Summary
Dyrkning humane mesenchymale stromacellers (hMSC'er) med autologt serum, reducerer risikoen for afstødning af xenogene materiale, og andre negative virkninger. Det giver også mulighed for genopretning af en delmængde af mesodermale stamfædre, som kan levere friske hMSC'er. Integrering hMSC'er i en autolog fibrinkoagel muliggør nem håndtering og effektiv kirurgisk implantation.
Abstract
Humane mesenchymale stromacellers (hMSC'er) dyrkes in vitro med forskellige medier. Grænser for deres anvendelse i kliniske omgivelser, dog primært afhænge af potentielle biohazard og betændelse risici udøves af xenogene næringsstoffer til deres kultur. Menneskelige derivater eller rekombinante materialer er de første valg kandidater til at reducere disse reaktioner. Derfor kultur kosttilskud og materialer af autolog oprindelse repræsenterer de bedste næringsstoffer og de sikreste produkter.
Her beskriver vi en ny protokol til isolering og dyrkning af knoglemarv hMSC'er i autologe forhold - nemlig patient-afledt serum som supplement til dyrkningsmediet og fibrin som et stillads for hMSC administration. Faktisk kunne hMSC / fibrinkoagel konstruktionerne være særdeles nyttige til adskillige kliniske anvendelser. Især fokuserer vi på deres anvendelse i ortopædisk kirurgi, hvor fibrinkoagel afledt af donorens eget blod tilladtudvekslinger effektiv levering celle og næringsstoffer / affald. For at sikre optimale sikkerhedsforhold, er det af yderste vigtighed at undgå risikoen for hMSC transformation og væv tilgroning. Af disse grunde den fremgangsmåde, der er beskrevet i dette dokument, viser også en minimalt ex vivo hMSC ekspansion, for at reducere celleældning og morfologiske ændringer, og kortfristet osteo-differentiering før implantering, at inducere osteogene afstamning specifikation, således formindsker risikoen for efterfølgende ukontrolleret proliferation.
Introduction
Humane mesenchymale stromacellers (hMSC'er) er en af de bedste cellekilder til anvendelse i vævskonstruktion til aktivering af osteogenese 1,2. De er let isoleret fra knoglemarv og andre voksne væv og hurtig typiske overflademarkører såsom CD90, CD105, CD73 en. Desuden kan de differentiere til flere celletyper, såsom osteoblaster, chondrocytter og adipocytter 3. Deres terapeutiske virkninger tilskrives deres regenerative og trofiske egenskaber 4. hMSC'er kan anvendes i ortopædisk kirurgi, såvel som i andre regenerative kliniske anvendelser. De kombineres fortrinsvis med stilladser, for at forbedre det kliniske resultat 5.
Sammenlignet med andre materialer, fibringelen viser interessante egenskaber, såsom klæbeevne, resorption og effektiv transport af næringsstoffer, hvilket gør det ekstremt anvendelige til en række af vævsdyrkningsapplikationer 6,7.
I vores fremgangsmåde, fibrin gel, der er afledt fra patientens eget blod, og autologt serum, til in vitro hMSC'er kultur blev anvendt som en mulig terapeutisk løsning på det ortopædiske felt 8.
Til kliniske formål, er hMSC'er sædvanligvis administreres via to vigtigste procedurer: (i) "one-step" procedure (dvs. minimal manipulation), der tillader den automatiske transplantation af knoglemarv, enten helt eller koncentreret (dvs. mononukleære celler), under kirurgi; og (ii) "to-trins" procedure (dvs. omfattende manipulation), som er baseret på ex vivo ekspansion af hMSC'er øge udbyttet før implantation, og kræver GMP faciliteter 9. Interessant, dyrkning af celler med human voksen serum i stedet for bovin kalveserum tillader genvinding, sammen med hMSC'er, af en delmængde af celler (1 - 10% i mononukleære kulturer) kaldet mesodermal progenitorceller (MPCS), i stand til in vitro differentiering til frisk hMSC'er 10,11. Således kan hMPCs spille en betydelig rolle i den regenerative proces sammenlignet med hMSC'er alene 12,13. Endelig kortsigtet osteo-induktion skubber hMSC'er til at starte deres differentiering i den osteogene afstamning uden at miste deres proliferative potentiale og levedygtighed 12. Disse resultater bekræfter tidligere undersøgelser, der har rapporteret forøget in vivo knogledannelse ved hMSC'er, efterfulgt af en forkultur i osteogen medium 14. Desuden kan en autolog plasmaclot som et stillads for celle levering nemt manipuleres af kirurgen og formet til at passe formen af knoglen hulrum 13.
therefore, kan denne metode være yderst nyttig for de forskere og klinikere, der sigter mod at omsætte deres hMSC-baseret behandling fra bænken til bedside i ortopædiske applikationer.
Protocol
Den nuværende protokol blev udviklet i overensstemmelse med World Medical Association erklæring af Helsinki om etisk adfærd af forskningsresultater, der involverer mennesker. Det blev godkendt af Etisk Komité Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana.
NOTE:
Knoglemarv blev opnået fra patienter, der gennemgår rutine total hoftealloplastik (ifølge trin 1.1) 15; plasma til fremstilling størkne blev opnået fra autologt perifert blod 13; autologt serum, som supplement til dyrkningsmediet, blev opsamlet fra en autolog fuldblod aferese. Alle patienter fik detaljerede oplysninger om proceduren og underskrev en skriftlig samtykkeerklæring.
1. Indsamling af knoglemarv Sample
- Saml knoglemarv fra den femorale marvkanalen efter en total hoftealloplastik (for forskningsundersøgelser). Kort beskrevet under det kirurgiske forberedelse af marvkanalen til hOuse den protetiske stamceller, indsamle marv blod, der løber over (cirka 10 - 15 ml, afhængigt af protesen størrelse) 15.
ELLER - Saml knoglemarvsaspirat fra hoftebenskammen under lokalbedøvelse, efter standard hæmatologisk procedure omkring 20 - 30 d på forhånd (for kliniske anvendelser) 16.
BEMÆRK: I begge tilfælde hepariniserede sprøjter (for at forhindre koageldannelse) skal bruges til knoglemarv opsving.
2. Fremstilling af autologt plasma
- Saml 20 ml perifert blod fra patienten i opsamlingsrør vakuum blod indeholdende K3 EDTA (5,4 mg i 3 ml-rør) og centrifugeres ved 2.400 x g i 15 minutter.
- Aspirer plasma komponent i et 15 ml rør og nedfryses ved -20 ° C indtil brug.
3. Fremstilling af autologt serum
- Overfør enheden af plasma til en overførsel pose under anvendelse af en spike. Afbryd fyldte pose ved svejsning og Weigh posen til at beregne volumenet af plasma (figur 1A).
- Koagulering af autologt plasma ved at injicere calciumgluconat 100 mg / ml ved 10% vægt / volumen gennem porten (Figur 1B). Efter blanding i posen, placere den ved 4 ° CO / N uden omrystning for at lette koageldannelse.
- Centrifugeres posen ved 4.900 x g i 15 minutter ved stuetemperatur. Tag centrifuge spand ud af centrifugen og fjern posen forsigtigt (følg producentens retningslinjer for udarbejdelse af blodpladelysat) (figur 1C).
- Isoler blodproppen lige over klemmen for at lette filtrering. Slut filtrering kit til overførsel posen under anvendelse af en spids anbragt i udløbsporten af filtrering kit.
- Hæng posen og åbne det blå klemme til at lade serum flow ved hjælp af tyngdekraften. Må ikke lægge pres på filteret for at undgå overførsel af fibrin i posen. Efter filtrering, forsegle slangen og fjern posen (følg fremstiltens retningslinier for udarbejdelse af blodpladelysat).
- Tilslut en dedikeret linje til den endelige pose og overførsel serum i 50 ml rør under en laminar strømning bænk for at undgå mikrobiel kontaminering.
- Tag en prøve med en sprøjte for at teste fravær af fibrinogen og udføre en sterilitet test for aerobe og anaerobe bakteriekulturer 17. Mærk rørene hensigtsmæssigt og fryse dem ved - 20 ° C indtil brug.
4. Forberedelse af Expansion Medium
- Forbered 500 ml komplet proliferationsmedium. Til Dulbeccos Modified Eagle Medium - Lav Glucose (DMEM-LG), der tilsættes 10% autolog serum (opnået som beskrevet i afsnit 3), 2 mM glutamin, 1% antibiotisk opløsning, og 1% antimykotikum løsning. Sterilt filter det komplette proliferationsmedium.
5. Isolering af hMSC'er fra knoglemarven
- Overfør knoglemarven prøve (5 - 10 ml) fra sprøjten i en 50 ml konisk tuvære og fortynde det med sterilt saltvand (forhold 1: 4). Vortex 50 ml rør i 30 s at opdele cellen klynger.
- Opvarm densitetsgradient (densitet 1,077 g / l; se tabel of Materials) til stuetemperatur før brug og lag den fortyndede knoglemarven forsigtigt (for at undgå blanding begge lag) på tæthedsgradienten ved tilsætning af 20 ml af prøven til 15 ml densitet gradient for hver 50 ml rør (figur 2A).
- Der centrifugeres ved 400 x g uden bremse ved 25 ° C i 30 minutter, derefter indsamle den mononukleare fraktion ved væske-væske-grænsefladen og overføre det til en ny 50 ml glas med en steril 5 ml pipette.
- Vask det opsamlede mononukleær fraktion to gange med komplet medium proliferation og centrifugere rørene ved 400 x g i 10 minutter ved 25 ° C til opnåelse cellepellets.
- Supernatanten kasseres, og forsigtigt resuspender hver cellepellet i 5 ml komplet proliferationsmedium. Fortynd ved en 1: 100 ratio for celletælling.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer efter en 1: 1 fortynding med trypanblåt-farvning til at evaluere cellelevedygtighed.
6. Kultur af hMSC'er i overværelse af Autolog Serum
- Fyld to eller flere 75 cm2 vævskultur (TC) flasker med 15 ml frisk komplet proliferation medium og overføre dem til en cellekultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2, indtil brug.
- Seed 0.3 - 0,5 x 10 6 celler / cm2 (37,5 x 10 6 celler / 15 ml frisk komplet proliferation medium) og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 48 timer.
- Samtidig, seed 1 x 10 6 celler i en 25 cm2 TC kolbe med 5 ml frisk komplet proliferation medium til kolonidannende enhed - fibroblast (CFU-F) assay. Kultur i 2 uger (fortsættes i § 12).
- Kassér medium og forsigtigt vaske kolberne fra trin 6.2 med komplet spredning medium til remove adhærerende celler og debris. Tilføj frisk medium til kolberne og erstatte halvdelen af det to gange om ugen, i 70 - med 80% konfluens (primær kultur, passage 0 (P0)) (Figur 2B).
- Gendan cellerne ved hjælp af en specifik rekombinant dyr fri protease (se tabel Materialer, bruge 3 ml af opløsning pr kolben som anbefalet af producenten), og der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 10 min. Tilsæt 6 ml komplet proliferationsmedium pr kolbe og samles i en 50 ml rør. Gentag trin 5.6.
BEMÆRK: VIGTIGT: Brugen af denne protease i stedet for trypsin tillader inddrivelse af visse mesodermal stamfædre Cells (MPCS) til stede i kulturen, som er trypsin resistente. - For yderligere ekspansion, replate cellesuspensionen på 2.000 - 3.000 celler / cm2 i ny 75 cm 2 TC kolber (P1) (figur 2C).
- Anvendes delprøver af celler til at evaluere differentieringsfaktorer potentialer MSC'ermod osteogent, adipogenisk og chondrogene afstamninger. Udfør differentiering analyser efter producentens anbefalinger (Figur 2D).
BEMÆRK: Forskellige farvning metoder kan anvendes til at vurdere multilineage differentiering.
7. Udarbejdelse af et osteogent Medium med Farmaceutiske Kosttilskud
- Fortyndet ascorbinsyreopløsning (Opløsning 1A:. Ascorbinsyre 200 mg / ml (se tabel of Materials) 1:10 med DMEM-LG, for at opnå en 20 mg / ml opløsning (opløsning 1B, brugsopløsning) Stock alikvoter af opløsninger 1A og 1B ved -20 ° C indtil brug.
- Resuspender 1 g hydrocortison i 10 ml sterilt vand (Opløsning 2A: hydrocortison 100 mg / ml (se tabel of Materials) fortyndet opløsning 2A ved 1:. 1.000 med DMEM-LG til opnåelse af en 100 ug / ml opløsning (opløsning 2B, arbejder opløsning). Stock alikvoter af opløsninger 2A og 2B ved -20 ° C indtil brug.
- Ved brug prepare frisk osteogen medium som følger: tilføj DMEM-LG med 10% autologt serum, 50 pg / mL ascorbinsyre og 0,4 ug / ml hydrocortison. Sterilt filter den osteogene medium.
8. Osteogen Pre-induktion og Inddrivelse af hMSC'er
- Helt fjerne spredning medium og tilsæt osteogene medium 96 timer før celle høst (dvs. 80 - er 90% sammenløb normalt nås på 7 d). Giv en ekstra osteogent medium forandring 24 timer før celle høst.
- Frigøre celler som beskrevet i trin 6.5 og forsigtigt pellet resuspenderes tilsætte 2 ml komplet proliferation medium i et 50 ml rør.
BEMÆRK: Cellelevedygtighed kan nedsættes (ca. 10%) som følge af osteoinduktion. Cellulære aggregater kan observeres. - Efter optælling, vaske cellerne med komplet proliferationsmedium og centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Pellet resuspenderes forsigtigt til 1 - 2 x 10 6 levedygtige celler / 2ml autologt plasma (se afsnit 2) pr 50 ml rør.
9. Fremstilling af hMSC / fibrinkoagel-konstruktioner
- Tilføj 150 pi calciumgluconat ved 100 mg / ml til hver 50 ml rør opnået fra trin 8.3. og cellerne resuspenderes under forsigtig omrystning.
- Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i 15 - 30 min til opnåelse af hMSC / fibrinkoagel konstruktioner (figur 3A). Forbered et fibrinkoagel konstrukt uden celler til anvendelse som en kontrol.
BEMÆRK: VIGTIGT: Det anbefales at forberede denne kontrol blodprop mindst 2 h før celleviabilitetstest, som det tager 30 min eller mere for at tværbinde.
10. cellelevedygtighed Assay
- Fjern væsken fra 50 ml rør, og der tilsættes 1 ml komplet proliferation medium indeholdende 10% v / v cellelevedygtighed reagens (AB; se tabel of Materials), ifølge producentens anvisninger.
- inkuber the rør ved 37 ° C og 5% CO2 i 3 timer. Absorbansen ved 570 nm med en referencebølgelængde på 600 nm (AB ved tid 0; t0).
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 2 ml frisk komplet spredning medium. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N. Den næste dag (AB på tidspunkt 24 h T24) Gentag trin 10,1-10,3 (figur 3B).
11. histologisk bedømmelse af cellelevedygtighed og Calcium Deposition inde fibrinkoagel-konstruktioner
- Fastgør hMSC / fibrinkoagel konstruktioner i 4% vægt / volumen neutral bufret formalin O / N ved 4 ° C. Vask 4x i D-PBS i 15 minutter og butik i 70% ethanol.
- Dehydrere prøverne ved 40 ° C i en serie af gradueret ethanol: 80%, når i 30 min, 95% to gange i 45 minutter og 3 x 100% i 1 time. Præcisere to gange i xylen i 45 minutter ved 40 ° C.
- Skyl prøverne i flydende paraffin ved 60 ° C i 2 timer og indlejre dem. Skær paraffin blok med en mikrotom og montere than sektioner (5 um) på objektglas.
- Farv de afparaffinerede sektioner ved hjælp af standard Hematoxylin og eosin (H & E) metode (figur 3C).
- Udfør von Kossa-farvning ved behandling af sektioner med 1% sølvnitrat i 15 minutter, 0,5% Pyrogallol i 2 min, og 5% natriumthiosulfat i 2 min. Kontrastfarve afsnittene med 0,1% nuklear fast red fortyndet i en opløsning indeholdende 5 g aluminiumsulfat i 5 minutter og skyl dem i ledningsvand i 5 minutter. Monter sektionerne med et monterings middel.
- Vurdere mineral deposition som sorte granulat under lysmikroskop (400X forstørrelse) (Figur 3D).
12. CFU-F-assay
- 25 cm2 kolbe vaske (fra trin 6.3.) Med D, PBS. Farv ved hjælp af standard May-Grunwald / Giemsa-metoden. Visuelt kvantificere hMSC nummer ved at score individuelle kolonier (figur 4) under et lysmikroskop.
BEMÆRK: Hvisknoglemarven tages som i trin 1.2. og afsnittene 2 - 9 udføres i Good Manufacturing Practice (GMP) med den nødvendige myndighedsgodkendelse kan hMSC / fibrinkoagel konstruktioner implanteres til ortopædiske applikationer.
Representative Results
Fremstilling af autologt serum
Plasma koagulation, udført ved tilsætning af calciumgluconat til overførsel taske, tillader inddrivelse af autolog serum i store mængder, som kræves til hMSC kultur. Faktisk med denne teknik, er det muligt at opnå op til 200 ml af serum (figur 1).
HMSC isolation, kultur og differentiering ved hjælp autolog serum
Knoglemarv mononukleære celler isoleres under anvendelse af en densitetsgradient, hvilket giver anledning til en mellemring lag (figur 2A). Ved at udplade disse celler og fjerne de ikke-adhærerende dem med vask, er det muligt at isolere hMSC'er (figur 2B). Under autologe dyrkningsbetingelser, detekteres en delmængde af celler, kaldet Middelhavspartnerlandene, ved P0 og i procenter op to 10%, afhængig af patientens variabilitet (figur 2B). Middelhavspartnerlandene er stadig til stede efter genudplade (dvs. P1) hvis der anvendes proteasen til celle passage (figur 2C). hMSC'er isoleres og dyrkes i et autologt indstilling opretholde deres evne til at differentiere til de tre kendte mesodermale slægter (osteogen, adipogenisk, og chondrogene). Differentieringen assays blev udført for at sammenligne hMSC befolkning identitet med dem, der opnås ved anvendelse af standard (ikke-autologe) dyrkningsbetingelser. Som funktionalitet analyser for denne protokol, von Kossa farvning osmiumtetraoxid farvning, og Alcian blå farvning ved pH 1 blev valgt i stedet for dem, der foreslås af producenten af differentiering medier (se tabel of Materials) (figur 2D).
Forberedelse, levedygtighed og histologisk karakterisering af MSC / fibrinkoagel konstruktioner
(figur 3A). Inde i disse plasmaclots, de hMSC'er er levedygtige, hvilket fremgår af farveændringen af cellelevedygtigheden farvestof T24 fra blå (kontrol uden celler) til lyserød (cellularized størkne) (figur 3B). Cellelevedygtighed inde blodproppen bekræftes af H & E-farvning, som viser en velbevaret cellemorfologi (figur 3C). Desuden er en minimal osteoinduktion lige før den anden celle høst giver anledning til indledende calcium deposition ved stimuleret hMSC'er (figur 3D).
Kolonidannende enhed
Tilstedeværelsen af hMSC kolonier efter 2 uger i kultur er vist ved CFU-F-analysen (figur 4).
s = "jove_step" fo: holde-together.within-side = "1"> Anvendelse af MSC / fibrinkoagel konstruere i knogler ikke-union
HMSC / fibrinkoagel konstruktioner opnået som beskrevet i denne metode (trin 1.1) blev anvendt med succes til behandling af alvorlige øvre lemmer nonunions i 8 medfølende tilfælde 13. Langsigtet (højst 7,6 måneder) vurdering bekræftede succesfulde kliniske og funktionelle resultater for alle patienter, uden tegn på væv overvækst eller tumordannelse.
Figur 1. Fremstilling af autologt serum.
(A) plasma enhed overføres i en overførsel pose ved hjælp af piggen; (B) Plasmaet koaguleret ved at indsprøjte calciumgluconat gennem porten stik; (C) En blod-pose centrifuge anvendes til at adskille serummet./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. hMSC Isolering, Kultur og differentiering ved hjælp Autolog Serum.
(A) De mononukleare cellelag (i vinduet blå linie) opnået efter knoglemarv centrifugering med en densitetsgradient; (B) Den cellekultur, som det vises på P1; (C) Celledyrkning, som det vises på P0 (primær kultur); (B - C) pile viser tilstedeværelse af Middelhavspartnerlandene i MSC kultur. Scale bar er 100 pm; (D) Histokemiske resultater af multilineage differentieringsfaktorer assays. Osteogen differentiering vurderes ved hjælp af von Kossa farvning for mineralsk matrix aflejring i sort, adipogenisk differentiering er vist ved tilstedeværelsen af fedtstoffer vakuoler, farvet i sort ved osmium tetroxide, og chondrogen differentiering vises ved tilstedeværelsen af sulfaterede glycosaminoglycaner, der er farvet i cyan ved Alcian Blue-farvning ved pH 1. Scale bar er 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Forberedelse, levedygtighed og Histologisk Karakterisering af MSC / fibrinproppen konstruktioner.
(A) hMSC / fibrinkoagel-konstruktion som den ser ud efter tværbinding; (B) Resultater af AB-assay: MSC'erne er levedygtige inde fibrinkoagel, som demonstreret ved farveændring af cellelevedygtigheden farvestof (T24), fra blå (kontrol uden celler, til højre) til lyserød (cellularized blodprop, om venstre). (C - D) Histokemiske resultater af hMSC / fibrinkoagel konstruktioner. Scale bar er50 um. (C) hematoxylin og eosin-farvning viser levedygtige celler indlejret i fibrin matrix; (D) Mineral matrix deposition farvet i sort ved von Kossa farvning, hvilket bekræfter en indledende osteogenesis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. CFU-F-analysen.
Billede af en kolbe dyrket med hMSC'er farvet af May-Grunwald / Giemsa-metoden. Den zoomet-in området er en lys-mikrograf viser morfologi en hMSC koloni. Scale bar er 100 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Anvendelse af hMSC / fibrin Clot Construct i Bone manglende opheling.
(A) X-ray af den øverste led af en patient ramt af Pseudartrose; (B) hMSC / fibrinkoagel konstrukt lige før implantation; (C) Kirurgisk anvendelse af hMSC / fibrinkoagel konstrukt; (D) X-ray af den øverste del af det samme patient efter 5 år. Dette tal er genudgivet fra Giannotti S. et al. med minimale ændringer 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
De kritiske trin i denne protokol vedrører brugen af voksent menneske serum og protease, som gør det muligt at opnå en BIOSAFE hMSC terapi. Især voksent menneske serum muliggør isolation og vedligeholdelse, mens protease sikrer høsten, af Middelhavspartnerlandene. Disse er umodne celler til stede i knoglemarven, der kan give anledning til nye hMSC'er, hvilket sikrer et reservoir af levedygtige hMSC'er langs dyrkningstid. Ikke alle Middelhavspartnerlandene kan opsamles, da øge eksponeringen tid til protease aktivitet er til skade for hMSC levedygtighed. Af denne grund blev en 10 min protease inkubation valgt som optimal kompromis mellem genopretning af Middelhavspartnerlandene og levedygtigheden af hMSC'er. Et andet afgørende skridt er osteodifferentiation tid. Faktisk ville en omfattende in vitro osteodifferentiation betydeligt reducere cellernes levedygtighed, hvilket påvirker den endelige knogledannelse in vivo. Det sidste kritiske trin består i benytter af en autolog bioresorberbart stillads, which opnås ved indlejring af cellerne (hMSC'er og MPCS) i en fibringel fra plasma koagulation.
Et vigtigt skridt til at forøge udbyttet af Middelhavspartnerlandene er at frø mononukleære celler ved højere koncentration. Under anvendelse afereseprocedurer at opnå plasma og behandle det med calciumgluconat gør det muligt at opnå autologt serum i store mængder. Det er blevet observeret, at humant serum som medium supplement er sammenlignelig med føtalt bovint serum (FBS) i hMSC-kulturer. Men vores erfaring, et komplet medium suppleret med FBS bidrager til hurtigere ældning end voksne mennesker serum,. Et vigtigt skridt er at administrere en minimal osteoinduktion til hMSC'er. Faktisk har denne behandling fører cellerne til nemt differentiere mod osteogene afstamning, således er nyttigt at undgå yderligere celletransformation in vivo. For at opretholde en god levedygtighed minimalt osteoinduced hMSC'er, anbefales det at følge nøje anbefalingerne beskrevet i trin 6.5. end 8.2., herunder håndtering, centrifugering og mellemstore beløb, der skal tilføjes. Hvis en aferese procedure ikke er tilgængelig, er det stadig muligt at udføre denne protokol ved at udføre flere blod trækker til patienten eller, alternativt, ved at købe samlet AB sera. , For at bringe denne protokol fra bænken-til-seng, er naturligvis det obligatorisk at have GMP cellefabrikker, eller ækvivalenter, til rådighed.
Begrænsninger for anvendelsen af denne teknik vedrører anæmiske, hæmatologiske-onkologi og ortopædiske patienter ramt af osteomyelitis., Tegning store mængder blod fra anæmiske patienter, bør undgås. I onkologiske patienter, er kvaliteten af celleprøver påvirket af kemoterapi behandlinger, mens infektion hos osteomyelitis patienter kan påvirke det endelige resultat. I alle de tilfælde, hvor den autologe serum er utilstrækkelig eller uegnet, samlet mandlige AB sera repræsenterer et godt alternativ.
Brug af celle / fibrin clot konstruktioner til mulige kliniske anvendelser er afgørende at frigive en helt autolog celleterapi, som kunne være let at håndtere og skimmel under kirurgi, hvilket resulterer i fremragende resultater til behandling af knogle manglende opheling 13. For kliniske formål, er hMSC'er normalt administreres via to procedurer: minimal manipulation og omfattende manipulation 9. For at overvinde problemerne i forbindelse med en omfattende ex vivo kultur, såsom abnormiteter i cellemorfologi og størrelse 18, udførte vi en kort tid ex vivo celle ekspansion og osteo-differentiering (kun 4 d).
Det xeno-fri protokollen beskrevet i dette papir, sammen med de korte celle ekspansion og osteodifferentiation gange, vist sig at være relevant i klinikker for at opnå hurtig knogle produktion in vivo, uden tegn på væv overvækst og transformation, hvilket bekræfter dets effektivitet og lang -term sikkerhed i knoglereparation (figur 5) 13.
Metoden præsenteres i denne rapport til formål at dokumentere effekten og sikkerheden af hMSC in vitro ekspansion i autologe betingelser for eventuel anvendelse i ortopædisk kirurgi. Denne protokol beskæftiger hMSC'er isoleret fra knoglemarv og dyrkes i et medium suppleret med autologt serum og indlejret i autolog fibrinkoagel, hvilket sikrer en fuldstændig autolog celleterapi. Det dobbelte osteogen induktion, lige før den anden løsrives, forbedrer hMSC evne til at differentiere til osteoblaster. Som følge heraf er denne teknik er særlig egnet til anvendelser i knogledefekter, eftersom den ikke er begrænset til Pseudartrose. Mulige fremtidige applikationer kan indebære talus cyste og knogletab management.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
| Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| DMEM-LG, no glutamine, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
| Glutamax (100x) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
| Penicillin/Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
| Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
| D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
| StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
| StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
| hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
| Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
| Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
| Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
| Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
| Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
| Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
| Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
| Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
| Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
| Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
| DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
| Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
| Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
| Microtome | Leika | histological assay | |
| May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
| Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
| Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
| Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
| Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
| Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
| Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
| Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
| Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
| SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |
References
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).
- Kassem, M., Abdallah, B. M. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases. Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo. J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).
- Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery. Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).
- Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).
- Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery. Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).
- Jockenhoevel, S., et al. Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).
- Veronesi, F., et al. Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease. Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Trombi, L., et al. Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing. J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).
- Giannotti, S., et al. Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment. PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).
- Castano-Izquierdo, H., et al. Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential. J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).
- Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. Orthopaedics. , Mosby. St. Louis, MO. Chapters 86-87 (2002).
- Lee, S. H., et al. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).
- Bugno, A., et al. Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products. Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cells in vitro. BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).
