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Genetics

पालन ​​और मिटायें बीटल में डबल असहाय शाही सेना की मध्यस्थता जीन पछाड़ना, Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Summary

यहाँ, हम प्रयोगशाला में एक मध्यवर्ती रोगाणु बीटल, Dermestes maculatus (डी maculatus) के पालन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम भी इस प्रजाति में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए भ्रूण phenotypes विश्लेषण करने के लिए भ्रूण और माता पिता का आरएनएआई के लिए प्रोटोकॉल और तरीकों का हिस्सा है।

Introduction

1998 में, आग और मेलो की रिपोर्ट है कि डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) Caenorhabditis एलिगेंस 1 में जीन समारोह के निषेध के लिए प्रेरित कर सकते हैं। DsRNA से शुरू हो रहा यह प्रतिक्रिया शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) नामित किया गया था, और जैसे आरएनएआई की मध्यस्थता जीन मुंह बंद जानवरों, पौधों, और कवक 2-7 में संरक्षित करने की सूचना मिली थी। पौधों और कुछ पशुओं में, आरएनएआई कार्यों प्रणालीबद्ध, जिसका अर्थ है प्रभाव अन्य कोशिकाओं / ऊतकों जहां dsRNA सीधे नहीं शुरू की है (8-10 में समीक्षा) में फैल सकता है। वैज्ञानिकों ने ब्याज की जीन को लक्षित करने के dsRNAs डिजाइन द्वारा इस अंतर्जात सेलुलर आरएनएआई प्रतिक्रिया का इस्तेमाल किया है, जिससे सीधे जीनोम (11-14 में समीक्षा) से छेड़छाड़ के बिना जीन समारोह नीचे दस्तक।

आरएनएआई निम्नलिखित लाभ के कारण कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। पहला, यहां तक ​​कि कम से कम जीन अनुक्रम जानकारी के साथ एक जीन आरएनएआई का उपयोग कर निशाना बनाया जा सकता है। यह अनुसूचित जनजाति के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैगैर-मॉडल जीवों जीनोमिक या transcriptomic डेटा की कमी के udies। दूसरा, जीवों जहां आरएनएआई प्रतिक्रिया मजबूती के साथ प्रणालीगत है, आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना लगभग किसी भी विकास के चरण में किया जा सकता है। यह सुविधा pleiotropic जीन के समारोह के अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी है। तीसरा, कुछ मामलों में, आरएनएआई प्रभाव gonads और संतान, ऐसा है कि phenotypes संतानों 15,16 में मनाया जाता है में फैल गया। यह घटना, माता पिता का आरएनएआई (pRNAi) के रूप में जाना जाता है, के रूप में एक ही इंजेक्शन माता-पिता द्वारा उत्पादित कई संतानों अंडे के प्रत्यक्ष हेरफेर के बिना जांच की जा सकती भ्रूण के विकास को प्रभावित जीनों के लिए विशेष रूप से फायदेमंद है। इन कारणों के लिए, pRNAi पसंद की विधि है। हालांकि, अगर pRNAi अप्रभावी है, oogenesis के लिए आवश्यक जीन के लिए उदाहरण के लिए, तो भ्रूण आरएनएआई (eRNAi) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। चौथा, आरएनएआई मजबूत दोषों को कमजोर उत्पादन करने के लिए है कि एक allelic श्रृंखला dsRNA की राशि वितरित एक सीमा से अधिक अलग किया जा सकता है के बराबर उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। phenotypes के इस तरह के एक उन्नयन जीन समारोह को समझने जब जीन एक जटिल प्रक्रिया है और / या समारोह का पूरा नुकसान में शामिल है घातक है के लिए सहायक हो सकता है। पांचवां, dsRNA के वितरण के लिए विशेष रूप से मजबूत प्रणालीगत आरएनएआई की प्रतिक्रियाएं दिखा पशुओं में, आम तौर पर आसान है और संभव है। dsRNA microinjection 1,5, खिला / घूस 17,18, भिगोने, 19,20 और वायरस / बैक्टीरिया की मध्यस्थता वितरण 21,22 द्वारा शुरू की जा सकती है। छठी, कुछ जीन लक्ष्यीकरण / संपादन विधियों के विपरीत, वहाँ उत्परिवर्तन ले जीवों के लिए स्क्रीन करने के लिए या आनुवंशिक पार जब आरएनएआई का उपयोग कर समयुग्मज उत्पन्न करने के लिए बाहर ले जाने की कोई जरूरत नहीं है। इसलिए, जीन समारोह के अध्ययन के लिए कई अन्य तकनीकों की तुलना में, आरएनएआई तेज, सस्ती है, और बड़े पैमाने पर स्क्रीन 23-25 के लिए आवेदन किया जा सकता है।

आरएनएआई की व्यापक उपयोगिता beyon अध्ययन के लिए उपलब्ध प्रजातियों की रेंज का विस्तार, जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में कार्यात्मक अध्ययन बाहर ले जाने के लिए साधन प्रदान करता हैपारंपरिक मॉडल प्रणाली है जिसके लिए आनुवंशिक उपकरण विकसित किया गया है घ। उदाहरण के लिए, गैर मॉडल प्रणाली का उपयोग अध्ययन विभिन्न विकास मोड का प्रतिनिधित्व करने या अलग रूपात्मक सुविधाओं 26-29 प्रदर्शन प्रजातियों से orthologs के कार्यों की तुलना द्वारा जीन और जीन नेटवर्क के विकास में अंतर्दृष्टि देने के लिए आवश्यक हैं। अध्ययन के इन प्रकार के जैविक विविधता का एक बेहतर समझ प्रदान करेगा, दोनों एप्लाइड और बुनियादी अनुसंधान के लिए प्रभावों के साथ।

ग्रह पर सबसे बड़ा पशु समूह होने के नाते, कीड़े अंतर्निहित तंत्र विविधता का पता लगाने के लिए एक महान अवसर प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, कीड़े आम तौर पर छोटे हैं, कम जीवन चक्र, उच्च उपजाऊपन है, और प्रयोगशाला में पीछे करने के लिए आसान कर रहे हैं। पिछले दो दशकों में, आरएनएआई सफलतापूर्वक आदेशों फैले, Diptera (सच मक्खियों) 5, Lepidoptera (तितलियों और कीटों), 30 सहित कीड़ों में लागू किया गया है, Coleoptera (बीटल) 16,31, कलापक्ष (sawfझूठ, ततैया, चींटियों और मधुमक्खियों) 32, Hemiptera (सच कीड़े), Isoptera (दीमक) 34, Blattodea (तिलचट्टे) 35, ऋजुपक्ष कीटवर्ग (क्रिकेट, टिड्डे, टिड्डियां, और katydids) 36 और Phthiraptera (जूँ) 37। आरएनएआई के सफल आवेदन जल्दी embryogenesis में patterning के अध्ययन के लिए कार्यात्मक डेटा (पूर्वकाल पीछे अक्ष 32, पृष्ठीय उदर अक्ष 28, विभाजन 26,38), लिंग निर्धारण 39,40, काइटिन / छल्ली जैवसंश्लेषण 41 प्रदान की गई है, ecdysone 42 सिगनल, सामाजिक व्यवहार 43, और अधिक। विभिन्न कीट प्रजातियों के लिए विकसित आरएनएआई तरीकों अतिरिक्त लाभ यह है कि वे कीट नियंत्रण (44-46 में समीक्षा) के लिए उपयोगी होने की संभावना है हो सकता है। आरएनएआई प्रभाव जीन विशिष्ट के साथ-साथ प्रजाति विशेष के लिए किया जाएगा, जब तक कि गैर संरक्षित क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए चुना जाता है। मधुमक्खियों और कीड़ों की तरह लाभकारी कीट प्रजातियों, लक्षित करने के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण जीनों के लिएवायरस या परजीवी संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए इन प्रजातियों 47,48 रक्षा के लिए एक उपन्यास रणनीति प्रदान कर सकता है।

Dermestes maculatus (डी maculatus), आम का नाम छिपाने बीटल, अंटार्कटिका को छोड़कर दुनिया भर में वितरित किया जाता है। एक holometabolous कीट के रूप में, डी maculatus जीवन चक्र भ्रूण, लार्वा, पोटा संबंधी, और वयस्क चरणों (चित्रा 1) शामिल हैं। यह शरीर पर खिलाती है क्योंकि, डी maculatus मरे हुए जानवरों पांडुलेख करने के लिए संग्रहालयों में प्रयोग किया जाता है और फॉरेंसिक entomologists मौत 49,50 के समय का अनुमान लगाने के लिए इसका इस्तेमाल कर सकते हैं। डी maculatus शवों, सूखे मांस, पनीर, और pupae / अन्य कीड़ों के ककून सहित पशु उत्पादों पर खिलाती है और इस तरह के परिवारों को नुकसान, संग्रहीत भोजन, और रेशम, पनीर, मांस और उद्योगों 51,52 कारण बनता है। इस बीटल में आरएनएआई को लागू करने में अपनी आर्थिक प्रभाव को कम करने के लिए एक कुशल और पर्यावरण के अनुकूल तरीके प्रदान कर सकता है। हमारी प्रयोगशाला में एक नया मीटर के रूप में डी maculatus इस्तेमाल किया गया हैOdel कीट विभाजन 53 अध्ययन करने के लिए। प्रयोगशाला के पालन करने के लिए उत्तरदायी होने के अलावा, डी maculatus के रूप में यह एक मध्यवर्ती रोगाणु डेवलपर है, यह एक उपयोगी प्रजातियों बनाने छोटी और लंबी रोगाणु विकास के बीच संक्रमण का अध्ययन करने के लिए बुनियादी अनुसंधान के लिए ब्याज की है।

आकृति 1
चित्रा 1: डी maculatus के जीवन चक्र। विभिन्न चरणों में जीवन डी maculatus के फोटोग्राफ, के रूप में संकेत दिया। वयस्क के लिए अंडे से जीवन चक्र कम तापमान पर 30 डिग्री सेल्सियस पर तीन सप्ताह लेकिन अब लगता है। (ए, एफ) हौसले रखी भ्रूण हल्के पीले रंग और अंडाकार, लंबाई में लगभग 1.5 मिमी के लिए सफेद होते हैं। Embryogenesis लेता है ~ 30 डिग्री सेल्सियस पर 55 घंटा। (बी, सी और जी) लार्वा अंधेरे pigmented धारियों और setae के साथ कवर किया जाता है। लार्वा पर्यावरण और उनकी लंबाई के आधार पर कई instars के माध्यम से जाने पर 1 सेमी तक विस्तार कर सकते हैं। (डी, एच) (ई, मैं) eclosion के फौरन बाद, अंधेरे रंजकता वयस्क बीटल शरीर पर प्रकट होता है। वयस्क कई महीनों तक रह सकते हैं और एक महिला उसकी जीवन भर से अधिक भ्रूण के सैकड़ों रखना कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इससे पहले, हम पता चला कि आरएनएआई डी maculatus 53 में जीन समारोह नीचे दस्तक करने में प्रभावी है। यहाँ हमारे अनुभव प्रयोगशाला में डी maculatus कालोनियों पालन दोनों भ्रूण और माता पिता का आरएनएआई सेट-अप, इंजेक्शन, बाद इंजेक्शन की देखभाल, और प्ररूपी विश्लेषण के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल के साथ साझा किया जाता है। यहां पेश dsRNA की मध्यस्थता जीन पछाड़ना और विश्लेषण के तरीकों न केवल डी maculatus में प्रश्नों के समाधान के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी के लिए संभावित महत्व हैआर अन्य गैर-मॉडल बीटल / कीट प्रजातियों में आरएनएआई आवेदन।

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Protocol

1. डी maculatus के पालन

नोट: डी maculatus की एक प्रजनन कॉलोनी वयस्कों का उपयोग करते हुए 'लेखक प्रयोगशाला में स्थापित किया गया था और लार्वा व्यावसायिक रूप से खरीदा है। प्रजातियों की पहचान के लिए डीएनए बारकोडिंग 53 का उपयोग कर सत्यापित किया गया था।

  1. प्रयोगशाला में एक नया पिंजरे की स्थापना करने के लिए, एक मध्यम आकार के कीट पिंजरे (30.5 x 19 x 20.3 सेमी 3) में लकड़ी की छीलन की एक पतली परत फैल गया। स्टायरोफोम की एक ~ 10 एक्स 6 एक्स 3 सेमी 3 हिस्सा पिंजरे में जगह pupation के लिए लार्वा छिपाने के लिए करते हैं। 50 बीटल (या तो वयस्कों या देर instar लार्वा) - 20 जोड़ें। बीट्लस लकड़ी छीलन में छिपा होगा।
  2. एक पेट्री डिश या एक वजन नाव में गीला बिल्ली का खाना जोड़ें। जाल कपड़ा के साथ पिंजरे कवर और एक मशीन में पिंजरे जगह है।
  3. प्रयोगशाला में एक प्रजनन कॉलोनी को बनाए रखने के लिए, 25 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान निर्धारित किया है। डी maculatus तेजी से उच्च तापमान पर बढ़ता है, लेकिन यह भी कवक और कण के विकास को बढ़ावा देता है। बनाए रखने के लिए एक चंगातेजी से कॉलोनी के विस्तार के लिए नियमित रूप से स्टॉक रखरखाव और 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 28 डिग्री सेल्सियस - तेरी कॉलोनी, 25 का उपयोग करें। जीवन चक्र पर्यावरणीय कारकों 50 (चित्रा 2) के आधार पर चार महीने के लिए लगभग तीन सप्ताह लगते हैं।

चित्र 2
चित्रा 2: डी maculatus लैब कॉलोनी। एक ठेठ डी maculatus कीट पिंजरे की तस्वीर में दिखाया गया है। लकड़ी छीलन बीटल छिपाने जाने के लिए फैले हुए हैं। बिल्ली का खाना एक छोटा सा पेट्री डिश या वजन नाव में जोड़ा जाता है। स्टायरोफोम अंतिम instar लार्वा पोटा बना जाना करने के लिए एक शरण के रूप में पिंजरे में रखा गया है। पिंजरे यहाँ दिखाया 30.5 x 19 x 20.3 सेमी 3 है और घरों में कुछ सौ लार्वा, प्यूपा, और वयस्कों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. घास का मैदानपिंजरे में परिपक्व करने के लिए अंडे किया है। कॉलोनी का विस्तार करने के लिए, लार्वा, या वयस्कों (धारा 2 में वर्णित के रूप में एकत्र), जैसा कि ऊपर अंडे के साथ नए पिंजरों की स्थापना। डी maculatus विशेष रूप से खाद्य स्रोत के पास पिंजरे में अंडे देते हैं।
  2. सप्ताह में दो बार के बारे में गीला बिल्ली का खाना बदलें।
    नोट: कारण गीला बिल्ली भोजन की अप्रिय गंध करने के लिए, वैकल्पिक भोजन सूत्रों ने यह भी परीक्षण किया गया (चर्चा देखने के लिए)।

2. भ्रूण संग्रह

  1. एक संग्रह की स्थापना करने के लिए, अलग कम से कम 50 पुरुषों और 50 महिलाओं कॉलोनी से। युवा वयस्कों के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं। एक मिनी आकार पिंजरे (17.8 x 10.2 x 12.7 सेमी 3) लकड़ी छीलन बिना प्लेस में वयस्कों। एक वजन नाव में बिल्ली का खाना जोड़ें।
  2. संग्रह शुरू करने से पहले, किसी भी उपस्थित भ्रूण के लिए ध्यान से पिंजरे की जाँच करें और उन्हें हटा दें। पिंजरे में एक बढ़ाकर कपास की गेंद रखो, और एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पिंजरे में छोड़ दें। उचित समय खिड़की के बाद कपास की गेंद भ्रूण संग्रह के लिए तैयार हो जाएगा।
  3. तहछमाही में काले निर्माण कागज (ए 4 आकार) का एक टुकड़ा एक क्रीज बनाने के लिए, और फिर प्रकट करना।
  4. पिंजरे से बढ़ाकर कपास की गेंद निकालें। कपास की गेंद से वयस्कों निकालें और पिंजरे में उन्हें वापस डाल दिया।
  5. बढ़ाकर कपास की गेंद बन्द रखो जबकि बहुत धीरे, धीरे-धीरे यह अलग आंसू पतले सूती तंतु में अंडे काले कागज पर गिर जाने के लिए।
    ध्यान दें: डी maculatus भ्रूण नाजुक है और कपास में देखने के लिए मेहनत कर रहे हैं। वे आसानी से अगर बहुत मजबूती से कपास की गेंद पकड़े कुचल दिया जा सकता है।

3. dsRNA तैयारी

  1. DsRNA संश्लेषण के लिए डीएनए खाका तैयार
    1. भागो 4 - दोनों 5 पर T7 प्रमोटर दृश्यों से युक्त प्राइमरों का उपयोग 6 50 μl पीसीआर प्रतिक्रियाओं 'निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए टेम्पलेट बढ़ाना समाप्त होता है।
    2. पीसीआर उत्पाद एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धि किट, निर्माता के निर्देशों का पालन उपयोग कर शुद्ध। डीएनए टेम्पलेट का आदर्श अंतिम एकाग्रता ≥ है100 एनजी / μl।
  2. इंजेक्शन बफर तैयारी
    1. इंजेक्शन बफर के 100 मिलीलीटर की तैयारी (0.1 मिमी नः 2 पीओ 4, 5 मिमी KCl)। 5 एम NaOH के साथ 6.8 पीएच को समायोजित करें।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots।
  3. dsRNA संश्लेषण
    1. बर्फ पर एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में एक प्रतिक्रिया सेट अप और T7 पोलीमर्स, निर्माता के निर्देशों का पालन के साथ इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले, का उपयोग कर ~ प्रतिक्रिया प्रति 500 एनजी टेम्पलेट।
    2. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन DNase के साथ डीएनए टेम्पलेट को पचाने।
    4. 94 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब गर्मी और 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    5. dsRNA पानी रखना करने के लिए, धीरे से 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट से ट्यूब शांत जब तक यह 1 घंटे के बाद 45 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है।
      नोट: कदम 3.3.2 3.3.5 के माध्यम से एक thermocycler में प्रदर्शन किया जा सकता है।
    6. dsRNA का वेग इथेनॉल के लिए, 280 μl जोड़नेप्रतिक्रिया के RNase मुक्त पानी के लिए 20 μl 300 μl के अंतिम मात्रा को समायोजित करने के लिए। 3 एम NaOAc (पीएच 5.2) और इथेनॉल के 650 μl के 30 μl जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूब रात भर रखें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,682 XG पर centrifuging के बाद, 70% इथेनॉल के साथ dsRNA गोली धोने। सूखी गोली और इंजेक्शन बफर μl 20 में भंग।
    8. DsRNA की एकाग्रता एक 260 पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग उपाय। 5 माइक्रोग्राम / μl - आदर्श एकाग्रता 3 है। 30 मिनट के लिए 90 वी में एक 1% agarose जेल पर dsRNA की एक 1:25 कमजोर पड़ने के 5 μl चलाने के द्वारा गुणवत्ता की जाँच करें। उम्मीद आकार के एक एकल बैंड आसानी से देखा जा सकेगा।
    9. -20 डिग्री सेल्सियस या ठंडा पर dsRNA स्टोर।
      नोट: हर आरएनएआई पछाड़ना प्रयोग के लिए, एक नियंत्रण dsRNA, जो इस प्रक्रिया अध्ययन किया जा रहा प्रभावित करने की उम्मीद नहीं की होगी शामिल हैं। GFP dsRNA सबसे प्रयोगों के लिए एक उत्कृष्ट नियंत्रण है। तैयार है और experime के साथ नियंत्रण dsRNA पक्ष द्वारा साइड इंजेक्षनntal dsRNA।

4. microinjector और micromanipulator के विधानसभा

ध्यान दें: चित्रा 3 देखें।

  1. एक साँस पंप साधन के दबाव निवेश करने के लिए नाइट्रोजन या अन्य हवा की आपूर्ति कनेक्ट करें। एक साँस पंप उपलब्ध नहीं है, तो एक 50 मिलीलीटर ठीक ट्यूबिंग से जुड़े सिरिंज का उपयोग कर दबाव लागू होते हैं।
  2. पंप बेदखल दबाव प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए दूरदराज के कनेक्टर के लिए एक पैर स्विच कनेक्ट करें।
  3. ट्यूब के साथ पंप के बेदखल दबाव बंदरगाह के लिए एक गिलास केशिका धारक संलग्न।
  4. एक micromanipulator एक विदारक माइक्रोस्कोप के करीब पर केशिका धारक को ठीक करें।

5. भ्रूण आरएनएआई

नोट: चित्रा 4 डी maculatus भ्रूण आरएनएआई की एक फ़्लोचार्ट पता चलता है।

  1. eRNAi तैयारी
    1. एक भ्रूण पेट्री डिश ढक्कन (90 मिमी व्यास) इकट्ठा करने को तैयार है। सी के लिए काला फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखेंढक्कन के अंदर खत्म हो गया। काले कागज पर एक मानक खुर्दबीन स्लाइड रखो।
    2. इंजेक्शन बफर के साथ उचित एकाग्रता के लिए dsRNA पतला। 3 माइक्रोग्राम / प्रारंभिक प्रयोगों के लिए μl - 2 का प्रयोग करें। हमेशा इंजेक्शन से पहले बर्फ पर dsRNA रहते हैं।
    3. मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए dsRNA और पिपेट धीरे कई बार 01:40 कमजोर पड़ने पर खाद्य रंग जोड़ें।
  2. इंजेक्शन के लिए एकत्रित भ्रूण
    नोट: 25 डिग्री सेल्सियस पर, भ्रूण 6 में नाभिक - 8 घंटे अंडे बिछाने के बाद (AEL) 53 परिधि अंडे की ओर पलायन। 10 घंटा AEL 53 - एक सेलुलर blastoderm 8 के भीतर स्थापित है। यह सुनिश्चित करने के लिए सेलुलर blastoderm चरण से पहले भ्रूण, इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल को 0 - 3 घंटा AEL भ्रूण उपयोग 53 के लिए सिफारिश कर रहे हैं। भ्रूण संग्रह, तैयारी, और इंजेक्शन आम तौर पर कम से कम 2 घंटा ले अगर कांच केशिकाओं अच्छी हालत में हैं। इसलिए, पूरी प्रक्रिया 5 घंटा AEL के भीतर पूरा किया जा सकता है।
    1. चरणों में वर्णित के रूप में भ्रूण लीजिए 2.2-2.5।
    2. काले निर्माण कागज पेट्री डिश ढक्कन संग्रह में भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए टैप करें।
    3. स्लाइड की बढ़त के साथ दो तरफा टेप चिपका।
    4. एक पेंट ब्रश का प्रयोग, पूर्वकाल या किनारे पर पीछे अंत के साथ स्लाइड किनारे करने के लिए सीधा टेप पर भ्रूण संरेखित। ध्यान दें कि जल्दी भ्रूण के पूर्वकाल और कूल्हों समाप्त होता है आसानी से अलग पहचाना नहीं कर रहे हैं, इस प्रकार औसतन आधा पीछे अंत जो आदर्श है पर इंजेक्ट किया जाएगा।
  3. गिलास केशिका में dsRNA लोड हो रहा है
    1. एक 20 μl microloader विंदुक टिप में dsRNA के 4 μl - 2 हाथ में ले लिया।
    2. एक पूर्व खींच लिया गिलास केशिका में टिप डालें (सुई के रूप में) और धीरे केशिका में dsRNA समाधान पिपेट। एक micropipette खींचने का उपयोग वाणिज्यिक कांच केशिकाओं से सुई तैयार करें। एक आदर्श खींच लिया सुई का एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है। लंबाई और सुइयों की घटना वायुसेना अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती हैआतंकवाद इंजेक्शन परीक्षण।
    3. कांच केशिका धारक में कांच केशिका को ठीक करें।
    4. micromanipulator में केशिका धारक इकट्ठा करो।
  4. भ्रूण में dsRNA इंजेक्शन
    1. ध्यान से विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर भ्रूण के साथ स्लाइड हस्तांतरण।
    2. क्षेत्र और ध्यान माइक्रोस्कोप के केंद्र के लिए एक भ्रूण लाने के लिए स्लाइड ले जाएँ।
    3. micromanipulator के साथ केशिका के टिप स्थिति जबकि विदारक माइक्रोस्कोप में देख रहे हैं। टिप पंक्ति में पहले भ्रूण के अंत के करीब लाने के लिए।
    4. नाइट्रोजन या अन्य हवा की आपूर्ति पर स्विच।
    5. वैक्यूम करने के लिए solenoid इनपुट चयनकर्ता स्विच सेट करें।
    6. 15 साई - 10 को बेदखल दबाव नियामक को समायोजित करें। तंत्र के आधार पर दबाव को समायोजित करें।
    7. केशिका खोलें यदि आवश्यक है। एक बार नोक खुला है, रंग का dsRNA समाधान टिप भरना होगा।
    8. ई पंचर करने के लिए आगे केशिका टिप चालMbryo। अगर दबाव सेटिंग आदर्श है, कोई भ्रूण तरल पदार्थ केशिका में बहेगा।
    9. भ्रूण में dsRNA समाधान बेदखल करने के लिए जब तक समाधान का एक उचित मात्रा अलग हो जाता है पैर स्विच पर कदम। चित्रा 5 भ्रूण आकृति विज्ञान के उदाहरण के बाद समाधान का उचित और अनुचित मात्रा में इंजेक्शन दिया गया है पता चलता है।
    10. ~ 2 सेकंड के लिए भ्रूण के अंदर केशिका टिप रखें, और फिर इसे हटा दें।
    11. अगले भ्रूण को केशिका ले जाएँ और दोहराने कदम 5.4.8 - 5.4.10 तक सभी भ्रूण इंजेक्ट कर रहे हैं। कांच केशिका परिवर्तन यह भरा हुआ या टूट जाता है, तो हो जाता है।
  5. बाद इंजेक्शन वसूली और ऊष्मायन
    1. इंजेक्शन के बाद, एक पेट्री डिश में स्लाइड जगह।
    2. पेट्री डिश के लिए एक गीला कपास की गेंद जोड़ें। कपास की गेंद स्लाइड को छूने मत देना।
    3. पेट्री डिश कवर और फिल्म सील के साथ लपेट। dsRNA, एकाग्रता, तारीख, समय, और इंजेक्शन की संख्या के नाम के साथ पकवान लेबलभ्रूण।
    4. एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर भ्रूण हैच तक में पेट्री डिश रखें।

6. माता पिता का आरएनएआई

  1. PRNAi के लिए Pupae अलग
    1. कॉलोनी से pupae लीजिए।
    2. क्रमबद्ध पुरुष और माइक्रोस्कोप के तहत महिला pupae (चित्रा 6 देखें)। उन्हें एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में दो अलग-अलग पेट्री डिश में रखें कि यह सुनिश्चित करने के लिए कोई संभोग के इंजेक्शन से पहले होता है।
    3. eclosed वयस्कों के लिए हर दिन की जाँच करें। 30 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिन - pupation आमतौर पर 5 लेता है।
    4. स्थानांतरण eclosed पुरुषों और महिलाओं के दो अलग-अलग पेट्री डिश (चित्रा 6 देखें) और उन्हें हर दूसरे दिन बिल्ली का खाना खिलाने के लिए जब तक वे इंजेक्शन के लिए तैयार हैं।
    5. इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ें एक बार वहाँ पर्याप्त महिलाओं और उचित उम्र में पुरुष हैं। महिलाओं 4 से 8 दिनों के बाद eclosion अच्छा कर रहे हैं। एक ठेठ विश्लेषण के लिए, 8 - 12 महिलाओं का इस्तेमाल किया जाता है। पुरुषों की संख्या बराबर 54 संभोग के लिए आवश्यक हैं।
    महिला पेट में dsRNA इंजेक्शन
    1. बर्फ (5.1.2 और 5.1.3) पर dsRNA तैयार करें।
    2. एक 10 μl सिरिंज के लिए एक 32 गेज सुई संलग्न।
    3. सीओ 2 के मंच पर महिलाओं बेहोश करना।
    4. किसी भी हवाई लेने के बिना सिरिंज में dsRNA समाधान लोड।
    5. एक हाथ से एक महिला उदर पक्ष पकड़ो और अन्य के साथ सिरिंज पकड़ो।
    6. धीरे सुई की नोक के साथ sternites 2 और 3 के बीच segmacoria (झिल्ली) घुसना। चित्रा 7 इंजेक्शन के दौरान एक महिला से पता चलता है। सुई आसानी से ऊतक घुसना नहीं करता है, तो कोण सुई ऊपर की ओर और धीरे धीरे नीचे दबाएँ। शरीर में सुई की लगभग 2 मिमी डालें।
    7. सिरिंज पैमाने की जाँच करते समय धीरे धीरे सवार धक्का, इंजेक्शन लगाने ~ मादा प्रति 2 μl।
    8. इंजेक्शन लगाने के बाद, महिला के पेट से हटाने से पहले कम से कम 5 सेकंड के लिए अभी भी सुई पकड़।
    9. एक पेट्री डिश के लिए इंजेक्शन महिलाओं स्थानांतरण (90 मिमी व्यास) और बिल्ली के भोजन के साथ खिलाओ।
    10. dsRNA नाम, राशि इंजेक्शन, तिथि, और महिलाओं की संख्या के साथ पेट्री डिश लेबल।
  2. बाद इंजेक्शन वसूली और संभोग
    1. एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पेट्री डिश सेते हैं।
    2. 24 घंटे के बाद, स्थानांतरण एक मिनी पिंजरे में इंजेक्ट महिलाओं।
    3. पिंजरे में जोड़े uninjected युवा पुरुषों की संख्या बराबर है, और पिंजरे लेबल।
    4. बिल्ली भोजन के साथ एक वजन नाव पिंजरे में जोड़ें।
    5. एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पिंजरे छोड़ दो संभोग की अनुमति है। 24 घंटे के बाद, महिलाओं अंडे देना शुरू कर देना चाहिए और भ्रूण दैनिक या आवश्यक समय अंतराल पर एकत्र किया जा सकता है।

7. प्ररूपी विश्लेषण के बाद आरएनएआई

नोट: 30 डिग्री सेल्सियस से कम, यह ~ लेता है 55 घंटा के अंडे 50 पक्षियों के बच्चे के लिए।

  1. eRNAi व्यवहार्यता विश्लेषण
    1. कुल परमाणु रची लार्वा की संख्या की तुलना द्वारा हैच दर की गणनाइंजेक्शन भ्रूण की mber। एक नकारात्मक नियंत्रण इंजेक्शन शामिल करने के लिए के रूप में भ्रूण को नुकसान पहुंचाया या इंजेक्शन प्रक्रिया द्वारा मारा जा सकता है सुनिश्चित करें। 60% - ठेठ हैच दरों में 30% से बदलती हैं। रची लार्वा unhatched अंडे खाने से सावधान रहो।
  2. pRNAi व्यवहार्यता विश्लेषण
    नोट: महिला व्यवहार्यता जीन आरएनएआई द्वारा लक्षित पर असर पड़ा है, तो महिलाओं के विशिष्ट dsRNA इंजेक्शन के साथ नहीं बल्कि नकारात्मक नियंत्रण dsRNA मरने के लिए शुरू हो जाएगा। अंडा उत्पादन या अंडे बिछाने पर असर पड़ा है, तो महिलाओं के आंशिक या पूर्ण बाँझपन प्रदर्शन करेंगे। स्कोर महिला अस्तित्व नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में या प्रयोगात्मक और नियंत्रण महिलाओं (7.2.3) द्वारा रखी अंडे की कुल संख्या की तुलना करें।
    1. 2.2 कदम के बाद भ्रूण संग्रह सेट करें।
    2. 2.5 - 24 घंटे के बाद, कदम 2.4 निम्नलिखित भ्रूण इकट्ठा।
    3. भ्रूण की कुल संख्या की गणना।
    4. एक 90 मिमी पेट्री डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण। जीन को निशाना बनाया, संग्रह की तारीख, और संख्या भ्रूण के साथ पेट्री डिश लेबल। एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण सेते हैं जब तक वे पक्षियों के बच्चे। unhatched भ्रूण पर रची लार्वा फ़ीड के बाद से, संदंश (चर्चा देखने के लिए) का उपयोग कर unhatched भ्रूण से पेट्री डिश बार और अलग रची लार्वा की जाँच करें।
    5. रची भ्रूण की संख्या की गणना और पक्षियों के बच्चे की दर की गणना।
  3. रची लार्वा में छल्ली दोष की जांच
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रची लार्वा लीजिए।
    2. एक धूआं हुड में, फिक्सेशन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर microcentrifuge ट्यूब को छोड़ दें तो कम से कम रात भर समाधान लार्वा ऊतक घुसना जाने के लिए।
    4. कल्पना करने के लिए, संभव के रूप में ट्यूब से के रूप में ज्यादा लगानेवाला निकालें।
    5. कुल्ला लार्वा कम से कम तीन बार PBST के साथ।
    6. PBST अंत के साथ एक पी-1000 विंदुक टिप का उपयोग के साथ एक बहु अच्छी तरह से कांच की प्लेट के लिए स्थानांतरण लार्वा काट इसे चौड़ा करने के लिए।
    7. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, दोष की जांच के लिए संदंश का उपयोग लार्वा खिंचाव। मैंटी लार्वा बाहर फैलाने के लिए लगानेवाला में अपने शरीर को अनुबंध के रूप में दोष की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. Unhatched लार्वा में छल्ली दोष की जांच
    नोट: यह प्रक्रिया जल्दी भ्रूण phenotypes की परीक्षा के लिए उपयोगी है, विशेष रूप से भ्रूण कि अंडे सेने के लिए जीवित नहीं है के लिए।
    1. pRNAi के लिए, पेट्री डिश (7.2.4) में PBST जोड़ सकते हैं और एक पी-1000 विंदुक टिप का उपयोग एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब unhatched भ्रूण स्थानांतरण अंत के साथ काट दिया। eRNAi के लिए, पेट्री डिश (5.5.4), माइक्रोस्कोप स्लाइड बंद ब्रश unhatched भ्रूण में PBST जोड़ने और उन्हें एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण।
    2. फिक्सेशन समाधान के साथ भ्रूण को ठीक करें और कदम 7.3.2 निम्नलिखित दृश्य के लिए PBST के साथ उन्हें कुल्ला - 7.3.6।
    3. संदंश का प्रयोग, PBST में एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत खोल से बाहर भ्रूण काटना।
    4. भ्रूण वापस 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (~ प्रत्येक ट्यूब में भ्रूण के 200 μl) करने के लिए स्थानांतरण।
    5. के रूप में ज्यादा प हटायेके रूप में संभव संविधान।
    6. 90% लैक्टिक एसिड / 10% EtOH के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अपकेंद्रित्र ट्यूब में कम से कम रात भर छोड़ दें।
      नोट: भ्रूण कई दिनों के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ा जा सकता है।
    7. भ्रूण माउंट करने के लिए, एक पी-1000 विंदुक टिप का उपयोग अंत के साथ काट एक खुर्दबीन स्लाइड पर उन्हें विंदुक।
    8. मैन्युअल एक आदर्श उन्मुखीकरण के लिए संदंश के साथ भ्रूण की स्थिति।
    9. एक कवर पर्ची के साथ भ्रूण कवर और डीआईसी का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे कल्पना।
  5. सेलुलर और आण्विक दोष की जांच
    नोट: यह प्रक्रिया छल्ली phenotypes या मारक है कि छल्ली दोष के साथ नहीं के मूल कारणों की जांच के लिए उपयोगी है।
    1. pRNAi के लिए, उचित विकास के स्तर पर कपास गेंदों से अलग भ्रूण और उन्हें एक भ्रूण एकत्रित टोकरी में स्थानांतरित। संग्रह टोकरी ही है या ड्रोसोफिला भ्रूण संग्रह के लिए उपयोग किया जाता है कि इसी तरह हो सकता है।
      1. बनानाशीशी हटा के नीचे के साथ एक 25 मिलीलीटर की प्लास्टिक जगमगाहट शीशी से अंडे की टोकरी, और ढक्कन (लगभग 1 सेमी व्यास) के बाहर एक सर्कल में कटौती। सुपर ठीक का एक चक्र के ढक्कन अंदर व्यास में लगभग 2.5 सेमी जाल रखें, और तब पर जगमगाहट शीशी पेंच और ऊपर से नीचे का उपयोग करें।
      2. जाल आसानी से एक बार भ्रूण धो रहे हैं हटाया जा सकता है के रूप में, जाल से चिपके हुए किसी भी भ्रूण ठीक करने के लिए पानी के साथ एक microcentrifuge ट्यूब में जाल विसर्जित कर दिया।
    2. eRNAi के लिए, उपयुक्त स्तर पर, पेट्री डिश के लिए PBST जोड़ें। भ्रूण ब्रश खुर्दबीन स्लाइड बंद है और उन्हें एक भ्रूण एकत्रित टोकरी के लिए स्थानांतरण।
      नोट: फिक्सेशन, सीटू संकरण, एंटीबॉडी धुंधला, और परमाणु धुंधला प्रोटोकॉल में जियांग एट अल में पाया जा सकता है। 2015 53।

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Representative Results

'लेखक प्रयोगशाला आरएनएआई तकनीक का इस्तेमाल किया गया है कीड़े 53,55 में विभाजन को विनियमित जीन की कार्यात्मक विकास का अध्ययन करने के लिए। सभी कीड़ों को खंडित कर रहे हैं, जीन इस प्रक्रिया को विनियमित करने कीट विकिरण 26,38,56-63 दौरान विसरित होते हुए दिखाई देते हैं। ड्रोसोफिला में आनुवंशिक स्क्रीन नौ जोड़ी नियम विभाजन जीन है कि शरीर खंडों 64-70 के गठन को बढ़ावा देने के लिए जिम्मेदार हैं का एक सेट की पहचान की। इधर, इन जीनों में से एक के ortholog, बनती (पीआरडी), डी maculatus में जीन समारोह के अध्ययन के लिए आरएनएआई की उपयोगिता दस्तावेज़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

इस प्रजाति में खंड गठन में पीआरडी - eRNAi और pRNAi प्रत्येक Dmac के लिए भूमिकाओं के प्रदर्शन में प्रभावी रहे थे। 2 - पीआरडी (आंकड़े 8B, 8D और 8F - 3 माइक्रोग्राम / dsRNA की μl Dmac को लक्ष्य बनाया गया GFP dsRNA की तुलना में था, नकारात्मक नियंत्रण (आंकड़े 8A, 8 और 8E के रूप में इंजेक्शन)।

नियंत्रण संतानों खंड प्रति एक pigmented पट्टी के साथ रची। पड़ोसी pigmented धारियों एक गैर pigmented अंतर (चित्रा 8A) से अलग हो गए थे। पीआरडी pRNAi के बाद, प्रभावित संतानों इनकार पड़ोसी pigmented धारियों के साथ रची है, यह दर्शाता कमानी सीमाओं दोषपूर्ण (चित्रा 8B) थे। प्ररूपी गंभीरता, एक या कई fusions पर निर्भर करता है प्रभावित लार्वा में पाया गया। फिर भी, fusions लगातार टी 2 के बीच सीमा क्षेत्रों / T3, A1 / ए 2, ए 3 / ए 4, ए 5 / ए 6, ए 7 / ए 8 में दिखाई दिया, इस जोड़ी को नियम-तरह के दोषों का संकेत है। पीआरडी पछाड़ना के बाद छल्ली phenotypes पेट क्षेत्रों के नुकसान के साथ ही छोटा शरीर की लंबाई (चित्रा 8D) से पता चला। Engrailed (एन) एंटीबॉडी धुंधला जल्दी में आणविक दोष की जांच करने के लिए किया गया थापीआरडी पछाड़ना के बाद भ्रूण। नियंत्रण भ्रूण हर क्षेत्र (चित्रा 8E) में बराबर तीव्रता के साथ अभिव्यक्ति एन धारीदार दिखाया, कम एन अभिव्यक्ति Dmac-पीआरडी dsRNA से संतानों में वैकल्पिक धारियों में (चित्रा 8F में तारों) का पता चला था महिलाओं के इंजेक्शन। कम हो एन अभिव्यक्ति की तर्ज दोषपूर्ण छल्ली पैटर्न प्रभावित रची लार्वा में मनाया के अनुरूप है। डी maculatus में पीआरडी पछाड़ना के बाद phenotypes के अधिक विस्तृत परिणामों के लिए, जियांग एट अल देखें। 2015 53।

चित्र तीन
चित्रा 3: इंजेक्शन तंत्र। विच्छेदन माइक्रोस्कोप और micromanipulator डी maculatus भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल की तस्वीर में दिखाया गया है। नाइट्रोजन की आपूर्ति एक वायवीय पंप के दबाव इनपुट बंदरगाह से जुड़ा है। ग्लास केशिका धारक ejec से जुड़ा हैपंप के टी दबाव बंदरगाह। पैर स्विच पंप से जुड़ा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: डी maculatus भ्रूण आरएनएआई के लिए एक फ़्लोचार्ट। (ई) इंजेक्शन के लिए भ्रूण एकत्रित। महिलाओं रखना भ्रूण कपास गेंदों में (नारंगी) (ग्रे वृत्त)। कपास गेंदों से अलग भ्रूण और उन्हें काले निर्माण कागज के एक टुकड़े पर छोड़ दें। सफेद सलाखों कपास की गेंद में आँसू संकेत मिलता है। एक पेट्री डिश एकत्रित ढकने के लिए स्थानांतरण भ्रूण, काले कागज के साथ खड़े हैं। (ई, एफ) भ्रूण में dsRNA इंजेक्शन। डबल स्टिक टेप पर स्लाइड पर भ्रूण संरेखित करें और उन्हें एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत अलग-अलग इंजेक्षन। हरी भोजन डाई के साथ सुई दिखाया गया है। (जी जे) के बाद इंजेक्शन वसूली और incubसमझना। पेट्री डिश में एक गीला कपास गेंद प्लेस नमी प्रदान करने के लिए। पेट्री डिश कवर और फिल्म (हल्के नीले रंग) सील के साथ लपेट। एक मशीन में पेट्री डिश में रखें और प्ररूपी विश्लेषण के लिए रची लार्वा को हटा दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: बनाम बुरा भ्रूण इंजेक्शन उदाहरण अच्छा है। (ए) uninjected भ्रूण। (बी) के भ्रूण बहुत कम dsRNA इंजेक्शन के साथ। (सी) भ्रूण dsRNA की उचित मात्रा में इंजेक्शन के साथ। (डी) बह निकला dsRNA ओवर-इंजेक्शन की वजह से टूटी भ्रूण। खाद्य रंग दृश्य के लिए dsRNA को जोड़ा गया है। (ई) खींच लिया केशिका इंजेक्शन के लिए सुइयों के रूप में इस्तेमाल किया नलियों के उदाहरण हैं। नोट शंकु और टिप लंबाई चया कार्यात्मक सुइयों के दो उदाहरण हैं। स्केल विज्ञापन के लिए सलाखों के 200 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: पुरुष और महिला वयस्क और pupae। (ए) एक पुरुष प्यूपा के उदर देखें। (ए ') ए (ए ") पुरुष प्यूपा जननांग के चित्रण के पीछे भाग की बढ़ाई। (बी) के एक महिला प्यूपा के उदर दृश्य। (बी) बी महिला pupae के पीछे भाग की बढ़ाई दो जननांग papillae है (सफेद तीर)। (बी ") मादा जननांग प्यूपा का चित्रण। (सी) एक पुरुष वयस्क के उदर देखें। (सी) सी के पीछे भाग का बढ़ाया दृश्य ध्यान दें कि पुरुष वयस्कों त्रिशूल की तरह है और एक जननांग4 वें sternite पर परिपत्र पालि की तरह संरचना (सफेद और काले रंग के तीर, क्रमशः)। (डी) एक महिला वयस्क के उदर देखें। (डी ') डी के पीछे भाग सभी पैनलों के लिए की आवर्धक अवलोकन, स्केल सलाखों 1 मिमी से संकेत मिलता है। जानकारी के लिए, जियांग एट अल देखें। 2015 53। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: इंजेक्शन के दौरान एक महिला। महिलाओं anesthetized और उदर पक्ष रखा जाता है। एक सुई 2 और 3 sternites dsRNA इंजेक्षन करने के बीच segmacoria मर्मज्ञ दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


8 चित्रा: Dmac-पीआरडी pRNAi के बाद प्रतिनिधि phenotypes। (ए) नियंत्रण इंजेक्शन। तीन खंडों वक्ष और उदर दस खंडों के साथ एक रची जंगली प्रकार की तरह GFP pRNAi संतानों के पार्श्व दृश्य। प्रत्येक खंड setae और pigmented धारियों है। (बी) के एक रची पीआरडी pRNAi संतानों के पार्श्व दृश्य। लेबल पड़ोसी pigmented धारियों के बीच अंतर कम या पूरी तरह से गायब है। एक unhatched नियंत्रण जंगली प्रकार की तरह भ्रूण की (सी) छल्ली फेनोटाइप। कम पेट क्षेत्रों के साथ एक unhatched पीआरडी pRNAi वंश की (डी) छल्ली फेनोटाइप। (ई, एफ) से germband विच्छेदित: (ई) नियंत्रण, GFP pRNAi समान रूप से एन हर क्षेत्र में व्यक्त किया गया है, (एफ) पीआरडी pRNAi, एन अभिव्यक्ति वैकल्पिक खंडों (तारों) में कम हो जाता है। सभी फलक के लिएरास, स्केल सलाखों 500 माइक्रोन से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

परिष्कृत मॉडल प्रणाली (चूहों, मक्खियों, कीड़े) की एक छोटी संख्या 20 वीं सदी के दौरान विकसित किए गए, वहीं 21 वीं सदी नया पशु प्रणालियों की एक लहर दुनिया भर में प्रयोगशालाओं में विकसित किया जा रहा देखा गया है। इन नई प्रणालियों वैज्ञानिकों तुलनात्मक, विकासवादी सवाल है कि केवल 'मानक' मॉडल प्रणाली का उपयोग करते हुए जांच नहीं की जा सकती संबोधित करने के लिए अनुमति देते हैं। नए मॉडल की यह तैनाती प्रयोगशाला संवर्धन, जीन की पहचान, और नई प्रजातियों में कार्यात्मक दृष्टिकोण के लिए तरीकों का तेजी से विकास की आवश्यकता है। इधर, प्रयोगशाला और भ्रूण आरएनएआई, माता पिता का आरएनएआई, और इस बीटल में प्ररूपी विश्लेषण के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल में डी maculatus के पालन के लिए प्रक्रियाओं को प्रस्तुत किए गए। लक्ष्य है कि इन विवरण अपने खुद के प्रयोगों में डी maculatus का उपयोग करने के लिए और यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त नए मॉडल प्रजाति विकसित करने के लिए दूसरों को प्रोत्साहित करता है।

जबकि डी एल maculatusएबी कालोनियों बनाए रखने के लिए अविश्वसनीय रूप से आसान कर रहे हैं, इस प्रजाति के पालन की एक सीमा भोजन के अपने स्रोत के रूप में बीटल को दिया गीला बिल्ली भोजन की अप्रिय गंध है। इससे बचने के लिए, इस तरह के मट्ठा / सोया प्रोटीन पाउडर, पनीर, जमीन कुत्ते को भोजन, और दूध पाउडर के रूप में वैकल्पिक खाद्य पदार्थ, आर्द्रता में परिवर्तन करने के साथ या गीला कपास के बिना परीक्षण किया गया। ग्राउंड कुत्ते के भोजन के लिए सबसे प्रभावी विकल्प था और नियमित रूप से कॉलोनी के भोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जीवन रक्षा के साथ या बिना गीला कपास कहा, 80% सापेक्ष आर्द्रता में सिर्फ सूखी कुत्ते के भोजन पर पाला पिंजरों में वयस्क के लिए अंडे से बहुत अच्छा था (> 90%)। हालांकि, गीला बिल्ली भोजन के साथ इस आहार का सप्लीमेंट जब उपजाऊपन बढ़ाने के लिए अंडे एकत्रित आवश्यक जब अंडे की बड़ी संख्या को इकट्ठा किया जा सकता है। कुत्ते के भोजन में प्रयोग किया जाता है, तो पुराने भोजन, नियमित रूप से हटा दिया जाना चाहिए के रूप में वातानुकूलित कुत्ते के भोजन के 54 बिछाने अंडे को बाधित करने के लिए मिला था। कुत्ते के भोजन kibbles (के.आर., प्रारंभिक परिणाम), काग, लकड़ी, कागज, और अन्य सामग्री भी refuges के रूप में 71 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।दिलचस्प है, स्टायरोफोम mealworm बीटल लार्वा का उपयोग करने का बायो़डीग्रेडेशन 72 सूचित किया गया है। इसलिए, इस डी maculatus लार्वा के लिए परीक्षण किया गया था। युवा डी maculatus लार्वा केवल स्टायरोफोम या अभ्रक युक्त सामग्री और गीला कपास के साथ वयस्कता तक बच (डेटा) नहीं दिखाया लेकिन क्या वे खाने के लिए और उन सामग्रियों को पचाने निर्धारित किया जाना बना रहता है।

इस रिपोर्ट में डी maculatus में कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन से बाहर ले जाने के लिए पहला विस्तृत प्रोटोकॉल है। आरएनएआई के उपयोग यहाँ एक नया मॉडल प्रणाली के लिए इस तकनीक का एक विस्तार का प्रतिनिधित्व करता है। कई विशिष्ट टिप्पणियों डी maculatus और अन्य गैर-मॉडल प्रजातियों में आरएनएआई पछाड़ना प्रयोगों के संबंध में ध्यान देने योग्य हैं। सबसे पहले, गारंटी नहीं है कि आरएनएआई डी maculatus, डी maculatus यहां इस्तेमाल नियोजित किया जाना चाहिए की एक ही तनाव में प्रभावी हो जाएगा। सबूत है कि विभिन्न प्रकारों आरएनएआई पी में भिन्नता दिखाने Tribolium castaneum से नहीं हैhenotypes 24,73, और उत्परिवर्ती phenotypes अक्सर मॉडल प्रजातियों 74-76 में आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्भरता दिखा। इसके अलावा, वहाँ अन्य प्रोटोकॉल में तनाव-निर्भरता, सीटू संकरण में शामिल करने के लिए वास्तविक सबूत है। दूसरा, इंजेक्शन का उचित समय डी maculatus में सफल आरएनएआई के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ हद तक इसके अनुसार, segmacoria सबसे बड़ी आसानी के बाद पूरी तरह से छल्ली, sclerotized गया है कम से कम दो दिनों eclosion के बाद प्रवेश कर रहा है। इसलिए, कुंवारी महिलाओं 4 - 8 दिनों eclosion के बाद किया जाना चाहिए। पुराने महिलाओं नव eclosed महिलाओं की तुलना में कम उपजाऊपन का अनुभव है और इस तरह के इंजेक्शन के लिए उपयुक्त नहीं हैं। तीसरा, इंजेक्शन dsRNA महिला पेट के भीतरी दबाव से बाहर धक्का दे दिया हो सकता है। इंजेक्शन के बाद dsRNA की एक बड़ी राशि खोने की संभावना को कम करने के लिए, इंजेक्शन के बाद ~ 5 सेकंड के लिए पेट में सुई पकड़ और फिर धीरे-धीरे इसे हटाने के लिए (6.2.8)। इस बीच, के दौरान या शीघ्र ही महिला के पेट दबाने से बचनेइंजेक्शन के बाद। इस मुद्दे की वजह से पक्षपाती परिणामों को नाकाम करने के लिए, प्ररूपी विश्लेषण के लिए कम से कम 8 महिलाओं इंजेक्षन प्रत्येक dsRNA पर्याप्त वंश (200 भ्रूण दैनिक ~) प्राप्त करने के लिए। चौथा, उच्च अंडे की उपज इंजेक्शन के बाद प्ररूपी विश्लेषण के लिए निष्पक्ष डाटा उपलब्ध कराने के लिए महत्वपूर्ण है। औसत पर, प्रत्येक डी maculatus महिला दैनिक लगभग 35-55 भ्रूण पैदा करता है। अंडे की उपज जनसंख्या के आकार, महिला उम्र, आर्द्रता, भोजन की उपलब्धता, तापमान (डेटा नहीं दिखाया गया है), और अन्य पर्यावरणीय कारकों 54 पर निर्भर करता है। आमतौर पर, महिलाओं के 25 डिग्री सेल्सियस से 30 डिग्री सेल्सियस पर अधिक लेट गई। पांचवां, unhatched भ्रूण रची लार्वा द्वारा cannibalized जा सकता है। रची लार्वा के रूप में, आमतौर पर जंगली प्रकार की तरह या केवल हल्का प्रभावित हैं, जबकि unhatched भ्रूण आमतौर पर अधिक गंभीर रूप से प्रभावित कर रहे हैं, डी maculatus लार्वा की इस आदत को एक मात्रात्मक प्ररूपी विश्लेषण में पक्षपाती परिणाम हो सकता है। इसलिए, रची लार्वा को हटाने के रूप में जल्दी संभव के रूप में दृढ़ता से सिफारिश की है।

हमारी प्रयोगशाला, डी maculatus विभाजन पर ध्यान केंद्रित किया है, हालांकि के कई पहलुओं को इस प्रजाति सहित शरीर क्रिया विज्ञान, पारिस्थितिकी, और कीट बहुत रुचि के नियंत्रण में हैं। Embryogenesis और विभाजन के अध्ययन के लिए, डी maculatus लार्वा के पृष्ठीय पक्ष पर अंधेरे में pigmented धारियों की एक श्रृंखला असामान्य विकास के लिए एक प्राकृतिक मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं। इसके अलावा, विशेषता setae लार्वा की pigmented धारियों पर निहित क्षेत्रों में से एक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये रूपात्मक सुविधाओं, एक साथ लग रहा है कि हल्का या मामूली प्रभावित भ्रूण अंडे सेने के लिए जीवित रह सकते हैं के साथ, बुनियादी शरीर योजना patterning में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के डी maculatus मॉडल के फायदे हैं।

अंत में, इस तरह के GFP dsRNA के रूप में अत्यधिक नियंत्रित प्रयोगों सहित एक नकारात्मक नियंत्रण से बाहर ले जाने और प्रत्येक के लिए दो गैर अतिव्यापी लक्ष्य क्षेत्रों परीक्षण के महत्व effec के कारण अशुद्ध अर्थ से बचने के लिए महत्वपूर्ण जीन हैइंजेक्शन के प्रति एसई टीएस और बंद लक्ष्य प्रभाव। डी maculatus, 4 के लिए - 6 माइक्रोग्राम dsRNA (2 या 3 माइक्रोग्राम / μl के 2 μl) प्रत्येक महिला में इंजेक्शन थे और dsRNA बीपी लंबे 200-250 था। राशि और प्रोटोकॉल के अन्य विवरण यदि विकास में या विभिन्न शारीरिक / चयापचय की प्रक्रिया में बाद में कार्य कर जीन को निशाना अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। पिछला खोजों से पता चला कि आरएनएआई प्रभाव आने वाली पीढियों के लिए पर पारित किया जा सकता परे सी में F1 पीढ़ी एलिगेंस 15। आरएनएआई के कारण विभाजन दोष के साथ रची डी maculatus लार्वा की एक अल्पसंख्यक वयस्कता जब तक जीवित रह सकते हैं और पुन: पेश कर सकते हैं। प्रारंभिक प्रयोगों F2 पीढ़ी में स्पष्ट दोषों को प्रकट करने में विफल रहा। भविष्य के अध्ययन के इस प्रजाति में आरएनएआई की transgenerational प्रभाव प्रकट हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

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References

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पालन ​​और मिटायें बीटल में डबल असहाय शाही सेना की मध्यस्थता जीन पछाड़ना,<em&gt; Dermestes maculatus</em
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Xiang, J., Reding, K., Pick, L.… More

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

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