.
  3. Après incubation pendant 2 heures à 20 ° C, de déterminer l' activité de la MDH en surveillant la diminution du NADH à 340 nm 9.
    REMARQUE: MDH catalyse la réduction de la NADH-dépendante de l'oxaloacétate en L-malate. Mélanger 50 ul de la réaction d'incubation avec 950 ul de tampon de dosage (phosphate de sodium 50 mM, pH 8,0, 1 mM de l'oxaloacétate et de 150 uM de NADH).
    REMARQUE: La concentration finale de la MDH dans le tampon d'essai doit être de 44 nm.
  4. Surveiller le changement d'absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre, équipé d'un bloc de contrôle de la température Peltier réglé à 20 ° C.
  5. Signaler l'activité MDH par rapport à 44 nM natif MDH qui a été maintenu à un pH de 7,0.

5. Effet de HdeB surexpression sur E. coli Survie sous stress acide

NOTE: E. coli MG1655 ADN génomique a été isolé à l' aide d' un protocole publié 21.

  1. Amplifier hdeB de E. coli MG1655 par PCR en utilisant des amorces hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT et hdeB - EcoR I-fw GGT CCG GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
  2. Mettre en place la réaction PCR dans 50 ul comme suit: 10 ul de 5 x tampon de polymerase, 200 uM de dNTP, 0,5 uM d' amorce JUD2, 0,5 pM d' amorce JUD5, 150 ng MG1655 d'ADN génomique, 0,5 ul d'ADN polymerase, ajouter ddH 2 O à 50 ul.
  3. Effectuer l' amplification de hdeB comme suit: Etape 1: 5 min à 95 ° C, 1 cycle; étape 2: 30 sec à 95 ° C, 30 s à 55 ° C, 30 s à 72 ° C, 40 cycles; Étape 3: 10 min à 72 ° C.
  4. Clone résultant fragment PCR dans les sites EcoR I et BamH I du plasmide pBAD18 en utilisant des méthodes standard pour site de restriction clonage. On purifie le plasmide en utilisant un kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant. Vérifier le plasmide obtenu par séquençage 10.
  5. Transformer le plasmide exprimant HdeB ou la régulation vectorielle pBAD18 vides dans la souche BB7224 (Δ rpoH) (génotype: F -, λ -, e14 -, [araD139] B / r [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 araD + rpoH :: kan +; 16) en utilisant des cellules chimiquement compétentes.
    NOTE: Cette souche est sensible à la température.
  6. Au bout de 45 secondes de choc thermique à 42 ° C et avant le placage, incuber les cellules à 30 ° C et à 200 tours par minute. Effectuer colonie streak-outs individuels des clones positifs et incuber une nuit à 30 ° C. Préparer une culture de nuit dans 50 ml de LB Amp et cultiver les cellules à 200 tpm et 30 ° C.
  7. Diluer les cultures d'une nuit de 40 fois dans 25 ml de LB Amp et cultiver les bactéries en présence de 0,5% d' arabinose (Ara) à 30 ° C et à 200 tours par minute à une DO 600nm = 1,0 pour induire l' expression des protéines HdeB.
  8. Pour les expériences pH de décalage, utilisez LBAmp + Ara pour diluer les cellules à OD 600nm de 0,5 et ajuster aux valeurs respectives de pH (ici: pH 2,0, pH 3,0, et un pH de 4,0) en ajoutant des volumes appropriés de HCl 5 M.
  9. Une fois les points temporels indiqués (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min, pH 4, 30 min), de neutraliser les cultures en ajoutant les volumes appropriés de NaOH 5M.
  10. Surveiller la croissance des cultures neutralisées en culture liquide pendant 12 heures à 30 ° C en utilisant des mesures de densité optique.

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Representative Results

HdeA et HdeB sont homologues E. protéines coli, connus pour protéger les protéines périplasmiques contre les conditions de stress acide 10. Notre travail a révélé que semblable à HdeA, HdeB fonctionne également comme un acide activé chaperon moléculaire. Cependant, contrairement aux fonctions HdeA, HdeB à un pH qui est toujours potentiellement bactéricide, mais nettement plus élevée que l'optimum de pH de HdeA 6,9,10,22. Afin d' étudier le pH optimal de l'activité de chaperon de HdeB in vitro, natif MDH a été dilué dans préchauffée (43 ° C) tampon du pH indiqué en présence ou en l' absence de HdeB. Après 360 secondes d'incubation, la réaction d'incubation a été neutralisée. Cette neutralisation déclenche l' agrégation de MDH à 43 ° C 9. Les résultats représentatifs montrent que le signal de diffusion de la lumière de la MDH en l'absence de HdeB augmente considérablement lors de la neutralisation due à l' agrégation des MDH (figure 1, blligne ack à chaque pH). En présence d'HdeB, le signal de diffusion de la lumière est diminuée de façon significative lors de la neutralisation de pH 4 ou pH 5 , ce qui indique que HdeB empêche l'agrégation de MDH (figure 1, à pH 4 et à pH 5). En revanche, cependant, lors de la neutralisation du pH 2 et pH 3, MDH agrégats rapidement dans la même mesure indépendante de la présence ou de l' absence de HdeB (figure 1, pH 2 et pH 3), ce qui indique que le pH optimal pour l'activité de chaperon de HdeB est un pH compris entre 4 et 5. le tampon de stockage de HdeB n'a eu aucun effet sur l' agrégation MDH (figure 1, le contrôle de la mémoire tampon), ce qui indique que le signal de diffusion de la lumière réduite de MDH en présence d'HdeB à pH 4 est due à sa fonction de chaperon. HdeA est chaperon actif dans sa forme monomère et déplié à un pH de 2-3 , mais ne montre aucune activité égale ou supérieure à pH 4 10. Ces résultats suggèrent que HdeB a son activité chaperon optimale autour de pH 4 10.

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Figure 1:. Activité Chaperone de HdeB à pH acide 0,5 uM MDH a été incubé dans un tampon D préchauffé au pH indiqué en l'absence ou en présence de 12,5 pM HdeB pour 360 sec à 43 ° C. Le pH des échantillons a ensuite été portée à pH 7 (comme indiqué par l'astérisque) par addition de 0,16 à 0,34 volume de 2 M K non tamponnée 2 HPO 4, l' agrégation MDH a été mesurée pendant un temps supplémentaire de 440 secondes en contrôlant la diffusion de la lumière à 350 nm pH neutre (fond bleu). Figure est modifiée à partir de Dahl et al. 10 recherche .Cet a été initialement publié dans le Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, S Horowitz, Bardwell JC, fonctions Jakob U. HdeB comme un chaperon acide de protection dans les bactéries. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Droit d'auteur de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pour faire face si les formes de HdeB complexes stables aussi avec d'autres protéines clientes, 3 uM LDH a été thermiquement dépliées à 41 ° C en présence ou en absence de 30 uM HdeB à différentes conditions de pH. L'analyse du comportement de sédimentation de ces échantillons par ultracentrifugation analytique a été effectuée à 22 ° C. Lors de la LDH et HdeB ont été incubées ensemble à un pH de 7 et à 41 ° C, de la LDH est restée exclusivement tétramère (masse moléculaire de 120 kDa) et est resté HdeB dimérique. Ces résultats indiquent que les protéines ne forment pas des complexes stables à pH 7, et la LDH ne subit pas de changements irréversibles dans oligomérisation sur 20 min d' incubation à 41 ° C (figure 2, ligne verte). De même, HdeB est resté dimérique lors d'une incubation à 41 ° C et à un pH de 4,0, ce qui indique que la faible incubation de pHde HdeB n'affecte son état d'oligomérisation même dans des conditions de choc thermique (figure 2, ligne rouge). LDH après incubation à pH 4 et 41 ° C en l'absence de HdeB agrégées rapidement comme indiqué par le fait que 40% de la LDH sédimenté avant la première analyse a été enregistrée (Figure 2, indiqué dans le coin supérieur droit). La LDH restante est apparu dans les sédiments principalement comme monomère (Figure 2, ligne bleue). A l' opposé, l' incubation de la LDH et HdeB à un pH de 4 et 41 ° C a provoqué une forte proportion des deux protéines co-sédiments (LDH HdeB-C), en formant une nouvelle espèce ayant un poids moléculaire de 134 kDa. Cette espèce représente probablement un complexe entre dimères HdeB et LDH dépliage thermiquement. De plus, en présence d'HdeB, aucune agrégation LDH significative avant la sédimentation a été observée, ce qui est cohérent avec nos mesures in vitro de l' agrégation. Ces résultats montrent que HdeB présente une activité de chaperon dans saforme dimère à pH 4,0. Ceci est en contraste frappant avec HdeA, qui est chaperon actif dans sa forme monomère. La nature dynamique de HdeB qui lui permet de subir des réarrangements structuraux entre pH 4 et à pH 7 est vraisemblablement suffisant pour l'activation de la fonction de chaperon de 10 HdeB.

Figure 2
Figure 2:. La détection de la formation du complexe entre HdeB et la LDH dépliée à un pH de 4 par ultracentrifugation analytique 3uM LDH a été incubée en présence d'un excès HdeB 10-molaire dans un tampon D (150 mM KHPO 4, NaCl 150 mM) pendant 15 min à 41 ° C soit à pH 7 (ligne verte) ou pH 4 (ligne noire). A titre de comparaison, LDH seule (ligne bleue) ou HdeB seule (ligne rouge) ont été incubées pendant 15 min à 41 ° C à pH 4. Analytical vitesse ultracentrifugation de sédimentation a été utilisée pour déterminer la stoechiométrie de HdeB, LDH, et le complexe formé entre HdeB et la LDH au difconditions férentes pH. Notez que ~ 40% LDH agrégées avant le premier balayage lors d'une incubation à pH 4 et en l'absence de HdeB (comme indiqué dans le coin supérieur droit). Montré est un graphique de distribution de coefficient de sédimentation (c (s)) a analysé en utilisant le SEDFIT du programme. Les lettres indiquent l'état oligomérique respectif de LDH ou HdeB respectivement: HdeB D, HdeB dimère; LDH M monomère LDH, T LDH LDH tétramère; HdeB-LDH C, complexe HdeB-LDH. Figure est modifiée à partir de Dahl et al. , 10. Cette recherche a été initialement publié dans le Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, S Horowitz, Bardwell JC, fonctions Jakob U. HdeB comme un chaperon acide de protection dans les bactéries. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Droit d' auteur de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.

Pour tester si HdeB soutient le repliement des protéines clientes sur la neutralisation, l'influence de HdeB sur le repliement de MDH pH dénaturé a été analysé. Dénaturée thermiquement MDH a été incubée à différentes valeurs de pH, en présence ou en l'absence de HdeB. Après incubation à faible pH, le pH a été neutralisé (qui initie repliage MDH) et l'activité de la MDH a été déterminée après 2 heures. Comme on le voit sur la figure 3, la réactivation significative de la MDH a été obtenu lors de la neutralisation du pH 4 en présence d'HdeB. Aucune activité de MDH a été déterminée lorsque HdeB était absent de la faible incubation de pH.

Figure 3
Figure 3: HdeB facilite le repliement de l' acide dénaturé MDH à un état enzymatiquement actif 1 uM MDH a été incubée dans un tampon D au pH indiqué pendant 1 heure à 37 ° C en l'absence ou p.resence de 25 uM HdeB. Ensuite, la température a été décalé à 20 ° C pendant 10 minutes avant que les échantillons ont été neutralisés à pH 7 par addition de 0,5 M de Na 2 HPO 4. Des aliquotes ont été prélevés après 2 heures d'incubation à 20 ° C et analysés pour déterminer l'activité de la MDH. activité MDH lors de la neutralisation en l'absence (barres blanches) ou la présence de HdeB (barres noires) est affiché. L'écart-type dérivé d'au moins 3 mesures indépendantes est affichée. Figure est modifiée à partir de Dahl et al. , 10. Cette recherche a été initialement publié dans le Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, S Horowitz, Bardwell JC, fonctions Jakob U. HdeB comme un chaperon acide de protection dans les bactéries. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Droit d' auteur de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.

Nos données in vitro ont révélé que HdeB se lie à différentes protéines clientes du modèle à un pH de 4, prévient leur agrégation et facilite le repliement client une fois que des conditions de pH neutre sont restaurées. Pour étudier les effets de HdeB in vivo, des essais de survie dépendant du pH ont été réalisées en utilisant la souche rpoH suppression sensible à la température. Cette souche n'a pas la plupart des chaperons et est donc plus sensible à la température élevée, à faible pH ou le stress oxydatif 15. La surexpression de HdeB dans des conditions de pH neutre n'a montré aucun effet sur le taux de croissance de la souche, qui a progressé comparativement bien à la souche témoin qui abrite le vecteur pBAD18 vide (Figure 4, non traité). En revanche, nous avons constaté des différences claires dans leur capacité à reprendre la croissance du pH 3 ou pH 4 traitement avec la souche surexprimant HdeB montrant de manière reproductible une récupération améliorée de faible trea pHTEMENT que la souche témoin. Contrairement à nos données in vitro, cependant, la présence de HdeB a également eu un effet significativement protecteur à pH 3. Cela peut être dû à la forte concentration de HdeB dans la cellule, ce qui pourrait changer l'état de HdeB d'oligomérisation vers dimères même à pH 3. Notez que le passage des cellules à pH 2 ou pH 3 a entraîné des effets très rapides et très toxiques, alors qu'aucun meurtre significative n'a été observée lorsque les cellules où incubés à pH 4 9,10,22.

Figure 4
Figure 4: HdeB protège E. coli contre un pH acide. HdeB (cercles rouges) a été surexprimés dans BB7224 (Δ rpoH) en présence de 0,5% d' arabinose à 30 ° C. BB7224 cellules hébergeant le vecteur pBAD18 vide ont été utilisées comme témoins (cercles noirs). Panneau supérieur gauche montre la croissance des deux stpluies à 30 ° C, pH 7. Les cellules ont été transférées au pH indiqué par addition d'HCl 5 M et incubées pendant 1 min à pH 2 (panneau supérieur droit), 2,5 min à pH 3 (partie inférieure gauche) ou 30 min à pH 4 (panneau inférieur droit). Par la suite, les cultures ont été neutralisés en ajoutant des volumes appropriés de NaOH 5 M et on a surveillé la croissance dans des milieux liquides à 30 ° C. Figure est modifiée à partir de Dahl et al. , 10. Cette recherche a été initialement publié dans le Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, S Horowitz, Bardwell JC, fonctions Jakob U. HdeB comme un chaperon acide de protection dans les bactéries. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Droit d' auteur de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Afin d'étudier le mécanisme d'activation et la fonction de chaperon HdeB, de grandes quantités de HdeB doivent être exprimés et purifiés. Un certain nombre de systèmes de vecteurs d'expression sont disponibles pour la production de niveaux élevés d'une protéine cible, y compris les vecteurs pTrc ou pBAD, dont les deux ont été utilisés dans cette étude. Les promoteurs sont facilement accessibles pour E. coli ARN polymérase et d' expression permettent ainsi fortement régulée positivement de HdeB en tout E. coli. Cet aspect est particulièrement pertinent pour étude in vivo de la surexpression de HdeB dans des conditions de stress acide, où la souche a été déficient rpoH utilisée. Cette souche n'a pas la plupart des chaperons et est plus sensible à divers facteurs de stress, y compris une température élevée, à faible pH et le stress oxydatif 15 ainsi. En tant que variante, la survie des études similaires à celles présentées ici peut être réalisée dans des souches mutantes dépourvues du gène d'intérêt.

t "> La conception expérimentale pour une activité de chaperon ou de dosage repliage doit être soigneusement pris en considération, à la fois en ce qui concerne le type de client, la concentration de la protéine cliente et le tampon conditions. Dans les essais de chaperon typique, les protéines clientes de modèles, tels que la citrate synthase, la luciférase ou la malate déshydrogénase sont dénaturés dans des concentrations élevées d'urée ou la guanidine-HCl, et on les dilue dans du tampon dénaturant libre à induire l' agrégation 23,13. les mesures en présence de chaperons révèle la mesure dans laquelle ils empêchent l' agrégation des protéines. en variante, les clients sont dépliée thermiquement et l' agrégation de la protéine est surveillée. dans les deux cas, les mesures de diffusion de lumière sont utilisés comme lecture pour l' agrégation des protéines. chaperons actifs empêchent l'agrégation de dépliage des protéines clientes, ce qui provoque une diminution du signal de diffusion de la lumière 6. tant de ces configurations expérimentales peut être combinée à une faible incubation de pH. En plus d'évaluer la moleactivité chaperon ecular en surveillant leur capacité à empêcher l' agrégation des protéines particulières du client, l'influence des chaperons sur le repliement du client lors du retour à des conditions non-stress peut être testé 24. Cela est particulièrement simple lorsque les protéines clientes possèdent une activité enzymatique qui peut être utilisé comme une lecture quantitative de leur inactivation et la réactivation. Alors que le repliage de chaperon à médiation est naturellement un processus dépendant de l' ATP, tels que des chaperons périplasmiques HdeA, et HdeB Spy ont été représentés afin de faciliter le repliage de façon ATP-indépendant client compatible avec le manque d'énergie dans le périplasme 9,25.

L'étude de l'optimum de pH d'un chaperon acide protecteur tel que HdeB est difficile pour diverses raisons: (i) les comportements d'agrégation de protéines chaperon client même bien établis tels que citrate synthase diffèrent à pH acide; et (ii) seulement quelques systèmes tampons fonctionnent dans la gamme de pH compris entre 05/02 et sont suitable pour deux le chaperon d'intérêt et la protéine de client. Nous avons décidé d'utiliser un tampon phosphate, même si nous sommes conscients que cela est un système tampon non-idéal dans des conditions de pH acide. Cependant, un tampon phosphate a été jugée bien adaptée pour caractériser HdeA que l' acide chaperon activé 9,22. mesures d'agrégation sont très sensibles aux variations de la teneur de la température ou de tampon. Pour éliminer les résultats faussement positifs, il est donc conseillé de toujours tester l'influence du tampon de stockage chaperonne sur l' agrégation de client (Figure 1, le contrôle de la mémoire tampon). Parfois, l'agrégation de la protéine du client se produit si vite que même le meilleur chaperon pourrait ne pas être capable de rivaliser avec le processus d'agrégation. Il est donc essentiel de procéder à des essais préliminaires pour trouver les conditions d'essai optimales. Un bon exemple d'une telle situation est donnée dans nos expériences d'ultracentrifugation où l'incubation de la LDH à des températures> 42 ° C est si rapide que même leprésence d'un excès de HdeB ne prévient pas l'agrégation de la LDH. En outre, le chaperon / co-chaperon rapport ou le rapport chaperon / client doit être déterminée avec soin 23. Nous avons commencé à l'aide d'un assez haut HdeB ratio MDH de 50: 1 dans des expériences préliminaires et qui nous a aidés à identifier pH 4 comme le pH optimal pour l'activité chaperonne de HdeB. Nous avons ensuite continué à analyser HdeB ratios MDH entre 1: 1 et 50: 1 à pH 4, l'identification de 25: 1 pour le rapport le plus efficace. En revanche, HdeA supprimé l' agrégation MDH comme 10: 1 chaperon: ratios clients 6,9,10,22. Ainsi, nous concluons que HdeA, par rapport à HdeB, est plus efficace dans la suppression de l'agrégation MDH comme chaperon inférieur: ratios clients étaient suffisants pour supprimer complètement l'agrégation MDH. Une autre approche pour étudier la suppression de chaperon à médiation de l'agrégation des protéines implique des dosages spin-down, dans lequel les agrégats clients sont éliminés par centrifugation et quantifiées par SDS-PAGE. Cette approche est également adapté pour les murveillance l'influence des chaperons sur l' agrégation des protéines in vivo. Les souches mutantes qui soit surexpriment ou de l'absence du chaperon d'intérêt sont exposés à des protéines dépliage des conditions de stress. Ensuite, les cellules sont lysées et les fractions solubles et agrégées sont séparés et quantifiés 15,16,26.

Pour la détection du complexe chaperon client, nous avons appliqué une ultracentrifugation analytique. Il est à noter ici que sur la base du dispositif expérimental, il est impossible de quantifier directement la quantité de HdeB et des monomères de LDH lié dans ce complexe, car les deux protéines absorbent à 280 nm. Si on le désire, la stoechiométrie du complexe chaperon client peut être déterminée séparément par marquage de chaperon et la protéine de client avec un chromophore, dont le maximum d'excitation se situe dans le domaine visible. En variante, la stoechiométrie des clients à l'intérieur des complexes chaperons peut être déterminée en utilisant PAGE natif couplé à western blot quantitatif. En suivant les protocoles présentés ici, nous avons pu caractériser deux chaperons moléculaires, HdeA et HdeB 9,10,22. En général, ces tests peuvent être également utilisés pour étudier le rôle des inhibiteurs potentiels de chaperons moléculaires dans le repliement des protéines in vitro et in vivo ou peuvent être appliqués à tester chaperons synthétiques pour leur capacité à empêcher l' agrégation du client sous contrainte acide. En outre, les protocoles présentés ici peuvent être utilisés pour les analyses de point-mutations et / ou variants tronqués des chaperons activés par un acide afin de faire la lumière dans le mécanisme de leur activation.

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Acknowledgments

Nous remercions le Dr Claudia Cremers pour ses conseils utiles sur les tests de chaperons. Ken Wan est reconnu pour son aide technique dans la purification HdeB. Ce travail a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute (à JCAB) et les National Institutes of Health subvention RO1 GM102829 à JCAB et UJJ-UD est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de la Fondation allemande pour la recherche (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

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References

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Biochimie numéro 116 Chaperone moléculaire stress acide réponse au stress la protéine d'agrégation le dépliement des protéines bactéries Light Scattering repliement des protéines interaction protéine-protéine contrôle de la qualité de la protéine.
Détection de l&#39;activité dépendant du pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; et<em&gt; In Vivo</em
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Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

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