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पता लगाने के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल Published: February 7, 2017 doi: 10.3791/54994
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Evolution, Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC)

Abstract

ग्लोबल वार्मिंग और eutrophication कुछ जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों सच के रूप में बायोरिएक्टर है कि तेजी से और बड़े पैमाने पर cyanobacterial विकास को गति प्रदान व्यवहार कर; इस प्रासंगिक स्वास्थ्य और आर्थिक परिणाम है। कई cyanobacterial उपभेदों विष निर्माता हैं, और केवल कुछ कोशिकाओं में पर्यावरण के लिए अपूरणीय क्षति प्रेरित करने के लिए आवश्यक हैं। इसलिए, पानी शरीर के अधिकारियों और प्रशासन तेजी से और कुशल प्रारंभिक चेतावनी प्रणाली विश्वसनीय डाटा उपलब्ध कराने के लिए अपने निवारक या उपचारात्मक फैसले का समर्थन करने के लिए आवश्यकता होती है। यह पांडुलिपि 17 एंटीबॉडी (पेट) वर्गीकरण संकल्प (CYANOCHIP) के साथ के साथ एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे चिप का उपयोग करके विष उत्पादक cyanobacterial स्ट्रेन के में क्षेत्र का पता लगाने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। इधर, एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट सैंडविच माइक्रोएरे प्रतिरक्षा (FSMI) 17 cyanobacterial उपभेदों के एक साथ निगरानी के लिए अक्सर मीठे पानी के पारिस्थितिक तंत्र में खिल पाया गया है, उनमें से कुछ विष उत्पादकों, वर्णित है। बहु के साथ एक माइक्रोएरेमिसाल समान प्रतिकृति CYANOCHIP का (24 से ऊपर) के लिए एक एकल खुर्दबीन स्लाइड पर मुद्रित किया गया था एक साथ नमूनों की एक समान संख्या में परीक्षण करने के लिए। तरल नमूने या तो एंटीबॉडी (पेट) के साथ सीधे ऊष्मायन द्वारा या एक 1- से 3 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा सेल एकाग्रता के बाद परीक्षण किया जा सकता है। इस तरह के अवसादों और जमीन चट्टानों के रूप में ठोस नमूने, पहली homogenized और एक ऊष्मायन बफर में एक हाथ से आयोजित ultrasonicator द्वारा बिखरे हैं। वे तो छान रहे हैं (5 - 20 माइक्रोन) मोटे सामग्री को हटाने के लिए, और छानना पेट के साथ incubated है। Immunoreactions 17 प्रतिदीप्ति लेबल पेट का एक मिश्रण के साथ एक अंतिम ऊष्मायन से पता चला रहे हैं और एक पोर्टेबल प्रतिदीप्ति डिटेक्टर से पढ़ रहे हैं। पूरी प्रक्रिया के आसपास 3 घंटे लगते हैं, इसके बारे में सबसे ऊष्मायन के दो 1-एच अवधि के लिए इसी। उत्पादन एक छवि है, जहां चमकीले धब्बों cyanobacterial मार्कर के सकारात्मक पता लगाने के अनुरूप है।

Introduction

का पता लगाने और जटिल प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदायों में सूक्ष्मजीवों की निगरानी बायोमेडिसिन, पर्यावरण पारिस्थितिकी, और Astrobiology सहित कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण हैं। Cyanobacteria प्रोकार्योटिक सूक्ष्मजीवों ताजा पानी में कोशिकाओं की खिलता (अत्यधिक प्रसार) के रूप में उनकी क्षमता के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। वे हर जगह हैं, और कई प्रजातियों, विषाक्त पदार्थों का उत्पादन करने के लिए अग्रणी न केवल मानव स्वास्थ्य के लिए एक संभावित खतरा है, लेकिन यह भी एक पारिस्थितिकी प्रभाव करने में सक्षम हैं। इस संबंध में, यह cyanobacteria और / या मिट्टी और पानी में उनके विषाक्त पदार्थों का जल्दी पता लगाने के लिए तेजी से और संवेदनशील तरीकों को विकसित करने के लिए आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए, एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट सैंडविच माइक्रोएरे प्रतिरक्षा (FSMI) पानी प्रबंधकों उन्हें निर्णय करने में मदद करने के लिए और इसके परिणामस्वरूप, उचित जल प्रबंधन कार्यक्रमों को लागू करने में एक उपकरण के रूप में विकसित किया गया है।

तरीकों की एक विविध रेंज का पता लगाने और सियान की पहचान करने के लिए विकसित किया गया हैobacterial कोशिकाओं और मिट्टी और पानी में cyanotoxins, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी, आणविक जीव विज्ञान, और प्रतिरक्षा तकनीक भी शामिल है। इन तरीकों में वे जानकारी प्रदान में काफी भिन्नता है सकते हैं। सूक्ष्म तकनीक सेल आकृति विज्ञान और इस तरह के रूप में phycocyanin cyanobacterial पिगमेंट, से इन विवो प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए या एक 1 क्लोरोफिल पर आधारित हैं। हालांकि वे वास्तविक समय और लगातार निगरानी के लिए त्वरित और सस्ता तरीकों कि प्रकार और एक नमूने में मौजूद cyanobacteria की संख्या के बारे में सूचित कर रहे हैं, वे संभावित विषाक्तता के बारे में जानकारी नहीं देते। इसके अलावा, वे विशेषज्ञता का एक निश्चित स्तर की आवश्यकता होती है, विचार है कि यह अक्सर बहुत निकट से संबंधित प्रजातियों 2 के बीच भेद करना मुश्किल है। इन सीमाओं को पार करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी दोनों जैविक और जैव रासायनिक स्क्रीनिंग assays और पहचान और cyanotoxins की मात्रा का ठहराव के लिए भौतिक तरीकों के साथ होना चाहिए।

3, 4 कर रहे हैं। इसके अलावा, इन तरीकों समय लेने वाली हैं; महंगे उपकरण, आपूर्ति, और नमूना तैयार करने की आवश्यकता होती है; और अनुभवी और विशेष स्टाफ द्वारा किया जाना चाहिए।

आण्विक आधारित विधियों दशकों का पता लगाने की पहचान है, और cyanobacteria और उनके इसी cyanotoxins यों तो जीनोम डेटाबेस में प्रकाशित अनुक्रम जानकारी के लिए धन्यवाद के लिए लागू किया गया है (जैसे, जैव प्रौद्योगिकी सूचना, एन सी बी आई के लिए राष्ट्रीय केन्द्र)। इन तरीकों के अलावा पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) है, जो डीएनए प्रवर्धन के लिए प्राइमरों के सेट की डिजाइन की आवश्यकता है और विभिन्न प्रजातियों के cyanobacterial डीएनए दृश्यों के पिछले ज्ञान पर निर्भर करते हैं पर आधारित होते हैं। जीन का पता लगाने, phycocyanin operon तरह, जीनस स्तर पर सटीक पहचान करने के लिए होता है, कुछ प्रजातियों या प्रकारों के साथ नहीं चल पाता हैंयह विधि। हालांकि, इस तरह microcystin operon से संबंधित उन के रूप में विष एन्कोडिंग जीन, नमूने में जहर की पहचान जहां उत्पादकों दुर्लभ 5 की सुविधा। बहरहाल, पीसीआर द्वारा विष मार्कर का पता लगाने के लिए जरूरी माहौल में विषाक्तता मतलब नहीं है। इसके अलावा, एक नमूने में मौजूद cyanobacteria और विष उत्पादकों की प्रजातियों की पूरी रेंज का विश्लेषण करने के लिए विकसित प्राइमरों के सेट अभी भी अधूरा है, और आगे की पढ़ाई अज्ञात प्रजातियों की पहचान करने के लिए किया जाना चाहिए। अन्य आणविक तकनीक ऐसी सीटू संकरण (मछली) और डीएनए में प्रतिदीप्ति के रूप में गैर-पीसीआर आधारित कर रहे हैं।

पिछले दो दशकों में, माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी महत्व आवेदन के कई क्षेत्रों में, विशेष रूप से पर्यावरण निगरानी में इजाफा हुआ है। डीएनए प्रजातियों और analytes 4 के बीच भेदभाव, 6, 7 के लिए अनुमति sup>, 8, 9, 10, लेकिन वे बहुत ही कठिन और समय लेने वाली कार्य है कि कई कदम (जैसे, माइक्रोएरे प्रदर्शन, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर प्रवर्धन, और संकरण) को शामिल माना जाता है। कारण है कि, कम समय लेने वाली ऐसी सैंडविच और प्रतिस्पर्धी प्रतिरक्षा प्रोटीन के रूप में एंटीबॉडी, पर आधारित assays, कई पर्यावरण analytes 11, 12, 13 का पता लगाने के लिए एक अनिवार्य और विश्वसनीय उच्च throughput विधि बन गए हैं। एंटीबॉडी की क्षमता विशेष रूप से उनके लक्ष्य यौगिकों की पहचान करने के लिए और, analytes और प्रोटीन की थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए लगभग किसी भी पदार्थ के खिलाफ एंटीबॉडी के उत्पादन की संभावना के साथ-साथ, एंटीबॉडी पर्यावरण उद्देश्यों के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बनाते हैं। इसके अलावा, कई को प्राप्त करने की क्षमता के रूप में विश्लेषण करती हैचिमनी परख, पीपीएम पीपीबी से लेकर पता लगाने की सीमा के साथ, इस विधि 14 का मुख्य लाभ में से एक है।

एंटीबॉडी आधारित biosensors पर्यावरण निगरानी 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 में रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने के लिए संवेदनशील और तेजी से उपकरण साबित हुई है। जबकि डीएनए तरीकों कई कदम शामिल है, एंटीबॉडी आधारित प्रोटीन केवल एक छोटा सा नमूना तैयार है कि मुख्य रूप से एक उचित समाधान बफर में एक छोटे से सेल कदम पर आधारित है की आवश्यकता होती है। Delehanty और Ligler 15 एक एंटीबॉडी सैंडविच प्रतिरक्षा 4 पीपीबी एक के एक प्रोटीन एकाग्रता पता लगाने में सक्षम पर आधारित प्रोटीन और जटिल मिश्रण में बैक्टीरिया analytes के एक साथ पता लगाने की सूचना दीडी 10 4 CFU / एमएल कोशिकाओं की। Szkoła एट अल। 21 कि जैविक युद्ध में इस्तेमाल किया जा सकता है proteotoxins और छोटे जहर, यौगिकों के एक साथ पता लगाने के लिए एक सस्ता और विश्वसनीय मल्टीप्लेक्स माइक्रोएरे विकसित किया है। वे ricin विष की सांद्रता का पता चला, कम से कम 20 मिनट में 3 पीपीबी, का पता लगाने की एक सीमा के साथ। हाल ही में, CYANOCHIP, विषाक्त और nontoxic cyanobacteria के बगल में पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे आधारित biosensor, 22 में वर्णित किया गया है। इस माइक्रोएरे ज्यादातर जलीय वातावरण, जो microscopically की पहचान करना मुश्किल है, संभावित cyanobacterial खिलता की पहचान के लिए अनुमति देता है। अधिकांश प्रजातियों के लिए 10 3 कोशिकाओं, यहां तक कि प्रजातियों के स्तर पर, मल्टीप्लेक्स का पता लगाने और cyanobacteria की पहचान के लिए एक लागत प्रभावी उपकरण में इस biosensor मोड़ - माइक्रोएरे का पता लगाने की सीमा 10 2 है। इन सभी गुणों antibo बनानावि माइक्रोएरे तकनीक, और विशेष रूप से विधि इस काम में प्रस्तुत किया, एक तेज और सरल विधि aforementioned तकनीकों की तुलना में।

इस काम के प्रयोगों है कि मिट्टी और पानी के नमूनों में cyanobacteria की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे आधारित biosensor उपयोग के दो उदाहरण प्रस्तुत करता है। यह एक सरल और विश्वसनीय विधि एक सैंडविच प्रतिरक्षा प्रारूप पर आधारित है कि बहुत छोटा सा नमूना मात्रा और बहुत ही बुनियादी नमूना तैयार करने की आवश्यकता है। विधि एक कम समय की आवश्यकता है और आसानी से क्षेत्र में किया जा सकता है।

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Protocol

1. Immunogens की तैयारी

  1. तालिका 1 में वर्णित शर्तों के तहत इसी संस्कृति के माध्यम में प्रत्येक cyanobacterial तनाव बढ़ता है।
    नोट: प्रत्येक cyanobacteria तनाव के लिए मध्यम विकास और संस्कृति की स्थिति में 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं। सभी cyanobacterial में तनाव, K17 के अपवाद के साथ, ऑटोनोमा विश्वविद्यालय (मैड्रिड, स्पेन) से एंटोनियो Quesada के समूह के हैं। Planktothrix rubescens के खिलाफ एंटीबॉडी Vilasouto जलाशय (उत्तरी स्पेन) से इस साइनोबैक्टीरीयम की monospecific खिलने का एक स्वाभाविक नमूना से उत्पन्न किया गया था।
  2. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा एक सेल गिनती चैम्बर का उपयोग कर एक देर घातीय या स्थिर विकास के चरण संस्कृति से लगभग 10 8 कोशिकाओं / एमएल प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की संख्या यों।
  3. 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर centrifugation द्वारा संस्कृति के 5 एमएल से हार्वेस्ट कोशिकाओं।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10 एमएल टब में कोशिकाओं resuspend1x फॉस्फेट बफर खारा के 5 एमएल (1x पीबीएस) के साथ ई एमएल लगभग 10 8 कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए /।
  5. Homogenize और बर्फ पर एक 30 करने के लिए 60-एस के ठहराव के साथ, 5 चक्र, 30 एस प्रत्येक के लिए sonication द्वारा निलंबन की कोशिकाओं lyse, एक पोर्टेबल, हाथ से आयोजित अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर का उपयोग कर या एक के पानी के स्नान में ट्यूब सूई से अधिकतम आयाम (30 kHz) पर सेल disruptor।
  6. दोहराएँ 1.3 कदम - 1.5 साइनोबैक्टीरीयम के प्रत्येक तनाव के लिए।
    नोट: Sonication सेल व्यवधान और सेलुलर सामग्री जारी पैदा करता है। जबकि प्रोटीन और polysaccharides ऐसे लिपिड और न्यूक्लिक एसिड के रूप में अच्छा immunogens, विशिष्ट अणु, कर रहे हैं, खुद के द्वारा एक त्रिदोषन immunogenic प्रतिक्रिया प्रेरित नहीं करते। इसलिए, वे इस तरह के polysaccharides या प्रोटीन के रूप में वाहक, करने के लिए बाध्य आणविक जटिलता में वृद्धि करने के लिए करना चाहिए। इसके अलावा, sonication intracellular सामग्री है कि एंटीबॉडी के उत्पादन को गति प्रदान कर सकते हैं विज्ञप्ति।

2. पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन

  1. पहले आई एम एम तैयारपूरा Freund के सहायक के 0.5 एमएल के साथ 1.5 चरण में प्राप्त ultrasonicated सेल lysate के 0.5 एमएल के मिश्रण से unogen खुराक। पॉलीक्लोनल खरगोश एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए एक जानवर की सुविधा के ऑपरेटर के लिए इसे वितरित।
  2. एक ही homogenate / lysate अधूरा Freund के सहायक के 0.5 एमएल के साथ 1.5 चरण में प्राप्त की 0.5 एमएल मिश्रण से एंटीबॉडी उत्पादन की प्रक्रिया में स्मृति को बढ़ा देता है के रूप में आगे उपयोग के लिए पहले के रूप में तीन और खुराक तैयार करें। एंटीबॉडी के उत्पादन की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए जानवरों की सुविधा के लिए उन्हें दे।
  3. दोहराएँ 2.1 और प्रत्येक नए एंटीबॉडी के उत्पादन की प्रक्रिया के लिए 2.2 कदम।
    नोट: आम तौर पर, एंटीबॉडी के उत्पादन, विशेष जानवर सुविधाओं या कंपनियों को सौंपा गया है, क्योंकि उचित लाइसेंस और प्रशिक्षण जानवरों के साथ काम करने के लिए आवश्यक हैं। कंपनियों के एक रिश्तेदार एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) सीरम के नमूने में मौजूद विशिष्ट प्रतिजन एंटीबॉडी की मात्रा का माप की आपूर्ति।

3. एंटीबॉडी Purification

  1. इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) दोनों प्रतिरक्षा और प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा चरण 2 में एकत्र पूर्व प्रतिरक्षा सीरम से अंश शुद्ध। कुछ व्यावसायिक शुद्धि किट, कारतूस सिस्टम पर आधारित है, अच्छी तरह से काम करते हैं; प्रदाता निर्देशों का पालन करें।
  2. शुद्धि किट एक desalting प्रणाली प्रदान नहीं करता है, शुद्ध एंटीबॉडी का क्षालन पीबीएस 0.1x करने के बाद बफर बदल सकते हैं या तो डायलिसिस द्वारा या एक 100 केडीए (या कम) झिल्ली में छेद के आकार के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों का उपयोग करके।
  3. 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा या ऐसे ब्रैडफोर्ड 23, लौरी 24, या Bicinchoninic एसिड (बीसीए) के रूप में 25 वर्णमिति तरीकों का उपयोग करके एंटीबॉडी एकाग्रता का निर्धारण।
    नोट: यह क्षालन बफर (जैसे, Tris buffers), क्योंकि वे ठोस epoxy समूहों के साथ सक्रिय सतहों के लिए बाध्य करने के लिए एंटीबॉडी के साथ प्रतिस्पर्धा में अमाइन समूहों सहित बचने के लिए महत्वपूर्ण है। पु के बादrification, यह एलिसा के साथ एंटीबॉडी गतिविधि का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है।

4. प्रतिदीप्ति एंटीबॉडी लेबलिंग

  1. एक वाणिज्यिक डाइमिथाइल sulfoxide के 100 μL (DMSO) में प्रोटीन की लेबलिंग 1 मिलीग्राम के लिए डाई युक्त शीशी भंग द्वारा एक fluorochrome (जैसे, एक दूर लाल फ्लोरोसेंट रंजक) के साथ धारा 3 में प्राप्त शुद्ध एंटीबॉडी लेबल। प्रत्येक एंटीबॉडी तैयार करने के लिए भंग डाई के 2 μL 2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में जोड़े 50 मिमी फॉस्फेट बफर खारा (पीएच 8.5) में 50 μL के अंतिम मात्रा में।
  2. परिवेश के तापमान पर 1 घंटे और एक हिल मंच पर 1,200 आरपीएम के लिए निरंतर आंदोलन के तहत लेबलिंग प्रतिक्रियाओं को बनाए रखें।
  3. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा लेबल एंटीबॉडी शुद्ध (जैसे, 1.5 और 30 केडीए एक कॉलम में फंस के बीच एक विभाजन रेंज के साथ एक जेल का उपयोग), सप्लायर सिफारिशों का पालन।
  4. 280 एनएम पर और eluates में 650 एनएम पर absorbance के उपाय और labe की गणनाआपूर्तिकर्ता सिफारिशों के बाद लिंग क्षमता।
    नोट: अप करने के लिए 50 x 50 μL एंटीबॉडी लेबलिंग प्रतिक्रियाओं प्रोटीन की लेबलिंग 1 मिलीग्राम के लिए फ्लोरोसेंट डाई की एक एकल शीशी के साथ किया जा सकता है। यह एल्यूमीनियम पन्नी या वैकल्पिक साथ ट्यूब कवर करने के लिए, अपारदर्शी 0.5 एमएल ट्यूबों का उपयोग करने के लिए 4.3 चरण के बाद शमन प्रक्रियाओं से बचने के लिए सिफारिश की है। आईजीजी के लिए, इष्टतम लेबलिंग एंटीबॉडी के मोल प्रति डाई की 3-7 मोल साथ हासिल की है।

5. CYANOCHIP उत्पादन

  1. एंटीबॉडी और मुद्रण समाधान में नियंत्रण
    1. 0.01% (वी / वी) बीच 20 (एक गैर ईओण डिटर्जेंट), अंतिम सांद्रता के रूप में सभी के साथ एक वाणिज्यिक 1x प्रोटीन मुद्रण बफर में 1 मिलीग्राम / एमएल में प्रत्येक एंटीबॉडी के मिश्रण से मुद्रण समाधान में प्रत्येक शुद्ध एंटीबॉडी के 30 μL तैयार करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक एंटीबॉडी समाधान 20% ग्लिसरॉल, 1% (w / v) सुक्रोज (या trehalose, एक संरक्षक के रूप में), और 0.01% (वी / वी) कार्बोनेट बफर में बीच 20 (8.5 पीएच) हो सकती है।
    2. 30 नियंत्रण के रूप में मुद्रण समाधान के μL तैयार: 1 मिलीग्राम में 0.01% (वी / वी) बीच 20, (ख) प्रोटीन-एक शुद्ध पूर्व प्रतिरक्षा सीरम के साथ (एक) 1x प्रोटीन मुद्रण बफर / एमएल 1x प्रोटीन मुद्रण बफर के साथ 0.01% (वी / वी) बीच 20, और (ग) गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) 1 मिलीग्राम / एमएल 0.01% के साथ 1x में प्रोटीन मुद्रण बफर (वी / वी) बीच 20।
    3. विभिन्न सांद्रता (जैसे, 50 माइक्रोग्राम / एमएल 1 माइक्रोग्राम / एमएल) से कदम 5.1.1 के रूप में बीच 20 के साथ 1x प्रोटीन मुद्रण बफर, में एक fluorescently लेबल, शुद्ध पूर्व प्रतिरक्षा सीरम के 30 μL तैयार करें। इन नमूनों फ्लोरोसेंट फ्रेम मार्कर के रूप में और खोलना के बाद रिश्तेदार प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    4. ऐसे polypropylene के रूप में, उच्चतम गुणवत्ता के लिए 384 अच्छी तरह से microplates माइक्रोएरे निर्माण के लिए कदम 5.1.1, 5.1.2 में तैयार मुद्रण समाधान के प्रति अच्छी तरह से 30 μL, और 5.1.3 जोड़ें।
      नोट: प्रोटीन मुद्रण बफर गुणवत्ता और एंटीबॉडी की स्थिरता बढ़ जाती है, और बीच 20 स्थान मो homogenizesrphology और प्रोटीन युग्मन को मजबूत बनाता है। यह प्रयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 384 अच्छी तरह से microplate बनाए रखने के लिए सिफारिश की है। समय की लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। Polypropylene कम डीएनए, प्रोटीन, सेल निकालने, और छोटे अणु आंतरिक बाध्यकारी है।
  2. एक खुर्दबीन स्लाइड पर एंटीबॉडी मुद्रण
    नोट: अलग सरणी प्लेटफार्मों का उपयोग, संपर्क, विभाजन सुई, या इस तरह के पीजोइलेक्ट्रिक प्रिंटर या "स्याही जेट" प्रौद्योगिकियों के रूप में गैर संपर्क उपकरणों, जैसे से सक्रिय खुर्दबीन स्लाइड पर एंटीबॉडी प्रिंट। इस काम में, CYANOCHIP नियमित रूप से एक रोबोट प्रणाली (arrayer) माइक्रोन पैमाने पर एंटीबॉडी के नाथन मात्रा खोलना करने में सक्षम का उपयोग कर संपर्क द्वारा मुद्रित किया गया है।
    1. 50% सापेक्ष आर्द्रता - 20 डिग्री सेल्सियस और 40 के लिए मुद्रण कमरे से पर्यावरण की स्थिति निर्धारित करें।
    2. (जैसे, 75 x 25 एमएम epoxy सक्रिय माइक्रोस्कोप कांच स्लाइड) कई समान एंटीबॉडी ARRA प्रदर्शन करने के लिए स्लाइड substrates सेट अपप्रत्येक स्लाइड पर वाई एस।
    3. नियंत्रण और संदर्भ फ्रेम, एक तीन प्रतियों मौके पैटर्न में सहित प्रत्येक शुद्ध एंटीबॉडी, स्पॉट; व्यास में 200 माइक्रोन - इन शर्तों के तहत, स्पॉट 180 हैं।
    4. मुद्रण के बाद, परिवेश के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए छोड़ दें स्लाइड उन्हें सूख जाने के लिए, और फिर उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर; क्षेत्र में काम करने के लिए, स्लाइड पहुंचाया और कई महीनों के लिए परिवेश के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।
      ध्यान दें: CYANOCHIP 3 एक्स 8 स्लाइड प्रति समान प्रोटीन या एक 1 एक्स 9 माइक्रोएरे प्रारूप में 9 समान सरणियों के साथ एक तीन प्रतियों मौके माइक्रोएरे प्रारूप में छपा है। प्रत्येक सरणी आकार 24 अच्छी तरह से गैसकेट (3 एक्स 8 संकरण कक्ष में आम तौर पर 7.5 x 6.5 मिमी) के लिए प्रतिक्रिया कक्ष आयामों से अधिक नहीं होना चाहिए।
    5. माइक्रोएरे का उपयोग कर पर्यावरण के नमूनों का विश्लेषण करने से पहले, एक अनुमापन की अवस्था में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए काम कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के FSMI का उपयोग करें। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, इसी आई एम एम की एक मानक एकाग्रता का उपयोगunogen (10 3 - 10 4 कोशिकाओं / एमएल) और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के धारावाहिक dilutions (1 के बीच: 500 और 1: 32,000)। इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता अनुमापन की अवस्था में प्राप्त अधिकतम संकेत तीव्रता का 50% से मेल खाती है। इसके अलावा, संवेदनशीलता और प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए विशिष्टता, निर्धारित किया जाना चाहिए ब्लैंको एट अल में वर्णित है। 22।

6. फ्लोरोसेंट सैंडविच माइक्रोएरे Immunoassay के लिए पर्यावरण Multianalyte अर्क की तैयारी (FSMI)

  1. एक तरल नमूना से Multianalyte निकालने
    1. ; तरल नमूना के 100 एमएल के एक बाँझ सिरिंज के साथ (जैसे एक जलाशय के तट से पानी,) - 1 ले लो नमूना की मात्रा बहुत लक्ष्यों की संभावित एकाग्रता पर निर्भर है।
    2. एक 3 माइक्रोन रोमकूप आकार 47 मिमी व्यास पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से पानी के नमूने से गुजर रहा कोशिकाओं ध्यान लगाओ; एक सेलुलर एकाग्रता10 के बीच 3 - कोशिकाओं 10 8 / एमएल सकारात्मक पता लगाने के लिए वांछनीय है, लेकिन वास्तविक एकाग्रता अज्ञात है।
    3. साथ यह scraping द्वारा; बायोमास एक संशोधित Tris बफर खारा के 1 एमएल, बीच 20 प्रबलित बफर (0.4 एम Tris एचसीएल (पीएच 8), 0.3 एम NaCl, और 0.1% बीच 20 TBSTRR) के साथ फिल्टर में एकत्र की वसूली एक 15 एमएल ट्यूब में एक रंग।
    4. Homogenize और, या बस नीचे कई बार ऊपर pipetting और 1.5 चरण में वर्णित के रूप में, एक हाथ से आयोजित अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर का उपयोग करके disaggregate; इस माइक्रोएरे द्वारा विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करता है।
  2. एक ठोस नमूना से Multianalyte निकालने
    1. एक 10 एमएल ट्यूब में ठोस नमूना की 0.5 ग्राम (जैसे, रॉक, मिट्टी, या अवसादों) तक वजन और TBSTRR के 2 एमएल को जोड़ें।
    2. ट्यूब में sonicator जांच डुबो, एक शक्तिशाली sonicator सींग का पानी के स्नान में ट्यूब सूई से, या एक हाथ से आयोजित sonicator का उपयोग करके द्वारा sonicate। प्रदर्शन करना कम से कम 5 x 30 s30 kHz पर चक्र, 30 एस जबकि बर्फ पर रोक नहीं सकता।
    3. एक 10 एमएल सिरिंज एक 10 करने के लिए 12 मिमी व्यास के लिए युग्मित, 5- 20 माइक्रोन के लिए ताकना आकार नायलॉन फिल्टर धारक के साथ रेत, मिट्टी, और अन्य मोटे सामग्री को हटाने के लिए फ़िल्टर। एक 1.5 एमएल ट्यूब में फिल्टर के माध्यम से नमूना पुश। अगर फिल्टर संतृप्त, सिरिंज में निलंबन आंदोलन और एक नया एक के पास ले; इस प्रतिरक्षा (चरण 7) के लिए छानना सामग्री तैयार करता है।
      ध्यान दें: TBSTRR की प्रतिरोधक क्षमता नमूना के प्रकार पर निर्भर करता है। यह पर्यावरण निकालने की तैयारी के तुरंत बाद प्रतिरक्षा बाहर ले जाने के लिए analytes पर enzymatic गिरावट के प्रभाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, अगले चरण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर पर्यावरण निकालने और फ्रीज में प्रोटीज अवरोधकों जोड़ें।

7. फ्लोरोसेंट सैंडविच माइक्रोएरे Immunoassay (FSMI)

  1. CYANOCHIP अवरूध्द
    नोट: तुरंत उपयोग करने से पहले, पी इलाजrinted स्लाइड पर सभी मुक्त epoxy समूहों को ब्लॉक करने और गैर covalently बाध्य एंटीबॉडी से अधिक दूर करने के लिए स्लाइड।
    1. 5% के साथ 0.5 एम Tris एचसीएल (पीएच 9) में विसर्जित कर दिया माइक्रोएरे (w / v) बीएसए एक स्वच्छ सतह पर हल्के आंदोलन के साथ एक घुमाव मंच से 5 मिनट के लिए समाधान (जैसे, पेट्री डिश या एक 50 एमएल ट्यूब)। वैकल्पिक रूप से, यह सामना करना पड़ रहा माइक्रोएरे धब्बों के साथ ऊपर समाधान की एक 100- 200 μL करने के लिए ड्रॉप पर नीचे स्लाइड लेट गई। 3 के लिए छोड़ दो - 5 मिनट और फिर आगे बढ़ें।
    2. ध्यान से प्लास्टिक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग स्लाइड लेने के; दिल को छू लेने माइक्रोएरे क्षेत्रों से बचने के लिए प्रयास करें। धीरे एक कागज तौलिया पर स्लाइड दस्तक द्वारा तरल से अधिक हटा दें। 2% के साथ 0.5 एम Tris एचसीएल (पीएच 8) (w / v) एक घुमाव मंच से हल्के आंदोलन के साथ 30 मिनट के लिए बीएसए समाधान में विसर्जित कर दिया।
    3. (- 1 मिनट के लिए 300 XG 200) एक वाणिज्यिक खुर्दबीन स्लाइड के लिए अनुकूलित microcentrifuge का उपयोग कर एक छोटी centrifugation प्रदर्शन से स्लाइड सूखी। वैकल्पिक रूप से, धीरे ONT दस्तक द्वारा स्लाइड सूखीOA कागज तौलिया।
  2. माइक्रोएरे साथ multianalyte नमूना निकालने की ऊष्मायन
    1. कई प्रोटीन के लिए 24 कुओं के साथ एक वाणिज्यिक माइक्रोएरे संकरण कैसेट में स्लाइड ढांचा; प्रदाता निर्देशों का पालन करें।
    2. स्लाइड और कैसेट विधानसभा के बाद, नमूना निकालने या कैसेट के प्रत्येक कुएं में TBSTRR में यह के कमजोर पड़ने के 50 μL के लिए ऊपर पिपेट।
    3. प्रत्येक नमूना के लिए दोहराएँ कदम 7.2.2 विश्लेषण किया जा सके।
    4. एक खाली नियंत्रण के रूप में, पिपेट 50 TBSTRR की μL कैसेट के कम से कम दो अलग-अलग कुओं में बफर।
    5. हर 15 मिनट pipetting द्वारा या हल्के झटकों के तहत इसे छोड़ने से मिश्रण के साथ 1 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए सेते हैं।
      नोट: माइक्रोएरे पैटर्न के एक समारोह के रूप में अन्य ऊष्मायन गास्केट का प्रयोग करें। समय और कदम 7.2.5 में ऊष्मायन के तापमान अनुभवजन्य पैरामीटर है कि सामान्य रूप से समानता और बाध्यकारी Ki पर निर्भर हैंप्रत्येक की netics प्रतिजन एंटीबॉडी बनती।
  3. धुलाई
    1. कैसेट नीचे डाल रहा है और ध्यान से एक साफ, शोषक कागज पर यह दस्तक से नमूने निकालें।
    2. , जैसा कि ऊपर हर एक के लिए TBSTRR के 150 μL जोड़कर कुओं धो लें, और बफर को समाप्त।
    3. दोहराएँ कदम 7.3.2 तीन गुना अधिक।
  4. फ्लोरोसेंट डिटेक्टर एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन
    1. एक एंटीबॉडी 17 विरोधी cyanobacterial तनाव एंटीबॉडी युक्त मिश्रण के 50 μL जोड़ें, प्रत्येक 1% (w / v) बीएसए के साथ TBSTRR में fluorochrome के साथ लेबल। मिश्रण में प्रत्येक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की एकाग्रता का निर्धारण (0.7 से 2 माइक्रोग्राम / एमएल) प्रत्येक प्रतिजन / एंटीबॉडी जोड़ी 22 का अनुमापन प्रयोगों के प्रदर्शन से।
    2. कदम 7.2.5 में वर्णित है, या 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए के रूप में, परिवेश के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. बाहर धोने फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी </ Strong>
    1. फ्लोरोसेंट अनबाउंड एंटीबॉडी निकालें, कदम 7.3 के रूप में।
    2. कैसेट अलग करना और एक त्वरित कुल्ला के लिए 0.1x पीबीएस में स्लाइड (जैसे, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में) विसर्जित कर दिया।
    3. कदम 7.1.3 के रूप में स्लाइड सूखी।

8. प्रतिदीप्ति के लिए स्कैनिंग

  1. प्रतिदीप्ति के लिए एक स्कैनर में दूर लाल फ्लोरोसेंट रंजक के लिए अधिकतम उत्सर्जन प्रतिदीप्ति चरम पर प्रतिदीप्ति के लिए स्लाइड स्कैन करें। विभिन्न स्कैनिंग मापदंडों पर प्रोटीन के कई चित्र लेने, आम तौर पर लेजर लाभ मूल्य को कम करके।
    नोट: बचें संतृप्त धब्बे (> 65,000 प्रतिदीप्ति मायने रखता है) -वे पैमाने से बाहर हैं और मात्रा का ठहराव त्रुटियों को पेश हो सकता है।

9. इमेज प्रोसेसिंग और डेटा विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; ई के लिए, (एक ही स्थान से मंझला या सभी पिक्सल का मतलब FI) सॉफ्टवेयर प्रतिदीप्ति तीव्रता का मापन प्रदान करता हैपूरे माइक्रोएरे की ACH हाजिर। - FI स्थानीय पृष्ठभूमि FI = FI स्पॉट: स्पॉट आसपास स्थानीय पृष्ठभूमि घटाएँ।
  2. Fi डेटा बचाने के लिए और एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग कर उन्हें खुला।
  3. मूल्यों नकारात्मक नियंत्रण की पहचान करने और झूठी सकारात्मक त्यागने के रूप में खाली सरणियों के लिए प्राप्त प्रयोग करें। निम्न समीकरण लागू प्रत्येक एंटीबॉडी स्थान के लिए वित्तीय गणना करने के लिए: FI = (एफआई नमूना - FI खाली), जहां FI नमूना = FI जगह - प्रोटीन में वाई-फ़ाई स्थानीय पृष्ठभूमि नमूना अर्क और खाली FI = FI स्थान के साथ चलाने - FI स्थानीय पृष्ठभूमि खाली प्रोटीन में।
  4. 2- करने के लिए एक अतिरिक्त सीमा कट-ऑफ लागू पूरे माइक्रोएरे की FI झूठी सकारात्मक की संभावना को कम करने के लिए की औसत 3 गुना; इस गरीब गुणवत्ता माइक्रोएरे छवियों और कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है।
  5. भूखंडों बनाएं और / या आवश्यक के रूप में आगे विश्लेषण करते हैं।

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Representative Results

इस काम के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक मीठे पानी cyanobacterial प्रजातियों के एक साथ पहचान (1 टेबल) CYANOCHIP एंटीबॉडी माइक्रोएरे प्रयोग करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा परीक्षण का वर्णन है। माइक्रोएरे एक 3 एक्स 8 माइक्रोएरे खुर्दबीन स्लाइड पर मुद्रित प्रारूप हो सकता है। प्रत्येक माइक्रोएरे एक तीन प्रतियों मौके पैटर्न में छपी 17 एंटीबॉडी का एक सेट, उनके इसी पूर्व प्रतिरक्षा एंटीबॉडी और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बीएसए से बना है। प्रोटीन भी एक fluorescently लेबल पूर्व प्रतिरक्षा एंटीबॉडी का उपयोग आसानी से माइक्रोएरे पैटर्न 22 (चित्रा 1) स्थानीय बनाना, एक फ्लोरोसेंट फ्रेम शामिल हैं।

माइक्रोएरे मीठे पानी Lozoya जलाशय है, जो मैड्रिड के शहर की आपूर्ति के तट पर एकत्र पानी के नमूनों की बगल में विश्लेषण के लिए क्षेत्र में परीक्षण किया गया था। नमूने के रूप में ऊपर वर्णित प्रोसेस किया गया है, औरमुख्य सकारात्मक immunoreactions ऐसे Microcystis एसपीपी के रूप में planktonic cyanobacteria, के लिए एंटीबॉडी के लिए corresponded। (K4 और K5), और इस तरह के Leptolyngbya एसपीपी के रूप में Oscillatoriales, Benthic करने के लिए। (K10 और K15)। लोअर प्रतिदीप्ति संकेतों Nostocales (K6 और K12, दो planktonic Aphanizomenon एसपीपी।), Benthic Rivularia सपा से प्राप्त किया गया। (K8), Anabaena सपा। (K1), और planktonic Microcystis Flos-Aquae सपा। (K3)। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप टिप्पणियों (नहीं दिखाया गया है) एक विविध cyanobacterial समुदाय से पता चला तट से प्रचुर मात्रा में भूजात मलबे के भीतर। Anabaena की कई प्रजातियों समुदाय, लेकिन Microcystis एसपीपी बोलबाला है। और Pseudanabaena एसपीपी। यह भी उपस्थित थे।

इसके अतिरिक्त, माइक्रोएरे भी cyanobacterial एमए की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए अंटार्कटिका में मैक्मुर्डो आइस शेल्फ में एकत्र एक सूखी, लगभग 1,000 साल पुराने माइक्रोबियल चटाई परख करने की क्रिया द्वारा मान्य किया गया थाrkers। चित्रा 1 Anabaena सपा सहित अन्य अंटार्कटिक मैट, से अलग cyanobacteria Benthic का उत्पादन करने के एंटीबॉडी में अत्यधिक फ्लोरोसेंट, सकारात्मक प्रतिक्रियाओं से पता चलता है। और Leptolyngbya एसपीपी। (K14 और K15, क्रमशः)। अतिरिक्त सकारात्मक immunoreactions ऐसे Microcystis एसपीपी के रूप में planktonic cyanobacteria, एंटीबॉडी के साथ पाया गया। (K4 और K5), Aphanizomenon एसपीपी। (K6 और K12), और Planktothrix सपा rubescens। (K17)। कम संकेतों अन्य benthic Tolypothrix सपा सहित एक अंटार्कटिक चटाई में अलग प्रजातियों के लिए एंटीबॉडी से प्राप्त किया गया। (K16) और Anabaena सपा। (K1)। फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी संरचनात्मक रूप cyanobacteria और हरी शैवाल के समान कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चला (नहीं दिखाया गया है)। कोई filamentous cyanobacteria पहचान की गई। फिर भी, के बारे में 1 माइक्रोन आकार और प्रचुर फैलाना प्रतिदीप्ति में के कई अनाकार फ्लोरोसेंट संरचनाओं का पता लगाया गया, whiचर्चा सेल अवशेष की उपस्थिति (टूटा हुआ है और मृत कोशिकाओं) और बाह्य polymeric पदार्थों (ईपीएस), क्रमशः के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। तदनुसार, जैव रासायनिक विश्लेषण से पता चला है कि चटाई biopolymers और सेल अवशेष (जटिल जैविक बात है) कि माइक्रोएरे में एंटीबॉडी के लिए लक्ष्य हो सकता है की विपुल मात्रा में शामिल थे।

आकृति 1
चित्रा 1: का पता लगाने के लिए Cyanobacteria त्वरित और विश्वसनीय मल्टीप्लेक्स माइक्रोएरे Immunoassay। ए) योजना एक CYANOCHIP के साथ बहु-लक्ष्य के नमूनों के विश्लेषण के लिए FSMI के मुख्य कदम दिखा। बी) के एक प्रिंटिंग पैटर्न लेआउट के योजनाबद्ध (तीन प्रतियों से) विरोधी cyanobacteria एंटीबॉडी संग्रह की: (0) बीएसए, गोजातीय सीरम albumin; (एक्स) केवल मुद्रण बफर; (1-17) के रूप में तालिका 1 में बी में एंटीबॉडी के प्रत्येकलैंको एट अल। 2015 (K17 को K1)। P1 से P17 के लिए, इसी पूर्व प्रतिरक्षा एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। पीले रंग की आयतों एक फ्रेम संदर्भ के रूप में एक फ्लोरोसेंट मौके ढाल के अनुरूप हैं। सी और डी) चित्र मैक्मुर्डो आइस शेल्फ (अंटार्कटिका) और CYANOCHIP की छवि क्रमशः, इस चटाई में cyanobacteria का पता लगाने से एक 1,000 साल पुराने सूखे माइक्रोबियल चटाई के शीर्ष भाग दिखा। ई) Lozoya जलाशय नमूने के समय में कोई दिखाई हरी कणों के साथ पारदर्शी पानी दिखाने का मनोरम दृश्य। एफ) पानी के नमूने के बगल में विश्लेषण के बाद माइक्रोएरे छवि (संदर्भ 22 से संशोधित)।

Ab कोड Immunogen (तनाव) व्यवस्था वास संस्कृति की स्थिति
K1 Anabaena सपा। Nostocales अनजान BG11 और नाइट्रेट 30 डिग्री सेल्सियस, निरंतर प्रकाश
K2 Anabaena सपा। Nostocales अनजान BG11o 30 डिग्री सेल्सियस, निरंतर प्रकाश
K3 Microcystis Flos-Aquae Chroococcales planktonic BG11 28 डिग्री सेल्सियस, निरंतर प्रकाश
K4 Microcystis novacekii Chroococcales planktonic BG11 28 डिग्री सेल्सियस, निरंतर प्रकाश
K5 Microcystis aeruginosa Chroococcales planktonic BG11 28 डिग्री सेल्सियस, निरंतर प्रकाश
K6 Aphanizomenon ovalisporum Nostocales planktonic BG11o 28 डिग्री सेल्सियस, निरंतर प्रकाश
K7 Phormidium सपा। Oscillatoriales benthic BG11 18 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K8 Rivularia सपा। Nostocales benthic चू-डी 18 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K9 Chamaesiphon सपा। Chroococcales benthic BG11 18 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K10 Leptolyngbya boryana Oscillatoriales benthic BG11 18 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K11 Tolypothrix distorta Nostocales benthic BG11o 18 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K12 Aphanizomenon aphanizomenoides Nostocales planktonic BG11o 28 डिग्री सेल्सियस, निरंतर प्रकाश
K13 नोस्टॉक सपा। (अंटार्कटिका) Nostocales benthic BG11o 13 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K14 Anabaena सपा। Nostocales benthic BG11o 13 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K15 Leptolyngbya सपा। Oscillatoriales benthic BG11 13 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K16 Tolypothrix सपा। Nostocales benthic BG11 13 डिग्री सेल्सियस, 16-8 photoperiod
K17 Planktothrix rubescens Oscillatoriales planktoएनआईसी कोई नहीं कोई नहीं

तालिका 1। एंटीबॉडी (पेट) और cyanobacterial खींच CYANOCHIP 22 का उत्पादन किया जाता की सूची।

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Discussion

इधर, एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट सैंडविच CYANOCHIP, पता लगाने और cyanobacterial पीढ़ी की एक विस्तृत श्रृंखला की पहचान के लिए एक 17 एंटीबॉडी माइक्रोएरे, का उपयोग प्रतिरक्षा 22 में वर्णित है। ये cyanobacteria, उनमें से कुछ किया जा रहा है विष उत्पादकों मीठे पानी के निवास में सबसे लगातार benthic और planktonic पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं। हाल ही में, फ्लोरोसेंट सैंडविच प्रतिरक्षा प्रारूप पर्यावरण अनुप्रयोगों 26, 27, 28 में सूक्ष्मजीवों और / या bioanalytes की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रोटोकॉल मुख्य रूप से दो कदम पर आधारित है: (i) immobilizing या कब्जा एंटीबॉडी विशेष रूप से एक परीक्षण के नमूने और से analytes बाध्य करने के लिए (ii) fluorescently लेबल एंटीबॉडी (दरियाफ्त या डिटेक्टर एंटीबॉडी) का उपयोग करके analyte एंटीबॉडी का पता लगाने जोड़े। क्योंकि सैंडविच परख के लिए analyte में कम से कम दो सुलभ एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों (epitopes) की आवश्यकताप्रतिक्रिया जगह लेने के लिए, किसी भी सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेत अपेक्षाकृत बड़े और जटिल oligo- या multimeric analytes कि समान या अत्यधिक कब्जा एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए इस्तेमाल लोगों के लिए समान हैं की उपस्थिति इंगित करता है।

हालांकि यह विधि छोटे संस्करणों और बुनियादी नमूना तैयार करने, विशेष विशेषज्ञता या ज्ञान की आवश्यकता के बिना की आवश्यकता है, कई कमियां परख बर्बाद कर सकता है। कम फ्लोरोसेंट संकेत या एक पूर्ण अभाव क्या गरीब एंटीबॉडी शुद्धि या गरीब लेबलिंग दक्षता के कारण हो सकता है। खरगोश आईजीजी के अलगाव के लिए, प्रोटीन ए क्योंकि यह विशेष इम्युनोग्लोबुलिन के एफसी क्षेत्र के लिए उच्च दक्षता के साथ बांधता है, सबसे अच्छा विकल्प है। जैसा कि धारा 4 में संकेत दिया है, एंटीबॉडी के तिल प्रति डाई की 3-7 मोल के बीच एक सीमा के साथ लेबलिंग फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट धब्बे की कमी का पता लगाने की सीमा के नीचे झूठ बोल analytes की एकाग्रता से समझाया जा सकता है। इस मामले में, नमूना सान्द्र हो सकता हैentrated माइक्रोएरे, या अधिक से अधिक मात्रा के साथ यह incubating से पहले एक नया निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उच्च फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि में अक्षम चिप अवरुद्ध या / और वाशिंग चरणों का और खनिज और जटिल कार्बनिक पदार्थ है कि चिप पर छड़ी से बना नमूनों से अर्क का परिणाम है। जटिल नमूने analytes के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, यह analyte एंटीबॉडी जोड़े के बीच विशेष बातचीत के पक्ष में नमक और / या डिटर्जेंट एकाग्रता बढ़ाने के लिए वांछनीय है।

हाल के वर्षों में, एंटीबॉडी माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी पर्यावरण अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है। बहरहाल, इस तकनीक के उपयोग के कुछ सीमाओं को शामिल करता है। पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी तेज और सस्ता उत्पादन करने के लिए और अधिक महत्वपूर्ण बात, संभावना एक जटिल पर्यावरण नमूने में किसी भी लक्ष्य मिलान के लिए बाध्य कर रहे हैं मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ अधिक से सैद्धांतिक रूप से अधिक है। हालांकि, इस तथ्य है कि वे अलग epitopes को पहचान सकते हैं FSM में पार प्रतिक्रियाओं की संख्या बढ़ जाती हैमैं उच्च विशिष्टता के तरीकों के उपयोग, deconvolution तरीकों 26, 27 का उपयोग कर उदाहरण के लिए, उच्च वांछनीय है द्वारा सच्चे आत्मीय प्रतिजन प्रतिरक्षी प्रतिक्रियाओं से इन घटनाओं को पार जेट सुलझाना हासिल करने के लिए। असल में, माइक्रोएरे कई का पता लगाने और cyanobacteria के वर्गीकरण के लिए एक गुणात्मक biosensor माना जाता है। इस संबंध में, यह प्रत्येक एंटीबॉडी एक-एक करके परख में उनके इष्टतम काम कर रहे सांद्रता का उपयोग करने के लिए पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। हालांकि इस माइक्रोएरे, FSMI के साथ एक साथ, एक मात्रात्मक विधि के रूप में कल्पना नहीं है, biosensor, उच्च संवेदनशीलता का तात्पर्य है क्योंकि CYANOCHIP 22 में निहित एंटीबॉडी के अधिकांश के कम का पता लगाने सीमा 10 2 10 3 के लिए कोशिकाओं / एमएल से है।

इन सीमाओं के बावजूद, इस पद्धति अन्य पर्यावरणीय मीटर में इस्तेमाल तकनीक के खिलाफ कई फायदेonitoring। एंटीबॉडी biosensors एक भी विश्लेषण, analytes की कम एकाग्रता का पता लगाने की संभावना में एक साथ अलग अणुओं को पहचानने की संभावना है, और लगभग किसी भी पदार्थ के खिलाफ एंटीबॉडी के उत्पादन की संभावना अनुमति देते हैं। इसके अलावा, माइक्रोएरे को प्राप्त कर सकते हैं 24 एक एकल परख में विश्लेषण करने के लिए, 10 2 कोशिकाओं / एमएल से पता लगाने की सीमा के साथ। अन्य तरीकों के साथ तुलना में, एंटीबॉडी जीवित या मृत कोशिकाओं, बाह्य सामग्री, और सेलुलर मलबे का पता लगा सकते हैं। हालांकि यह पूरी परख पूरा करने के लिए कम से कम 4 घंटे लगते हैं, यह पर्यावरण की निगरानी करने के लिए लागू अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों से भी तेज है। CYANOCHIP मूल cyanobacterial उपभेदों की पहचान के लिए नियोजित किया गया था। इस biosensor औपचारिक रूप से, उस उद्देश्य के लिए तैयार नहीं था तो यह संभावित विष उत्पादकों की पहचान कर सकते हैं और नए उपभेदों की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ एंटीबॉडी जोड़कर भविष्य में सुधार किया जा सकता है। ऐसे एलिसा, PPIA, और नयूरोचेमिकल के रूप में जैव रासायनिक assays,चूहों में परीक्षण, cyanotoxins की पहचान की अनुमति है, लेकिन वे कुछ ज्ञात विषाक्त पदार्थों को प्रतिबंधित कर रहे हैं और झूठी सकारात्मक दे सकते हैं। इसके अलावा, CYANOCHIP का उपयोग विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है, जबकि ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और माउस bioassays प्रशिक्षित कर्मियों या जीवित पशुओं के साथ श्रम साध्य काम की आवश्यकता होती है, और वे एक नमूने में मौजूद विषाक्त पदार्थों के प्रकार के बारे में जानकारी नहीं देते। Cyanotoxins भी पहचान की है और इस तरह के HPLC, जीसी एमएस, या MALDI-TOF के रूप में अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों, द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इन तरीकों में, नमूना शुद्ध होना चाहिए, और संदर्भ मानकों की कमी cyanotoxins की पहचान की सीमा। इसके अलावा, विश्लेषणात्मक तरीकों महंगे उपकरण और आपूर्ति और विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। आणविक विधियों, नमूनों से डीएनए निष्कर्षण के आधार पर कर रहे हैं, जबकि FSMI केवल एक पर्यावरण निकालने बहुत ही सरल कदम के एक जोड़े में तैयार, cyanobacteria शुद्धि के बिना की आवश्यकता है।

के लिए CYANOCHIP के उच्च प्रदर्शनबगल में मीठे पानी के जलाशयों में cyanobacteria का पता लगाने के लिए यह पानी प्रशासकों की पूर्व चेतावनी के लिए एक नया उपकरण बनाती है। इसके अलावा, माइक्रोएरे भी Astrobiology के क्षेत्र के लिए दिलचस्प है, विशेष रूप से जीवन के साक्ष्य के रूप में माइक्रोबियल मार्कर के लिए खोज के लिए है। extremophiles के अध्ययन से हमें मदद कर सकते हैं पृथ्वी पर जीवन की उत्पत्ति को समझने के लिए और कैसे जीवन चरम वातावरण हमारे सौर मंडल में और परे वर्तमान में जीवित रह सकता है। पृथ्वी पर कई वातावरण बहुत ही ऐसी मंगल ग्रह के रूप में अन्य ग्रहों, पर स्थानों के लिए समान हैं के रूप में, यह विलुप्त जीवन के सबूत के रूप में संश्लेषक प्रोकैर्योट के अवशेष खोजने के लिए संभव हो सकता है। माइक्रोएरे रहने वाले या कोशिकाओं निर्जीव से cyanobacterial मार्कर की पहचान करने में सक्षम था; आबादी बनी हुई है और / या पुराने माइक्रोबियल मैट (चित्रा 1) में बाह्य सामग्री; और पानी, मिट्टी, चट्टानों और ऐसे अंटार्कटिका, अटाकामा, रेडियन झीलों, उच्च आर्कटिक, या के रूप में चरम वातावरण में एकत्र सेस्पेन में रियो टिंटो क्षेत्र (नहीं दिखाया गया है)। कर रहे हैं यह देखते हुए कि cyanobacteria पृथ्वी पर आदिम सूक्ष्मजीवों, वहाँ विश्वास है कि वे एक बार अन्य ग्रहों पर रहते थे हो सकता है कारण है।

अंत में, इस तथ्य CYANOCHIP-FSMI सीटू cyanobacterial मार्करों में पहचान है कि कर सकते हैं और यहां तक कि उन्हें अलग phylotypes या समूहों के लिए संबद्ध कर सकते हैं, और माइक्रोएरे, निवास की एक विस्तृत रेंज, प्लवक, benthos, और endoliths के उन सहित शामिल किया गया यह है कि यह दर्शाता है कि तकनीक पर्यावरण निगरानी के लिए एक उपकरण सकता है। माइक्रोएरे करने के लिए भविष्य में सुधार इतना है कि प्रासंगिक वंशावली समूहों अभी भी लंबित शामिल किए गए हैं नए उपभेदों के लिए एंटीबॉडी की संख्या में वृद्धि हो सकती है। इसके अतिरिक्त, चिप ऐसे विषाक्त पदार्थों या cyanophicin बहुलक के रूप में विशिष्ट cyanobacterial यौगिकों, एंटीबॉडी के साथ लागू किया जा सकता है। यह मानव सुविधाओं में ताजे पानी के जलाशयों, पाइप, और प्रतिष्ठानों की निगरानी के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। वर्तमान माइकरoarray और भविष्य के संस्करणों या तो जीवन का पता लगाने के लिए या मानव अंतरिक्ष सुविधाएं (जैसे, निगरानी पानी जलाशयों या जीवन समर्थन प्रणाली) की निगरानी के लिए, Astrobiology के क्षेत्र में बहुत उपयोगी हो जाएगा। वास्तव में, हम नियमित रूप से जीवन के "ऑन-साइट 'का पता लगाने रहता है के लिए एक विधि के रूप में चरम वातावरण के लिए क्षेत्र अभियानों में माइक्रोएरे का उपयोग करें। माइक्रोएरे तथाकथित लाइफ डिटेक्टर चिप (LDChip), ग्रहों के अन्वेषण मिशन 29, 30 में जीवन के लिए खोज के लिए 300 से अधिक एंटीबॉडी के साथ एक माइक्रोएरे का हिस्सा है। माइक्रोएरे अकेले या LDChip के हिस्से के रूप में स्थलीय analogues करने के लिए कई क्षेत्र अभियानों में ग्रहों के अन्वेषण के लिए ठोस LDChip अवधारणा को मान्य करने के लिए लाइफ डिटेक्टर (ठोस) साधन 29 के लक्षण में लागू किया जाएगा। माइक्रोएरे की पहचान cyanobacteria और / या उनके द्वारा विषाक्त पदार्थों को उपयोगी जानकारी प्रदान करेगा। उपभेदों का निर्धारण करके, यह सैनिक जाएगावातावरण और निवास जिसमें वे विकसित किया है के बारे में जानकारी।

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Acknowledgments

हम cyanobacterial उपभेदों प्रदान करने के लिए Universidad ऑटोनोमा डे मैड्रिड से डा एंटोनियो Quesada धन्यवाद। इस काम Subdirección जनरल डी PROYECTOS डे स्पेनिश Ministerio de Economía y Competitividad की Investigación (MINECO) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, कोई अनुदान। AYA2011-24803 और ESP2014-58494 आर।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 mm pore diameter filters Millipore GSWP04700 For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge Fisher Scientific For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) Thermo Fisher Scientific 70011036 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H Hielscher For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant  Sigma-Aldrich F5881 Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant Sigma-Aldrich  F5506 For boost injections
Protein A antibody purification kit   Sigma-Aldrich PURE1A  For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa Millipore UFC510096-96K For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated Sigma-Aldrich D7884-10FT For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns  GE-HealthCare GE27-5330-02 For isolation of IgG
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916-500 mL To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit  Thermo Scientific 23235 To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2x Whatman (Sigma Aldrich)  S00537 Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20  Sigma-Aldrich  P9416 Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich  A9418 Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate Genetix X6004 For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides MicroGrid II TAS arrayer from Digilab For antibody printing
Epoxy substrate glass slides Arrayit corporation VEPO25C Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester  Molecular probes A20006 Fluorochrome
DMSO  Sigma-Aldrich  D8418 Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker Fisher Scientific For antibody labeling 
Illustra Microspin G-50 columns  Healthcare 27-5330-01 For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0.5 mL tubes Sarstedt 72,704,001 For labeled antibodies storage 
Nanodrop 1000 spectrophotometer Thermo Scientific To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter Millipore TMTP04700 To concentrate cells
1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 Sigma-Aldrich  T3038 For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653 For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters  Millipore NY2004700 For environmental extract preparation
10 - 12 mm filter holders Millipore SX0001300 For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich  P8340 For environmental extract storage
1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 Sigma-Aldrich  T2819 To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker VWR To block slides; for incubation processes 
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge VWR C1403-VWR To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette Arrayit corporation AHC1X24 Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner  Molecular Devices Scanner for fluorescence
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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 120 cyanobacteria CYANOCHIP पर्यावरण निगरानी ​​एंटीबॉडी माइक्रोएरे पोर्टेबल फ्लोरोसेंट प्रतिरक्षा मीठे पानी जलाशय की निगरानी
पता लगाने के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल<em&gt; Cyanobacteria</emएक एंटीबॉडी माइक्रोएरे चिप के साथ तरल और ठोस नमूने में&gt;
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Blanco, Y., Moreno-Paz, M., Parro, V. Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip. J. Vis. Exp. (120), e54994, doi:10.3791/54994 (2017).

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