Summary
מאמר זה מציג שיטה איתור וכימות של חומצות אורגניות מחומר הצמח באמצעות אלקטרופורזה נימי אזורי חינם. דוגמא של יישום הפוטנציאל של שיטה זו, הקובע את ההשפעות של תסיסה משנית על רמות חומצה אורגניות זרעי קפה, מסופקת.
Abstract
חומצות קרבוקסיליות הן חומצות אורגניות המכילות carboxyl מסוף אחד או יותר (COOH) קבוצות פונקציונליות. קצר שרשרת חומצות קרבוקסיליות (SCCAs; חומצות קרבוקסיליות המכילות שלושה עד שישה פחמנים), כגון malate ציטראט, הן קריטיות לתפקוד התקין של מערכות ביולוגיות רבות, שבו הם מתפקדים נשימה תאית והוא יכול לשמש אינדיקטורים של בריאות תא. במזונות, תכולת חומצות אורגניות יכולה להיות השפעה משמעותית על טעם, עם רמות SCCA מוגברת וכתוצאה מכך טעם חמוץ או "חומצה". בגלל זה, שיטות לניתוח מהיר של רמות חומצה אורגנית הם בעלי עניין מיוחד לתעשיות המזון והמשקאות. למרבה הצער, עם זאת, רוב שיטות כימות SCCA תלויות פרוטוקולי זמן רבים המחייבים את derivatization של דגימות עם ריאגנטים מסוכנים, ואחריו chromatographic היקר ו / או ספקטרומטריה מנתח. שיטה זו מפרט שיטה חלופית עבור איתור וכימות של orgחומצות anic מחומר צמח דגימות מזון באמצעות אלקטרופורזה נימי אזורים חינם (CZE), לפעמים פשוט המכונות אלקטרופורזה נימים (CE). CZE מספק שיטה חסכונית למדידת SCCAs עם הגבלה נמוכה של גילוי (0.005 מ"ג / מ"ל). מאמר זה מפרט את המיצוי וכימות SCCAs ממדגמים צמח. בעוד השיטה ספקה מתמקדת מדידת SCCAs מפולי קפה, השיטה הניתנת ניתן ליישם חומרי מזון על בסיס צמחי מרובים.
Protocol
לדוגמא הכנה 1.
- להרכיב דגימות עבור חומצה קרבוקסילית שרשרת קצרה (SCCA) החילוץ. כן 1.0 גרם של זרעי קפה בכל פעם, כדי להבטיח מדגם זה מספיק יישאר לאחר עיבוד.
- אם דגימות הוקפאו לפני תהליך הטחינה, לשמור על הרקמה הקפואה בכל עיבוד כדי למנוע נזק ההקפאה / הפשרה וחמצון המדגם. הסר את המדגם מתוך האחסון במקפיא או מתחת לאפס רק לפי צורך לטחינה.
- פלאש להקפיא דגימות טריות בחנקן נוזל ערב לטעום טחינה. כדי למזער טיפול מדגם, דגימות להקפיא פלאש ידי הצבתם במכתש מראש מלאים בחנקן נוזלי.
- ניתוח דגימות נוזל מיד לאחר הדור, או להקפיא פלאש בחנקן נוזלי ולאחסן ב -20 ºC או -80 ºC עד הניתוח. לפני הניתוח, להסיר דגימות קפואות מהאחסון ולאפשר להפשיר. לקבלת דוגמיות נוזלת המשך לשלב (3.5) לעיבוד.
- תלבש approציוד מגן אישי priate (כולל משקפי מגן, כפפות וחלוק מעבדה) לפני עבודה עם חנקן נוזלי.
- דגימות רקמה Triple-לטחון לאבקה דקה באופן אחיד (כלומר, של גודל החלקיקים אחיד) בחנקן נוזלי באמצעות ובמכתש קרמיקה.
הערה: השגת גודל חלקיקים אחיד חיונית למקסום יעיל מיצוי SCCA.- טרום לצנן את ובמכתש עם חנקן נוזלי לפני התוספת של המדגם. שמור על המרגמה מלאת נפח קטן של חנקן נוזלי כמו המדגם הוא הוסיף.
- בעזרת מצקת, להוסיף חנקן נוזלי מספיק כדי המדוכה כדי להטביע את המדגם לחלוטין.
- להוסיף דגימות קרקע בקלות, כגון עלים או קפה קלוי, אל החנקן הנוזלי ולרסק בתנועות ליטוש מעגליות. בגין לטחון דגימות כאשר רמת החנקן הנוזלת ירד עד לנקודה שבה זה רק בקושי מכסה את הדגימות.
- הוסף קשה לטחון דגימות, כזהזה זרעי קפה גולמיים, חנקן נוזלי ולאפשר להם להקפיא למשך 10-30 שניות (או עד החנקן הנוזלי מפסיק הרותחים במרץ) לפני הטחינה. לשבור את הרקמה לרסיסים קטנים בתנועות ריסוק אנכיות, ולאחר מכן רקמה שלמה שחיקה בתנועות ליטוש מעגליות.
- חזור על שלבים 1.3.2-1.3.4 עוד פעמיים, כך דגימות הקרקע בסך הכל שלוש פעמים. בדרך כלל, שלושה סיבובים רצופים של שחיקה יפחיתו דגימות לאבקה עם עקביויות קמח דמוי.
- אם עקביויות קמח דמוי אינה מושגות, חזור על שלבי 1.3.2-1.3.4 עד דגימות מופחתות לאבקה של גודל חלקיקים קטן באופן אחיד (יעילות מיצוי עומדת ביחס הפוך לגודל חלקיקים).
- העבר אבקת צלוחיות זכוכית או 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge. ליזום עיבוד במורד זרם מייד לאחר שחיקה (מומלץ), או דגימות חנות ב -80 ºC עד דגימות מוכנות חילוץ.
- אם דגימות חייבות להיות מאוחסנות לפניניתוח, לפצל את המדגם לתוך 500 aliquots מ"ג (או 500 aliquots μl עבור דגימות נוזלות) ולפצל בין צינורות מרובים לאחסון. אל תחשפו את דגימות מחזורים להקפיא / להפשיר שוב, כמו אלה עשויים לשנות רכב מדגם ולהשפיע לרעה על מדידות מדגם בעתיד.
2. הכנת התקן חומצה אורגנית
- להרכיב סטנדרטים אותנטיים עבור SCCAs עניין. אלה ישמשו כדי ליצור פתרונות סטנדרטיים חיצוניים ופנימיים לשימוש בקביעת ריכוזי SCCA. לקבלת דוגמיות קפה כוללות לימון, מאלית, חומצה אצטית, וחומצה לקטית כמו חומצות עניין וחומצת adipic כתקן הפנימי.
- ודא בטוח כי התקן הפנימי רצוי לא יאותר טבעי במדגם, וכי התקן אינו לשתף elute עם פסגות אחרות בפרופיל המדגם.
- הפעל עקומות סטנדרטיות לכל SCCA של עניין, ולקבוע טווח התגובה ליניארי לכל SCCA (ראה סעיף 4 להפעלת Instמהומה גדולה). הקפד להפעיל עקומות סטנדרטיות לכל SCCA להימדד המדגם.
הערה: עקומות סטנדרטיות ניתן לרוץ או חיץ או ברקע של המדגם להיות assayed. במקרה השני ( "בנוסף תקן"), ערכים עבור אזור השיא של כל נקודה עקומה סטנדרט ייקבעו על ידי הפחתה משם ברקע של המדגם. - טרום תווית כל צינורות זכוכית צורך עם שם SCCA החומצה, ריכוז, ואת התאריך של assay.
- הכינו פתרונות המניות עבור כל תקן בריכוז ידוע (10 מ"ג / מ"ל) באמצעות בקבוק מדידה כדי להבטיח דיוק במהלך הכנת תקן.
- ממיסים סטנדרטים SCCA מוצק (חומצת לימון וחומצה מאלית) במים ultrapure (18.2 MΩ) כדי להשיג את הריכוז הרצוי עבור פתרון המניות.
- צור פתרון המניה 10 מ"ג / מ"ל על ידי הוספת 100 מ"ג לסטנדרטים בבקבוק נפח 10 מ"ל. מלאו את הבקבוק volumetric לקו 10 מ"ל עם מים ultrapure דissolve החומצה.
- צור ריכוז נמוך יותר לסטנדרטים חומצה או בעדינות לחמם את צלוחיות לנהוג קשות לפזר סטנדרטים SCCA, כמו חומצה adipic, אל הפתרון.
- לדלל סטנדרטי חומצת שלב נוזלי (חומצה אצטית וחומצה לקטית) במי ultrapure כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
- טרום למלא בקבוק מדידה עם 5 מ"ל מים ultrapure. הוסף מספיק חומצה להכין פתרון 10 מ"ג / מ"ל (מחושב לפי צפיפות חומצה הניתנים על ידי הספק) אל הבקבוק, ולאחר מכן להוסיף מספיק מים כדי להביא את הנפח הסופי של הפתרון 10 מ"ל.
- ממיסים סטנדרטים SCCA מוצק (חומצת לימון וחומצה מאלית) במים ultrapure (18.2 MΩ) כדי להשיג את הריכוז הרצוי עבור פתרון המניות.
- העברת כל מניות פתרון לצינור זכוכית נקי 15 מ"ל, עם polytetrafluoroethylene (PTFE) מצופה כובע, ואת החותם עם הסרט פרפין פלסטיק. ניתן לאחסן פתרונות מניות צינורות אטומים 4 ºC עבור 1 בשבוע.
- ודא כי הסטנדרטים SCCA לא זירז מתוך פתרון לפני השימוש אם פתרונות המניות כבר בקירור לאחר preparation. כונן משקעים בחזרה פתרון באמצעות חימום עדין.
- הכן את פתרון חילוץ SCCA. כלול את תקן פנימי בריכוז מספיק לגילוי בדגימות (0.05 מ"ג / מ"ל). כן פתרון מספיק כדי לחלץ את כל הדגימות.
- הכן 50 מ"ל של תמיסת מיצוי SCCA על ידי דילול פתרון המניות תקן פנימי 0.05 מ"ג / מ"ל מים ultrapure. הוסף 250 μl של פתרון המניות תקן פנימי (10 מ"ג / מ"ל) ל 49.75 מ"ל מים.
- אם לחלץ צריך להיות מדולל, להתאים את ריכוז התקן הפנימי בפתרון החילוץ כך את הריכוז הסופי ייפול בגבולות כימות (נותן לזיהוי, אבל לא יותר מדי רווי, שיא, ראה 5.2.2 להלן) של מערכת CE לאחר דילול (0.05 מ"ג / מ"ל).
- כן פתרון חילוץ טרי עבור כל סדרה של עקירות (כלומר, עבור כל סדרה ניסיון).
- הכן דגימות עקומות סטנדרט(סדרה של דילולים מתאימים) עבור SCCAs של עניין, באמצעות מינימום של 5 נקודות לפחות. הריכוזים העקומים הסטנדרט המועסק יצטרכו להיות בטווח בתגובה ליניארית עבור SCCA נתון, היקף ריכוזי SCCA הצפוי בדגימות.
- כלול את התקן הפנימי נבחרי הפתרונים העקומים הסטנדרט לאפשר כימות של התקן הפנימי בדגימות. ההתקן הפנימי ישמש כדי לסייע בזיהוי שיא ויעילות חילוץ חישוב (סעיף 6).
- לדלל כל SCCA הריכוזים נקבעו לעיל (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 מ"ג / מיליליטר; ראה לעיל, 2.4.2) צינורות microcentrifuge חדשות (אחת עבור כל נקודה עקומה ריכוז / רגילה) באמצעות מי ultrapure. כן 1 מיליליטר של תמיסה לכל נקודת ריכוז עקום סטנדרט. ודא שכל נקודת ריכוז מכילה את כל ארבעת תקני חומצה ואת התקן הפנימי בריכוז הנכון.
- כן נקודות עקומות סטנדרט חדשים עבור כל קבוצהדגימות שיופעלו על מערכת אלקטרופורזה נימים. החזק את דגימות התקן העקום SCCA ב 4 ºC עד לניתוח, אשר תתרחש בעקבות החילוץ של SCCAs מרקמות היעד (סעיף 3).
3. הפקת חומצה אורגנית
- דוגמיות טרום תווית, הכנת צינור אחד לפחות עבור כל דגימה להיעקר.
- הסר דגימות להיות מופקות אחסון ומניח אותם על קרח תוך שקיל את חומר עבור חילוץ.
- תשקול 100 מ"ג של מדגם להפקת SCCA.
- לאחר שקילת כל דגימה, העברת רקמות צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge נקי. מדוד את כמות של מדגם קרובה ככל למסת היעד ככל האפשר כדי להפחית השתנות.
- עקוב אחר של המסה של כל דגימה הנמדדת, לפי סכומי SCCAs זוהה יהיו מנורמלים באמצעות מסת המדגם (ראה 6.5.2, להלן).
- לאחר שקילת כל הדגימות, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת מיצוי (להלן water + תערובת תקן פנימי משלב 2.4) לכל אחד מן דוגמיות. שמור את היחס של פתרון חילוץ מסת רקמה הזהה בכל העקירות (במקרה זה 1 מיליליטר 100 ± 5 רקמות מ"ג). מערבבים היטב על ידי מערבולת עבור 10 שניות.
- אפשר דגימות לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. במהלך שעה זו, לערבב כל צינור כל 15 דקות כמו בשלב 3.4.
- אחרי שעה 1 של מיצוי, לערבב את דגימות בפעם האחרונה ולהעביר דוגמיות על microcentrifuge. צנטריפוגה דגימות ב 4 ° C, XG 10,000 במשך 10 דקות כדי לזרז חומר מוצק (קירות תא, חומר חלקיקים, וכו ').
- כאשר עיבוד דגימות נוזלי, מוסיפים את הריכוז המתאים של תקן פנימי, לערבב בקצרה צנטריפוגות. לאחר צנטריפוגה, לטפל דגימות נוזל זהה לחלץ מן הדגימות מוצקות.
- בדוק את ה- pH של דגימות כדי לוודא שהם עולים בקנה אחד עם טווח ה- pH של למאגר פועל בערכה זיהוי (שלב 4.6) או חיץ מערכת להיות EMPloyed. כמו הכרכים של מדגם הם בדרך כלל די קטנים, pH ניתן לנטר באמצעות נייר pH.
- היכון לסנן דגימות באמצעות מסנני דיסק רכוב מזרק (3.8).
הערה: מנע אובדן מדגם ידי הבטחה שכל מסנן מחובר כהלכה מזרק לפני העברת supernatant. הכין מזרק אחד המצוידת במסנן דיסק עבור כל דגימה להיות מנותחת (כולל דגימות עקומות סטנדרט). - לאחר צנטריפוגה של דגימות והכנת מסננים מזרק, להעביר את supernatant מכל מדגם מזרק 3 מ"ל המצוידת במסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. שימוש במסנן מזרק חדש עבור כל דגימה. לסנן את כל הדגימות, כולל דגימות עקומות סטנדרט ובקרות חיץ, לפני פועל על מערכת CE.
- סנן את המדגם ישירות לתוך צינור microcentrifuge נקי. לאחר סינון, לסגור את התסנין המכיל צינור וזורקי מנגנון המזרק / פילטר.
- מיד למקום דגימות מסונניםלמערכת CE לגילוי SCCA; או דגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אם דגימות הן להיות מאוחסן לילה, לאטום את הצינורות עם סרט פרפין פלסטיק כדי למנוע חילופי גזים ואידוי מדגם.
- אם דגימות חייבות להיות מאוחסנות כבר מיממה לאחר סינון, תמציות להקפיא פלאש בחנקן או הקפאת נוזלי ב -20 ºC. לאחר ההפשרה, לעומת זאת, להבטיח כי כל דגימה נבחנת להיווצרות המשקע ולסנן במידת הצורך (כמו בשלב 3.6).
4. הגדרת הפעלת איתור SCCA
- התייעץ במדריך למשתמש CE לפרטי programming- ובקרו תוכנות ספציפיות.
- כן אלקטרופורזה נימים (CE) בקבוקונים מדגמים לגילוי SCCA. ודא בקבוקונים מסומנים כראוי, נקי, ללא פגמים.
- לשטוף ולייבש את הכמוסות של בקבוקוני CE לפני השימוש.
- לשטוף כמוסות על ידי השריית אותם במים ultrapure ומאפשר להם להשרות לילה. לאחר השריית כובעים, לבטל את להשרותing פתרון ולשטוף את הפקקים עוד פעמים עם מי ultrapure.
- העברת שטופי כמוסות משטח ייבוש נקי בשורה עם רקמת מוך ללא ולאפשר להם אוויר יבש. ודאו כמוסות יבשות לחלוטין לפני השימוש כדי למנוע כשלי לחץ.
- העבר 1 מ"ל של המדגם לכל בקבוקון CE, להיות זהיר, כדי למנוע מתיז המדגם בטעות לתוך הצוואר של הבקבוקון. לאחר ההעברה, למקם כובע CE על כל בקבוקון.
- אם דילול נדרש, לדלל את דגימות זרע קפה 1:10 או 1: 100 ישירות בבקבוקון CE באמצעות מי ultrapure. עבור דילולים גדולים מ -1: 100, ליצור דילול ביניים כדי למנוע שגיאות pipetting.
- הכן בקבוקון אחד עבור כל נקודה עקומה סטנדרט ידי העברת פתרונות עקומים סטנדרט (1.0 מיליליטר) משלב 2.5 כדי בקבוקוני CE. כיסוי או כל צינור לאחר ההעברה.
- כן 0.1 M פתרון של נתרן הידרוקסידי (NaOH) על ידי הוספת 0.04 גרם של NaOH כדי כוס המכילה 90 מיליליטר מי ultrapure ולאפשר t הכדורo לפזר. מעבירים את הפתרון M NaOH 0.1 בבקבוק נפח 100 מ"ל ולהביא את הנפח הכולל עד 100 מ"ל.
- הוסף 1 מ"ל של 0.1 פתרון M NaOH בקבוקון וכובע CE נקי.
- הכין בקבוקוני חיץ CE עבור כל אצווה של דגימות שיופעל על מערכת CE. ערכות הפרדה זמינות או 13 יכול לשמש מאגרים מותאמים אישית.
- הכן 1 בקבוקון עם 1 מ"ל של החל פתרון חיץ וכובע.
- הכן שלוש צלוחיות עם 1 מ"ל כל אחד פועל פתרון חיץ וכובע. חלף למאגר פועל לפני כל אצווה של דגימות ונקודות עקומות סטנדרטיות, או לאחר 35 דגימות, מוקדמים מבין שתיים.
- מלאו שלוש צלוחיות נוספות עם 1 מיליליטר מי ultrapure וכובע בקבוקון אחד.
- כן 1 בקבוקון ריק "פסולת" עם כובע.
- לאחר הכנת הצלוחיות כמתוארות בשלב 4.8, לטעון את הבקבוקונים המכילים מאגרי מים, כמו גם את הצלוחיות הפסולות (בצעדיו 4.8.2-5) למגש החיץ של sys אלקטרופורזה הנימיםTEM, לפי הוראות יצרן 15. בזהירות לציין את המיקום של כל בקבוקון עבור תכנות אוטומטי סמפלר.
- טען את הבקבוקונים המכילים את הנקודות עקומות סטנדרט ואת הבקבוקונים המכילים דגימות להיות assayed למגש מדגם הכניסה, כמתואר הוראות היצרן. הערה המיקום של כל בקבוקון עבור תכנות אוטומטי סמפלר (ראה צעדים 4.11.1 להלן).
- הכין מיזוג ושיטות הפרדה מדגמות (תוכניות אלה ניתנות בלוחות 1 ו -2, בהתאמה), ולכתוב קובץ רצף מדגם לפי הוראות הפעלה מכשירות. השתמש בשיטת ההפרדה המפורטת בטבלה 2: לשטוף את העמודה עם יוזם (20 psi) עבור 0.2 דקות; לשטוף עם מאיץ (20 psi) עבור 0.5 דקות, להזריק דגימות (0.5 psi) על הטור עבור 0.09 דקות, דגימות נפרדות 20 קילו וולט עבור 12 דקות, לשטוף עם NaOH (20 psi) עבור 0.5 דקות, ולבסוף לשטוף עם מים ( 20 psi) עבור 0.5 דקות.
- Using תוכנות שליטה CE, לכתוב את רצף פועל מדגם (כלומר, worklist; קובץ רשימה המפרטת את הסדר שבו הדגימות תיבדקנה, והשיטה לשמש כדי להפריד כל דגימה) באמצעות ממשק גיליון "רצף". כל שורה בגיליון האלקטרוני תתאים ריצה מדגם והפקת קובץ נתונים יחיד.
- ודא כי בעת כתיבת קובץ הרצף, דגימות מזוהות באמצעות המיקום הנכון במגש הדגימה. ודא כי כל קובץ נתונים יש שם ייחודי כדי למנוע מהתוכנה להחליף קבצים קודמים. תוכנית CE ריצות מיזוג נימי כרצף נפרד לפני בטווח רצף המכיל את שיטת ההפרדה המדגם.
- בגין רצף המדגם לרוץ עם הפתרונים העקומים סטנדרט, ואחריו דגימות SCCA, ולסיים עם סיבוב שני של הפתרונים העקומים סטנדרט. זה יאפשר חישוב של מידת אובדן אות המתרחשים במהלך מדגם המנתח. </ Ol>
- Using תוכנות שליטה CE, לכתוב את רצף פועל מדגם (כלומר, worklist; קובץ רשימה המפרטת את הסדר שבו הדגימות תיבדקנה, והשיטה לשמש כדי להפריד כל דגימה) באמצעות ממשק גיליון "רצף". כל שורה בגיליון האלקטרוני תתאים ריצה מדגם והפקת קובץ נתונים יחיד.
טבלה 1: בתכנית שיטת מיזוג המשמשת להכנת הנימים להפרדת חומצה קצרה שרשרת קרבוקסיליות דרך נימי אלקטרופורזה א.
טבלה 2: תכנית שיטת הפרדה נהגה מנתח חומצות קרבוקסיליות שרשרת קצרה דרך נימי אלקטרופורזה א.
5. ביצוע SCCA איתור הפעלה ואיסוף נתונים
- ליזום ריצות מיזוג נימים. צפו להתנות את נימי פעמיים או שלוש לפני הטור מוכן ההפרדה המדגם. מיזוג טור צריך להתבצע כפי שמתואר בטבלה 1. בקצרה, לשטוף טור עם 0.1 M NaOH (20 psi) 1 דקות, לשטוף עם מים (20 psi) עבור1 דקות, לשטוף עם יוזם (20 psi) עבור 0.5 דקות, לשטוף עם מאיץ (20 psi) עבור 0.5 דקות, מאיץ נפרד ליום 30 קילו וולט עבור 10 דקות, לשטוף טור עם 0.1 M NaOH (20 psi) עבור 0.5 דקות, ולבסוף לשטוף את העמודה עם מים (20 psi) עבור 0.5 דקות.
- להתנות את הנימים לפני כל ריצה ברצף מדגם. להשיג מיזוג ראוי על ידי שמירה על מתח ההפרדה הוא קבוע לאורך כל הריצה ולשמור על בסיס שטוח על עקבות photodiode המערך.
- לאחר מיזוג, ליזום הפרדה מדגם ידי פתיחת התפריט "שליטה" התוכנה ובחירה (כלומר, לחיצה על) "רצף לרוץ." צג photodiode המערך (PDA) עקבות כדי להבטיח הפרדה נאותה.
- שים את העקבות הראשונות ולהבטיח כי יש לו בסיס שטוח נפתר בצורה נקיה (רזולוצית בסיס), פסגות חומצת פרט. יתר טעון דגימות יראה זנבות שיא ארוך, או עוקב השיא, ויהיה צריך להיות דליל (איור 1).
איור 1:. מהשוואת PDA עקבות הדגשת מדגם עמוס כפי שעולה ריכוז אנליטי, גיאומטרית שיא אישה יכולה להתחיל להיות סימטרי. ב (א) 0.05 מ"ג / מ"ל, חומצה אצטית מציגה שיא מוגדרים היטב, בילטרלי סימטרי. ככל ריכוז של עליות חומצה אצטית (ב) 0.07 מ"ג / מ"ל ו (ג) 0.10 מ"ג / מ"ל, צורות זנב השיא (חיצים). עוקב שיא זה מהווה אינדיקציה טובה כי המדגם עמוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- בסיום ריצת הרצף, לפתוח את קבצי נתונים אחד בכל פעם בתוכנת ניתוח CE ולשלב את הפסגות.
- שלב פסגות מדגמות.
- פתח את הקובץ הראשוןולהגדיר את צעדי אינטגרציה האוטומטיים להוציא את דקות 3 הראשונות של הריצה (שבו המתח, ולכן כיוון זרימת טור, הוא הפוך כמתוארים בטבלה 1). באותה תפריטים, להגדיר קריטריונים לבחירת שיא לרוחב שיא מינימום של 50 יחידות ו אזור שיא של 100 יחידות (או את הגדרות ברירת המחדל של היצרן) כדי לספק רמה גבוהה יחסית של סלקטיביות, הפרדת פסגות חומצה מרעש רקע העקבות.
- ידני לבדוק גבולות שיא ערכי בסיס לכל שמץ PDA כדי להבטיח אינטגרצית שיא נכונה. פסגות משולבות אינו נאות (כלומר, לשיא SSCA סימטרי מעט כי כבר משולב כמו שני שיאים נפרדים על ידי התוכנות האוטומטיות) יהיה צורך מחדש משולבות באופן ידני.
- שלב פסגות מדגמות.
- לאחר אינטגרציה, להציג את דוח אזור אחוזים, ואז לסמן ולהעתיק את דו"ח אזור האחוזים ולהדביק אותו לתוך גיליון אלקטרוני נפרד. חזור על הפעולה עבור כל דגימה כדי לבנות את repor השיא מלא בטווחt עם כל שורה המייצגת שיא יחיד (כלומר., שיא כל צריך מכיל תרכובת אחת אם ההפרדה עובדת היטב).
6. ניתוח נתונים
- הכן את הנתונים לניתוח באמצעות הגיליון האלקטרוני שנבנה (5.4). בגין ניתוח על ידי תיוג בסטנדרטי החומצה עבור כל אחת מן הנקודות העקומות הסטנדרטיות, כולל התקן הפנימי.
- חישוב מדד בשייר שיא כל על ידי חלוקת זמן שמירה על שיא כל במדגם ידי זמן השמירה של התקן הפנימי במדגם זה. מיין את הנתונים שקבעו מדד השמירה וכתוצאה מכך לזהות פסגות עניין מדגם זה.
- לאחר זיהוי השיא עבור כל חומצת עניין, לבנות עקומות סטנדרטיות עבור כל חומצה באמצעות נקודות עקומות סטנדרט החיצוניות.
- צור עקומת סטנדרט (ריכוז) עבור כל תקן SCCA ידי קביעת אזור השיא עבור כל ריכוז של סטנדרטים SCCA, והתוויית ריכוז על XAxis לעומת אזור השיא על ציר ה- y. עלילת רגרסיה ליניארית לכל עקומת SCCA רגילה והגדר את משוואת המדרון (y = mx + b).
- ודא שערכי R 2 של רגרסיה לינארית הם 0.90 ומעלה כמו quantifications מבוצעות בצורה המדויקת ביותר בטווח הליניארי של עקומת הסטנדרט.
- חשב את ריכוז החומצה עבור SCCA נתון מדגם באמצעות אזור השיא ומשוואת מדרון עבור קו רגרסיה ליניארית של עקומת סטנדרט (המחושב 6.3.2 לעיל). בקצרה, לחלק את אזור השיא הנצפה עבור חומצה שנתן שיפוע קו הרגרסיה עבור עקומת סטנדרט של כי חומצה.
- תקן את ערכי ריכוז הגלם מחושבים בשלב 6.4 עבור אובדן מדגם במהלך העיבוד באמצעות התקן הפנימי (שלב 6.5).
- חשבתי את גורם התיקון עבור כל דגימה באמצעות התקן הפנימי.
- מחלק את ריכוז בפועל של התקן הפנימי (כלומר, known כמות הוסיפה בתחילת הניסוי) על ידי הערך הנצפה של התקן הפנימי במדגם (כלומר, הסכום המחושב באמצעות משוואת השיפוע העקום הסטנדרטי עבור התקן הפנימי). הכפל את ערכי ריכוז הגלם של כל SCCA במדגם ידי גורם התיקון הזה.
- מחלק את התקן הפנימי תקן ריכוז SCCA על ידי המסה של המדגם המשמש להפקה לתקן כל וריאציה במסת מדגם. חישוב זה מניב כמות אנליטי לכל המוני של המדגם (מ"ג SCCA לכל מ"ג קפה טחון בדוגמה זו), אשר לאחר מכן ניתן להמיר ליחידות המתאימות לחקר נתון (מ"ג / מ"ג, מ"ג / g, g / g, וכו ' ).
- לאחר חישוב ריכוזי SCCA (מנורמל או המסה [עבור דגימות מוצקות או נוזלים] או הנפח [עבור דגימות נוזל]), להשתמש בערכים אלה לניתוח סטטיסטי על פי הדרישות של תכנון הניסוי ושאלות של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה נוצל בהצלחה למדוד את ההשפעות של טיפולים זרע על תוכן SCCA של זרעי קפה ירוקים. בניסוי זה, ששת הטיפולים היו: השעית חיידקים רוויה של Leuconostoc pseudomesenteroides GCP674 זן במדיום הגידול שלה (1), השעיה מימית של GCP674 חיידקים במים (2), בתמיסה מימית של אצטית וחומצות לקטית (0.15 ו -0.4 מ"ג / מ"ל בהתאמה) (3), טיפול מדיום הגידול בילה M1 (4), dH 2 O מים (5), ואת פקד בלתי מטופלים (ללא שום חומר להוסיף זרעים) (6). טיפולים יושמו ו לתסוס למשך 24 שעות. ארבע חזרות עצמאיות הוערכו עבור כל טיפול. הניתוח נערך עבור לימון (C), מאלית (M), אצטית (א) ו לקטית (L) רמות חומצת באמצעות חומצה adipic כסטנדרט פנימי.
עבור כל SCCA ואת התקן הפנימי, עקומות סטנדרטיות פורש tהוא טווח הריכוזים צפוי להיות בדגימות קפה (5, 10, 20, 40, 60, ו -80 ng / μl) נוצרו. כצפוי, כל חומצה הציגה תגובה ליניארי עבור טווח הריכוז הזה עם ערכי R בריבוע של 0.9876 עבור חומצת לימון, 0.9987 עבור חומצת מאלית, 0.9998 עבור חומצה אצטית, ו 0.9999 עבור חומצה לקטית. ההתקן הפנימי (חומצת adipic) גם הציג תגובה ליניארי מעל טווח הריכוז הזה, מניב ערך R בריבוע של 0.9984. ניתוחים לפני לטעום, מגבלות של גילוי (לוד) גבולות quantitation (LOQ) חושבו לכל SCCA ואת התקן הפנימי (חומצת adipic). המגבלה של זיהוי של לימון, מאלית, חומצה אצטית, חומצה adipic היה 1 ng / μl; ואת LOD עבור חומצה לקטית היה 2 ng / μl. המגבלה של לכמת לימון, adipic, אצטית, וחומצה לקטית היה 4 ng / μl; ואת LOQ עבור חומצה מאלית היה 2 ng / μl. כדי לחשב את SCCAs התאוששות אחוז וחומצה adipic, קפה היה מתובל SCCAs הפרט או חומצה adipic ו processeד באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. ההתאוששות אחוזים אז חושבה באמצעות הנוסחה הבאה ([{אזור השיא ממוסמר מדגם - המדגם לשלוט אזור השיא} / אזור השיא התיאורטי של ריכוז מחושב של מדגם ממוסמר {שנוצר על ידי ניתוח חיץ + SCCA / ספייק חומצה adipic}] x 100) . באמצעות שיטה זו, חשבנו החלמת אחוז 106.08% ± 12.66 עבור חומצת לימון, 98.35% ± 1.15 עבור חומצת מאלית, 91.94% ± 3.07 עבור חומצה אצטית, 97.42% ± 1.48 עבור חומצה לקטית, ו 100.19% ± 2.57 עבור חומצת adipic.
כדי לקבוע את רמת הדיוק של השיטה, השתנות התוך והבין-יום של מדידות שנעשו באמצעות CZE גם חושב. כדי לקבוע השתנות תוך-יומי, דגימות של כל SCCA וחומצה adipic נמדדו ממדגם קפה יחיד חמש פעמים על פני תקופה של 24 שעות ביממה, ומקדמי השתנות (COV; מחושב על ידי חלוקת סטיית התקן באזור השיא [או ריכוז] FOr כל SCCA ידי אזור השיא הממוצע [או ריכוז] בשביל זה SCCA, ולאחר מכן הכפלת התוצאה ב -100) עבור כל מתחם חושב באמצעות אזור השיא. כדי להעריך את החשיבות של תיקון דגימות באמצעות התקן הפנימי, מקדם שונה עבור כל SCCA חושב גם באמצעות הריכוזים של כל SCCA מחושבים באמצעות חומצת adipic כסטנדרט פנימי. כצפוי, השיטה CZE הצליח למדוד SCCAs בדיוק וחומצה adipic, עם COVs של 3.02% עבור חומצת לימון, 2.64% עבור חומצה מאלית, 3.74% חומצה אצטית, ו 2.01% עבור חומצה adipic (חומצה לקטית היה מתחת לוד / LOQ עבור כל דגימות הקפה נמדד). מדידות אלה חזרו על עצמם על פני תקופה של חמישה ימים, ואת קורות החיים נעים בין 2.11-5.25% עבור חומצת לימון, 2.01-5.32% עבור חומצת מאלית, 1.72-3.74% חומצה אצטית, ו 1.26-3.82% עבור חומצת adipic. כאשר באזורי שיא תוקנו באמצעות התקן הפנימי ומחושבים ריכוזים SCCA ששמשו בחישוב COVs, את COVs תוך-היום נע from 1.08-4.17% עבור חומצת לימון, 1.47-3.40% עבור חומצה מאלית, 2.68-5.10% חומצה אצטית. כדי להעריך השתנות הבין-יום, SCCAs במדגם קפה יחיד נמדד פעם ביום על פני תקופה של חמישה ימים. ניסוי זה חזר על עצמו אז חמש פעמים לכל SCCA וחומצה adipic. COV לכל SCCA אז היה מחושב על ידי חלוקת סטיית התקן באזור השיא (או ריכוז) עבור כל SCCA ידי אזור השיא הממוצע (או ריכוז) בשביל זה SCCA ומכפילים אותו 100. כדי להעריך את החשיבות של דגימות תיקון באמצעות פנימי התקן, COVs חושב גם באמצעות הריכוזים של כל SCCA מחושבים באמצעות חומצת adipic כסטנדרט פנימי. השיטה CZE הצליח לשחזר מדידות SCCA באופן מהימן, עם COVs החל 5.24-10.02% עבור חומצת לימון, 6.55-9.47% עבור חומצה מאלית, 7.67-8.63% חומצה אצטית, ו 3.08-6.57% עבור חומצה adipic. כאשר באזורי שיא תוקנו באמצעות התקן הפנימי ומחושבים ריכוזים SCCA שמש caCOVs lculated, את COVs ימים היתר נע בין 4.56-6.23% עבור חומצת לימון, 3.39-4.99% עבור חומצה מאלית, 9.5-10.94% חומצה אצטית.
איור 2: דוגמא PDA עקבות עם פסגות הצביעו דגימות קפה ירוקות דוללו 01:10 לפני הטעינה לתוך צלוחיות CE.. חומצות עניין מסומנות:. חומצה אצטית (א), חומצת לימון (C), חומצה לקטית (L), חומצת מאלית (M) ואת התקן הפנימי, חומצת adipic (IS) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה דמות.
עיבוד סטטיסטי בוצע על ריכוזי חומצת תיקן באמצעות מודל ליניארי כללי (GLM) כדי לקבוע אם או לא טיפולים שינו רמות חומצה אורגניות. משלב מודל "טיפול" x "לרוץ" (מקודד כגורם אקראי) היה implemen טד עבור GLM. השוואות pairwise Tukey ב 95% שימשו כדי לקבוע את הכיווניות של שינויים.
טיפול שינה ריכוזי SCCA בקפה הירוק. חומצה אצטית הועשר משמעותית בכל הטיפולים על שום שליטה טיפול (GLM, p <0.0001).
איור 3:. השפעת הטיפול על רמות חומצה אורגנית קפה ירוק טיפול לא היתה השפעה על (א) לימון או חומצה מאלית רמות בקפה ירוק. עם זאת, כל הטיפולים גדלו באופן משמעותי (ב) רמות חומצה אצטית לעומת לא שולט טיפול (GLM, p <0.001). עליות ברמות חומצה אצטית היו גדולות עם החיידק + טיפול בינוני. מכתבים לציין הבדל משמעותי על ידי השוואות pairwise Tukey ב 95%.e.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
העלייה הגבוהה ביותר נצפתה בטיפול החיידק + מדיה, שהגדיל 0.25-פי (0.5 לעומת 0.4 מ"ג / g קפה GCP674 לעומת NT). מגמה דומה נצפתה רמות חומצה לקטית, למרות שהם לא היו שונים משמעותית. לא חלו שינויים או מגמות משמעותיים חומצות האחרות במעקב (לימון וחומצת מאלית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמו בכל שיטה אנליטית, ישנם מספר גורמים קריטיים שיכולים להשפיע על איכות ואמינות משמעותית של נתונים שנוצר. ראשית, חשוב לעבד דגימות ביעילות, עם מינימום של מחזורי הקפאה / פשרה. חוזרות הקפאה להפשרה יכולים לסכן את ההרכב הכימי של המדגם לפני עיבוד או ניתוח. שנית, חשוב ליישם את השלבים של פרוטוקול זה לכל הדגימות בעקביות ובאופן שווה. טעויות טכניות נובעות הכנת מדגם עולה בקנה אחד וטיפול יכולות להשפיע באופן משמעותי את איכות הנתונים שנוצרו, ואת התוצאה "רעש" הגדיל את מדידות SCCA. לדוגמה, גודל החלקיקים של שחיקה שלאחר מדגם תשפיע על המהירות והיעילות של מיצוי SCCA. לכן זה קריטי כדי להבטיח כי הדגימות נטחנות לגודל חלקיקים אחיד, כמו זה יהיה לשמור על יעילות מיצוי ברחבי דגימות ולעזור להפחית השתנות מדגם אל-מדגם. סיימתיilarly, מדידת pipetting מדויקת במהלך תקופת ההכנה של פתרונות סטנדרטיים, מדידה מדויקת של המונים מדגמים, וניטור זהיר (ונורמליזציה) פעמי חילוץ יגרום הדור של נתונים אחידים יותר. לוקח זמן לנרמל, מדד בקפידה, ולהקליט כל אחד מהפרמטרים האלה יבטיחו את אמינות הנתונים ולאפשר תיקון שלאחר הריצה מדויק של הנתונים עבור כל שגיאות עיבוד אשר עלולה להתרחש. שלישית, זה קריטי כדי לבחור ולהשתמש תקן פנימי מתאים. חישובים של ריכוז אנליטי הסופי יהיו להסתמך בכבדות על תיקון מדויק המבוססים על אזור השיא של התקן הפנימי שנצפה מדגם זה. בגלל זה, זה קריטי, כי התקן הפנימי להיות גם נמדדו בודד ומדויק; ורצוי לא להתרחש באופן טבעי במדגם או שיתוף elute עם תרכובות אחרות. לא רק את הבחירה והשימוש הנכון של תקן פנימי בכל דגימות לאפשר לחוקר לשלוט FOr שינויים ברמות המטבוליט ציינו עקב הבדלי יעילות מיצוי; זה גם מאוד מפשט עיבוד במורד הזרם והזדהות השיא. לבסוף, יש צורך לפקח על זיהוי שיא תהליך האינטגרציה. בעוד אלגוריתמים לעיבוד אוטומטי מועילים, הם אינם מושלמים. הנתונים שנוצרו על ידי טכניקה זו מסתמכים על הדיוק של אינטגרציה, ועקביהם חייבים להיבדק באופן ידני כדי להבטיח את האיכות של אירועי אינטגרציה, במיוחד בהגדרת גבולות שיא ערכי בסיס.
כמו בכל הליך אנליטית, חשוב לקבוע כי שיטת CZE המוצגת כאן היא: א. מדויק: מסוגל לקבוע את סכום מתנה SCCA נתון; ב. מדויק: מסוגל לכימות SCCAs בתוך באותו יום reproducibly ו במדידות שנעשו על פני כמה ימים של ניתוח; ג. חזק: מסוגל לחלץ ביותר של הווה SCCAs בדגימות להיות מנותח. כפי שניתן לראות לעיל מיל נציגאולטס, השיטה המתוארת כאן היא מסוגלת קביעת הסכומים במדויק הנוכחי SCCAs בדגימות. כל SCCAs הנמדד (הלימון, מאלית, חומצה אצטית, החומצה לקטית) ואת התקן הפנימי (חומצת adipic) הציגו תגובה ליניארי של 0-80 ng / טווח הריכוז μl. בנוסף, LOQs ו LODs עבור חומצות אלה נע בין 2-4 ng / μl ו 1-2 ng / μl, בהתאמה. השיטה הייתה גם מדויקת, שכן כל SCCAs נמדד ואת התקן הפנימי חומצת adipic הציג השתנות תוך-יומיות נמוכות, נופל בין 2.0-5.5% של אזור השיא (או בין 1.0-5.2% של הריכוז המחושב) עבור כל SCCAs נמדד. ההשתנות הבין-היום של מדידות SCCA הייתה גם נמוכה יחסית, נופלת בין 3.05-10.10% של אזור השיא (או בין 3.30-10.95% של הריכוז המחושב) עבור כל SCCAs נמדד. מעניין, למעט חומצה אצטית, אשר היה עקבי או קרוב לגבול של זיהוי / כימות בכל דגימות קפה analyzed, תיקון הדגימות באמצעות חומצה adipic כסטנדרט פנימי הביא מדידות לשחזור יותר וירידה מקדם השתנות (ראה נציג תוצאות, לעיל). נתונים אלה עולים בקנה אחד עם תוצאות שפורסמו בעבר המציין תיקון שעם תקן פנימי חיוני בשמירת הדיוק ב CE מנתח לאורך זמן 16. בעוד כמה שיטות יש מועסקי יונים אנאורגניים כסטנדרט פנימי, הרגשנו כי חומצת adipic הייתה תקן מתאים יותר לשיטת CZE שהוצג כאן, כפי שהוא חומצה אורגנית ולכן סיכוי גבוה יותר לחוות אובדן בהכנת מדגם הצעדים דומה לזה שחווה SCCAs עניין במדגם. הייתה חומצת Adipic היתרונות הנוספים של לא להיות נוכח דגימות קפה נבחנים, מפגין תגובה ליניארי על פני אותו הריכוזים המשמשים SCCAs במחקר זה, מציג הנמוך יחסית לוד / ערכי LOQ (1 ננוגרם / μl ו -4 ng / μl, בהתאמה), גידולהשבה גבוהות אחוזי דה ממטריצת הקפה (100.19% ± 2.57), מה שהופך אותו תקן שימושי לכימות SCCAs בדגימות קפה. מעניין לציין, כי התאוששות האחוז הגבוהה שנצפתה עבור חומצת adipic הייתה ברה השגה עבור כל החומצות האורגניות נמדדו במחקר זה, אשר הציגו ערכי התאוששות אחוזים החל 91.94-106.08%. נתונים אלו מעידים כי שיטת CZE המוצגת כאן היא מסוגלת לחלץ ביותר של ההווה SCCAs בדגימות קפה.
התאמת פרוטוקול זה לסוגים מדגמים חדשים דורשת איסוף נתונים ראשוניים, המבוסס על ספרות או ראיות אמפיריות, לעניין הסכומים שמצפים analytes הממוקד. מידע זה יסייע להנחות את תכנון הניסוי, הכנת המדגם, ובנייה עקומת סטנדרט. קביעת דילול המדגם הנכונה לשימוש ניתן להשיג בקלות אמפירית על ידי הפעלת סדרת דילול של תמצית מבחן למצוא דילול עבודה תקין. פרוטוקול זה נועד לזהות אתSCCAs התווה בתוצאות למשל, אבל זה יכול בקלות להיות מותאם כדי לזהות SCCAs האחר על ידי שינוי פרמטרי הפרדה, כגון מתח הפרדה, לחץ, או זמן. חשוב לזכור, עם זאת, כי שינוי פרמטרי ההפרדה רשאי לשנות את מספר ריצות שניתן להשיג על סט אחד של מאגרי הפרדת מאגרים אלה לבזות עם שימוש. שפלה או שינויי Baseline ב נוכחי הם לעתים קרובות ביטויים של מאגרי יתר בשימוש / מדולדלים. החלפת חיץ הריצה שפוץ הנימים לעתים קרובות ניתן לפתור את הבעיות הללו. לאחר שימוש ממושך, היכולת של הנימים לפתור analytes תקטן גם כן. ירידה יציבות הבסיס, משמרות דרסטית זמן השמירה, ורזולוציה השיא מופחת הם כולם סימנים כי נימי ייתכן שיהיה צורך להחליפו. כמו כן ניתן לקבל שגיאת לחץ הנובע איטום פסול בין הבקבוקון מדגם ואת הנימים בשל כובע בקבוקון הלמו או בקבוקון פגום. לְהַבטִיחַהכמוסות להתאים בנוחות לתוך צלוחיות המדגם למנוע שגיאה זו.
באופן מסורתי, שיטות chromatographic כגון GC-MS, GC-FID, או HPLC שימשו כדי לזהות SCCAs במגוון רחב של מטריצות, כולל אוויר, מים, קרקע, דגימות צמח 14. בעוד יעיל, חסרון עיקרי בשיטות אלה הוא הצורך derivatize SCCAs לפני זיהוי. Derivatization משתמשת ריאגנטים מסוכנים לגבול של זיהוי מושפע בדרך כלל את יעילות התגובה derivatization 13,14. הגילוי של SCCAs הלא derivatized דרך CZE מונע אובדן אנליטי במהלך עיבוד, חשיפה לחומרים מסוכנים derivatizing, ומפחית את זמן הכנת המדגם. יתרונות אלה ניתן לראות את שיעורי ההחלמה גבוהים אחוזים (הנעים בין 91.94-106.08%) מחושבים עבור כל SCCAs נמדד במחקר זה. בנוסף, כימות CZE של SCCAs משיגה מגבלות של גילוי דומה לאלה שדווחו בספרות עבור GC-MS, GC-FID, ו HPLC, ב o מגווןחלקים f למיליון לחלקים למיליארד 13,14. בשילוב עם פעמים במהירות גבוהה בטווח, כוח הפרדה ברזולוציה גבוהה, פרוטוקולי עיבוד המדגם ישר קדימה המועסקים על ידי שיטה זו של ניתוח, הרגישות והנוחות של CZE להפוך אותו לאלטרנטיבה אטרקטיבית לשיטות GC או HPLC מסורתיות.
עם זאת, חשוב לציין כי בעוד CZE מספק מספר יתרונות על פני GC-MS HPLC, או LC-MS / MS מבוסס ושיטות ניתוח SCCA, זה לא מתאים לכל SCCA מנתח. לדוגמא, מאז שיטת CZE המתוארת כאן מסתמכת אך ורק על זיהוי spectrophotometric, זה אינו מאפשר זיהוי של SCCAs הידוע הנוכחי במדגם, או האישור של זהות SCCA באמצעות פרופיל ספקטרלי המוני. בגלל זה, שיטות GC-MS או LC-MS / MS תהיינה מתאימות יותר SCCA מנתח בדגימות המכילות כמות רבה של SCCAs הידוע, או דוגמאות בן היא קריטי כדי לוודא את זהותו של כל SCCAs הנוכחי.בנוסף, כמו שיטות המבוססות שדווח בעבר LC-MS / MS לאפשר גבולות נמוכים של גילוי (LODs) ממוצע -ב, 0.05 מיקרוגרם / מיליליטר עבור LC-MS / MS 17 לעומת מיליליטר 1 מיקרוגרם / עבור CZE שהושג באמצעות השיטה המוצגת כאן-LC-MS / MS מבוסס כימות של SCCAs עשוי להיות מתאים יותר עבור דגימות שבו SCCAs נמצאים גם הם בכמויות נמוכות מאוד או להתחקות.
הפרוטוקול המובא כאן מתמקד החילוץ וכימות של חומצות קרבוקסיליות שרשרת קצרה (SCCAs) מרקמות הצמח. קבלת מיומנות בטכניקה זו תפתח את הדלת למגוון רחב של יישומים בטכנולוגיה זו עבור חוקר הפרט. טכניקה זו, עם שינויים קלים בלבד במתודולוגיה, הועסק בהצלחה בניתוח SCCAs ב אוכלוסיה מגוונת של דגימות מצעים, החל במוצרי מזון דגימות רקמה למים סביבתיים דגימות קרקע 8. בנוסף, צובר היכרות עם העקרונות הכימיים שבבסיסטכנולוגיה זו אף פרוטוקול זה יספק לחוקרים את בסיס הידע הדרוש כדי לנסות את הניתוח של תרכובות אחרות, כגון פחמימות או מתכות 8,13. הגמישות אנליטי של אלקטרופורזה נימי עושה את זה כלי עוצמה בלתי רגילה מתאים מספר עצום של יישומים ניסיוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
- Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
- Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
- Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
- Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
- López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
- Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
- Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
- Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
- Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
- Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
- Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
- Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
- Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384 (2008).
- Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
- ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
- Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
- Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).
