Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Utvinning av plantebaserte Kapsler for microencapsulation Applications

Published: November 9, 2016 doi: 10.3791/54768
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Denne protokollen / manuskriptet beskriver et strømlinjeformet fremgangsmåte for fremstilling av sporopollenin exine kapsler (sek) fra myk kråkefot sporer og for lasting av hydrofile forbindelser i disse SECsek.

Abstract

Mikrokapsler som stammer fra plantebasert sporer eller pollen gir en robust plattform for et variert utvalg av mikroinnkapslingsteknikker applikasjoner. Sporopollenin exine kapsler (sek) oppnås når sporer eller pollen behandles for derved å fjerne de indre sporoplasmic innhold. De resulterende hule mikrokapslene oppvise en høy grad av ensartethet micromeritic og beholde intrikate mikrostruktur funksjoner knyttet til de spesielle plantearter. Heri viser vi et strømlinjeformet fremgangsmåte for fremstilling av sek fra myk kråkefot sporer og for lasting av hydrofile forbindelser i disse SECsek. Den nåværende SEC isoleringsprosedyren er nylig blitt optimalisert for å redusere prosesseringskravene som vanligvis anvendes i SEC isolasjon, og for å sikre produksjon av intakte mikrokapslene. Naturlig L. clavatum sporer er avfettet med aceton, behandlet med fosforsyre, og grundig vasket for å fjerne sporoplasmic innhold. Etter avfetting aceton, har et enkelt behandlingstrinn ved bruk av 85% fosforsyre har vist seg å fjerne alle sporoplasmic innhold. Ved å begrense syrebehandlingstiden til 30 timer, er det mulig å isolere rene SECsek og unngå SEC frakturering, noe som har vist seg å forekomme med forlenget behandlingstid. Omfattende vasking med vann, fortynnet syre, fortynnet base og løsningsmidler sikrer at alle sporoplasmic materiale og kjemiske rester er tilstrekkelig fjernet. Vakuum lasting teknikk benyttes for å laste inn en modell protein (bovint serumalbumin) som en representativ hydrofil forbindelse. Vakuum lasting gir en enkel teknikk for å laste forskjellige forbindelser uten behov for sterke løsningsmidler eller uønskede kjemikalier som ofte kreves i andre mikroinnkapslingsteknikker protokoller. Basert på disse isolasjon og laste protokoller, SECsek gi en lovende materiale for bruk i en rekke ulike mikroinnkapslingsteknikker programmer, for eksempel, terapi, mat, kosmetikk og personlig pleie prodter.

Introduction

Det er betydelig interesse for naturlige plantebaserte kapsler hentet fra plante sporer og pollen til bruk i mikroinnkapslingsteknikker applikasjoner. 1-15 I naturen, sporer og pollen gi beskyttelse for sensitive genetiske materialer mot tøffe miljøforhold. Den grunnleggende strukturen av plante sporer og pollen omfatter typisk et ytre skall lag (exine), et indre skall lag (intine), og den indre cytoplasmisk materiale. Den exine består av en kjemisk robust biopolymer 1,9,10,13,16 referert til som sporopollenin og intine består hovedsakelig av celluloseholdige materialer. 16-18 Tomme kapsler kan isoleres ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter for fjerning av 7,9 cytoplasmisk material , proteiner, og det intine lag. 2,12,16 Disse sporopollenin exine kapslene (SECsek) gir et attraktivt alternativ til syntetiske innkapslingsmidler på grunn av deres snever størrelsesfordeling og ensartet morfologi. 7,9,13,19,20 denutvikling av standardiserte prosesser for å få sek fra ulike plantearter, for eksempel myk kråkefot, åpner muligheten for et bredt spekter av mikroinnkapslingsteknikker applikasjoner innen feltene stoffet levering, mat og kosmetikk. 6,10-13,21

For å oppnå Sek, forskere første behandlede sporer og pollen med organiske løsningsmidler og tilbakeløpskokt med alkaliske oppløsninger for å fjerne cytoplasmiske innhold. 22-25 imidlertid den gjenværende kapsel Strukturen ble bestemt til fortsatt inneholde cellulose intine lag. For å fjerne denne, forskere undersøkt ved bruk av sur hydrolyse forlenget behandling ved hjelp av saltsyre, varm svovelsyre, eller varm fosforsyre i løpet av flere dager, 22-25 med fosforsyre bli den foretrukne fremgangsmåte for SEC intine fjerning. 2 imidlertid kontinuerlig forskning gjennom årene har vist at ulike sporer og pollen har ulik grad av fleksibilitet til den harde behandlingen av megthods brukte. 26,27 Noen sporer og pollen er helt nedbrutt og mister all strukturell integritet i sterke alkaliske løsninger, eller blir sterkt skadet i sterke sure løsninger. 16 variasjon i SEC svar på behandlingsforhold skyldes subtile variasjoner i kjemisk strukturen og morfologien av exine sporopollenin exine materiale mellom artene. 28 på grunn av variasjonen i robustheten sporopollenin exine kapsler (sekunder), er det nødvendig å optimalisere prosessbetingelsene for hver art av spore og pollen.

Plant sporer fra arten L. clavatum har blitt den mest studerte enkelt kilde til SECsek. Det foreslås at dette er først og fremst på grunn av sin omfattende tilgjengelighet, lave kostnader, monodispersitet og kjemiske robusthet 9,29 Sporene kan lett høstes og inneholder sporoplasmic innholdet i form av grupperinger av 1 -. 2 mikrometer cellulære organeller og biomolecules. 11 L. clavatum sporer har blitt brukt som en naturlig pulver smøremiddel, 30,31 en base for kosmetikk, 30 og i urtemedisin 32-36 for et bredt spekter av terapeutiske anvendelser. Resultatene fra L. SECsek clavatum har vist seg å være mer motstandsdyktige mot behandling enn sek fra andre arter av sporer og pollen. 2 Etter behandling, har de resulterende SECsek vist seg å beholde sine intrikate microridge konstruksjoner og høy morfologisk jevnhet samtidig som det gir et stort innvendig hulrom for innkapsling. 7 studier indikerer at L. clavatum Sekunder kan anvendes for innkapsling av medisiner, vaksiner, 10,13 11 proteiner, 7,14 celler, 8 oljer, 5-7,9 og kosttilskudd. 5,15 Observerte SEC lastende effektivitet er relativt høy sammenlignet med konvensjonelle innkapsling materialer. 7. Det finnes også et antall rapporterte fordelertil SEC innkapsling, slik som evnen til å maskere smak, 6,10 og for å tilveiebringe en viss grad av naturlig beskyttelse mot oksidasjon. 12 I de foreliggende studier, er det mest brukte SEC utvinningsmetode for L. clavatum er basert på fire hovedtrinn. Trinn en er oppløsningsmidlet tilbakeløpsbehandling i aceton i opp til 12 timer ved 50 ° C for å fjerne fettet sporene. 11 Trinn to er alkalisk koking under tilbakeløp i 6% kalium-hydroksyd i opp til 12 timer ved 120 ° C for å fjerne cytoplasmisk og proteinholdige materialer. 11 Trinn tre er syre tilbakeløpsbehandling i 85% fosforsyre i opp til 7 dager ved 180 ° C for å fjerne cellulose intine materiale. 11 Trinn fire er en omfattende vaskeprosess med vann, oppløsningsmidler, syrer og baser for å fjerne alle gjenværende ikke-exine material og kjemikalierester.

De viktigste målene for SEC utvinning i forhold til innkapsling programmene er å produsere kapsler som er tom for cytoplasma materiale, gratis from potensielt allergifremkallende proteiner, og morfologisk intakt. 2,37 Men fra en industriell produksjon perspektiv, er det også viktig å vurdere ytterligere økonomiske og miljømessige faktorer, for eksempel, energieffektivisering, produksjon varighet, sikkerhet, og som resulterer avfall. Med hensyn til energieffektivitet, både høye temperaturer og lang saksbehandlingstid påvirke produksjonskostnader samt miljøpåvirkningen. Produksjon varighet og behandlingstid er viktige faktorer som påvirker behandling lønnsomhet. Av spesiell bekymring er at høy temperatur fosforsyre behandling øker sikkerhetsproblemer og er kjent for å resultere i etsende skalering som fører til betydelige økninger i infrastruktur vedlikehold og forsinkelser i batch behandlingstid. 38-40 Der det er mulig, noe som minsker antall trinn som kreves kan føre å betydelig redusere avfallet som produseres. Imidlertid er det mest brukte fire-trinns prosess med L. clavatum SEC utvinning har rett og slett evolved fra tiår med forskning og har hatt lite faktiske prosessoptimalisering. Nylig Mundargi et al., 41 gitt et betydelig bidrag til den pågående arbeid på dette feltet ved systematisk å evaluere og optimalisere en av de hyppigst rapporterte SEC utvinning teknikker.

I den første delen av denne studien: spore avfetting er demonstrert å benytte aceton behandling ved 50 ° C i 6 timer; sporoplasm og intine fjerning prosedyrer blir demonstrert bruk av 85% fosforsyre behandling ved 70 ° C i 30 timer; omfattende vasking med vann, oppløsningsmidler, syre og base anvendes for å demonstrere fjerning av gjenværende sporoplasmic innhold; og SEC tørking er demonstrert bruk konveksjon tørking og vakuum ovn tørking. I den tredje seksjon, er SEC vakuum lasting demonstrert å benytte vakuum lasting av en modell protein, bovint serumalbumin (BSA), etterfulgt av BSA belastede-SEC vask og frysetørking. I den fjerde delen, den determinasjon av BSA innkapsling effektivitet er demonstrert bruk av sentrifugering, probe ultralydbehandling, og UV / Vis spektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utvinning av Sporopollenin Exine Kapsler (SECsek) fra L. clavatum spores

Merk: SEC utvinning prosessen innebærer en brannfarlig pulver (L. clavatum), varme korrosive syrer, og brannfarlige løsemidler, derav riktig personlig verneutstyr (vernebriller, ansiktsmaske, hansker, frakk), godkjent risikovurdering av bruk og avhending av kjemikalier ved autorisert laboratoriepersonell er viktig.

  1. Spore Avfetting
    1. Fremstille en tilbakeløps satt opp i et avtrekk ved hjelp av et glass kondensator, vannsirkulasjonssystem, og vannbad (figur 1).
    2. Vei 100 g L. clavatum spores uten å fremkalle støv og bort fra alle antennelseskilde.
      Merk: Sporene brukt her ble oppnådd kommersielt (Se Materials List).
    3. Overføring av sporer langsomt til en 1-liters polytetrafluoretylen (PTFE), rundbunnet kolbe med en magnetisk rørestav.
    4. Legg 500 ml aceton til sporene iPTFE kolbe og kolben ristes forsiktig for å danne en homogen suspensjon.
    5. Sett PTFE kolbe i vannbad innstilt på 50 ° C og koble til tilbakeløpskjøler.
    6. Utfør tilbakeløpende i aceton i 6 timer med røring ved 200 rpm og deretter la den avkjøles i romtemperatur.
    7. Filtrer suspensjonen med filterpapir under vakuum og samle avfettet sporer i store (15 cm diameter) glass petriskåler.
    8. Tørk de spores ved romtemperatur (avtrekk) ved å dekke med aluminiumsfolie med hull for løsningsmiddelfordampning.
  2. acidolyse
    1. Fremstille 85% (v / v) fosforsyre med deionisert (DI) vann og overføre avfettede tørre sporer i en 1-liters kolbe PTFE.
    2. Legg 500 ml fosforsyre (85% v / v) til de avfettede spores.
    3. Sett PTFE-kolbe i et vannbad innstilt på 70 ° C og koble til tilbakeløpskjøler.
    4. Utfør milde tilbakeløpende (70 ° C) i fosforsyre i 30 timer og deretter lakul ved romtemperatur.
    5. Fortynne suspensjonen ved hjelp av 500 ml varmt avionisert vann og samle SECsek ved vakuumfiltrering ved bruk av filterpapir.
    6. Overfør SECsek til en 3 liters glassbeger til å utføre en serie med vask.
  3. SEC Vaske
    1. Plasser tre L glassbeger inneholder SECsek i en avtrekkshette.
    2. Legg 800 ml varm (50 ° C) avionisert vann til de SECsek under forsiktig omrøring i 10 min.
    3. Filtrer suspensjonen ved hjelp av filterpapir og en vakuumfiltrering oppsett.
    4. Samle SECsek i et rent 3 L glassbeger.
    5. Gjenta trinn 1.3.1. til 1.3.4. fem ganger.
    6. Legg 600 ml varm (45 ° C) aceton til SECsek under forsiktig omrøring i 10 min.
    7. Samle SECsek ved filtrering under vakuum og overføre sek å en ren 3 L glassbeger.
    8. Gjenta trinn 1.3.6. og 1.3.7. ved bruk av 600 ml varm (50 ° C) 2 M saltsyre.
    9. Gjenta trinn 1.3.6. og 1.3.7. bruker 600 ml hot (50 ° C), 2 M natriumhydroksyd.
    10. Gjenta trinn 1.3.1 og 1.3.4 åtte ganger.
    11. Gjenta trinn 1.3.6. og 1.3.7. ved bruk av 600 ml varm (45 ° C) aceton.
    12. Gjenta trinn 1.3.6. og 1.3.7. ved bruk av 600 ml varm (45 ° C) etanol.
    13. Gjenta trinn 1.3.6. og 1.3.7. ved bruk av 800 ml varm (50 ° C) DI vann.
    14. Overfør de rene sek å seks store glass petriskåler og tørt i et avtrekksskap ved RT i 24 timer for å fjerne alle vanninnhold.
    15. Det spesifikke tørke i en vakuumovn ved 60 ° C og 1 mbar vakuum i 10 timer eller inntil konstant vekt.
    16. Samle tørket SECsek og overføre til en polypropylen flaske.
    17. Oppbevar SECsek på et tørt skap.

2. Karakterisering av SECsek

  1. Utfør scanning elektronmikroskopi analyse 41 ved hjelp av sporer og SECsek produsert på ulike stadier.
  2. Utfør elementanalyse 41 ved hjelp av sporer og SECsek produsert på ulike stadier. Dry alle prøvene ved 60 ° C i minst en time før elementanalyse og beregning av proteininnholdet ved hjelp av prosent nitrogen med en multiplikasjonsfaktor på 6,25. 11 Motta resultater ved bruk av triplikate målinger for hver prøve.
  3. Gjennomføre micromeritic egenskaper analyse ved hjelp av et dynamisk bilde partikkel analysator. 41
  4. Skann ubehandlet, behandlet og FITC-BSA lastede SECsek hjelp konfokal laser scanning mikroskopi. 41

3. Biomacromolecule Innkapsling av Vacuum Loading Technique

  1. Forbered 1,2 ml 125 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) løsning ved hjelp av avionisert vann og overfør til et 50 ml polypropylenrør.
  2. Vei 150 mg SECsek og overføre til BSA løsning.
  3. Vortex-røret i 10 min for å danne en homogen løsning.
  4. Dekk røret ved hjelp av filterpapiret.
  5. Overfør røret til en frysetørker kolbe og tørke i 4 timer med vakuum ved 1 mbar.
  6. Utfør trinn 3.1til 3.5. for tre uavhengige grupper.
  7. Samle BSA belastede SECsek og fjerne agglomeratene ved hjelp av en morter og pistill.
  8. Overfør BSA lastede SECsek til en 50 ml tube og tilsett 2 ml DI vann for å fjerne rester av BSA.
  9. Samle SECsek ved sentrifugering ved 4704 xg i 5 min og kast supernatanten.
  10. Gjenta vaske med DI vann en gang.
  11. Dekk røret som inneholder SECsek BSA-lastet ved hjelp av filterpapiret.
  12. Overfør SECsek til en fryser (-20 ° C) og fryse i 1 time.
  13. Fryse tørke SECsek for 24 timer og i fryser inntil videre karakterisering.
  14. Forbered placebo SECsek uten BSA bruker samme prosedyre som i trinn 3.1. til 3,13.
  15. Forbered FITC-BSA lastet SECsek ved hjelp av samme prosedyre som i trinn 3.1. til 3,13.

4. Bestemmelse av Innekapslingseffektivitet

  1. Vei 5 mg BSA lastede SECsek i 2 ml polypropylen rør.
  2. Legg 1,4 ml fosfatte bufret saltvann pH 7,4 (PBS) og vortex i 5 min.
  3. Probe sonikere suspensjon ved 40% amplitude i 3 sykluser med 10 sek.
  4. Filtrer løsningen ved hjelp av en 0,45 mikrometer polyetersulfon (PES) filter.
  5. Utfør den samme prosedyren som i trinn 4.1. til 4,4. ved hjelp av placebo SECsek.
  6. Mål absorbansen ved 280 nm ved bruk av placebo, som en blank.
  7. Kvantifisere mengden av BSA innkapslet ved anvendelse av en BSA-standardkurve (200 til 1000 ug / ml) i PBS. 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strømlinjeformet utpakkingen for Sporopollenin Exine Capsules

Den L. clavatum SEC ekstraksjon ble oppnådd ved tre hovedtrinn: (1) Virker avfettende bruker aceton; (2) acidolyse ved bruk av fosforsyre 85% (v / v); og (3) omfattende SEC vasking ved hjelp av oppløsningsmidler. Strømmen av den strømlinjeformede SEC ekstraksjonsprosessen er presentert i Figur 1 A -. I korthet innebærer fremgangsmåten en avfettende trinn med aceton tilbakeløpsbehandling i 6 timer ved 50 ° C og den avfettede sporer ble deretter tørket over natten i et avtrekk for å fjerne gjenværende aceton. De avfettede sporer ble underkastet acidolyse ved hjelp av fosforsyre i 30 timer. Under acidolyse flertallet av sporoplasmic materialene oppløses og fjernes deretter under vakuum filtreringstrinnet. For rest sporoplasmic materialer for å fjerne en omfattende serie av vasketrinn ved hjelp av løsemidler, syre, Base og vann utføres. Det spesifikke energiforbruket ble først tørket ved RT i 24 timer og ytterligere tørket ved 60 ° C og 1 mbar vakuum i 10 timer for å fjerne rester av løsningsmidler og fuktighet.

Som vist i figur 1, ble alle ekstraksjonstrinn SEC utført i et avtrekk med en fare varsel. Under SEC utvinning, ca 70% massetap er observert på grunn av fjerning av sporoplasmic materialer og våre data er i samsvar med eksisterende rapporter om produksjon av rene og intakte SECsek. 7, 19,20,29 Den strømlinjeformet prosess fra den innledende avfetting trinnet til det endelige produktet blir utført i omtrent 5 dager, og prosessen kan lett skaleres opp til en 1 kg lab batch skala med korrekte sikkerhetskontroller.

Innkapsling trinn som anvender SECsek er presentert i figur 1 J - M, dette er en fordel på grunn av å være enkle trinn uten involving sterke organiske løsemidler eller som krever mekaniske skjærkrefter. 7 Våre innkapsling eksperimenter innebære 150 mg SECsek og en lasteløsning volum tilstrekkelig for opptak av SECsek. Lastingen i disse SECsek er begrenset av oppløseligheten forbindelsen i utvalgte vandige eller organiske oppløsningsmidler, og lasting kan oppnås ved hvilken som helst av tre lastefremgangsmåter: passive, kompresjon, og vakuum lasting. Men gir vakuum lasting relativt høyere innkapsling av forbindelser. 7, 19,20

Fysio karakterisering av Sporopollenin Exine Capsules

For å bestemme renheten av SECsek produsert ved hjelp av den strømlinjeformede fremgangsmåten presentert i figur 1, ble overflaten og tverrsnitts morfologi, micromeritic egenskaper, og elementsammensetning undersøkt på forskjellige stadier av SEC utvinningsprosessen. Som vist iFigur 2 er de SEM bilder indikere intakte sporer med en unik mikrostruktur, og før behandling, ble mikron stilt sporoplasmic organeller observert i tverrsnittsbildet. Med spore avfetting og alkali behandling ingen morfologiske og strukturelle endringer ble observert bortsett fra sprekker av sporoplasmic organeller.

Figur 3 viser SEM bilder av SECsek etter acidolyse ved hjelp av fosforsyre ved forskjellige tidspunkter fra 5 timer til 30 timer. Disse resultatene støtter at acidolyse for opp til 30 timer gir intakte og rene SECsek blottet for sporoplasmic materialer. For å bekrefte gjenværende proteinholdig materiale, ble CHN elementanalyse 29 utført, og dataene er presentert i figur 4. Disse resultater gir en rettesnor for å velge den beste behandling betingelse for å oppnå ren og intakt SECsek. I tilfelle av avfettet og alkali behandlet Sek, ingen vesentlig proteinholdigslipe er observert. Men med acidolyse ved hjelp av fosforsyre, er mesteparten av proteinholdige materialer fjernet i 30 hr, og ingen ytterligere reduksjon observeres med økende behandlingstiden opp til 120 timer. Det elementære data er konsistent med tidligere rapporter om forlenget behandling av SECsek 7,11 og med kommersielle SECsek.

Micromeritic egenskaper ble analysert ved dynamisk bilde partikkelanalyse (DIPA), og resultatene er vist i figur 5. Disse resultatene støtter ensartet størrelsesfordeling av SECsek etter acidolyse i opp til 30 timer, med en størrelse på 31,0 ± 2,2 um. I kontrast, SEC strukturell integritet avtar med langvarig acidolyse og begynner å forårsake betydelig fragmentering av SECsek utover 30-timers behandlingsvarighet.

Figur 6 viser SEM og DIPA data for SECsek fremstilt med bare acidolyse probearbei- ved hjelp av fosforsyre i 30 timer. Disse resultatene bekrefter at etter avfetting trinnet, acidolyse produsert rene og intakte SECsek med en enhetlig størrelsesfordeling på 32,5 ± 2,7 mikrometer. Acidolyse-bare SECsek ha en restproteininnhold på bare 0,15 ± 0,0%, som bestemt i forhold til% nitrogeninnhold, 11 som kan sammenlignes med SECsek produsert av alkali og acidolyse behandling som beskrevet ovenfor og med tidligere rapporter. 7

Microencapsulation bruker Sporopollenin Exine Capsules

For å demonstrere bruken av L. clavatum SECsek produsert ved hjelp av acidolyse beskyttet prosess, ble mikroinnkapslingsteknikker eksperimenter utført ved bruk av BSA som modell protein. Laste inn SECsek ble oppnådd ved hjelp av en vakuum lasting teknikk med 150 mg SECsek og 1,2 ml 125 mg / ml BSA. Figur 7 viser CLSM imalderen SECsek før og etter acidolyse-bare behandling og med FITC-BSA innkapsling. Dataene viser at ubehandlede SECsek oppviser autofluorescens på grunn av tilstedeværelsen av sporoplasm bestanddeler inne i spore hulrom. Men etter acidolyse-bare behandling, blir alle sporoplasmic innholdet fjernes som resulterer i et tomt indre hulrom. Påfallende, etter innkapsling av FITC-BSA, grønn fluorescens observert inne i Sek, bekrefter innkapsling av modellen protein i SECsek. 19,20,41

Videre, for å undersøke de morfologiske endringer og micromeritic egenskaper av BSA-lastet Sek, SEM og DIPA-analyse ble utført, og dataene er presentert i figur 8. De SEM bilder bekrefte tilstedeværelse av intakte og rene microridges etter BSA lasting. I tillegg ble det ikke observert noen vesentlige endringer i diameter, sirkularitet, og størrelsesforholdet etter BSA lasting i SECsek. Disse dataene er consistent med tidligere rapporter om innkapsling av narkotika ved hjelp SECsek. 7,10

For å kvantifisere mengden av innkapslet BSA, ble BSA ekstrahert fra 5 mg BSA-lastet Sek, og dataene er presentert i tabell 1. Dataene indikerer 0,170 ± 0,01 g BSA lasting per gram SECsek. Totalt sett, SEM, DIPA, CLSM, og kvantifisering av BSA ved Spectrographic_records analyse, bekrefter vellykket innkapsling av BSA i L. clavatum SECsek og SEC morfologiske stabilitet.

Figur 1
Figur 1. Strømlinjeformet utpakkingen for L. clavatum Sporopollenin Exine Kapsler (SECsek). (A) Ubehandlede sporer. (B) Spore avfetting ved hjelp av en tilbakeløpskokende satt opp ved 50 ° C i 6 t. (C) Oppløsningsmiddel filtrering og samle ion av avfettede sporer. (D) Tørking av avfettede sporer ved romtemperatur. (E) Spore acidolyse i PTFE-kolbe ved bruk av 85% (v / v) fosforsyre ved 70 ° C i 30 timer. (F) Acid filtrering ved bruk av vakuumfiltrering set-up. (G) SEC vasking ved hjelp av en serie av vann, syre, base og løsningsmidler vasketrinn. (H) SEC tørking ved hjelp av vakuum-ovn ved 60 ° C og 1 mbar vakuum i 10 timer. (i) Intakt, feilfri og tørket SECsek som et sluttprodukt. (J) Blanding av SECsek og BSA løsning. (K) Homogenisering av SECsek og BSA løsning. (L) Vacuum lasting av BSA inn SECsek. (M) BSA lastede SECsek. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

54768 / 54768fig2.jpg "/>
Figur 2. Scanning Electron mikroskopisk analyse av L. clavatum Spores under forskjellige stadier av Pre-syre behandling. (A) Ubehandlet sporer som viser sporoplasmic cellulære organ og biomolekyler. (B) Aceton behandlet sporer som viser forstyrret sporoplasmic innholdet. (C) og (D) Alkali behandlet sporer som viser fjerning av sporoplasmic innholdet og rynkete intern cellulose intine lag. Tilpasset fra 41 og brukes med tillatelse fra Scientific Reports. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Scanning Electron mikroskopisk analyse av L. clavatum Spores under ulike stadier av AcidBehandling fra 5 til 30 t (A - D). Henholdsvis, 5, 10, 20, og 30 hr syrebehandlet sporer som viser intakt ytre mikrostruktur og ren innvendig hulrom. Tilpasset fra 41 og brukes med tillatelse fra Scientific Reports. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Protein innhold av sporer og Sporopollenin Exine Kapsler (SECsek). Proteininnhold etter forskjellige trinn av behandlingen. Data som representeres er et gjennomsnitt av tredoble målinger med standardavvik (n = 3). Tilpasset fra 41 og brukes med tillatelse fra Scientific Reports. Klikk her for å se en større versjon of denne figuren.

Figur 5
Figur 5. Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) av sporer og Sporopollenin Exine Kapsler (SECsek) på ulike stadier av behandling Columns (A - C). Er henholdsvis pre-syrebehandling, syrebehandling, og intakte SECsek. Tomter er representative grafer av SEC diameter, sirkularitet, sideforhold, og kanten gradient. Tilpasset fra 41 og brukes med tillatelse fra Scientific Reports. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Scanning elektronmikroskopi (SEM) og Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) på 30 hr Acidolysis-bare Sporopollenin Exine Kapsler (SECsek). (A) SECsek viser intakt ekstern mikrostruktur og ren innvendig hulrom. (B) Representative grafer av SEC diameter, sirkularitet, og størrelsesforhold. Tilpasset fra 41 og brukes med tillatelse fra Scientific Reports. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Confocal Laser Scanning Mikroskopi (CLSM) Analyse av Sporopollenin Exine Kapsler (SECsek) før og etter behandling og BSA Innkapsling. Den første raden viser ubehandlede sporer som viser sporoplasmic cellulære organeller og biomolekyl autofluorescence. Den andre raden viser 30 timers acidolyse-bare SECsek med et tomt indre hulrom. Den tredje raden viser FITC-BSA lastettil 30 t acidolyse-bare SECsek. (Scale barer er 10 mikrometer). Tilpasset fra 41 og brukes med tillatelse fra Scientific Reports. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Scanning elektronmikroskopi (SEM) og Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) Karakterisering av BSA-lastet Sporopollenin Exine kapsler (SECsek). (A) SEM bilder av BSA lastede SECsek. (B) Representative grafer av BSA-lastet SEC diameter, sirkularitet, sideforhold, og kanten gradient. Tilpasset fra 41 og brukes med tillatelse fra Scientific Reports. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Materiale BSA lasting per batch (125 mg / ml) BSA i 5 mg SECsek (mg) Mengde BSA lastet (g per g SECsek) ubehandlede sporer 0,6 ml 0,654 ± 0,05 0,131 ± 0,01 SECsek 1,2 ml 0,831 ± 0,05 0,170 ± 0,01

Tabell 1. Innkapsling av bovint serumalbumin (BSA) i Ubehandlede sporer og SECsek. Volum av BSA løsning som brukes til lasting per 150 mg batch av "ubehandlede sporer" eller "SECsek '. Data som representeres er et gjennomsnitt av tredoble partier med standardavvik (n = 3). Tilpasset fra 41 og brukes med tillatelse fra Scientific Reports.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet, en systematisk analyse av SEC utvinning fra L. clavatum sporer er presentert, og denne rapport viser at det er mulig å produsere høyere kvalitet kapsler og samtidig oppnå en betydelig effektivisering av pre-eksisterende brukte protokollen. 11 I motsetning til eksisterende protokoll som krever en høy prosesstemperatur (180 ° C) og en lang prosess varighet (7 dager), 11 den aktuelle SEC ekstraksjon behandling optimalisering er primært fokusert på å redusere temperaturen og varigheten av acidolyse trinn.

De avfetting og alkali behandlinger gir minimal fjerning av sporoplasmic materiale fra spores. Men acidolyse fra fem timer til 120 timer fjernet den maksimale mengden av sporoplasmic materialet. Resultatene indikerte at den totale behandlingsvarighet og temperaturer kan bli drastisk redusert fra konvensjonelle teknikker, 11 og at bare 30 timer ved moderat temperatur (70° C) fosforsyre, forutsatt at optimal kvalitet kapsler. Dessuten utover 30 timer acidolyse, ble det funnet at den SECsek begynte å sprekke, og ble det observert en signifikant økning i partikkel fragmenter, noe som tyder på at hele partiet av SECsek kan være oppviser en reduksjon i totale strukturelle integritet. I tillegg bør det legges merke til at L. clavatum anses å omfatte forholdsvis robust sporopollenin, 2, og at de spesifikke prosessbetingelser som er involvert i denne protokoll, for eksempel, syrekonsentrasjon, temperatur, og / eller hydrolyse varighet, kan måtte justeres for andre pollen arter.

Det ble vist at produksjonen av SECsek ved acidolyse-bare ved hjelp av fosforsyre (85% v / v) for 30 hr gir ekstremt rene og intakte SECsek. 41 Dataene bekrefter at acidolyse er det avgjørende skritt i SEC produksjon. Til slutt ble de syre eneste SECsek anvendt for innkapsling av BSA og en høy grad av lasting ble observert. Laste wsom oppnås ved anvendelse av et vakuum, hvorved det indre hulrom SEC trykk forandres til å trekke hardt BSA-oppløsning inn i de tomme kapsler. Nanochannels (fig 15 -. 20 nm), som tidligere er blitt identifisert i exine veggene av L. clavatum, 7 la løsningen å gå inn i store interne hulrom. Etter påsetting, ble kapslene vasket og tørket i en frysetørker for å gi et frittstrømmende pulver.

Størrelse ensartethet og morfologiske egenskaper er viktige faktorer for å vurdere kvaliteten av en vellykket innkapsling materiale. Den observerte størrelse ensartethet og intakt morfologi av BSA-lastet SECsek bekreftet potensialet bruk av acidolyse-bare behandlet SECsek for mikroinnkapslingsteknikker applikasjoner.

Disse resultatene er viktige for storskala industriell produksjon av SECsek og for å stimulere til økt interesse for potensielle anvendelser av SECsek i mikroinnkapslingsreaksjonen av narkotika,proteiner, peptider, kosttilskudd, kosttilskudd og kosmetikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17 (7), 609-612 (2007).
  2. Barrier, S. Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. , University of Hull. (2008).
  3. Dosage Form. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. , US 7,608,270 B2 (2009).
  4. Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
  5. Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45 (7), 645-649 (2010).
  6. Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43 (1), 73-76 (2010).
  7. Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21 (4), 975-981 (2011).
  8. Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21 (44), 18018-18023 (2011).
  9. Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22 (19), 9767-9773 (2012).
  10. Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1 (5), 707-713 (2013).
  11. Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
  12. Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., et al. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. Gaonkar, A. G., et al. , Elsevier. 283-297 (2014).
  13. Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6 (1), 80-96 (2014).
  14. Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31 (7), 667-673 (2014).
  15. Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2 (8), 945-959 (2014).
  16. Southworth, D., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. Blackmore, S., et al. , Academic Press. 193-212 (2013).
  17. Stanley, R. G., Linskens, H. F. Pollen: Biology, Biochemistry, Management. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 307 (1974).
  18. Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
  19. Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12 (9), 1167-1173 (2015).
  20. Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26 (4), 487-497 (2015).
  21. Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. , WO2007012857A1 (2007).
  22. Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461 (1), 89-109 (1928).
  23. Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 517-519 (1931).
  24. Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 62-67 (1931).
  25. Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148 (9-10), 267-286 (1937).
  26. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5 (2), 247-252 (1964).
  27. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. , 16-22 (1966).
  28. Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12 (3), 171-178 (1999).
  29. Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
  30. Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109 (1), 146-150 (2007).
  31. Baytop, T. Therapy with medicinal plants in Turkey. , 2nd, Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Istanbul. 334-335 (1999).
  32. Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47 (7), 602-607 (2009).
  33. Ma, X., Gang, D. R. The lycopodium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21 (6), 752-772 (2004).
  34. Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698 (1), 110-121 (2013).
  35. Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57 (3), 61-68 (2011).
  36. Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3 (1), 207-210 (2014).
  37. Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6 (20), 16533-16539 (2016).
  38. Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Proceedings of 3rd Joint China/USA Chemical Engineering Conference, Beijing, China, , (2000).
  39. El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190 (1), 324-329 (2011).
  40. Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
  41. Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
  42. Smith, B. C. Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. , CRC press. 182 (2011).

Tags

Bioteknologi , naturlig sporer sporopollenin exine kapsler innkapsling mikrostruktur microridges
Utvinning av plantebaserte Kapsler for microencapsulation Applications
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potroz, M. G., Mundargi, R. C.,… More

Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter