Summary
Мы описываем высокой пропускной способностью, мультиплекс, и целевой Протеомные спинномозговой жидкости (CSF) анализ, разработанный с потенциалом для клинического перевода. Тест может количественно оценить потенциальные маркеры и факторы риска для нейродегенеративных, такие как варианты гена аполипопротеина Е (Е2, Е3 и Е4), и измерить их аллельного выражение.
Abstract
Многие нейродегенеративные заболевания , до сих пор отсутствуют эффективные методы лечения. Надежные биомаркеры для идентификации и классификации этих заболеваний будет иметь важное значение в развитии будущих новых видов лечения. Часто потенциальные новые биомаркеры не делают его в клинику из-за ограничений в их развитии и высокими затратами. Тем не менее, целевые протеомики с использованием множественного контролировании реакции жидкостной хроматографии-тандем / масс-спектрометрии (МРМ ЖХ-МС / МС), в частности, с помощью тройных квадрупольные масс-спектрометры, является одним из методов, который может быть использован для быстрой оценки и подтверждения биомаркеров для клинического перевода в диагностические лаборатории , Традиционно, эта платформа широко используется для измерения малых молекул в клинических лабораториях, но потенциал для анализа белков, что делает его привлекательной альтернативой ELISA (Enzyme-Linked Immunosorсогнуты анализа) основе методов. Здесь мы опишем, как целенаправленный протеомики могут быть использованы для измерения уплотненных маркеров деменции, в том числе детекции и количественного определения известного фактора риска алипопротеина изоформы 4 (apoE4).
Для того чтобы сделать анализ подходит для перевода, он предназначен, чтобы быть быстрым, простым, высокоспецифичным и экономически эффективным. Для достижения этой цели, каждый шаг в развитии анализа должны быть оптимизированы для отдельных белков и тканей они анализируются. Этот метод описывает типичный рабочий процесс, включая различные советы и приемы для разработки целевых протеомика MRM LC-MS / MS для перевода ,
Разработка метода оптимизирована с использованием пользовательских синтезированные версии триптических quantotypic пептидов, которые откалибровать MS для обнаружения, а затем подскочили в CSF, чтобы определить правильную идентификацию эндогенного пептида в хроматографического разделения до анализа в MS. Для достижения ABSOLUТ.Е. Количественную, стабильные меченого изотопом внутренний стандарт версии пептидов с бирками порядковых кислоты коротким амино- и содержащий сайт расщепления трипсином, включены в анализ.
Introduction
Растущее влияние нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Альцгеймера, деменция с тельцами Леви и болезнь Паркинсона, становится социально - экономической проблемой во многих странах 1. Существует потребность в дополнительных биомаркеров, которые могут быть использованы для идентификации и классификации пациентов на ранних стадиях заболевания, а также для мониторинга любых потенциальных новых методов лечения. Общая цель этого метода заключается в создании общего трубопровода для обтекаемой, экономичным и быстрым способом проверки потенциальных маркеров CSF нейродегенерации. Смысл заключается в использовании целевых протеомики или пептида MRM LC-MS / MS, как легко исправимо метод для оценки множества потенциальных биомаркеров белка из экспериментов обнаружения. Они могут быть далее мультиплексированы более быстрым хроматографическим разделением (<10 мин) и оценены. В пределах этого мультиплекса экрана для нейродегенеративных биомаркеров, мы включили известный фактор риска развития слабоумия аполипопротеина E4 изоформы (apoE4), поэтому мы чап одновременно определить его статус и уровень экспрессии, тем самым устраняя необходимость в отдельных тестах генотипирования 2. LC-MS / MS обычно используется в качестве метода выбора для точного количественного анализа малых молекул, по сравнению с другими методами, такими как ELISA или иммунологического анализа (RIA). Этот сдвиг в использовании технологии MS для анализа белков, было обусловлено в основном проблемами с иммуно-технологии. Они включают в себя кросс-специфичность, от партии к партии изменения, ограниченный срок годности, а также высокую стоимость. Поэтому целенаправленные протеомика быстро становится растущей альтернативой методам антител на основе таких как Вестерн-блоттинга, RIA и ELISA. Тем не менее, способность мультиплексировать множество маркеров в одном анализе является основным преимуществом этого метода над иммуно на основе методов 3. Методика применима ко многим тканям и использовалась в качестве стратегии аттестации для многих протеомики исследований , включая плазму 4 и мочи 5,6.
тэchnique может быть применен к любой лаборатории, которая имеет доступ и опыт в использовании тройные квадрупольные масс-спектрометры. Конструкция Пептид является относительно простым с растущим использованием баз данных с открытым исходным кодом. Конкурентный рынок синтеза пептидов пользовательских делает их гораздо более доступными. Тяжелые пептиды, однако, являются дорогостоящими и поэтому маркеры должны быть оценены на небольшой когорте до переезда в более крупном масштабе. Существует растущий потенциал для техники для использования в клинических диагностических параметрах, при этом большинство крупных больниц, имеющих тройные платформы на базе квадрупольные, которые могут быть легко адаптированы для выполнения целевых протеомические анализов. Одним из таких применений метода, что делает его в рутинной диагностической установке, является его недавнее применение к скрининга новорожденных пятна крови на серповидно - клеточная анемия 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание:. Схема общего протокола , описанного здесь дается в рисунке 1 Все образцы , используемые для разработки этого метода являются избыточные клинические диагностические пробы и имеют этическое одобрение от комитета по этике London Bloomsbury.
Рисунок 1. Схема Иллюстрируя Общий процесс создания целенаправленную CSF MRM LC-MS / MS анализа. Кандидат маркерные пептиды для оценки выбраны из белковых мишеней. Благодаря использованию пользовательских синтезированных пептидов, целевой метод мультиплекс ЖХ-МС / МС создается. После оценки, анализ может быть использован для оценки эффективности потенциальных маркеров нейродегенерации.
1. Пептид Выбор и дизайн
Примечание: Критерии для маркера пептида является то , что он должен быть уникальным (proteotypic (quantotypic). Для того, чтобы определить, является ли пептид является уникальным или нет, "взрыв" инструмент поиска на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/blast/) могут быть использованы.
- Определить список целевых белков (маркеров), т.е. АпоЕ (смотри таблицу 2).
Примечание: Если маркер был идентифицирован из предыдущих экспериментов протеомическим профилирование 8, а затем выбрать пептид , который дает наилучший ответ из этого набора данных. - Если эта информация недоступна, используйте веб - сайты с открытым исходным кодом, такие как в силикомарганца трипсином переваривания белков - мишеней, используя программные средства , такие как MS-Digest.
- Выберите пептид, который трипсином и не восприимчивы к сообщению модификации поступательные.
Примечание: Эта информация может быть проверена на сайте UniProt www.uniprot.org. Избегайте пептидов, склонных к химической модификации при подготовке пробы LC-MS. <LI> Заказать пользовательский синтез выбранных пептидов.
Примечание: пептиды-маркеры могут быть специально синтезированы различными коммерческими компаниями. Для АроЕ quantotypic пептид использовали для измерения уровней общего APOE был определен AATVGSLAGQPLQER. В proteotypic пептидные последовательности, используемые для определения вариантов Е2 и Е4 являются триптические пептиды для позиции 158 (RLAVYQAGAR и CLAVYQAGAR) и положении 112 (LGADMEDVCGR и LGADMEDVR), соответственно.
2. Приготовление стандартных пептидами
Примечание: Для того, чтобы выбрать лучшие количественные переходы, обнаружение матрицы (CSF) должен быть оптимизирован. Наиболее эффективный способ оптимизации уплотненных пептидов является создание пулов пептидов в известных концентрациях. Эти пулы затем могут быть использованы для разработки метода и стандартных кривых.
- Ресуспендируют синтетические пептиды (пептидные детали приведены в таблице 2) до 1 мг / мл стоковыйКонцентрация согласно инструкции производителя. По умолчанию, если инструкции отсутствуют, ресуспендирования пептиды в 50:50 (об / об) ацетонитрила (ACN) / H 2 O.
- Приготовьте 1:10 разбавление пептида от концентрации запасов и пул 1000 пмоль каждого пептида в низкой трубки микроцентрифужных связывания. Сушат вниз в скорости вакуумном концентраторе окончательный бассейн и хранить при температуре -20 ° C. Подготовьте несколько бассейнов для использования в будущем.
- Алиготе 100 мкл ликвора в низких связывающих труб. Сублимационной сушит CSF.
- Ресуспендируют аликвоты суммированных 1000 пмоль пептидов в пищеварении буфере (100 мМ Трис-HCl, рН 7,8, 6 М мочевина, 2 М тиомочевина, 2% ASB14) с получением концентраций 10 и 1 пмоль / мкл.
- Спайк Отстоявшийся пептиды в лиофилизатах 100 мкл аликвоты CSF в 0, 1, 2, 5, 10 и 15 концентраций пм. Добавьте 20 нг интактного неродственного белка, таких как дрожжи энолаза, чтобы выступать в качестве внутреннего стандарта и контроля за эффективностью переваривания TRypsin.
- Доливают CSF аликвоты с переваривать буфером до конечного объема 20 мкл. Vortex.
- Добавить 1,5 мкл дитиотреитола (30 мг в 1 мл 100 мМ Трис-HCl, рН 7,8) и встряхивают при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Добавить 3 мкл йодацетамида (35 мг в 1 мл 100 мМ Трис-HCl, рН 7,8) и встряхивают при комнатной температуре в течение 45 мин в темноте.
- Добавить 165 мкл DDH 2 O.
- Добавляют 10 мкл 0,1 мкг / мкл секвенирования сорта модифицированного раствора трипсина ресуспендировали в 50 мМ буфера бикарбоната аммония, рН 7,8. Инкубируют на водяной бане при 37 ° CO / N и прекратить переваривание путем замораживания образцов. Хранить не переваривает при -20 ° С до готовности для анализа.
3. Оптимизация MS обнаружения пептидных
- Скопируйте и вставьте последовательность пептида быть оптимизированы, в соответствующее программное обеспечение, например, Skyline 9. Нажмите на пептидной последовательности, чтобы получить информациюожидаемых ионов ионов предшественника массы и продукта.
- Развести пептиды от концентрации акций (смотри раздел 2.1) дополнительно до 1 нг / мл концентрации для разработки метода MS.
- Непосредственно влить пептидов в масс-спектрометре при оптимизированной скорости потока (обычно 0,1 - 0,8 мл / мин) и при 0 - 5% энергии столкновения.
- Приобретать MS спектра с целью выявления экспериментальных ионов многозарядные прекурсоры 8. Выберите ион-предшественник (m / z), что дает наиболее интенсивность (двукратно или ионы трехзарядная предшественника рекомендуется).
- Reinfuse пептида и применить энергию столкновения к фрагменту пептида при столкновении индуцированной диссоциации (CID). Оптимизация энергии конуса и столкновений, чтобы получить лучший образец фрагментации (фрагмент ионы однократно или двукратно заряжены, и масса фрагмента иона, предпочтительно больше, чем родительский ион, рекомендуется).
- Убедитесь в том, что экспериментально полученные переходы соответствуют переходы , генерируемые в силикомарганца </ EM> (как описано в пункте 3.1). Сохранение списка переходов в файле метода MRM с использованием по меньшей мере, 2 наиболее интенсивные переходы на ион-предшественника. Включите 2 переходов: 1 для количественному и 1 для подтверждения в окончательном анализе.
Примечание: Некоторые производители MS имеют функцию (т.е. Waters Intellistart) для автоматизированного управления записями или оптимизации анализа SRM. Если это возможно влить пептиды с комбинированной подвижной фазы на 50 - 70% ACN с 0,1% ФА.
Метод разработки 4. LC-МРМ
Примечание: Анализ смеси синтетических пептидов с помощью жидкостной хроматографии Ультра системы (UPLC) в сочетании с тройной квадрупольный масс-спектрометр Performance. Убедитесь, что источник чист. Растворитель А является DDH 2 0 с 0,1% FA; Растворитель Б ACN с 0,1% FA.
- С помощью системы LC-MS оборудованный колонкой UPLC наполненную C-18 фазы (1,6 мкм диаметром, 90 поры A, 2,1 мм х длина 50 мм) и прикрепленной к предколонки и той же фазы. </ Li>
- Размораживание CSF дайджесты по льду, центрифуге при 16000 г в течение 10 мин и передачи 60 мкл в 300 мкл стеклянной вставкой флаконах и хранить остальное обратно при -20 ° С
- Придать самую высокую концентрацию от стандартной точки кривой , используя 10 мин 1 - 40% ACN линейный градиент (см таблицу 1 для градиента настроек)
- Откройте полученный хроматограммы и удерживающий примечание времени и два верхних наиболее интенсивные (количественный) переходов в пептид со всеми переходами, созданных на шаге 3.
- Основываясь на этой информации, обновить метод MRM 10 мин (созданный на шаге 3.6) с приуроченных каналов для измерения пептидов (см рисунок 2 для примера). Для поддержания чувствительности, сохранить каждый канал с точками на пик больше, чем 8, и время выдержки больше, чем 0,01 с по меньшей мере, одного перехода для каждого пептида.
- не включают "растворителей" задержки в методе MRM: один в начале до 10 секунд до первого пика элюирования идругой в конце метода, 20 сек после последнего пика элюирования. Сделайте это, выбрав "растворителя задержки" в методе событий в файле метода MS.
- Выполните стандартную кривую через приуроченной метод MRM и обеспечить нет мешающие неспецифические пики с переходами (сгенерированных на этапе 3.6) путем проверки линейности.
- Определить, если пептиды могут быть обнаружены путем запуска без пичковый объединенного контроля и CSF болезни с помощью метода.
- Удалить пептиды, которые ниже предела обнаружения из анализа.
Рисунок 2. Пример динамического управления записями MS методом. Таймерная каналы пептидных переходов могут быть сгруппированы в соответствии с установленными времени удерживания. Включение МРМС для включения в таймерную моды, как выбранный маркер пептиды элюируют из хроматографической колонки, минимизирует число TRAnsitions в течение определенного периода времени и повышает чувствительность анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
5. Добавление внутренних стандартов
Примечание: Как было описано выше 10, стабильные меченого изотопом внутренние стандарты могут быть включены в анализ. Из-за счет этих стандартов, то рекомендуется сначала оценить пептиды в матрице.
- Определить идеальные пептиды, оптимизированные для обнаружения в CSF: выбрать пептиды, которые являются наиболее рецидивирующий, с наибольшей интенсивностью и без пиков помех.
- Дизайн соответствующие пептиды включают тяжелые метки 13 C 15 N аминокислот , которые увеличивают массу пептида по крайней мере , 6 Da относительно эндогенного пептида. Кроме того, добавьте тег 4 - 6 дополнительных аминокислот либо к N- или С-конце тяжелой бодрости духаприлива, чтобы контролировать для трипсинизированном пищеварения.
- Развести стабильным изотопом меченных внутренних стандартов в пищеварении буфере (см шаг 2.4). Определить идеальное количество стабильных изотопов меченных внутреннего стандарта, который будет резко возросшей в СМЖ наблюдаются пики на различных уровнях в зависимости от abundancies наблюдавшимся ранее в процессе разработки. Цель достичь примерно 1: 1 соотношение стабильных изотопов меченных стандарта к эндогенным пептида.
Примечание: стабильный изотоп-меченых внутренние стандарты могут быть синтезированы различными коммерческими компаниями.
6. LC-MRM Анализ спинномозговой жидкости клинических образцов
- Шип оптимизировано количество стабильных изотопов меченных стандартов в 100 мкл ликвора и подвергают сублимационной сухой смеси.
- Ресуспендируют CSF в 20 мкл буфера и дайджеста выполнять перевариванию, как это описано в пунктах 2.7 - 2.10.
- Анализ образцов с использованием метода LC-MRM, разработанный на этапе 4.
- Для количественного анализа, запустите стандартную PEPПриливы в концентрациях от 0 -15 пмоль в стандартной кривой. См шаг 2.5 для получения стандартной кривой.
7. Анализ данных
Примечание: Количественные данные основаны на соотношении интенсивностей пиков базовых внутренних стандартов (тяжелые меченые пептиды). Подробная информация о анализа данных / MRM SRM было описано ранее 10. Данные Ratio затем могут быть использованы в стандартной кривой, чтобы определить абсолютные уровни или вычислять их от концентрации добавленного тяжелого меченных пептида.
- Анализ данных LC-MRM использованием стандартного программного обеспечения масс - спектрометров производителей не 10. Кроме того , использование программного обеспечения Skyline для анализа количественных данных 10 MRM.
- Проверьте чувствительность запуска, проверяя реакцию внутреннего стандарта, таких как дрожжи игольчатым энолаза или стабильным меченого изотопом стандарта в каждом цикле. Убедитесь в том, что коэффициент вариации (CV) не больше25%.
- Вручную просмотреть аннотацию данных для обеспечения точности. Анализ каждого пептида и отношение к соответствующему стабильному меченого изотопом внутреннего стандарта, то есть, используют стабильный меченого изотопом вариант пептида , если имеется.
- Для получения абсолютных значений пмоль на 100 мкл ЦСЖ, запустить данные о соотношении с помощью соответствующих стандартных кривых, которые были запущены одновременно.
- Рассчитывают коэффициент вариации (CV). CV для каждого пептида должно быть ниже 25% и ниже 15%, для высоких обильными пептидов.
Примечание: Абсолютное значение пмоль на 100 мкл значений CSF может использоваться в последующем ниже по течению статистического анализа.
8. аполипопротеина Е изоформы Статус
Примечание: Чтобы определить статус изоформ APOE, наличие соответствующих пептидов может быть осуществлено путем определения присутствия каждой изоформы.
- Рассмотрим APOE в 100 мкл ликвора порога> 1000 сигнала-в-шум как положительный для этого пептида. На рисунке 5 пептидов , необходимых / отсутствующих для определения статуса изоформы пациента. Определить выражение аллельного путем вычисления% от каждой изоформы к общему выражению APOE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью метода , описанного выше, был разработан с высокой пропускной способностью 10 мин мультиплексного анализа , состоящий из 74 пептидов из 54 белков, как тест на маркеры нейродегенеративных расстройств болезни Альцгеймера и деменции с тельцами Леви (LBD) 8. На рисунке 3 показана мультиплексного хроматограмму опубликованную ранее 8 из значимых пептидных маркеров из анализа. Пептиды , включенные в анализе и их количественных переходов приведены в таблице 2. Данные , полученные с помощью этого метода дает стандартизованные коэффициенты к соответствующему стабильному меченого изотопом внутреннего стандарта. Эти значения могут быть поставлены через стандартную кривую для определения абсолютных пмоль / 100 мкл концентрации CSF. Эти значения могут быть статистически проанализированы для изменений в клинических образцах.
Как было описано выше 8, Количественную из 74 реptides, включенные в этот CSF анализа показали, что 25 из этих маркеров были значительно изменены в спинномозговой жидкости пациентов с деменцией. Для иллюстрации эффективности данного анализа, результаты ранее описанных слабоумие маркеры Pro-Orexin и YKL хитиназы 3-подобный белок (YKL-40) 11,12 приведены на рисунке 4. Интегрированный АпоЕ анализ идентифицирует статус АпоЕ изоформ / аллель пациент, как хорошо. Апо Е4 является известным фактором риска развития болезни Альцгеймера, поэтому интеграция этого в анализе предоставит ценную информацию. Обнаружение изоформ АроЕ поясняется на рисунке 5 , и основан на обнаружении соответствующих пептидов для Замены аминокислот для изоформ Е2 (R158C) и Е4 (C112R). На фиг.5А показан пик образец ожидаемого для каждой комбинации изоформ и на фиг.5В показан результат CSF испытания с анализом на образцах пациента.
Рисунок 3. Представитель Наложенные MRM хроматограммы. Перепечатка из Хейвуд и др. 8 биомаркеры значимых для нейродегенеративных расстройств с тельцами Леви слабоумия и болезни Альцгеймера 8 показаны в течение 10 мин LC градиента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Пример данных. Перепечатка из Хейвуд и др. 8 Графики показывают , как описано MRM LC-MS метод / МС может надежно количественно оценить и различить от управления известные нейродегенеративные маркеры , такие как YKL хитиназной 3-подобного белка (YKL-40) 11 , 12 и AD маркер Pr о-Orexin 13. AD = болезнь Альцгеймера, LBD = тельцами Леви слабоумия и болезни PD = Паркинсона. Данные ранее опубликованные. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Иллюстрация Как Апо Е изоформы Состояние пациента может быть определен. A. Указывает пептиды охватывающих 112 аминокислотной последовательности LGADMEDVCGR для нейтрального (E3A) или LGADMEDVR на предмет наличия E4 и для позиции 158 , чтобы обнаружить RLAVYQAGAR нейтральный (E3b) или CLAVYQAGAR для Е2 изоформы. B. пептидами из последовательности ApoE показаны на левой панели. Различные комбинации пептидов, обнаруженных в CSF может указывать статус изоформы APOE.Файлы / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Время | Поток (мл / мин) | % A | % В | кривая |
| начальный | 0,8 | 97 | 3 | начальная |
| 0,2 | 0,8 | 97 | 3 | 6 |
| 0,8 | 60 | 40 | 6 | |
| 7,01 | 0,8 | 0,1 | 99.9 | 6 |
| 8 | 0,8 | 0,1 | 99.9 | 6 |
| 8,01 | 0,8 | 97 | 3 | 1 |
| 10 | 0.8 | 97 | 3 | 1 |
Таблица 1. UPLC Настройки градиента для метода 10 мин. A = DDH 2 0 0,1% FA, B = ACN, 0,1% FA
Таблица 2. Пептиды Включенные в СМЖ MRM LC MS / MS анализа. Изображены все включенные в пептиды , используемые в способе, которые описаны и опубликованы 8. Индикация того, был ли маркер надежно обнаружен в 100 мкл CSF указывается. Переходы , обозначенные жирным шрифтом , являются те , которые используются для количественных данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как и со всеми на основе MS анализов, критические шаги в методе являются определение соответствующих и точных сумм внутренних стандартов. Если абсолютное Количественное определение используется, то правильные количества меченых пептидов в стандартной кривой также имеют важное значение.
Наш анализ не требует осаждения CSF или использование любого типа вымыться или обессоливания шагов до анализа MS - это совершенно один горшок метод реакция. Из-за небольшого объема спинномозговой жидкости и ее ограниченной сложности (по сравнению с плазмой), было установлено, что эти этапы могут быть удалены из итогового протокола, тем самым упрощая анализ и делает его более подходящим для перевода на диагностической установке. Включения предварительной колонки к основной аналитической колонке и из растворителя задержки в методе MS, по всей видимости, будет достаточно для поддержания чувствительности во время МС работать в течение более чем 500 образцов. По мере того как тест-UPLC Runniнг времени мало, важно, чтобы однозначно идентифицировать правильный пик в ликворе переваривать матрицу.
Это может быть достигнуто только с использованием меченых синтезированных пептидов и стандартной кривой. Если существует неопределенность пептида, совпавшего с правильным пика хроматографического то это может быть полезно, чтобы запустить образец через множество переходов и проверить распределение интенсивности переходов с синтетическими стандартами. Все наши анализы содержат по меньшей мере 2 пептидов переходов, чтобы подтвердить идентичность пептида.
Анализ был разработан для маркеров, обнаруженных в до 100 мкл спинномозговой жидкости. Для некоторых других маркеров деменции, может потребоваться больший объем CSF. Другим ограничением анализа является вопрос динамический диапазон экспрессии белка. Некоторые обильные маркеры должны быть введены на масс-спектрометре в меньшем количестве в то время как некоторые низкочастотные обильные маркеры требуют больших объемов впрыска. Поэтому SAMPLе, возможно, потребуется вводить дважды.
Значение этого метода является способность к мультиплекс и повышенная специфичность 3-х уровней идентификации над антител (время удерживания, предшественник и продукт м / г). С точки зрения клинического перевода, большим преимуществом является потенциальная стоимость экономии на антитела, хотя требуется первоначальных затрат для масс-спектрометрического оборудования и квалифицированного персонала. Еще один актив является скорость, в котором метод может быть переведен на системах на основе тройной квадруполь. Это ускоряет значительно возможность переводить и проверки по результатам анализа по сравнению со всеми иммуно на основе методов. Наконец, поскольку эта платформа и опыт регулярно используется для измерения малых молекул клинически, многие крупные больничные центры уже имеют эту инфраструктуру. В области нейродегенеративных есть много внимания и потребность в новых биомаркеров в сыворотке крови и спинномозговой жидкости. Этот метод обеспечивает PLAТГогт для высокой пропускной способности анализа , где могут быть добавлены в будущем маркеры (и удалены) , чтобы быть оценены на предмет эффективности и т.д.. Этот метод имеет еще одно применение в другие ткани для идентификации изоформы ApoE, таких как плазма , которая уже была описана 2 и даже bloodspots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Urea | Sigma | U0631- 500 g | |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg | Genscript | custom | |
| heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides | Genscript | custom | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm column | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 | |
| 300 μl clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system | |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V.
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
