Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

दवा उपचार और Published: January 1, 2017 doi: 10.3791/55025
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 2NUS Centre for Bioimaging Sciences (CBIS), National University of Singapore

Abstract

बोन बनाने अस्थिकोरक अस्थि-resorbing अस्थिशोषकों के साथ बातचीत हड्डी मैट्रिक्स का कारोबार करने के लिए समन्वय और कंकाल homeostasis को नियंत्रित करने के। Medaka और zebrafish लार्वा को व्यापक रूप से हड्डी गठन, अध: पतन, और मरम्मत के दौरान अस्थि कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। उनके ऑप्टिकल स्पष्टता fluorescently लेबल अस्थि कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट रंगों mineralized कंकाल मैट्रिक्स के लिए बाध्य के दृश्य के लिए अनुमति देता है। हमारी प्रयोगशाला ट्रांसजेनिक medaka मछली है कि एक गर्मी सदमे inducible प्रमोटर के नियंत्रण में अस्थिशोषक उत्प्रेरण कारक परमाणु कारक κB ligand (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक का इजहार उत्पन्न किया है। सक्रिय अस्थिशोषकों, जो cathepsin कश्मीर (ctsk) प्रमोटर के नियंत्रण में nlGFP अभिव्यक्ति के साथ संवाददाता लाइनों में देखे जा सकते हैं से अधिक गठन में RANKL परिणामों के अस्थानिक अभिव्यक्ति। RANKL प्रेरण और अस्थानिक अस्थिशोषक गठन गंभीर ऑस्टियोपोरोसिस की तरह phenotypes की ओर जाता है। यौगिक ट्रांसजेनिक medaka लीएनईएस कि ctsk एक्सप्रेस: nlGFP अस्थिशोषकों, साथ ही समय से पहले अस्थिकोरक में osterix (OSX) प्रमोटर के नियंत्रण में mCherry में, दोनों प्रकार की कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह हड्डी अध: पतन और मरम्मत की शर्तों के तहत सेलुलर व्यवहार के vivo अवलोकन की सुविधा। यहाँ, हम आमतौर पर मानव हड्डियों की कमजोरी के उपचार में इस्तेमाल एक दवा परीक्षण और लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए इस प्रणाली के उपयोग का वर्णन। Medaka मॉडल सेल संस्कृति और चूहों में पढ़ाई के पूरक है, और कंकाल प्रणाली में दवा कार्रवाई के vivo विश्लेषण के लिए एक उपन्यास प्रणाली प्रदान करता है।

Introduction

कशेरुकी कंकाल, संरचनात्मक समर्थन और अंगों के लिए सुरक्षा प्रदान करता है गतिशीलता की अनुमति देता है, और कैल्शियम का एक स्रोत के रूप में कार्य करता है। जीवन के दौरान, बाह्य मैट्रिक्स हड्डी लगातार खत्म कर दिया है हड्डी स्थिरता और कठोरता को बनाए रखने के लिए। इस प्रक्रिया को कसकर समन्वित गतिविधि और बोन बनाने अस्थिकोरक और हड्डी resorbing अस्थिशोषकों की परस्पर क्रिया की आवश्यकता है। अस्थिकोरक multipotent mesenchymal progenitors से ली गई है और osteoid, हड्डी मैट्रिक्स 10 के प्रोटीन हिस्से के रूप में कोलेजन का उत्पादन कर रहे हैं। अस्थिकोरक अस्थिशोषकों के साथ बातचीत दोनों प्रकार की कोशिकाओं, जो हड्डी homeostasis 7 को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है की एक संतुलित गतिविधि को प्राप्त करने के लिए। क्योंकि इन जटिल नियामक बातचीत की, नशीली दवाओं के उपचार और हड्डी homeostasis के लिए प्रतिक्रियाओं को पूरी तरह से इन विट्रो अध्ययन में उपयोग कर जांच नहीं की जा सकती। इसलिए, वहाँ पशु मॉडल के लिए एक मजबूत मांग है। सेल संस्कृति सेटिंग्स की तुलना में, विवो मॉडल में प्रदान कर सकते हैंहड्डी वातावरण में बहुकोशिकीय नेटवर्क में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि।

कई माउस मॉडल ऑस्टियोपोरोसिस 16 सहित मानव हड्डी विकारों की एक किस्म के लिए मौजूद हैं। हालांकि, आकार और माउस भ्रूण की पहुंच कंकाल की प्रक्रियाओं का जीना इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। छोटे Teleost मछली, दूसरे हाथ पर, vivo इमेजिंग के लिए एक आकर्षक विकल्प के रूप में सेवा करते हैं। Zebrafish (Danio rerio) और medaka (Oryzias latipes) पिछले दो दशकों के 17, 19, 22, 24 से अधिक कंकाल अनुसंधान के लिए लोकप्रिय पशु मॉडल बन गए हैं। Teleost मछली में और स्तनधारियों में हड्डी एक संरचनात्मक पर और एक शारीरिक स्तर पर दोनों बहुत समान है, और मुख्य नियामक जीन और संकेत रास्ते में से कई 3 संरक्षित कर रहे हैं। स्तनधारियों में के रूप में, Teleost मछली ध्यान से अस्थिकोरक और अस्थिशोषकों हड्डी गठन और अवशोषण 26 को संतुलित करने की गतिविधि को विनियमित। सबसे महत्वपूर्ण बात, फाई की ऑप्टिकल स्पष्टताश लार्वा फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग अस्थि कोशिकाओं और calcified कंकाल मैट्रिक्स 8, 9, 12, 21, 23, जो जीवित जानवरों में सेलुलर प्रक्रियाओं के अवलोकन की सुविधा लेबल करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, आनुवंशिक उपकरणों की एक श्रृंखला मछली में biomedically प्रासंगिक अनुसंधान की सुविधा के लिए उत्पन्न किया गया है। विशेष रूप से medaka, CrispR / Cas9 2, सेल वंश 6 ट्रेसिंग, और साइट विशेष transgenesis 14 हाल ही में स्थापित किया गया है और व्यापक रूप से इस्तेमाल के 15 में अब कर रहे हैं द्वारा लक्षित जीन उत्परिवर्तन के लिए तरीके के लिए।

छोटे teleost लार्वा सफलतापूर्वक रासायनिक स्क्रीन है, जो कई औषधीय प्रासंगिक दवाओं 1, 18 की खोज के लिए नेतृत्व के लिए इस्तेमाल किया गया है।

मछली के लार्वा DMSO की कम मात्रा के सहिष्णु हैं और उनके जलीय वातावरण से यौगिकों को अवशोषित करने के लिए या तो त्वचा के माध्यम से या जठरांत्र पथ 1, 5 के माध्यम से कर रहे हैं। हमारी प्रयोगशाला पहले से प्रतिनिधिorted ट्रांसजेनिक medaka लाइनों है कि विभिन्न osteoblast- और अस्थिशोषक-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में अस्थि कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से व्यक्त करते हैं। 20, 21, परिपक्व अस्थिकोरक (osteocalcin, ओएससी), 27, और अस्थिशोषकों (cathepsin कश्मीर, ctsk) 24; ये समय से पहले अस्थिकोरक (osterix, OSX कोलेजन 10a1, col10a1) शामिल हैं। हम यह भी एक ट्रांसजेनिक लाइन है कि एक गर्मी सदमे inducible प्रमोटर 24 के नियंत्रण में अस्थिशोषक उत्प्रेरण कारक परमाणु कारक κB ligand (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक व्यक्त उत्पन्न।

इस प्रणाली में RANKL की प्रेरण सक्रिय अस्थिशोषकों के अस्थानिक गठन में यह परिणाम है। इस वृद्धि की हड्डी अवशोषण और एक गंभीर ऑस्टियोपोरोसिस की तरह phenotype की ओर जाता है, कशेरुका निकायों में काफी कम खनिज के साथ। हमने हाल ही में पता चला है कि इस मॉडल में अस्थिशोषक गतिविधि बिसफ़ॉस्फ़ोनेट्स etidronate और alendronate, tw द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता हैओ दवाओं सामान्यतः मानव हड्डियों की कमजोरी के उपचार में इस्तेमाल किया, इस प्रकार ऑस्टियोपोरोसिस 27 के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली के रूप में मान्य medaka।

उनकी एक बड़ी चिंता का आकार तेजी से विकास, और भ्रूण के छोटे आकार के कारण, ट्रांसजेनिक medaka लार्वा अनोखे ऑस्टियोपोरोसिस की दवाओं की बड़े पैमाने पर जांच के लिए और हड्डी सेल व्यवहार के vivo विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। medaka में अध्ययन इस प्रकार कुशलता सेल संस्कृतियों में और चूहों कि मानव हड्डी विकारों के लिए नई चिकित्सकीय लक्ष्य और उपन्यास के उपचारों की खोज करने के उद्देश्य से कर रहे हैं में प्रयोगों के पूरक कर सकते हैं।

वर्तमान अध्ययन में, हम आम ऑस्टियोपोरोसिस दवा, alendronate साथ medaka हड्डी संवाददाता लार्वा के इलाज के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम यह भी विस्तार से वर्णन कैसे इलाज किया लार्वा घुड़सवार और हड्डी मैट्रिक्स और अस्थि कोशिकाओं का जीना इमेजिंग के लिए तैयार हैं। इन प्रोटोकॉल आसानी से अन्य छोटे रासायनिक यौगिकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि हड्डी उपचय या antiresorptive दवाओं के रूप में या तो काम करते हैं। </ P>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगों सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय (R14-293) की मंजूरी दे दी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे।

1. मछली पालन और भ्रूण के संग्रह

  1. उठाएँ गुम्मट, ctsk: nlGFP 24, RANKL: एचएसई: सीएफपी 24, और OSX: mCherry 21 एकल या 26 डिग्री सेल्सियस पर यौगिक ट्रांसजेनिक medaka मछली एक नियंत्रित प्रकाश चक्र के तहत (14 घंटे प्रकाश, 10 घंटे अंधेरे) स्पॉन प्रेरित करने के लिए।
  2. डेली स्पॉन पहले 30 मिनट के दौरान जगह लेता है के बाद प्रकाश पर बंद है। अंडे तंतु के माध्यम से एक साथ रहना और कई घंटे के लिए महिला के पेट को देते हैं। एक अंडा क्लस्टर ले जा रही एक महिला वयस्क को पकड़ने के लिए एक ठीक meshed नेट का प्रयोग करें। मछली संक्षेप नेट में आराम और फिर धीरे से मछली के पेट ध्यान से महिला के पेट से निषेचित अंडे क्लस्टर पट्टी करने के लिए मालिश करते हैं।
    नोट: एक स्वस्थ महिला medakaलगभग 5 महीने के लिए 20 अंडे प्रत्येक दिन - 10 उत्पादन कर सकते हैं।
  3. अंडे एक 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में रखें। 5 के साथ भ्रूण कुल्ला करने के लिए एक प्लास्टिक पिपेट का प्रयोग करें - 10 एमएल 0.3x Danieau का समाधान (मछली मध्यम; 19.3 मिमी NaCl, 0.23 मिमी KCl, 0.13 मिमी MgSO 4, 0.2 मिमी सीए (सं 3) 2, और 1.7 मिमी HEPES, पीएच 7.0)। एक 0.25% की 1 एमएल (डब्ल्यू / वी) मछली माध्यम की 2.5 एल methylene नीले शेयर समाधान कवक विकास को रोकने के लिए जोड़ें।
  4. धीरे लगाव तंतु की एक गाँठ के लिए फार्म का अंडा क्लस्टर रोल। संदंश का प्रयोग सावधानी से व्यक्तिगत भ्रूण (चित्रा 1 ए) प्राप्त करने के लिए निषेचित अंडे समूहों से लगाव तंतु हटा दें।
  5. Iwamatsu 2004 13 के अनुसार भ्रूण स्टेज।
  6. संस्कृति 20 - एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्रति 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश 30 भ्रूण। मध्यम दैनिक परिवर्तन भ्रूण के सामान्य विकास सुनिश्चित करने के लिए।
    नोट: अंडे सेने मंच (8 के आसपास समय - 9 घ postfertilization,DPF) अस्तित्व के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। मुक्त अस्थायी chorions हटाये मध्यम स्वच्छ रखने के लिए और अच्छा लार्वा जीवित रहने की दर सुनिश्चित करने के लिए।

2. ट्रांसजेनिक भ्रूण स्क्रीनिंग

  1. 40x बढ़ाई का उपयोग कर फ्लोरोसेंट संवाददाता अभिव्यक्ति के लिए ट्रांसजेनिक भ्रूण स्क्रीन करने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग और GFP, आरएफपी, और CFP फिल्टर के लिए एक पारा दीपक के साथ सुसज्जित एक stereomicroscope का प्रयोग करें।
  2. में mCherry संवाददाता अभिव्यक्ति द्वारा mCherry भ्रूण जल्दी बनाने ऐसे cleithrum के रूप में कपाल हड्डियों, पीछे सिर (चित्रा 1 बी, तीर), और parasphenoid के दोनों किनारों पर, उदर कपाल में एक केंद्रीय स्थान पर (: नेत्रहीन OSX पहचान चित्रा 1 बी, नोक)।
    नोट: संवाददाता अभिव्यक्ति 5 DPF के बाद 21 से शुरू होता है।
  3. Ctsk पहचानें: सिर (चित्रा 1C, तीर) और पूंछ (चित्रा 1C, नोक) में मजबूत nlGFP अभिव्यक्ति द्वारा nlGFP भ्रूण से शुरू6 DPF।
    नोट: अंतर्जात अस्थिशोषकों केवल 21 DPF के बाद के रूप में। nlGFP व्यक्त इस प्रारंभिक चरण (6 DPF) पर कोशिकाओं नहीं अस्थिशोषकों लेकिन अन्य, अब तक uncharacterized हैं पॉजिटिव कोशिकाओं 24 ctsk।
  4. 39 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक छोटे से गर्मी झटका उपचार, 2 DPF पर या बाद में स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए आयोजित करने के बाद देशव्यापी सीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा सीएफपी ट्रांसजेनिक भ्रूण: RANKL पहचानें: एचएसई।
    नोट: RANKL और CFP ट्रांसजीन ही द्विदिश हीट शॉक तत्व (एचएसई) के नियंत्रण में हैं। सीएफपी अभिव्यक्ति सफल RANKL प्रेरण 24 इंगित करता है।
  5. ट्रंक क्षेत्र, जिसके फलस्वरूप एक ऑस्टियोपोरोसिस की तरह phenotype 24 में परिणाम में अस्थानिक अस्थिशोषकों की बड़ी संख्या को प्रेरित करने के लिए बाद में 9 DPF 2 h गर्मी झटका उपचार या - एक 1.5 प्रदर्शन करना।
    नोट: ट्रांसजेनिक RANKL अभिव्यक्ति निष्क्रिय अस्थिशोषक पूर्वज कोशिकाओं है, जो endogenously ट्रिगर नहीं है की एक अस्थानिक सक्रियण में 9 DPF परिणाम प्रेरित21 DPF से पहले। स्थिर 39 डिग्री सेल्सियस की स्थिति प्राप्त करने के लिए एक पानी के स्नान का प्रयोग करें। पेट्री डिश युक्त medaka भ्रूण पानी की सतह पर तैरने लगते हैं। यकीन पेट्री डिश के ढक्कन पकवान के डूबने को रोकने के लिए सूखी है बनाओ।
  6. ऐसे RANKL के रूप में यौगिक लाइनों से स्क्रीन भ्रूण: एचएसई: सीएफपी / ctsk: nlGFP डबल ट्रांसजेनिक और OSX: mCherry / RANKL: एचएसई: सीएफपी / ctsk: nlGFP ट्रिपल ट्रांसजेनिक, प्रत्येक व्यक्ति transgene की अभिव्यक्ति पैटर्न के अनुसार।
    नोट: hemizygous और homozygous ट्रांसजेनिक भ्रूण संवाददाता transgene के विभिन्न स्तरों प्रतिदीप्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया गया। Homozygous भ्रूण एक प्रतिदीप्ति तीव्रता है कि लगभग hemizygous ट्रांसजेनिक्स की तुलना में दोगुनी हो गया था। यौगिक लाइनों है कि दोनों RANKL लिए homozygous थे: एचएसई: सीएफपी और ctsk: nlGFP दोहराया कई पीढ़ियों से अधिक incrossing द्वारा प्राप्त किया गया। MCherry / RANKL: एचएसई: सीएफपी / ctsk: ट्रिपल ट्रांसजेनिक OSX के लिए nlGFP मछली, homozygous RANKL: एचएसई: सीएफपी / ctsk: mCherry वाहक: nlGFP मछली homozygous OSX के साथ पार कर रहे थे। जिसके परिणामस्वरूप विषमयुग्मजी ट्रिपल ट्रांसजेनिक संतान उठाया और RANKL लिए homozygous भ्रूण प्राप्त करने के लिए incrossed गया: एचएसई: सीएफपी। RANKL: एचएसई: सीएफपी ट्रांस्जीन आदेश अस्थानिक अस्थिशोषकों के कुशल प्रेरण प्राप्त करने के लिए homozygous होना चाहिए।

आकृति 1

चित्रा 1: WT और 7 डी postfertilization पर ट्रांसजेनिक Medaka भ्रूण (DPF)। एक। गुम्मट भ्रूण brightfield रोशनी के साथ मनाया। बी। ट्रांसजेनिक दिखा OSX भ्रूण: cleithrum (तीर) और parasphenoid (नोक) के आसपास mCherry अभिव्यक्ति। सी। ट्रांसजेनिक भ्रूण ctsk दिखा: सिर (तीर) में nlGFP अभिव्यक्ति और पूंछ (नोक)। स्केल सलाखों: 500 माइक्रोन।025 / 55025fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. Medaka लार्वा की bisphosphonate उपचार

  1. खुराक-प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए बिसफ़ॉस्फ़ोनेट्स (बीपीएस) के विभिन्न सांद्रता युक्त समाधान तैयार करें।
    नोट: अनुकरणीय इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बीपी alendronate है।
    1. एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में मछली माध्यम में alendronate भंग।
    2. एक भंवर मिक्सर का उपयोग पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान स्टोर।
    3. सांद्रता की एक श्रृंखला के लिए मछली माध्यम के साथ शेयर समाधान गिराए द्वारा अलग अलग काम समाधान तैयार (यानी, 25, 37.5, 50, 62.5, और 75 माइक्रोग्राम / एमएल)।
      नोट: विभिन्न दवाओं के विभिन्न अवशोषण, वितरण, चयापचय, और उत्सर्जन (ADME) पैरामीटर है, जो इस medaka लार्वा प्रणाली का उपयोग कर परीक्षण के दौरान विचार किया जाना चाहिए हो सकता है। इसके अलावा, दवा घुलनशीलता और स्थिरता जब भिन्न हो सकते हैंएक जलीय समाधान के रूप में लागू होता है। कम पानी में घुलनशील यौगिकों पहली बार इस तरह DMSO के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स में भंग करने की आवश्यकता हो सकती है। इस मामले में, एक शेयर समाधान DMSO, जो फिर आगे मछली माध्यम में पतला है में तैयार किया जाता है। ध्यान दें कि पानी (मछली मध्यम) में काम कर समाधान कई विकेटकीपर के लिए रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, DMSO युक्त समाधान क्रिस्टलीकरण को रोकने के लिए आरटी पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  2. छह अच्छी तरह प्लेटों में स्थानांतरण medaka लार्वा (छह लार्वा / अच्छी तरह से) बाद में बीपी (alendronate) के इलाज के लिए।
  3. मछली के माध्यम से निकालें ध्यान से एक साफ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए alendronate समाधान की एक छोटी मात्रा (लगभग। 0.5 एमएल) जोड़ें।
  4. बचे हुए मछली मध्यम, के रूप में जोड़ा बीपी समाधान पतला हो सकता है, जो कम-केंद्रित alendronate समाधान के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है से बचें।
  5. एक साफ प्लास्टिक विंदुक के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से alendronate समाधान (0.5 एमएल) की एक छोटी मात्रा निकालें और एक बड़ा volu के साथ बदलेंमेरे alendronate समाधान (4 एमएल)।
  6. मध्यम दैनिक परिवर्तन सामान्य भ्रूण विकास सुनिश्चित करने के लिए।

4. Mineralized की हड्डी मैट्रिक्स का लाइव धुंधला

  1. क्रमशः 1% और 0.1% शेयर समाधान तैयार करने के लिए, या मछली माध्यम के 50 एमएल में calcein के 0.05 छ; (Alizarin-3-methyliminodiacetic एसिड कृत्रिम अंग केन्द्र) Alizarin complexone की 0.5 ग्राम भंग। एक भंवर मिक्सर का उपयोग पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए।
    नोट: methylene नीले रंग के अलावा बिना मछली मध्यम इस में प्रयोग किया जाता है और बाद के चरणों में लार्वा autofluorescence कम करने के लिए।
  2. फिल्टर करने के लिए धुंधला समाधान एक सिरिंज और एकल उपयोग फिल्टर (0.2 माइक्रोन) का प्रयोग करें। आरटी पर अंधेरे में छान समाधान स्टोर।
    नोट: फ़िल्टर, स्पष्ट कृत्रिम अंग केन्द्र धुंधला समाधान के रंग नारंगी के लिए काले रंग पीला है। फ़िल्टर, स्पष्ट calcein समाधान के रंग चमकीले पीले रंग की है। समाधान के लिए कई महीनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. मछली माध्यम में छान कृत्रिम अंग केन्द्र या calcein शेयर समाधान 01:10 पतलाएक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2.5 एच (0.01% calcein समाधान) यदि 9 के बीच और 17 लार्वा DPF इस्तेमाल कर रहे हैं - 2 h (0.1% कृत्रिम अंग केन्द्र समाधान) या 2 - और 1.5 के लिए medaka लार्वा सेते हैं। अंधेरे में नमूने रखें।
  4. एक साफ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करने के लिए ताजा मछली मध्यम लार्वा स्थानांतरण।
  5. एक साफ प्लास्टिक विंदुक के साथ मछली के माध्यम से निकालें और ताजा मछली के माध्यम जोड़ें। 3 के लिए इस चरण को दोहराएँ - जब तक कोई लाल या पीले रंग से सना हुआ समाधान 4 बार (कृत्रिम अंग केन्द्र या calcein, क्रमशः) पर छोड़ दिया है। उन्हें इमेजिंग के लिए बढ़ते मध्यम से epifluorescence से बचने के लिए पहले 60 मिनट - 30 के लिए मछली माध्यम में लार्वा छोड़ दें।
    नोट: 0.1% कृत्रिम अंग केन्द्र धुंधला समाधान बढ़ा जोखिम बार के लिए medaka लार्वा के लिए हानिकारक है। अब से 2 घंटा की ऊष्मायन बार लार्वा के अस्तित्व को प्रभावित। एकाग्रता और धुंधला समय इसलिए क्रम में इष्टतम भ्रूण अस्तित्व और धुंधला परिणाम प्राप्त करने के विभिन्न चरणों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता।

5. लाइव प्रतिदीप्ति इमेजिंग p>

  1. मछली माध्यम में 0.01% Tricaine (इथाइल 3-aminobenzoate methanesulfonate) के साथ medaka लार्वा anesthetize।
    नोट: Anesthetized लार्वा के बाद 5 स्थिर हो जाते हैं - Tricaine समाधान में 10 मिनट और आम तौर पर उनके पक्ष या उनकी पीठ पर या तो झूठ बोल रहे हैं।
  2. ब्याज की क्षेत्र के अनुसार लार्वा बोध कराता है एक प्लास्टिक microloader का प्रयोग करें। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल लार्वा के उन्मुखीकरण पार्श्व है।
  3. इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति रोशनी के साथ एक stereomicroscope का प्रयोग करें। उच्च वृद्धि का प्रयोग करें जब छवियों को लेने, लार्वा (सिर, पूर्वकाल ट्रंक, पीछे ट्रंक, और पूंछ) के विभिन्न भागों पर ध्यान दे। व्यक्तिगत छवियों एक साथ सिलाई के लिए एक उपयुक्त छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (चित्रा 3 जी में insets) का उपयोग क्षेत्रों ओवरलैपिंग पर।
    नोट: यह सही फोकल हवाई जहाज़ में सभी प्रासंगिक शरीर के अंगों की छवि गुणवत्ता में सुधार करने में मदद करता है।
  4. इमेजिंग के बाद वसूली के लिए मछली मध्यम लार्वा लौटें।
TLE "> 6। जीना confocal इमेजिंग

  1. 5 के लिए मछली माध्यम में 0.01% Tricaine साथ लार्वा anesthetize - 10 मिनट तक वे स्थिर हो जाते हैं।
  2. एक माइक्रोवेव ओवन में गर्म करके मछली माध्यम में 1.5% agarose कम पिघलने भंग। कूल लगभग 30 डिग्री सेल्सियस के लिए इस समाधान।
  3. 1 एमएल एक गिलास तली पेट्री डिश के लिए मछली माध्यम में agarose तरल 1.5% कम पिघलने की - 0.5 जोड़ें। समाधान के लिए एक साफ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करने में anesthetized लार्वा स्थानांतरण।
    नोट: विशेष एहतियात रखना है कि तरल कम पिघलने agarose का तापमान काफी कम लार्वा को नुकसान नहीं है।
  4. agarose solidifies से पहले, पेट्री डिश के नीचे करने के लिए लार्वा पुश करने के लिए एक प्लास्टिक की microloader का उपयोग करें और ब्याज के क्षेत्र के हिसाब से लार्वा बोध। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल लार्वा के उन्मुखीकरण पार्श्व है।
    नोट: नमूने के बाद agarose पूरी तरह solidifies confocal रहते इमेजिंग के लिए तैयार हैं।
  5. ACQ करने के लिए एक confocal खुर्दबीन का प्रयोग करेंuire छवियों।
  6. mCherry और कृत्रिम अंग केन्द्र धुंधला के लिए विश्लेषण करती है एक 543 एनएम लेजर लाइन का प्रयोग करें। nlGFP के लिए एक 488 एनएम लेजर लाइन का प्रयोग करें और calcein धुंधला विश्लेषण करती है।
  7. इमेजिंग के बाद, पेट्री डिश के लिए मछली मध्यम जोड़ने और ध्यान agarose से लार्वा को दूर करने के लिए ठीक सिरिंज सुई (27 जी एक्स 1 आधा ") की एक जोड़ी का उपयोग करें। अवशिष्ट ठीक करने के लिए मछली माध्यम के साथ एक पेट्री डिश के लिए agarose संलग्न के साथ लार्वा स्थानांतरण ।
  8. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 27 छवियों की प्रक्रिया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रचुर मात्रा में अंडे की संख्या है, साथ ही लार्वा के छोटे आकार, medaka दवा स्क्रीनिंग के लिए एक शानदार मॉडल बनाते हैं। एक एकल छह अच्छी तरह से थाली 36 लार्वा, जो सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करने के लिए पर्याप्त था अप करने के लिए संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया था। कंकाल के विश्लेषण के लिए मछली का उपयोग करने का एक और बड़ा लाभ रहते इमेजिंग करने की संभावना है। मछली के लार्वा की पारदर्शिता फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग अस्थि कोशिकाओं, साथ ही रंगों है कि आदेश में खनिज कल्पना करने में हड्डी मैट्रिक्स के लिए बाध्य के उपयोग के लेबल करने के लिए अनुमति देता है। मछली के लार्वा को संभालने के लिए आसान कर रहे हैं, और इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करने के लिए सरल (चित्रा 2) है।

एक RANKL: एचएसई: सीएफपी / ctsk: nlGFP डबल ट्रांसजेनिक लाइन RANKL प्रेरित अस्थिशोषकों के अस्थानिक गठन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अतिरिक्त, OSX: mCherry / RANKL: एचएसई: सीएफपी / ctsk: nlGFP ट्रिपल ट्रांसजेनिक लार्वा एक साथ के लिए इस्तेमाल किया गया है का पता लगाने केसमय से पहले अस्थिकोरक और विभेदित अस्थिशोषकों (चित्रा 3) के आयन। है, जबकि confocal माइक्रोस्कोपी सेलुलर स्तर पर प्रक्रियाओं (चित्रा 3 डी, ई, आई, जे तीर) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अवलोकन छवियों को एक stereomicroscope (एच - - सी और एफ चित्रा 3) के साथ ले जाया गया। तंत्रिका मेहराब के साथ कृत्रिम अंग केन्द्र से सना हुआ हड्डी मैट्रिक्स (एनए) और Centra (ग) (चित्रा 3 डी) fluorescently लेबल अस्थि कोशिकाओं (चित्रा 3 डी और मैं) की स्थिति निर्धारित करने के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

एक साथ एक ही बरकरार लार्वा में अस्थिशोषकों और अस्थिकोरक visualizing का एक लाभ यह है कि antiresorptive बनाम एक परीक्षण परिसर के अस्थि-उपचय गतिविधियों प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इस के लिए, अस्थिशोषकों और अस्थिकोरक का वितरण पूर्व मौजूदा और नवगठित mineralized हड्डी मैट्रिक्स के साथ चुना गया है। सफलताकृत्रिम अंग केन्द्र (लाल) (चित्रा -4 ए, बी) के साथ हड्डी मैट्रिक्स के cessive धुंधला calcein (हरा) के बाद (चित्रा 4C, डी) नए सिरे से mineralized हड्डी मैट्रिक्स (हरा) (चित्रा 4E, एफ तीर) का पता चलता है। इस परख हड्डी गठन की दर की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। नशीली दवाओं के उपचार के बाद बढ़ नए सिरे से दरों का परीक्षण परिसर के एक हड्डी-anabolic प्रभाव से संकेत मिलता है। इसके विपरीत, दवा 27 के एक antiresorptive गतिविधि के लिए पूर्व मौजूदा हड्डी मैट्रिक्स अंक के हठ। लार्वा में दोनों कृत्रिम अंग केन्द्र और calcein लेबल एक निरंतर विवो में medaka लार्वा में नई हड्डी गठन के अवलोकन की अनुमति के लिए कम से कम दो सप्ताह के लिए स्थिर रहे हैं।

चित्र 2
चित्रा 2: दवा उपचार, कृत्रिम अंग केन्द्र लाइव धुंधला की योजनाबद्ध आरेख, और confocal रहते इमेजिंग के लिए बढ़ते। एक। एक छह अच्छी तरह से थालीनशीली दवाओं के उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है लार्वा के लिए पर्याप्त जगह सुनिश्चित करने के लिए। अंधेरे में 2 एच - mineralized की हड्डी मैट्रिक्स 1.5 के लिए 0.1% कृत्रिम अंग केन्द्र में medaka लार्वा incubating द्वारा दाग है। सना हुआ लार्वा मछली मध्यम के साथ कई बार rinsed हैं। 0.01% Tricaine लार्वा anesthetize करने के लिए प्रयोग किया जाता है। बी। करने के लिए गुनगुने और तरल 1.5% agarose कम पिघलने, उनकी स्थिति एक प्लास्टिक microloader साथ निकाला जाता है anesthetized लार्वा के हस्तांतरण के बाद। लार्वा तो ब्याज के क्षेत्र (जैसे, कशेरुकी स्तंभ सबसे अच्छा पार्श्व दृश्य में imaged है) के अनुसार बढ़ रहे हैं। बाद agarose जम गया है, घुड़सवार नमूना confocal इमेजिंग के लिए तैयार है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र तीन: ctsk: nlGFP और OSX: 10 DPF पर ट्रांसजेनिक Medaka लार्वा में mCherry अभिव्यक्ति, बिना और हीट शॉक प्रेरित RANKL अभिव्यक्ति के बाद। एसी। RANKL प्रेरण बिना नियंत्रण लार्वा। कृत्रिम अंग केन्द्र से सना हुआ कंकाल मैट्रिक्स (ए); ध्यान दें वर्णक कोशिकाओं के पीछे की ओर स्थित पंक्ति में unspecific ऑटो प्रतिदीप्ति संकेत। ctsk: सिर और पूंछ (बी) में nlGFP अभिव्यक्ति और OSX का वितरण: कपाल, कशेरुका कॉलम में mCherry पॉजिटिव समय से पहले अस्थिकोरक, और दुम फिन (सी)। डी। ए और बी में बॉक्सिंग क्षेत्र तंत्रिका मेहराब के आसपास अस्थानिक अस्थिशोषकों के अभाव दिखा के Confocal ढेर (एनए) और Centra (ग) इस विकास के चरण में। ई। क्षेत्र सी दिखा OSX में बॉक्सिंग के Confocal ढेर: mCherry व्यक्त neura साथ समय से पहले अस्थिकोरकएल मेहराब और Centra के किनारों पर। अस्थिशोषकों RANKL प्रेरण बिना ट्रंक से अनुपस्थित रहे हैं। एफजे। लार्वा 9 DPF पर गर्मी सदमे से RANKL शामिल होने के बाद। एफ। कृत्रिम अंग केन्द्र से सना हुआ कंकाल मैट्रिक्स। जी। ctsk: nlGFP कशेरुका स्तंभ में बनाने अस्थिशोषकों -expressing। जी में insets उच्च बढ़ाई लिया व्यक्तिगत छवियों है कि एक साथ सिले हैं जी में यौगिक छवि में परिणाम के लिए दिखा। एच। OSX का वितरण: mCherry व्यक्त कोशिकाओं RANKL शामिल होने के बाद 1 डी बदल नहीं है। मैं। एफ और जी में बॉक्सिंग क्षेत्र RANKL प्रेरित तंत्रिका मेहराब के आसपास के गठन अस्थिशोषकों दिखाने का Confocal ढेर, साथ ही Centra (तीर)। जम्मू। NlGFP व्यक्त OSX के बगल में अस्थिशोषकों: क्षेत्र एच दिखा ctsk में बॉक्सिंग के Confocal ढेर साथ mCherry लेबल समय से पहले अस्थिकोरकतंत्रिका मेहराब और Centra। ए, बी, सी, एफ, जी, और एच में स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन। डी, ई, मैं, और जम्मू में स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: 12 और 15 DPF क्रमश: कृत्रिम अंग केन्द्र और Calcein साथ लार्वा की लगातार धुंधला द्वारा हड्डी मैट्रिक्स के डी नोवो खनिज का विश्लेषण। ए, बी। 12 DPF पर कृत्रिम अंग केन्द्र से सना हुआ कंकाल मैट्रिक्स। सी, डी। एक ही लार्वा में 15 DPF पर कंकाल मैट्रिक्स Calcein से सना हुआ। ई, एफ। मर्ज किए गए नव minera दिखा छवितंत्रिका मेहराब (हरे, तीर) के सुझावों पर हड्डी मैट्रिक्स lized। बी, डी, एफ और। क्षेत्र में क्रमश: ए, सी और ई में बॉक्सिंग के Confocal हो चुकी है। ए, सी और ई में स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन। बी, डी, एफ और में स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि छवियाँ एक असफल और एक सफल confocal इमेजिंग के लिए बढ़ते दिखा रहा है। एसी। नमूना (बाएं) फोकल हवाई जहाज़ के बाहर पड़ी के हिस्से में कम पिघलने agarose परिणामों में असफल बढ़ते। DF। सफल बढ़ते सब regi दिखाएक ही फोकल हवाई जहाज़ में ब्याज की ons। स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: Alendronate उपचार रोकता अस्थि अवशोषण। कृत्रिम अंग केन्द्र से सना हुआ कंकाल मैट्रिक्स और ctsk: RANKL प्रेरण (एसी) के बिना nlGFP व्यक्त ट्रांसजेनिक medaka लार्वा में अस्थिशोषकों, गर्मी झटका प्रेरित RANKL अभिव्यक्ति (डीएफ) के साथ, और RANKL प्रेरण के रूप में एक ही दिन (सैनिक) पर alendronate के अलावा के साथ । सी, एफ, और मैं। ए और बी, डी और ई, जी और एच, क्रमशः में बॉक्सिंग क्षेत्रों के Confocal ढेर।सी। RANKL प्रेरण बिना बरकरार कशेरुकी कॉलम कृत्रिम अंग केन्द्र से सना हुआ। एफ। RANKL प्रेरित, ctsk -expressing अस्थिशोषकों तंत्रिका मेहराब और Centra के आसपास फार्म, तंत्रिका मेहराब (तीर) के mineralized मैट्रिक्स की पूरी अवशोषण में और Centra (तीर) को दोष में जिसके परिणामस्वरूप। जी। Alendronate के अलावा ctsk के गठन पर कोई प्रभाव नहीं है: nlGFP व्यक्त अस्थिशोषकों, लेकिन यह ब्लॉक हड्डी अवशोषण और तंत्रिका मेहराब और Centra बरकरार छोड़ देता है। 100 माइक्रोन: ए, बी, डी, ई, जी, और एच में स्केल सलाखों। सी, एफ में स्केल सलाखों, और मैं: 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

यह आवश्यक है जब विभिन्न नमूनों की तुलना गर्मी झटका उपचार के लिए परिस्थितियों के अनुरूप और स्थिर हैं। स्थिर तापमान की स्थिति ट्रांसजेनिक लार्वा में RANKL प्रेरण के समान स्तर की गारंटी और इसके परिणामस्वरूप, तुलनीय अस्थिशोषक गठन, जो ctsk के लिए स्क्रीनिंग से इसकी पुष्टि की जा सकती है: nlGFP अभिव्यक्ति। अंततः, इस प्रेरित अस्थानिक हड्डी अवशोषण और हड्डियों की कमजोरी की तरह घावों का एक समान डिग्री की ओर जाता है, के रूप में कृत्रिम अंग केन्द्र धुंधला द्वारा मान्य। इस तरह के एक प्रयोगात्मक डिजाइन तो दृढ़ संकल्प और विभिन्न विरोधी resorptive दवाओं या एक ही दवा अलग सांद्रता में लागू किया के प्रभाव की तुलना करने के लिए अनुमति देता है।

संशोधन और समस्या निवारण

मछली के लार्वा बहुत कमजोर हैं और ध्यान से इमेजिंग के लिए बढ़ते प्रक्रिया के दौरान नियंत्रित किया जाना चाहिए। इष्टतम जीना confocal इमेजिंग के लिए, लार्वा ध्यान की स्थिति में हैंबजाय संदंश की तुलना में एक प्लास्टिक microloader साथ वन, चोटों (चित्रा 2 बी) से बचने के लिए। जर्दी विस्तार कम उत्तेजनाओं स्पर्श के प्रति संवेदनशील है और एक microloader साथ लार्वा बोध कराता है, जिससे बढ़ते दौरान लार्वा आंदोलन से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ब्याज के क्षेत्र सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना इमेजिंग (चित्रा 5) के दौरान एक फोकल हवाई जहाज़ में केंद्रित किया जा सकता फ्लैट मुहिम शुरू की जानी चाहिए। हड्डी सेल व्यवहार बहुत गतिशील है और जीने इमेजिंग के दौरान उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प की आवश्यकता है। बेहतर, confocal विश्लेषण द्वारा समय चूक इमेजिंग रहने वाले लार्वा में कई घंटे के पाठ्यक्रम पर अस्थिकोरक-अस्थिशोषक बातचीत का पालन करने के लिए वांछित है। हालांकि, इस लार्वा जीवित है और एक निश्चित स्थिति में रखने के लिए विशेष परिस्थितियों की मांग। लंबे समय तक संज्ञाहरण के लिए, मछली माध्यम में 0.001% Tricaine का एक समाधान इमेजिंग के दौरान agarose जम कवर करने के लिए जोड़ा गया है। यह बाहर सुखाने से रोकता है और agarose imag के दौरान लार्वा के अचानक हिल रोकताकई घंटे से अधिक रही है।

तकनीक की सीमाएं

ऑस्टियोपोरोसिस कि ज्यादातर बुजुर्ग मनुष्य को प्रभावित करता है एक बीमारी है। इसलिए, ऑस्टियोपोरोसिस दवा स्क्रीनिंग के लिए विवो मॉडल में एक आदर्श वयस्क मछली को शामिल करना चाहिए। अब तक, हालांकि, इस रिपोर्ट में वर्णित रहते इमेजिंग तकनीक का भ्रूण और लार्वा चरणों तक सीमित है। वर्तमान में उपलब्ध confocal इमेजिंग प्रवेश गहराई में सीमाओं के कारण वयस्क मछली में आनुवंशिक रूप से लेबल अस्थि कोशिकाओं का जीना इमेजिंग की अनुमति नहीं है। प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) है, जो गहरी ऊतक रहने में इमेजिंग की अनुमति देता है, एक साथ कम pigmented "देखने के माध्यम से" medaka उपभेदों की उपलब्धता के साथ की हाल ही में विकास, यह कल्पना है कि इस सीमा को जल्द ही दूर किया जाएगा, और का जीना इमेजिंग बनाता है दवा स्क्रीनिंग के बाद वयस्क medaka मछली में अस्थि कोशिकाओं संभव हो जाएगा।

मौजूदा / वैकल्पिक एम के सम्बंध में तकनीक का महत्वethods

विशेष रूप से हड्डी अनुसंधान - - लाइव इमेजिंग और उन्नत आनुवंशिक उपकरणों की एक अद्वितीय संयोजन छोटे Teleost मछली जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए लोकप्रिय बना दिया है और दवा स्क्रीनिंग के लिए इन विवो मॉडल के रूप में। संभावना एक अक्षुण्ण जीव के भीतर सेल सेल बातचीत का विश्लेषण करने के साथ, ट्रांसजेनिक medaka लाइनों अनोखे हड्डी मॉडलिंग और remodeling के दौरान गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का जीना इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं। क्योंकि वे कई जीन विनियामक नेटवर्क का हिस्सा medaka में स्तनधारियों के साथ हड्डी homeostasis को नियंत्रित करने, vivo अध्ययन में पूरक कर सकते हैं और यहां तक कि इन विट्रो स्तनधारी अस्थिकोरक और अस्थिशोषक सेल संस्कृति assays का उपयोग अध्ययनों से अधिक है।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश इस तकनीक माहिर के बाद

एक ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि में एकल यौगिकों के परीक्षण के अलावा, इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, मछली भी VA के संयोजन की जांच करने के लिए सरल दृष्टिकोण की पेशकशसंभव तालमेल या यौगिकों के हस्तक्षेप के लिए कुख्यात दवाओं। इसके अलावा, विभिन्न संवाददाता लाइनों का एक संयोजन का उपयोग करते हैं, उदाहरण के लिए, एक विशेष उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के संदर्भ में, हड्डी अध: पतन और मरम्मत के विभिन्न चरणों के दौरान अस्थि कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त अवसर है, या एक हड्डी की उपस्थिति में प्रदान करता है -modulating दवा। अपनी अनूठी विशेषताओं है कि माउस assays के पूरक के साथ, medaka ऑस्टियोपोरोसिस मॉडल विवो दृष्टिकोण में एक उत्कृष्ट परीक्षण और उपचय और उपन्यास हड्डी का नियमन यौगिकों के प्रभाव antiresorptive यों को प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा या वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस परियोजना पर शिक्षा के सिंगापुर मंत्रालय (मो, अनुदान संख्या 2013-T2-2-126) और स्वास्थ्य, संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थान (एनआईएच, संख्या 1R21AT008452-01A1 अनुदान) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया। TY बायोलॉजिकल साइंसेज के एनयूएस विभाग से स्नातक छात्रवृत्ति प्राप्त की। हम उनके निरंतर समर्थन के लिए Bioimaging विज्ञान के लिए एनयूएस केंद्र (CBIS) के confocal इकाई धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alendronate  Sigma A4978
alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone Sigma A3882
Calcein Sigma C0875
ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) Sigma A5040
ImageJ (1.4.3.67) National Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
LSM 510 Meta confocal  Zeiss
LSM Image Browser (4.2.0.121) Zeiss http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html
Micro-loader Eppendorf 5242956003 Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL
NIS-Elements BR 3.0 software Nikon
Photoshop CS6 (13.0.0.0) Adobe
SMZ1000 stereomicroscope  Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
  2. Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
  3. Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
  4. Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
  5. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
  6. Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
  7. Charles, J. F., Aliprantis, A. O. Osteoclasts: more than 'bone eaters. Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).
  8. DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
  9. Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
  10. Eriksen, E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).
  11. Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
  12. Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
  13. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
  14. Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
  15. Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
  16. Komori, T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).
  17. Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
  18. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  19. Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
  20. Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
  21. Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
  22. Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
  23. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  24. To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
  25. Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
  26. Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
  27. Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 119 लाइव इमेजिंग अस्थिकोरक अस्थिशोषक जीना हड्डी धुंधला हो जाना हड्डी remodeling ऑस्टियोपोरोसिस Medaka बिसफ़ॉस्फ़ोनेट्स विरोधी resorptive दवाओं
दवा उपचार और<em&gt; Vivo</em&gt; एक Medaka मछली ऑस्टियोपोरोसिस मॉडल में अस्थिकोरक-अस्थिशोषक सहभागिता की इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, T., Winkler, C. Drug Treatment… More

Yu, T., Winkler, C. Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model. J. Vis. Exp. (119), e55025, doi:10.3791/55025 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter