Abstract
Ağaçlarda ikincil kök büyümesi ve buna bağlı ahşap oluşumu, biyolojik ve ticari açılardan hem önemlidir. Ancak, nispeten daha az gelişimlerini yönetir moleküler kontrolü hakkında bilinmektedir. Bunun nedeni genellikle ikincil büyüme süreçlerinin çalışma ile ilişkili fiziksel, kaynak ve zaman sınırlamaları bölümünde yer almaktadır. In vitro bir dizi teknik odunsu ve odunsu olmayan bitki türleri hem de her iki bitki parçası ya da tüm bitki sistemi kapsayan kullanılmıştır. Ancak, ikincil kök büyüme süreçlerinin incelenmesi için kendi uygulanabilirliği konusunda sorular, belirli türlerin ve emek yoğunluğu dinlemezlik yüksek hacimli uygulamalar için orta için genellikle engelleyici bulunmaktadır. İkincil kök gelişimi ve ahşap oluşumu bakarken Ayrıca, soruşturma kapsamında belirli özelliklerin sadece büyümenin birkaç yıl sonra geç bir ağacın ömrü ölçülebilir hale gelebilir. In vivo p bu zorluklar alternatif elerotocols doğrudan bitkinin ikincil kök transgenik somatik doku sektörlerin oluşturulmasını içeren Kaynaklı Somatik Sektör Analizi, adını geliştirilmiştir. Bu protokolün amacı ağaç türlerinin aralığında kullanılabilir geni ve hızlandırıcı fonksiyonel karakterizasyon için transgenik sekonder bitki dokusu yaratmak için, etkili, kolay ve nispeten hızlı bir araç sağlamaktır. Burada sunulan sonuçlar, ikincil ikincil promotör ekspresyonu yanı sıra ağaç türlerinin ve ahşap morfolojik özelliklerin çeşitli kaynaklanıyor transgenik ikincil kök sektörleri kolayca yüksek orta kolaylaştırıcı değerlendirilebilir kaynaklanıyor tüm canlı dokular ve hücre tiplerinde oluşturulabilir göstermektedir verim fonksiyonel karakterizasyonu.
Introduction
Ağaç gezegen biyokütle önemli bir miktarı içerir ve büyük biyolojik, kültürel ve ticari öneme sahiptir kaynaklanmaktadır. İkincil birçok diğer canlılar için kaynak ve barınak sağlayarak yaşam oluşturmak kaynaklanıyor. Onlar yaşamak ve kereste, kağıt hamuru ve kağıt ve diğer ahşap ve odun dışı ürünlerin üretimi için yenilenebilir bir kaynak olarak hareket ekosistemlerin diğer birçok hizmetler sunmak. İkincil kök gelişimi ve daha özel olarak ahşap oluşumu özel hücre tiplerinin gelişimi düzenleyen karmaşık bir moleküler sistem tarafından yönetilir, biyokimyasal hücre duvarlarının bir bileşim ve nasıl doku ve organ oluşturmak üzere düzenlenmiştir. ikincil kök gelişimi ve ahşap oluşumunun moleküler temelini Kesme içinde ve sapları arasında, uzun nesil süreleri, out-geçiş çiftleşme sistemleri, yüksek heterozigotluk, yüksek genetik yük, mevsimsel dinlenme, uzun ahşap ve kök özelliklerinin değişkenliği dahil olmak üzere birçok faktör tarafından şaşırmış olgunSürekli kuruluş dönemleri ve olgun ağaçlar sırf fiziksel boyutu. Sonuç olarak, bitki gelişiminin moleküler kontrolü çoğu diğer yönlerini ayrıntılı bilgiye ikincil kök gelişimi akrabası anlayışı, henüz emekleme aşamasında olduğunu.
In vitro bir dizi teknik çalışma ve özellikle ahşap ve ikincil hücre çeperi oluşumu, ikincil kök gelişimini anlamak için kullanılmıştır. Bu protokoller, transgenik bitkiler, ya oluşturulur ya da belirli ikincil hücreler ya da doku, ahşap ve / veya ikincil kök gelişimi 1 spesifik yönlerini çalışma için dönüştürülen tüm bitki ya da bitki parçası sistemlerinin kullanılmasını içerir. Transgenik bitkiler bitki dokularında ve hücre tiplerinin çeşitli sonrası genetik dönüşümü telafi edilebilir, ancak ilerleme yavaş, özellikle nedeniyle uzun rejenerasyon için ahşap lif özelliklerinin analiz edilmesi ve (yaş sırasına göre) olgunlaşma süreleri kök zaman, yüksek teknik ve emek demands, düşük aday genlerin verim yanı sıra bazı odunsu bitki türleri yayma zorluklar. Benzer teknikler başarıyla bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek Arabidopsis olmayan odunsu model sistemde geliştirilmiştir, fakat bu bir hediye değil tüm orta kök hücre tipleri sapları ve mevsimsel ya da uzun ömür ile ilgili özellikler bu türler 2 okudu edilemez. Alternatif olarak, pinu s radiata kallus kültürleri 3 gibi bitki parçası sistemleri, ilgili zaman dilimleri azaltır. Bu yöntemler ancak bireysel bir hücre tipi çalışmaya kısıtlı ve in vitro deneylerde belirtildiği gibi benzer kısıtlamalar acı vardır. Benzer şekilde, bütün kök eksplantlar içeren apikal kök kültürleri 4 söz göstermiştir ancak henüz spesifik genlerin veya ilgi ortakların çalışma için uygulanmamıştır. Daha yakın zamanda, saçak kök kültürleri içeren alternatif bir protokol eucalypts için geliştirilmiştir ve başarılı olmuştursapları ve tek ağaç türleri sınırlıdır tarihinden en az 5, bununla birlikte, bu yöntem, halen nitro ekimi gerektirir uygulanan çok ikincil kökler içerir.
Burada anlatıldığı gibi uyarılan somatik sektör analizi (ISSA), odun oluşumu ve ikincil kök doku gelişiminde şüpheli rollerle genler ve rehberleri için yüksek verimlilik fonksiyonel bir tarama aracı bir ortam sağlayarak bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. ISSA emek aşılır iken, dokunulmamış sekonder gövde transjenik hücrelerin ve dokuların üretilmesi için gerekli süreyi azaltmak için geliştirilmiş bir in vivo dönüşüm ve eleme sistemi, rutin teknik ve verimlilik sınırlamaları vitro yöntemler kullanılır. İkinci g olmayan ağaç türleri ve ilgi konusu dokuda, kısa bir zaman süresi içinde gövde burada tarif edilen protokoller, bağımsız olarak dönüştürülmüş doku sektör ve hücrelerden yüzlerce aynı anda oluşturulması için izinNispeten kısa zaman dilimlerinde ve düşük işgücü maliyeti içindeki enetic ve / veya çevresel varyasyon. ISSA in vivo teknikleri ilk ve kambiyal farklılaşmasında rol oynayan gen ve / veya ortakların çalışmaları ile ikincil kök dokusunda rafine edilmiş bu yana ikincil kök 6 ve tomurcuk 7 dokular için tarif ve var edilmiştir şunlardır: tubulin (TUB) 8, fasciclin benzeri arabinogalaktan ( FLA) 9, selüloz sentaz (CESA) 10, ikincil hücre duvarı ilişkili nac alanı (SND2) 11, ARBORKNOX (ark1) 12 ve gerçekten ilginç yeni gen (HALKA) H2 proteini 13. İkincil yapılmıştır Bu çalışmalar kavak ve okaliptüs bitki ve hücre morfolojisi, hücre duvarı kimyası ve gen ifadesi içine sağlanan anlayışlar kaynaklanıyor.
Burada anlatılan protokoller deneyim a bir araya getirmek için tasarlanmıştırnd bilgi son on yılda yayınlanmış ve yayınlanmamış çalışmaların bir dizi ISSA geliştirilmesi ve uygulanması yoluyla kazandı. Onlar ikincil kök dokularında 6 in vivo dönüşümü odaklanmak ve Ak Kavak 'Pyramidalis' klon, Okaliptüs Globulus yanı sıra 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis klonlar içeren çalışmalar üzerinde yoğunlaşmaktadır. Bu belge bitki ve bakteri, kök dokuları, büyüme ve doku hasat, transgenik hücrelerin ve dokuların belirlenmesi, veri toplama ve analizi için fenotipik değerlendirmeler ve yöntemler için hazırlık dönüşümün ekimi protokol ile araştırmacılar alır. Teknikleri başarıyla nedeniyle uzay sınırlamaları, aynı zamanda 9,11 hücre duvarı monosakkarit kompozisyona ölçmek için uygulanan olsa da, bu belge ikincil st gen ekspresyonu hücre ve doku morfolojisi ölçmek ve anlamak için kullanılan teknikler üzerinde yoğunlaşmaktadırems sadece. Buna göre, belirtilen protokol yüksek verimli yöntemi düşük maliyetli, teknik olarak kolay ve orta kullanarak kaynaklanıyor ikincil bağlantılı genlerin rolü ve / veya ifadeye daha fazla anlayışlar kazanmak isteyenler için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bitki Materyali hazırlanması 1.
- Önceki deneyler için, tohum veya kesme ile ilgili tercih edilen bir ağaç türlerinin yeni bir fide yükseltmek ve deney için amaçlanan bölgede kök çapı çapı yaklaşık 1 cm kadar ağaç / s büyür.
Not: Bitki büyüme oranları bu nedenle bu adım için üç ila dokuz ay arasında izin dolayı değişebilir gereken süreyi.
2. İkili vektör oluşturulması
- Bir laboratuvar veya Agrobacterium tumefaciens ele alınabilir sera ve laboratuvar için öngörülen, uygun kişisel koruyucu ekipman bölümünde 7'ye bu bölümden çalışmaları yapmak için kullanılır.
- İlgi devirme veya aşırı ekspresyonu kaseti ve bir β-glukuronidaz (GUS) raportör gen kasetinin bir geni veya çalışma türüne bağlı olarak, bir GUS genine kaynaşmış ilgi bir promoter ya da ihtiva eden bir ikili vektör hazırlanır.
Not: ikili vektör bac bir dizi vardırikili vektörlere genleri ve ilgi proje sahiplerine eklemek için kullanılabilir araştırma ağlarına yanı sıra çok sayıda teknikleri ile ticari ya da kaynaklı olabilir kbones. Bu protokol çerçevesinde bir ikili vektör oluşturma konusunda karar vermek için deneyci kalmıştır. - A. silahsız bir gerginlik içine ikili vektör Dönüşümü elektroporasyon veya ısı şoku 14 kullanılarak ve deney için gerekli olana kadar uygun şekilde saklamak tumefaciens.
- herhangi bir pozitif ve / veya negatif kontroller için yineleyin 2.2.
Not: Negatif kontroller faiz çalışmanın bir gen ve faiz çalışmanın promotör için promotorsuz GUS ilgi hiçbir geni içeren bir ikili vektör içermelidir. İlgi çalışmanın bir promotör için pozitif kontrol, bir GUS raportör kaynaşmış bir karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü (CaMV35S) içermelidir.
A. 3. hazırlanması Aşılama için tumefaciens
- exper için en az bir hafta önceimentation, A. küçük bir miktar (yaklaşık 1 ul) sunar Bakteriyel seçimi için uygun antibiyotik içeren 14 tabak adım 2.2 ve 2.3 sırasında hazırlanan ve agar ile ayrı LB ortamında yayılmaya tumefaciens. küçük koloniler meydana getirmek üzere, bir kuluçka makinesi içinde 28 ° C'de büyütülmüştür ve daha sonra 4 ° C'de saklayın ihtiyaç kadar ° C.
- 48 saat deney öncesinde, A'nın bir koloni aktarmak ayrı ayrı 50 ml her plaka tumefaciens önceden ısıtılmış (28 ° C), LB ortamı 14, bakteriyel seçim için uygun antibiyotikler ihtiva eden kadar ve 28 ° C 'de yaklaşık 48 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe 200 rpm'de ajitasyon 5 ml ihtiva eden En tüpler vida karışım çok bulutlu.
- 4-6 saat bitki aşılama öncesinde gövde arasında (bölüm 4) LB / A 1 ml ekleyin yeni bir 50 ml'lik tumefaciens Karışım için uygun antibiyotik ile en taze sıcak (28 ° C) 19 ml (1:20 seyreltme) ihtiva eden tüp LB ortamı vidabakteriyel seçim. 600 nm'de (spektroskopi ile ölçülen OD 600) de optik yoğunluk (OD) 0.1 üzerinde ise, bu elde edilene kadar, sıcak bir LB ile daha fazla seyreltilir.
- Seyreltilmiş LB / A yerleştirin OD 600 kadar tumefaciens karışım geri çalkalama inkübatör ve sallamak aynı koşullar altında (200 rpm, 28 ° C) 0.4-0.6 ve çıkarın arasındadır.
- Santrifüj LB / A. 1,000 x g'de 15 dakika 4 ° C tumefaciens karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
- Sıvı Durusu ve hemen A. tekrar süspansiyon tumefaciens pelet 1 ml MS ortamı 15 soğutmalı içine, 2 ml mikrotüp aktarmak ve aşılama (bölüm 4) için gerekli kadar buz üzerinde saklayın. Bu çözelti, aşılama ortamı olarak adlandırılır.
Tesisi 4. Aşılama A. ile Stem tumefaciens
- geç ilkbahar veya etkin ve hızlı büyüyen kambiyumu sahip bölüm 1'de oluşturulan bitkileri kullanarak erken yaz aylarında deney başlayın. Bir için iyi bir tanıAktif ve hızlı büyüyen kambiyum floem kolayca ksilem soyulmuş olmasıdır.
- bitkinin tabanına yakın kök net bir düz bölümünü bulun ve herhangi bir yaprak ve dalları temizleyin.
- Keskin bir neşter (tercihen No. 11) ya da jilet kullanarak, uzunluğu 20 mm ve bir 5 mm floem yoluyla ayrı sonra bir iki dikey paralel insizyon getirerek kök net bir bölümünde 1 cm 2 'kambiyal penceresi' oluşturmak bazal sonunda iki dikey kesimler bağlayan yatay kesim.
- Peel kesi yukarı gelişmekte olan ksilem dokusu açığa ve bir pipet (genellikle 5-10 ul) kullanılarak maruz gelişmekte olan ksilem yüzeyini ıslak adım 3.6 yeterli Aşılama Medya eklemek tarafından oluşturulan floem şerit. Hemen Floem şerit takın.
- sıkıca Parafilm ile gövdeye floem şerit bağlayın.
- Tekrarlayın ilgi bir yaratma gen (ler) ya da yükseltici (ler) için herhangi bir ek kambiyal pencereler için 4.5'e 4.2 adımlarıEn az ny yeni kambiyal pencereler üzerinde veya diğer kambiyal pencerelerin altında ve offset bir 90 ° 1 cm.
- Tam adımları, her vektörü, deneyde kullanılan her bitkinin aynı köke eklenir sağlamak pozitif ve negatif kontrol vektörleri (2.4 adım a) 4.5 4,2.
- GUS deneyi için kök çapı periyodik büyüme ve hasat en az 5 mm radyal büyüme kaynaklanıyor gözlenmiştir (bölüm 5) izleyin.
Not: gerekli radyal büyüme miktarı aşağı analiz için gerekli olan doku miktarına bağlıdır.
GUS histolojik analiz 5. Hasat
- Tüketim herhangi bir doku kambiyal pencere içinde yeni büyüme parçası olmayan kaldırma sapından 'kambiyal pencere'.
- ksilemini ve floem hücre / doku morfolojisi olgun ilgili çalışmalar için, ksilem gelen floemi soyun.
- kambiyal bölgesi sağlam veya promotör ekspresyonu kalması için gerekli olan çalışmalar için değerlendirilmesi edileceked, enine kalınlığı 0,5 ila 1 mm diskler içine bir jilet veya başka bir keskin bıçak kullanarak kambiyal pencereyi dilim.
- 14 hafta ml alt borular işleme kambiyal cam dokular yerleştirin ve pH 7 ila 14 0.1 M fosfat tamponu içinde iki kez yıkayın., En az beş dakika süre ile çözelti içinde kalır ve fazla çözelti sonunda çıkarılır, doku tamamen daldırılmış olduğundan emin olun ikinci durulama.
- GUS reaktifi (0.5 mm X-gluc (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-glukuronik asit), 10 mM EDTA,% 0.5 Triton X-100, h / h, 0.5 mM potasyum 5 mL . bkz Hawkins ve arkadaşları 16) her bir tüpe, ferrisiyanür (III), 0.05 mM potasyum ferrosiyanür (II), 0.1 mM fosfat tamponu pH 7 ile nihai hacme tamamlanır. Doku tamamen sular altında değilse, ek GUS reaktifi ekleyin.
- Karanlıkta 55 ° C sıcaklıkta 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Karanlıkta 37 ° C sıcaklıkta bir çalkalamalı bir inkübatör üzerinde daha fazla 12-16 saat boyunca inkübe edin(Rpm 30 ila 60) narin ajitasyon kullanılarak karışımın sağlanması için.
- Shaker inkübatör çıkarıldıktan sonra rastgele bir pH aralığı 0-7 ile turnusol kağıdı kullanarak tüpler küçük bir alt GUS reaktif pH'ı kontrol edin.
- tüplerin herhangi 6'nın altında bir pH değerine sahip sonra etiketleyin. pH'ı onaylamak ve pH altında 6 veya eğer etiket tüplerin kalanını kontrol etmeye devam.
Not: 6'nın altında bir pH değerine sahip numuneler analiz için uygun olmayabilir. Bu numuneler bundan başka analize dahil edilmesi gerekir.
- tüplerin herhangi 6'nın altında bir pH değerine sahip sonra etiketleyin. pH'ı onaylamak ve pH altında 6 veya eğer etiket tüplerin kalanını kontrol etmeye devam.
- GUS reaktif boşaltacaktır ve doku karşılamak için yeterli% 70 etanol ile değiştirin.
- 4 ° C'de saklayın kadar gerekli.
Transgenik Doku 6. Kimlik
- forseps kullanarak, mikroskobik görünüm için izin küçük tepsiye veya petri bir tüp ve bir yerden tüm kambiyal pencere doku çıkar.
- 1X ve 4X büyütme arasında bir diseksiyon mikroskobu kullanarak tanımlamak ve hücrelerin veya dokuların sayısını taksitliBu parlak mavi boya var. Mavi boyanmış hücreler ya da doku Bu noktadan itibaren bir sektör olarak belirtilir. aşağıdaki şekillerde onları çetelesini.
- Floem (adım 5.1.1) kaldırıldı numuneler için, gelişmekte olan ksilem (kambiyal sektörü, Şekil 1a) yüzeyinde bulunan kambiyal dokuda sektörlerin sayısını.
- Diskler (aşama 5.1.2) halinde kesilmiş numuneler için, farklı bir hücre ya da doku tiplerinde bulunan sayı kesimleri (Şekil 1b, 1c, 1d) sayısı. Sektörler aşağıdaki doku tiplerinde bulunabilir: peridermeyı (Periderm sektörü, Şekil 1e), floem (Floem sektörü, Şekil 1f), kambiyal dokuyu (Kambiyal sektörü, Şekil 1g, 1h, 1I), yara parankimi (Yara Parankima Sektörü, Şekil 1j) ve tyloses bölgesindeki (Tylose kesimi Şekil 1k).
- mikroskopik a sırasındaBir diskin her iki tarafı inceledi edildiğini ve numaralar abartılmıştır değil böylece iki diskler üzerinde meydana gelen sektörler uyumlu olmasını sağlamak ssessment.
- ihtiyaç kadar% 70 etanol ve mağaza içeren tüpe geri sadece doku içeren sektörlerin yerleştirin.
- pozitif ve / veya negatif kontrol dahil olmak üzere herhangi bir ek kambiyal pencereler için 6.3'e adımı tekrarlayın 6.1.
- Dokularına cm2 dönüşüm olaylarının arasında ortalama bir sayı türetmek için 1 cm2 kambiyal pencere toplam sayısına göre sektörlerin toplam sayısına bölünmesi ile ayrı ayrı gen veya ilgi promoter ve kontrol için, her sektör tipi için ortalama transformasyon etkinliğini hesaplayın Aşılanmış (ATScm -2).
- promotör ekspresyonu analizi için 7,2 ve 8. adıma ve teknikleri kambiyal dokusunda hücre ve doku morfolojisi değerlendirmek için 7.1, 7.2 ya da 7.3 adıma geçin.
7. AnaliziKambiyal Doku Hücre ve Doku Morfoloji
Not: Aşağıda ISSA analizi için başarıyla kullanılmıştır tekniklerin bir seçim vardır örnekleri türetilmiş.
- Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile ksilem hücre alanı, lümen alanında, hücre duvarı kalınlığı ve hücre duvarı alanının analizi.
Not: Bu protokol asgari numune hazırlık gerektirir ve belirtilen morfolojik özellikleri ile ilgili sektör analizi nispeten yüksek verimlilik sağlar.- Bu adımdan itibaren laboratuvar önlüğü, göz koruma sağlamak ve odunsu doku ele ve tedavi ediliyor her eldiven kullanılır lütfen.
- Analiz için kambiyal sektörü tanımlamak ve bir kesi disk (Şekil 2a) oluşturmak için tek bir kenar jilet kullanarak bunun her iki tarafında yaklaşık 0,5 mm yapmak.
- Sektörün teğet tarafına ksilem dokusunun yaklaşık 1 mm bırakarak aşırı ksilem dokusu keserek (Şekil 2b).
- Dikkatlily taze çift kenar jilet (Şekil 2c) kullanarak sektörün merkezi aracılığıyla enine kesti.
- Transgenik doku (Şekil 2d) ayırmak için enine düzlemde her iki sektörün yanında iki ek sığ radyal kesiler olun. GUS boyama doku derin nüfuz edeceği gibi kambiyal yüzeyinde bulunan boyanmış dokunun her iki yanına hücre radyal dosyaları birlikte izleyin.
- Bir SEM pim saplama aşamasına kadar hazırlanan kambiyal sektörü yüzünü takın SEM iletken bant (Şekil 2e) kullanarak monte ve SEM görselleştirme için gerekli olana kadar desikatörde tutmak.
- Tekrarlayın negatif kontrol gelenler de dahil olmak üzere herhangi bir ek sektörler için 7.1.6 için 7.1.2 adımları.
- Düşük vakum modunda SEM kullanılarak, (enerji 5 kV, 3.0 nm nokta) görselleştirmek ve sektör içindeki hücre / doku fotoğrafları yanı sıra hücre / doku doğrudan bitişik sektör (Şekil 2f) alır. büyütme miktarıÇevrede özelliklerine bağlıdır. Ksilem elyaf için, 2,000X uygun (Şekil 2 g) 'dir.
- Bir kambiyal sektörü görüntülenmiştir ve fotoğraflar uygun bir büyütmede alınmış sonra, görüntü ölçme yazılımı kullanılarak ilgi ksilem hücre / doku morfolojik özellikleri ölçülür.
- İstatistiksel analiz için, transgenik sektör ve bir p belirlemek için her bir sektör için (sektör kenardan 0,5 mm içinde ölçülen) komşu transgenik olmayan kontrol hücre / doku içinde ölçülen morfolojik arasındaki farkı karşılaştırmak için eşleştirilmiş t-testi kullanılarak çoklu pairwise analizleri taahhüt -değeri.
- Negatif kontrol için yineleyin 7.1.10.
- Pozitif kontrol, düşük p-değeri (α <0.05) göstermektedir durumlarda, bir morfolojik özellik için transgenik ve bitişik olmayan transgenik hücre / doku arasındaki farkı hesaplar. negat ile ilgilenilen genin etkisini karşılaştırmak için eşleştirilmemiş t-testi, bu 'fark değeri' kullanınp-değerini belirlemek için kontrol ive.
- ışık mikroskobu kullanılarak kök hücre / dokularda kambiyal hücre / doku morfolojisi veya promotör ekspresyonu histokimyasal analizi.
Not: daha zaman alıcı olmakla birlikte, bu yöntem, kambiyal dinamiği, örneğin, kambiyal genişliği hem de hızlandırıcı ekspresyonu yönleri de dahil olmak üzere daha fazla analiz amaç için izin verir. Buna ek olarak, bir SEM ulaşmak mümkün, bu protokolün adım 7.1 için bir alternatif olarak kullanılabilir.- Tüketim ustura kullanılarak ilgi alanı ve 4 ° C'de en az 2 gün boyunca vidalı kapaklı bir numune şişesi içine 1-3 ml% 100 etanol içinde doğrudan çevredeki bazı küçük bloklar doku (Resim 1 mm'den 3) ve bir yer bir karıştırıcıda. Bir mikrotom tarafından erişilebilir ilgi yüzeyi için izin verecek şekilde küçük blok hazırlayın.
- negatif kontrol de dahil olmak üzere herhangi bir ek sektörler için tekrarlayın.
- Sıvı çıkarın ve 2 ile değiştirin% 5 etanol: koşullar muhafaza 2 gün boyunca% 75 LR beyaz karışım.
- % 50 etanol ile adımı tekrarlayın 7.2.3:% 50 LR beyaz,% 25 etanol:% 100 LR beyaz nihayet iki kere daha sonra beyaz ve% 75 LR.
- kısa sonuna kadar hizalanmış ilgi yüzeyi ile Kalıp gömülmesi küçük blok yerleştirin ve dikkatlice taze LR beyaz ile kaplayın ve üreticinin talimatlarına göre polimerize.
- bir döner mikrotom faiz yüzeyinden 5 mikron bölümleri kesmek ve bir bardak slayt monte edin. Hücre duvarı ve / veya başka özellikleri görselleştirmek için Safranin O (% 0.01) boyama kullanın.
- Montaj medya ekleyin bir kapak kayma yerleştirin ve bir gecede ayarlamanızı sağlar.
- 100X ve 600X büyütme ve yakalama görüntü arasındaki bir ışık mikroskobu altında görünümü.
- görüntü ölçüm yazılımı kullanarak görüntüleri morfolojik özellikleri yakalayın.
- Kantitatif morfolojik özelliklerin istatistiksel analizi için, adım 7.1.10 itibaren izleyin.
- morfolojik özelliklerin niteliksel analizi için,karşılaştırarak gen veya ilgi promoter ve negatif ve / veya pozitif kontrol için gözlemlenen kalıpları tarif eder.
- Işık Mikroskobu kullanılarak macerated Elyaf içinde Mikrofibril Açısı (MFA) analizi.
- Bir sektör hem de ona bitişik, transgenik olmayan dokuların şirketinden Tüketim transjenik ksilem dokusu ayrı 1.5 ml tüpler ve yeri (0.5 mm, Şekil 2 saat içinde). negatif kontrol de dahil olmak üzere herhangi bir ek sektörler için tekrarlayın.
- Komple adımlar Davlumbaz 7.3.5 için 7.3.3.
- hidrojen peroksit, 250 ul, her bir tüpe, buzlu asetik asit, 250 ul ekle.
- çeker ocak içinde, 2 saat boyunca 90 ° C'de ısıtma bloğu tüp yerleştirin.
- tüpler doku kaldırmak ve dikkatle en az iki kez damıtılmış su ile durulayın.
- suda eriyen bir montaj medyayı kullanarak, bir cam slayt doku monte ve bir kapak kayma yapıştırılması önce keskin forseps ile ayrı kızdırmak.
- Görünüm400X'lik daha yüksek büyütmede tek tek liflerden oluşan bir ışık mikroskobu ve çekim görüntü altında.
- Liflerin mikrofibril açısını belirlemek için, çukur deliklerin ve / veya hücre duvarı şeritlerin ve görüntü ölçme yazılımı kullanılarak fiber (Şekil 2i) uzun ekseni arasındaki açı ölçer.
- İstatistiksel analiz için, adım 7.1.10 itibaren izleyin.
8. Analiz Promoter İfadesi Kalıpları
- İkincil Kök Dokularındaki Yarışmayı İfade Desenleri analizi.
- Adım 6.2.2 de belirtildiği gibi ilgi promotör yanı sıra pozitif ve negatif kontroller için her sektör Çeşidi sıklığını taksitli.
- p-değerleri kurmak için Ki-kare testleri kullanılarak pozitif kontrol ile ilgi organizatörü farklı sektör türlerinin sıklığını karşılaştırın. Hücre / Doku spesifikliği daha fazla analizi, gereken şekilde bir adım 7.2 kullanılarak yapılabilir.
- birden fazla hızlandırıcı Eğerilgi daha sonra ilgi tüm yararlanıcı ve pozitif kontrol arasındaki bu analiz yapma karşılaştırma tekrar araştırılmaktadır.
- Sektörler veya mavi boyama negatif kontrol gözlenir sonra analiz bu ekleyebilir veya boyutuna bağlı olarak veya endojen boyama şüphesi varsa (Tartışma) terk.
- Kambiyal Türev Geliştirme ve Farklılaşma sırasında Yarışmayı İfade Desenler analizi.
- Bir disseksiyon mikroskobu kullanılarak, Aşama 6.2'de tanımlanan tüm kambiyal kesimleri (Şekil 1 g, 1 H, 1 H), görselleştirmek ve kambiyumda türetilen üç doku tiplerinde, mavi lekelenme varlığını / yokluğunu tespit etmek; floem (P), ksilemini (X1) veya gelişmiş ksilem dokusu (X2) (gelişen Şekil 3A).
- Aşama 8.1.2 uyarınca, Int promotör P, X1 ve X2, bölgelerindeki GUS boyama varlığı / yokluğu sıklığını karşılaştırmakp-değerleri kurmak için Ki-kare testleri kullanılarak pozitif kontrol ile erest. Hücre / Doku spesifikliği daha fazla analizi, gereken şekilde bir adım 7.2 kullanılarak yapılabilir.
- Ek hususlar için adımlar 8.1.2.1 ve 8.1.2.2 bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm canlı ikincil kök hücre ve doku tipleri gösterilmiştir bu protokolü kullanarak A'ya duyarlı olmak dönüşümleri tumefaciens ve başlangıçta dönüştürülmüş hücre türüne göre sektör türleri ve daha sonraki gelişim büyüme kalıbı içine tanımlanmıştır. Sektör türleri peridermeyı, floem, kambiyal, yara parankimi ve TYLOSE (Şekil 1b, 1c, 1d) içerir ve tutarlı yerleri bu paragrafın geri kalan kısmında tarif bulunabilir. Bir periderm sektörü floem (Şekil 1 E) içine uzanan özel periderm ve asla bulunan dönüştürülmüş hücrelerin bir grup ihtiva eder. Bir Floem sektör asla bu çevre dokulara (Şekil 1f) içine uzanan, ancak başlatan tabakası ve periderm arasında çeşitli yerlerde bulunabilir. Bir kambiyal sektörü tran türetilen transforme edilmiş odun dokusu / kambiyum / floem dokuların oluşurkambiyal initial ve süreci yaşandığını üç farklı desenler oluşabilir: floem dokusu ksilem ve kambiyal bölgesi içinden yara parankim dokusunun sınır uzanan i) 'tam' kambiyal sektörü, dönüştürülmüş ksilem / kambiyal / floem hücreleri ray hem de içeren ve fusiform hücreleri veya ışın elemanları sadece (Şekil 1g), ii) 'kayıp ilk' kambiyal sektörü, ilk aynalı ksilemini ve floem sektörleri ve bir dönüştürülmemiş başlatan tabakası bırakarak başlatan tabakasından kesildi tam kambiyal sektörünün bir varyantı (Şekil 1 H), iii) 'ksilem sadece "kambiyal sektörü yeni oluşan xylogenic dokuya değişken uzunlukta sarılmış parankima dokusu sınır uzanan ama asla başlatan tabakası (Şekil 1 H) ulaşan dönüştürülmüş ksilem dokusu. Bir yara parankim sektörü radyal fil genellikle, tek bir hücrenin veya hücre gruplarının ya da bulundu yara parankima hücreleri transforme içerirES önceden var olan ahşap ve yeni oluşan ksilem dokusu (Şekil 1j) arasında yer almaktadır. Önceden var olan ahşap içinde bulunan dönüştürülmüş damar tyloses oluşan bir tiloz Sektörü (Şekil 1k).
Gen ve faiz çalışmaları yanı sıra pozitif kontroller promotör hem Temsilcisi dönüşüm verimi verileri Tablo 1 ve Tablo 2'de sunulmuştur. Veri, aynı genotipleri aynı zaman diliminde (Aralık-Nisan) boyunca yürütülen iki büyük çalışmalarda çekilmiştir odun oluşumu genler ve ilgi rehberleri bir dizi içeren iki ardışık yıl boyunca eucalypt ve kavak. Faiz çalışmalarının promotör olumlu kontrollere odaklanma (Tablo 2), A. en duyarlı doku tipi tumefaciens T-DNA transferi kambiyal yaklaşık% 60 ile dokular sırasıyla eucalypts ve kavak tanımlanan sektörlerin% 40kambiyal sektörleri olmak. Diğer sektör türleri tüm% 5'in altında ATScm -2 değerleri vardı eucalypts, bir sonraki en bol sektör tip% 35 parankimi sarılır. Sektör türleri kalan% 5'in altında bir frekansta bulunan ise kavak, bir sonraki en bol sektör tipi% 15 floem, ardından% 20 parankimi sarılır. Floem kabuğu protokolü (Tablo 1, adım 5.2.1) nedeniyle boyama için yetenek ve görselleştirmek için olasılığı kullanıldığı bir kambiyal pencerede bir sektör bulma yanı sıra tanımlanan kambiyal sektörlerin daha fazla sayıda daha yüksek bir olasılık tipiktir Kambiyumdan tüm alanı.
Bu protokollerin geliştirilmesi sırasında bir dizi değişkenin protokol optimizasyon denemeleri kapsamında incelenmiştir. Aşılama Medya, Aşılanması Medya, doku yaş ve A acetosyringone eklenmesi kullanılan Aşılama Medya, medya türü Bunlar bakteri konsantrasyonu. tumefaciens suşu hem de aşılama ve genotip süresi. Kambiyal sektörü ATScm -2 bu çalışmalardan elde edilen veriler, aşılama bakteri konsantrasyonu arttıkça, özellikle değiştirilmiş zaman incelenmiştir değişkenlerin çoğunun, kambiyal ATScm değişiklikler -2 her iki türde de yol açar. Tablo 3 ve Tablo 4'te sunuldu ve dahildir Medya, Aşılanması Medya MS kullanımı ve A. seçimi tumefaciens suşu. Buna ek olarak, aşılama ve ağaç genotipi zaman kombine tüm aylar boyunca başkalarına eucalypt klonları SG21 ve SG44 ATScm -2, 41.6 ve 40.4 daha yüksek kambiyal gösterdi yüksek ATScm -2 sırasıyla karşılaştırıldığında gösteren erken yaz aylarında ekimlerde ile eucalypts anlamlı farklılık gösterdi.
Ortalama kambiyal kesim boyutu değişir ve bir kambiyal penceresindeki teğet ve radyal büyüme miktarına bağlıdır. bir altYaklaşık 4 ay boyunca yetiştirilen kavak 53 sektörlerin, örnek, kambiyum sektörlerin teğet genişliği 0.09 ve 0.27 mm ortalama 0.58 mm arasında değişmektedir ise 1.35 ortalama ile 0.7 2.2 mm arasında değişmektedir kambiyal pencereler arasında radyal büyüme aa. Birleştirildiğinde, bu analiz için, transjenik doku 2 mm, 2 mm, 0.063 ila 1.276 sağladı. Kambiyal penceresi boyunca radyal büyüme 1,5-4 arasındaki mm x yaklaşık 5 ay gözlendi aynı türün 188 sektörlerin bir alt örnek, olarak, ortalama sektör kütle 72 ug (Tablo 5).
oluşturulan transjenik doku miktarı yeterli hücre ve / veya morfolojik ölçümleri taahhüt olarak yükseltici aktivitesi çalışma için dokuyu sağlamak için gösterilmiştir. Örneğin, üç Eucalyptus etkisi ksilem lif morfolojik özellikler 9 ex bir dizi FLA grandis okaliptüs klonlarında araştırılmamış ve hücre boyutu belirleme (Tablo 6) MFA belirlenmesinde EgrFLA2 ve EgrFLA1 olası roller saptandı. Buna ek olarak, okaliptüs ekspresyon modelleri geliştirilmesi ksilem (X1) 'de CESA'nın gen promotörü, gelişmiş ksilem (X2) ve floem (P) grandis EgrCESA1, 2, 3 ve EgrCESA4, 5, 7 ila 10 tespit önemli ölçüde farklı ekspresyonu dokular eucalypt kaynaklanıyor. Bu analiz, EgrCESA1, 2, 3, öncelikle EgrCESA4, 5, 7, gelişmekte ksilem ve floem doku (Şekil 3b, Tablo 7), hem de ifade edildiği gösterilmiştir ise ksilem dokusu geliştirilmesi ifade edilmesi gösterilmiştir. Tüm EgrCESA promoterler pozitif kontrol (CaMV35S promoteri) (Tablo 7) önemli ölçüde farklı ekspresyonu gösterdi.
4553 / 54553fig1.jpg "/>
Şekil 1:. Transgenik sektörler türleri (a) floem soyma protokolü (adım 5.2.1) kullanarak işledikten sonra maruz ksilem yüzeyinde görüldüğü gibi Kambiyal sektörler. Enine kavak (b) 'de yüzeyi ve okaliptüs (c) enine kesilmiş protokolü (adım 5.2.2) kullanarak işledikten sonra sapları üzerinde sektör tiplerine gösteren diskler. (D) bitki sapları bulunan sektör türleri aralığında şematik diyagramı. Periderm sektörü (e), floem sektör (f), 'tam' kambiyal sektörü (g) 'kayıp ilk' kambiyal sektörü (h) 'ksilem sadece' kambiyal sektörü (i), yara parankimi sektörü (j) örnekleri ve kavak içinde tiloz sektör (k). Daha küçük boyutlu sektör nerede olduğunu siyah oklar göstermektedir. Tüm ölçek çubukları = 1 mm.iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. SEM ve ışık mikroskobu kullanılarak morfolojik analizi için kambiyal sektörlerin hazırlanması (a) disk içeren sektörün eksizyonu. (B) Disk aşırı doku kaldırmak için kesilmiş. Transgenik sektör (c) 'nin, enine yüzey boyunca kesilmesi. İki radyal kesim (d) Giriş yardımcı olmak için SEM altında transgenik doku yerini. Iletken bant kullanarak bir SEM pin üzerine monte (e) Doku. (F) analiz için görüntülü olmalıdır transgenik ve transgenik olmayan dokuların bölgenin Tasvir. (G) 2,000X büyütme yakalanan ksilem lif ve ışın hücrelerinin tipik görüntüsü. (h (I) macerated elyaf çukurları ve / veya hücre duvarı şeritlerin açısını gösteren ışık mikroskobu altında ve hücrenin uzun eksenine inceledi. Siyah ok çukur diyafram gösterir. Ölçek çubukları = af, h = 1 mm, g, i 20 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Analiz ve kambiyal türevlerinin bir gen promoter ekspresyonu sonuçları P (floem) X1 (yıkama ksilem) ve X2 (gelişmiş ksilem) bölgelerde (a) Tasvir.. (B) CESA bir dizi içeren bir araştırmadan kambiyal sektörlerde P, X1 ve X2 boyama oranını gösteren Sonuçları Okaliptüs gelen destekçiler dönüştürdü grandis. Creux ve ark., 10 kaynaklı veriler. n = değerlendirilen sektörlerin sayısı. Ölçek çubuğu = 0.5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| ağaç türleri | vektör tipi | Ilgili genlerin sayısı kullanılan | Oluşturulan pencerelerin sayısı | Bir sektör tespit edilmiştir pencere sayısı (%) | Kambiyal ATScm -2 kambiyal (windows bir sektör tespit edilmiştir) |
| Okaliptüs globulus x camaldulensis melezleri (üç klon toplam) | Pozitif Kontrol (söz konusu genler) | 1 (GUS için) | 96 | % 97 | 45.1 (1.5) |
| Ilgili genler | 20 | 630 | % 92 | 46.1 (2.2) | |
| Ak Kavak 'Pyramidalis' | Pozitif Kontrol (ilgi Genler) | 1 (GUS için) | 110 | % 74 | 10.8 (1.5) |
| Ilgili genler | 20 | 700 | % 81 | 14.6 (0.8) |
Tablo 1:. Tipik kambiyal ATScm -2 pozitif kontrol ve ilgi genler için rakamlar genlerin bir dizi ve floem kabuğu hasat protokolü (adım 5.2 kullanarak aynı eucalypt içinde üst üste iki yıldır yapılan çalışmalar ve kavak klonlarının kaynaklı edilmiştir. 1). Parantez içindeki standart hata değerleri. </ P>
| ağaç türleri | vektör tipi | Promotör / gen sayısı | Oluşturulan pencerelerin sayısı | Bir sektör tespit edilmiştir pencere sayısı (%) | ATScm -2 tüm sektörler | ATScm -2 Periderm | ATScm -2 Floem | ATScm -2 kambiyal | ATScm -2 Parankima Yara | ATScm -2 Tylose |
| Okaliptüs globulus x camal- dulensis hibridleri (üç klondan toplamı) | pozitif Kontrol | <td> 1 (GUS yalnızca)118 | % 63 | 25.74 (2.35) | 0.24 (0.07) | 0.89 (0.19) | 15.7 (1.71) | 8.84 (1.4) | 0.07 (0.03) | |
| İlgi Organizatör | 28 | 1050 | % 31 | 14.67 (1.77) | 0.02 (0.01) | 0.05 (0.01) | 13.79 (1.75) | 0.78 (0.21) | 0.03 (0.01) | |
| Ak Kavak 'Pyramidalis' | pozitif Kontrol | 1 (GUS için) | 110 | % 54 | 12.37 (1.77) | 0.22 (0.07) | 1.85 (0.29) | 5.07 (0.6) | 2.78 (0.75) | 0.29 (0.53) |
| İlgi Organizatör | 28 | 990 | % 26 | 8.28 (1.18) | 0.16 (0.04) | 0.9 (0.09) | 6.67 (1.16) | 0.27 (0.07) | 0.28 (0.11) |
Tablo 2:. Tipik sektör ATScm -2 pozitif kontrol ve ilgi rehberleri için Şekil yükseltici sıraların bir dizi ve disk hasat protokolü (adım 5.2 kullanarak aynı eucalypt içinde üst üste iki yıldır yapılan çalışmalar ve kavak klonlarının kaynaklı edilmiştir. 2). ATScm -2 değerleri sektör sadece tespit edilmiştir pencerelerden elde edilmiştir. Parantez içindeki standart hata değerleri. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| tür | Deneme | tedavi Açıklama | Tedavi pencerelerin sayısı | |
| okaliptüs globulus | A. Konsantrasyon Aşılama Medya tumefaciens | 25 mi MS içinde yeniden süspansiyon haline | 10 | 1.4 (0.62) |
| 5 mi MS içinde yeniden süspansiyon haline | 10 | 1.6 (0.72) | ||
| 1 mi MS (kontrol) içinde yeniden süspansiyon haline | 10 | 2.4 (1.16) | ||
| Aşılama Medya Medya türü | 1 POUND = 0.45 KG | 10 | 0.4 (0.22) | |
| MS (kontrol) | 10 | 2.4 (1.16) | ||
| Aşılama Medya acetosyringone eklenmesi | asetosiringon ile | 11 | 0.9 (0.37) | |
| Acetosyringone (kontrol) olmadan | 11 | 0.6 (0.64) | ||
| kök dokusunun yaşı aşılanmış | 6 ay (control) | 11 | 1.1 (0.66) | |
| 18 ay | 11 | 1,8 (0.95) | ||
| A. tumefaciens suşu | AGL1 (kontrol) | 18 | 0 (0) | |
| C58 | 18 | 0.1 (0.1) | ||
| LBA4404 | 18 | 0.6 (0.4) | ||
| Ak Kavak 'Pyramidalis' | A. konsantre medya tumefaciens | 25 mi MS içinde yeniden süspansiyon haline | 10 | 2.2 (0.55) |
| 5 mi MS içinde yeniden süspansiyon haline | 10 | 2,7 (0.63) | ||
| 1 mi MS (kontrol) içinde yeniden süspansiyon haline | 10 | 5,1 (1.58) | ||
| Ortam türü kök aşılama için kullanılan | 1 POUND = 0.45 KG | 10 | 2.8 (0.71) | |
| MS (kontrol) | 10 | 5,1 (1.58) | ||
| Aşılama Medya acetosyringone eklenmesi | asetosiringon ile | 11 | 0.3 (0.14) | |
| Acetosyringone (kontrol) olmadan | 11 | 0.5 (0.25) | ||
| kök dokusunun yaşı aşılanmış | 6 ay (kontrol) | 11 | 1.5 (0.33) | |
| 18 ay | 11 | 1.5 (0.63) | ||
| A. tumefaciens suşu | AGL1 (kontrol) | 20 | 8.1 (2) | |
| C58 | 20 | 12.5 (2) | ||
| LBA4404 | 20 | 11.1 (2) |
Tablo 3: Protokol optimizasyonu yollar bir parçası olarak alınan değişkenler aralığı için Kambiyal ATScm -2 değerler. Değişkenler bir kavak klonu ve sunulan kambiyal ATScm -2 verilerle birkaç yıl boyunca Okaliptüs globulus bireylerin bir dizi incelenmiştir. Kambiyal pencereler disk hasat protokolü (adım 5.2.2) kullanılarak toplanmıştır. Parantez içindeki standart hata değerleri.
| Okaliptüs globulus x camaldulensis klon ID | Her ay için kambiyal pencerelerin sayısı | Kambiyal ATScm -2 Geç İlkbahar (Kasım) Aşılama | Kambiyal ATScm -2 Erken Yaz (Aralık) Aşılama | Kambiyal ATScm -2 Orta Yaz (Ocak) Aşılama | Kambiyal ATScm -2 Geç Yaz (Şubat) Aşılama | Kambiyal ATScm -2 Erken Sonbahar (Mart)aşılama | Kambiyal ATScm -2 kombine tüm ay |
| SG5 | 10 | 15.7 (7.8) | 50.7 (13.7) | 10.5 (5.1) | 30.7 (4.4) | 16.8 (6.3) | 24.9 (4.3) |
| SG6 | 10 | 6.1 (3.1) | 38.5 (15.1) | 4.5 (1.7) | 14.5 (3.3) | 27.6 (8.4) | 18.3 (4) |
| SG13 | 10 | 28.4 (6.7) | 41.8 (9.1) | 16.1 (7) | 29.3 (5.2) | 19.8 (4.3) | 27.1 (3.1) |
| SG18 | 10 | 6.7 (2.9) | 18.3 (6.7) | 17.4 (3.4) | 19.2 (6.1) | 18.1 (6.3) | 15.5 (2.4) |
| SG21 | 10 | 38.7 (14.3) | 77 (17.5) | 23.9 (5.7) | 27.5 (6.9) | 40.7 (13.5) | 41.6 (6) |
| SG35 | 10 | 23.5 (10.2) | 42.8 (12.2) | 7.6 (2.5) | 17.6 (4.3) | 31.3 (4.6) | 24.6 (3.8) |
| SG37 | 10 | 19.7 (8) | 55.2 (14.5) | 7.4 (1.8) | 35 (10.4) | 15.9 (4.5) | 26.6 (3.8) |
| SG39 | 10 | 12.5 (2.4) | 23.6 (6.3) | 6.9 (3) | 26.3 (8.1) | 7.3 (2.3) | 15.5 (2.6) |
| SG40 | 10 | 24.8 (11) | 24.5 (6.8) | 14 (5.6) | 35.6 (6.1) | 19.9 (4.2) | 23.8 (3.2) |
| SG44 | 10 | 22.3 (3.4) | 63 (29.3) | 9.8 (2.6) | 52.5 (10.3) | 54.3 (15) | 40.4 (7.4) |
| SG46 | 10 | 15.3 (5.2) d> | 63.9 (20.1) | 23.6 (4) | 22.5 (4.8) | 17.4 (4.9) | 28.5 (5.1) |
| Aylık Kambiyal ATScm -2 | 19.9 (5) | 45.3 (9.1) | 12.6 (2.8) | 27.8 (4.5) | 24 (5.1) |
Tablo 4:. Genotip ve kambiyal ATScm -2 eucalypt klonlar üzerinde aşılama zamanı Etkisi On pencereler tüm Mayıs ayında hasat edildi 10 farklı Okaliptüs globulus x camaldulensis klonları büyüyen sezon boyunca her ay tanıtıldı. Aylık veriler genel ortalama aylık ve genotipik ATScm -2 da sunulan her genotip için sunulmuştur. Kambiyal pencereler Floem kabuğu hasat protokolü (adım 5.2.1) kullanılarak toplanmıştır. Parantez içindeki standart hata değerleri.es / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| bitki Numarası | Kambiyal Sektör sayısıdır kesilmiş | Tüm sektörlerin toplam kütlesi (mikrogram) | Sektörde ortalama kütlesi (ug) |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1.460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4460 | 172 |
| 5 | 15 | 1320 | 88 |
| 6 | 22 | 2490 | 113 |
| 7 | 19 | 1720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| Genel Toplam | 188 | 13550 | 72 |
Tablo 5: a. Kambiyal sektörün tipik kütle dokuz bitkiler arasında 45 windows sektörün ortalama kütlesini belirlemek için kavak araştırılmıştır ve disk hasat protokolü (adım 5.2.2) kullanılarak toplanmıştır. Bitkiler 5 ay boyunca büyütüldü ve kambiyal penceresi boyunca radyal büyüme 1-4 mm arasında değişir.
| Morph- ological özellik | GUS, sadece (pozitif kontrol) | Transgenik olmayan dokuların (GUS için) | P-değeri | Çevrede 1 geni (FLA1) | Transgenik olmayan dokuların (FLA1) | P-değeri | Çevrede 2 Gen (FLA2) | Transgenik olmayan dokuların (FLA2) | P-değeri | Çevrede 3 Gen (FLA3) | Transgenik olmayan dokuların (FLA3) | P-değeri |
| Ortalama Hücre Duvarı Kalınlığı (mikron) * | 1.81 (0.1) | 1.65 (0.1) | 0,2692 | 1.47 (0.14) | 1.55 (0.12) | 0,6403 | 1.65 (0.13) | 1.78 (0.13) | 0,4839 | 1.59 (0.12) | 1.63 (0.11) | 0,8254 |
| Ortalama hücre çeperinin Konum (2 um) * | 69.1 (4.74) | 60.7 (2.03) | 0,1229 | 64.1 (15.68) | 59.9 (9.79) | 0,5004 | 61.6 (3.4) | 65 (3.96) | 0,5182 | 61.9 (3.56) | 61.5 (3.16) | 0,9438 |
| Ortalama hücre alanı (um 2) * | 115.9 (11.01) | 99.9 (5.1) | 0,2041 | 124.4 (6.1) | 108 (4.36) | 0,0445 | 110.8 (8.45) | 111.3 (9.06) | 0,9671 | 108.5 (4.43) | 103 (3.07) | 0,3204 |
| Ortalama Lümen Alanı (mikron 2) * | 46.9 (7.55) | 39.2 (4.89) | 0.407 | 60.2 (5.28) | 48.1 (4.46) | 0,0991 | 49.2 (7.56) | 46.3 (7.5) | 0,7882 | 46.6 (3.31) | 41.5 (3.9) | 0,3264 |
| Ortalama Mikrofibril Açısı (O) # | 24.3 (0.75) | 24.2 (0.45) | 0,8648 | 22.3 (0.82) | 22.7 (0.7) | 0,5664 | 23.7 (0.55) | 26.6 (0.5) | 0.0001 | 26 (0.88) | 27.2 (0.72) | 0,0903 |
Tablo 6:. ISSA lif morfolojisi Ölçümler çalışmanın geninden türetilen elyaf hücre duvarı, hücre boyutu ve okaliptüs globulus X CAMALDULENSIS klonlarından kaynaklı transjenik elyaf alınan MFA ölçümlerinin karşılaştırılması Eucalyptus ile transforme saplar FLA'lar (EgrFLA1, 2, 3) ve grandis pozitif kontrol komşu olmayan transgenik kontrol lifleri ile (GUS sadece). MacMillan ve ark., 9 kaynaklı veriler. * (Deneme 10 sektörde 10 liflerin ölçümü dahil tot gösterir100 elyaf benzeri). # Deneme 20 sektörler (100 liflerin toplam) 5 liflerin ölçümü dahil gösterir. α <kalın gösterilen 0.05. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS, sadece (pozitif kontrol) | |
| EgrCESA1 | 0,708 | 2,839 | 8,856 | 9,976 | 9.18 | 29,165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12,008 | 11,363 | 30,234 | |||
| EgrCESA3 | 15,151 | 16,123 | 15,488 | 37,791 | |||
| EgrCESA4 | 4,852 | 0.108 | 46,858 | ||||
| EgrCESA5 | 3.275 | 11,278 | |||||
| EgrCESA7 | 36,082 | ||||||
| GUS, sadece (pozitif kontrol) |
Tablo 7: Ki kambiyal türevleri promotör ekspresyonu karşılaştırıldığında elde edilen 2 değerleri kambiyal türevlerinin P, X1 ve X2, bölgesinde GUS boyama varlığını / yokluğunu karşılaştırırken Ki 2 analizi. altı Okaliptüs CESA'nın gen promoterleri dizileri grandis arasında (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) ve pozitif kontrol (GUS için). Creux ve ark., 10 kaynaklı veriler. α <0.05 altı çizili gösterilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ISSA protokol genler ve ahşap yer alan ilgi rehberleri analizi için birkaç ay uzayda ağaç türlerinin transgenik kök dokuların oluşturulması için nispeten basit ve etkili bir yöntemdir ve oluşumunu kaynaklanıyor. Canlı bitkiler tutmak ötesinde küçük bir çaba, geniş kültür dokusu veya bitki, ağaç üretimi yıla kadar sürebilir başlamak için ya da nerede bir gerçek korumak için gerekli olan in vitro yöntemlerin aksine duruyor inokülasyon aşağıdaki transgenik kök dokusunun büyümesi için gereklidir ikincil kök 1 oluşturulmaz. Çok az varsa, optimizasyon için gereklidir burada ISSA da Populus, okaliptüs ve Pinus 6 cinsi türlerin yanı sıra Akasya ve Corymbia içeren ağaç türleri, geniş bir yelpazede uygulanabilir (veriler gösterilmemiştir) olduğu gösterilmiştir transjenik doku elde. Bu yöntemle kullanarak, o bir numara araştırmak mümkün olmaktadırf genler veya ilgi en türleri daki promoterler. Dahası, protokol daha yaygın birden fazla gen vitro yöntemler daha fazla yer ileriye götürmek için potansiyel adaylar belirlemek için ilk etapta ISSA kullanılarak incelenebilir in vitro tekniklerinde kullanılan ile kendi başına veya birlikte kullanılabilir.
açıklanan örnekler yeterli sektörler transgenik kambiyal pencerelerin sadece küçük bir sayı aşağı analizinin gerçekleştirilmesi oluşturulabilir göstermektedir. Kavak sadece bir veya iki kambiyal pencerelerinde eucalypt içinde 46,1 ve 14,6 arasında ATScm -2 değerleri tek bir özelliği incelemek yeterli olacaktır sayesinde tek bir bitki kök sayısız pencereleri ekleyebilir veya çok sayıda bitkiler üzerinde çoğaltmak mümkün olduğu gibi. Ancak uygulamada, her kambiyal pencere sektörlerin boyutu değişebilir olarak, genellikle küçüktür (Tablo 1, Tablo 2) kullanılabilen bir kambiyal sektörünün oluşturulması yol açmazve durumlarda alt analiz için kullanımlarını sınırlayan birbirine yakın konumlandırılabilir. Buna ek olarak, ilgi konusu gen, hücre canlılığı, 12 veya potansiyel olarak, ilgilenilen belirli bir geni için transgenik sektörlerin tam yokluğunda elde edilen hücre gelişiminin diğer yönlerine etkileyebilir. Her zaman analiz için gerekli olabilir daha pencere daha fazla sayıda amacı bu nedenle tavsiye edilir. Önemli farklılıklar, bazı durumlarda (Tablo 2) 'de görülmüştür / biraz zayıf ya da ifade ile beklendiği gibi yükseltici çalışmaları için ISSA kullanırken aynı dikkatli yapılmalıdır. Bununla birlikte, sektörde daha az sayıda, 6 kadar az, başarılı bir şekilde analizi 10 için kullanılmak üzere gösterilmiştir. Bu sonuçlar, pencerelerin sadece az sayıda içeren oldukça mütevazı deneyler gen fonksiyonu ve promotör aktivitesi hakkında önemli bilgiler yol göstermektedir.
transgen bir analiz açısından bakıldığında, yakınlıkic ve transgenik olmayan doku ilgi genleri arasındaki özelliklerde küçük ama anlamlı farklılıklar tespit etmek için güçlü bir araç sağlar. birbirlerine doğrudan bitişik örneklenmiş Hücreler ve dokular aynı genotipik arka plan ve bağımsız değişkenlerin sayısını azaltarak ve gerekli istatistiksel analiz basitleştirilmesi aynı çevre koşullarında etkilenmiştir. Bir numune alma açısından, ISSA güç analizi (örn, Tablo 6), göstermiştir çeşitli deneylerinden elde edilen veri edilen bu sektörde için ölçümlerin daha az sayıda, örneğin, hücre duvarı sektör başına 3-5 hücre kalınlığı ve daha büyük bir sayı ölçüm sektörlerin, örneğin, ilgi konusu bir gen için 20-25 alanları, daha etkili ve güçlü bir istatistiksel örnekleme strateji sağlar. Her sektör bağımsız bir transformasyon olayı veya birden fazla dönüşüm olaylarının ortalama etkisinin belirlenmesi üstlenilen istatistiksel analiz ile hücrelerin 'çizgi' temsililgilenilen geni içeren. Aynı şekilde, bütün kök dokuları dönüştürme yeteneği kambiyum farklılaşma sırasında özellikle bütün kök ve karşısında çıkarları rehberleri ifadesini incelemek için bir fırsat sağlar. Burada anlatılan ISSA protokolleri örnekleri, toplama ve doku ve hücre morfolojisi ve destekçi ifade kalıpları için verilerin analiz hasat yoluyla transgenik doku yaratılışından güvenilir ve onaylanmış boru hattı sağlamaktadır.
Çoğu durumda, alanları, hücre bölünmesi yoluyla türevi hücre ve dokuları, bir dizi yol açmış olabilir, tek bir hücre, bir dönüşümün sonucudur. Örneğin, bir kambiyal sektör kurtarma sırayla floem orijinal yara kadar uzanan bir sektör oluşturmak için periclinally ve anticlinally bölen bir kambiyal başlangıç olur yara, post tek bir hücrenin dönüşümü kaynaklanmaktadır. Bu gibi durumlarda, transforme edilmiş başlangıç tutulmuşturgözlenir hasat ve 'tam' varyantının zamanına kadar kambiyum olan, ancak, bu başlangıç bir dönüştürülmemiş "hücre istilası 'üzerinden sonraki hücrenin, o zaman radyal büyüme sırasında kambiyal tabakasından kayıp değiştirilir, burada A' kayıp ilk 'varyant sonucu olacaktır. sipariş sektörü tiplerinin doğru sınıflandırma sağlamak ve sonuçların yorumlanması ile yardımcı olmak için o ikincil kök gelişimi ve yara yanıtların anatomik özellikleri olması ISSA sonuçlarının analizi için önkoşullar o alışma tavsiye şiddetle edilir. Ayrıca, GUS ayıraç pH düzenli test (adım 5.6) tavsiye edilir. Düşük bir pH değeri (örneğin, 6'nın altında) bir sektörün gerçek boyutunu maskelemek veya yanlış pozitif tanımlanmasına yol bitki kök endojen β-glukuronidazlar (GUS) aktivasyonuna yol açar. Bu beklendiği durumlarda, numuneler daha analize dahil edilmesi önerilmektedir. GUS reaktif protokolü55 fosfat pH 7'ye örnekleri denge sağlaması için tampon ve ısıl işlem ile iki durulama olmak üzere güvenilir. Hawkins ve ark adapte edilmiştir endojen GUS aktivitesi ile ilgili olası sorunları hafifletmek amacıyla burada özetlenen çalışmalarda (2002) 16 uygulanmış ve kullanır ek önemli adımlar 10 dakika boyunca o C endojen GUS aktivitesi 17,18 istikrarsızlaştırmak için. GUS reaktifi geçirgenliği sınırlıdır ve floem sıyrılma protokolüne göre enine disk protokolü kullanılarak tanımlanır az bölgelerinden de sorumludur.
göstermiştir trialed Bütün türler kambiyal doku dönüşümü duyarlı olduğu. Bununla birlikte, ATScm önemli farklılıklar -2 ila cins ve türler içinde hem de gözlenmiştir. A. Benzer suşu tumefaciens ve aşılama zamanı / sezon ATScm etkileyebilir -2. Bu olduğu ileri sürülmektedir speci bu değişkenlerin bazı ön testler üstlenenProtokolün büyük ölçekli kabul öncesinde soruşturma kapsamında es ve genotipleri. Teorik olarak hangi ISSA sürece aktif bir şekilde büyüyen kambiyum olarak orada uygulanabilir için sapları yaş veya boyutu sınırı yoktur. Bununla birlikte, transjenik doku sektörlerin sonraki işlem kolaylığı için önerilir aşılama yaklaşık 1 cm çapında kaynaklanmaktadır.
ISSA sınırlamalar olmadan değildir. transgenik doku sektörlerin nispeten küçük boyutu şu alt fenotipleme yöntemleri kısıtlar ve bu yöntemler dolayısıyla sadece sınırlı sayıda rutin bugüne kadar kullanılmıştır. Giriş 9,11 belirtildiği gibi yukarıda yanı sıra ikincil hücre duvarındaki monosakkaritler kompozisyonun yarı kantitatif tahmini belirtildiği gibi bu yöntemler çoğunlukla morfolojik karakterizasyon odaklanmıştır. gelişi ve biyolojik maddelerin ince ölçekli analizi için yeni teknolojilerin arıtma ek fenotiplendirilmesini geliştirmek için daha fazla potansiyel varISSA sektörler için boru hatları, hücre çeperi kompozisyon analizi örneğin. Bu sektör, ribonükleik asit (RNA) esaslı gen ekspresyonu ve protein çalışmaları sektörü kantitatif yapmak ve / veya belirlemek ve İSSA GUS deneyi yıkıcı yapısı nedeniyle daha fazla analiz için in vitro olarak kültür yoluyla transgenik hücrelerin türetilmiş yaymak için, ancak, hala zordur . Bazı floresan raportör genler ve doku baskı bireysel sektörlerden ama bu yaklaşımlar başarılı rutin operasyonda yüksek verimli tarama için orta kullanılmamıştır bugüne kadar RNA ölçmek için trialed edilmiştir. Bundan başka, RNAi tarihe kadar denememiş transgenik teknikler, GUS ekspresyonu ve hedef genin aşağı regülasyonu birlikte lokalize olabilir analiz karmaşık hale getirebilir.
bazı güncel sınırlamalar, yeni birleştirilmesi ve gelişen teknolojiler ve daha fazla ISSA a rolünün güçlendirilmesine, bu sınırlamaları aşmak için muhtemel analitik yöntemler varkenkambiyal farklılaşma, ahşap gelişiminin karmaşık moleküler yapısını diseksiyon ve gövde oluşumunu teşvik için yüksek verimlilik protokolüne sa, orta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
