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Developmental Biology

Medikamentöse Behandlung und Published: January 1, 2017 doi: 10.3791/55025
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 2NUS Centre for Bioimaging Sciences (CBIS), National University of Singapore

Abstract

Knochenbildenden Osteoblasten interagieren mit dem Knochen-Osteoklasten, den Umsatz der Knochenmatrix zu koordinieren und zu Skelett Homöostase Kontrolle zu bringen. Medaka und Zebrafisch-Larven sind weit verbreitet zu analysieren das Verhalten von Knochenzellen während der Knochenbildung, Degeneration und Reparatur verwendet werden. Ihre optische Klarheit ermöglicht die Visualisierung von fluoreszierend markierten Knochenzellen und Fluoreszenz auf die mineralisierte Skelett-Matrix gebunden Farbstoffe. Unser Labor hat transgene Medaka Fisch erzeugt, die die Osteoklasten-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-Faktor kappaB Ligand (RANKL) unter der Kontrolle eines Hitzeschock-induzierbaren Promotors exprimieren. Ektopische Expression von RANKL ergibt die überschüssige Bildung von aktivierten Osteoklasten, die in reporter Linien mit nlGFP Expression unter der Kontrolle des Cathepsin K (cSt) -Promotor sichtbar gemacht werden kann. RANKL Induktion und ektopische Osteoklastenbildung führt zu schweren Osteoporose-ähnlichen Phänotypen. Verbindung transgenen Medaka lines , die ausdrücken cSt: nlGFP in Osteoklasten sowie mCherry unter der Kontrolle des osterix (OSX) -Promotor in vorzeitigem Osteoblasten, verwendet werden , um die Interaktion beider Zelltypen zu untersuchen. Dies erleichtert die in vivo Beobachtung von Zellverhalten unter den Bedingungen der Knochenabbau und Reparatur. Hier beschreiben wir die Verwendung dieses Systems ein Medikament häufig in menschlichen Osteoporose-Therapie verwendet zu testen und ein Protokoll für Echtzeit-Bildgebung beschrieben. Das Medaka - Modell ergänzt Studien in Zellkultur und Mäuse und bietet ein neuartiges System für die in vivo Analyse der Arzneimittelwirkung im Skelettsystem.

Introduction

Die wirbel Skelett sorgt für eine strukturelle Unterstützung und Schutz von Organen ermöglicht Mobilität und dient als Quelle für Calcium. Im Laufe des Lebens wird die extrazelluläre Knochenmatrix kontinuierlich gedreht über die Knochenstabilität und Steifigkeit zu erhalten. Dieser Prozess erfordert die eng koordinierte Aktivität und das Zusammenspiel von Knochen bildenden Osteoblasten und Knochen-Osteoklasten. Osteoblasten sind von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen abgeleitet und produzieren Kollagen die osteoid zu bilden, die proteinartiges Teil der Knochenmatrix 10. Osteoblasten mit Osteoklasten zusammenwirken , eine ausgewogene Aktivität beider Zelltypen zu erreichen, die Knochenhomöostase 7 zu steuern , erforderlich ist. Aufgrund dieser komplizierten regulatorischen Wechselwirkungen, Antworten auf eine medikamentöse Therapie und Knochenhomöostase nicht voll werden kann unter Verwendung von in vitro - Studien untersucht. Daher gibt es eine starke Nachfrage nach Tiermodellen. Im Vergleich zu den Zellkultur - Einstellungen können in - vivo - Modellen liefernwertvolle Einblicke in die vielzelligen Netzwerke innerhalb des Knochenumgebung.

Zahlreiche Mausmodelle existieren für eine Vielzahl von menschlichen Knochenerkrankungen einschließlich Osteoporose 16. Allerdings stellen die Größe und die Zugänglichkeit von Maus-Embryonen erhebliche Einschränkungen für die Live-Darstellung von Skelett Prozesse. Kleinknochenfischen, andererseits dienen als attraktive Alternative für die in vivo Bildgebung. Zebrabärbling (Danio rerio) und Medaka (Oryzias latipes) haben für Skelett-Forschung in den letzten zwei Jahrzehnten beliebte Tiermodelle werden 17, 19, 22, 24. Knochen in Knochenfischen und in Säugetieren ist sehr ähnlich, sowohl auf struktureller und auf physiologischer Ebene und viele der wichtigsten regulatorischen Gene und Signalwege sind 3 konserviert. Wie bei Säugetieren, Knochenfische regulieren sorgfältig die Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten 26 Knochenbildung und Resorption zu balancieren. Am wichtigsten ist, die optische Klarheit der fish Larven ermöglicht die Verwendung von Fluoreszenz - Reportern , Knochenzellen und die verkalkten Skelettmatrix 8, 9, 12, 21, 23, die die Beobachtung von zellulären Prozessen in lebenden Tier erleichtert zu etikettieren. Darüber hinaus hat eine Reihe von genetischen Werkzeugen erzeugt worden biomedizinisch relevante Forschung in den Fischen zu erleichtern. Für Medaka insbesondere Verfahren zur gezielten Genveränderung von CRISPR / Cas9 2, Zell-Linie Tracing 6 und ortsspezifische Transgene 14 haben nun weit verbreitet in Gebrauch 15 vor kurzem gegründet und sind sind.

Kleine Teleost Larven wurden für chemische Bildschirme, die zur Entdeckung von mehreren pharmakologisch relevanten Wirkstoffe 1, 18 eingesetzt.

Fischlarven sind tolerant gegenüber niedrigen Konzentrationen von DMSO und können Verbindungen aus ihren Gewässern zu absorbieren, entweder durch die Haut oder durch den Gastrointestinaltrakt 1, 5. Unser Labor zuvor reported transgenen Medaka Linien, die fluoreszierende Reporter in Knochenzellen unter der Kontrolle von verschiedenen Osteoblasten und Osteoklasten spezifischen Promotoren exprimieren. Dazu gehören vorzeitige Osteoblasten (Kollagen 10a1, Col10a1; osterix, osx) 20, 21, reifen Osteoblasten (Osteocalcin, osc) 27, und Osteoklasten (Cathepsin K, cSt) 24. Wir erzielten auch eine transgene Linie, die die Osteoklasten-inducing factor Receptor Activator von 24 Nuclear-Faktor kappaB Ligand (RANKL) unter der Kontrolle eines Hitzeschock-induzierbaren Promotor exprimiert.

Induktion von RANKL in diesem System ergibt die ektopische Bildung von aktiven Osteoklasten. Dies führt zu erhöhten Knochenresorption und eine schwere Osteoporose-ähnlichen Phänotyp, mit drastisch reduziert Mineralisierung in den Wirbelkörpern. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Aktivität der Osteoklasten in diesem Modell kann durch die Bisphosphonate Etidronat und Alendronat blockiert werden, two Medikamente häufig in menschlichen Osteoporose - Therapie, so Medaka als ein geeignetes Modellsystem für Osteoporose 27 zu validieren.

Aufgrund ihrer großen Brutgröße, schnelle Entwicklung, und die geringe Größe von Embryonen, sind transgene Medaka Larven in einzigartiger Weise geeignet für die groß angelegte Screening von Osteoporose Medikamente und für die in - vivo - Analyse von Knochenzellverhalten. so können Studien in Medaka effizient Experimente in Zellkulturen und bei Mäusen zu ergänzen, die auf die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele und neuartige Therapien für menschliche Knochenerkrankungen abzielen.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll Medaka Knochen-Reporter Larven mit dem gemeinsamen Osteoporose-Medikament, Alendronat zu behandeln. Wir beschreiben auch im Detail, wie behandelten Larven montiert sind und für die Live-Darstellung von Knochenmatrix und Knochenzellen hergestellt. Diese Protokolle können leicht auf andere kleine chemische Verbindungen, die entweder Arbeit als Knochen anabole oder antiresorptiv Medikamente angepasst werden. </ P>

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Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit genehmigten Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Protokolle der National University of Singapore (R14-293) durchgeführt.

1. Fischhaltung und die Sammlung von Embryonen

  1. Heben Sie WT, cSt: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24 und osx: mCherry 21 ein- oder Verbindung transgenen Medaka Fisch bei 26 ° C unter einem gesteuerten Lichtzyklus (14 h Licht, 10 h Dunkelheit) zu induzieren Laichen.
  2. Täglich Laich findet während der ersten 30 Minuten, nachdem das Licht eingeschaltet wird. Die Eier halten zusammen durch Filamente und zu den weiblichen Bauch für mehrere Stunden befestigen. Verwenden Sie ein feinmaschiges Netz mit einer weiblichen Erwachsenen trägt ein Ei-Cluster zu fangen. Lassen Sie die Fische kurz im Netz ruhen und dann sanft massieren den Bauch der Fische vorsichtig die befruchtete Eizelle Cluster aus dem Bauch des Weibchens abzustreifen.
    HINWEIS: Eine gesunde Medaka weiblichfür ca. 5 Monate 20 Eier pro Tag - können 10 produzieren.
  3. Legen Sie die Eier in eine 60 mm Petrischale aus Kunststoff. Verwenden einer Plastikpipette die Embryonen mit 5 auszuspülen - 10 ml 0,3x Danieau-Lösung (Fischmedium; 19,3 mM NaCl, 0,23 mM KCl, 0,13 mM MgSO 4, 0,2 mM Ca (NO 3) 2 und 1,7 mM HEPES, pH 7.0). 1 ml einer 0,25% (w / v) Methylenblau-Stammlösung auf 2,5 L Fischmedium Pilzwachstum zu verhindern.
  4. Sanft Ei Cluster rollen einen Knoten der Befestigung Filamente zu bilden. Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Befestigungsfäden aus der befruchteten Eizelle Cluster entfernen , um einzelne Embryonen (1A) erhalten.
  5. Bühne , um die Embryonen nach Iwamatsu 2004 13.
  6. Kultur 20 bis 30 Embryonen pro 60 mm Kunststoff-Petrischale in einem 28 ° C Inkubator. Ändern, um die mittlere tägliche normale Entwicklung des Embryos zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die Zeit um die Schraffur Stufe (8 - 9 d postfertilization,DPF) ist besonders kritisch für das Überleben. Entfernen Chorion frei schwebenden das Medium sauber zu halten und um eine gute Larvenüberlebensraten.

2. Transgene Embryo Screening

  1. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einer Quecksilberlampe ausgestattet für Fluoreszenz-Imaging und GFP, RFP und GFP Filter transgenen Embryonen für Fluoreszenzreporter-Expression mit 40-facher Vergrößerung zu screenen.
  2. Identifizieren Visuell osx: mCherry Embryonen durch mCherry Reporter Ausdruck in der frühen Bildung Schädelknochen, wie die Cleithrum, auf beiden Seiten des hinteren Kopf (Abbildung 1B, Pfeil), und der Parasphenoid, an einer zentralen Stelle im ventralen Schädel ( 1B, Pfeilspitze).
    HINWEIS: Reporter Ausdruck beginnt ab 5 DPF ab 21.
  3. Identifizieren cSt: nlGFP Embryonen , die durch starke nlGFP Ausdruck im Kopf (1C, Pfeil) und Schwanz (1C, Pfeilspitze), ausgehend von6 DPF.
    HINWEIS: Endogene Osteoklasten erst nach 21 DPF bilden. nlGFP-exprimierenden Zellen in diesem frühen Stadium (6 DPF) nicht Osteoklasten aber auch andere, bisher nicht charakterisierten, CTSK -positiven Zellen 24.
  4. Identifizieren RANKL: HSE: GFP transgenen Embryonen , die durch allgegenwärtige GFP - Expression nach einer kurzen Hitzeschockbehandlung für 20 min bei 39 ° C, bei 2 DPF durchgeführt oder später für Screening - Zwecken.
    HINWEIS: Die RANKL und CFP Transgene stehen unter der Kontrolle des gleichen bidirektionalen Heat Shock Element (HSE). GFP - Expression zeigt die erfolgreiche RANKL Induktion 24.
  5. Durchführen einer 1,5-2 h Hitzeschockbehandlung bei 9 DPF oder später eine große Anzahl von ektopischen Osteoklasten im Rumpfbereich zu induzieren, die folglich in einem Osteoporose-ähnlichen Phänotyp führt 24.
    HINWEIS: Die transgene Expression RANKL induziert bei 9 DPF führt zu einer ektopischen Aktivierung ruhender Osteoklasten-Vorläuferzellen, die endogen nicht ausgelöst wirdvor 21 DPF. Verwenden Sie ein Wasserbad stabil 39 ° C Bedingungen zu erhalten. Lassen Sie die Petrischale mit Medaka Embryonen auf der Wasseroberfläche schwimmen. Stellen Sie sicher, dass der Deckel der Petrischale ist trocken die Versenkung der Schale zu verhindern.
  6. Bildschirm Embryonen aus Verbindung Linien, wie RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP doppelt transgenen und osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP triple-transgenen nach dem Expressionsmuster jedes einzelnen Transgen.
    HINWEIS: Hemizygote und homozygote wurden transgene Embryonen, die durch unterschiedliche Fluoreszenzwerte des Reporter-Transgen aus. Homozygote Embryonen hatten eine Fluoreszenzintensität, die ungefähr doppelt so im Vergleich zu der hemizygous transgenics. Compound Linien , die für beide RANKL homozygot waren: HSE: CFP und cSt: nlGFP wurden durch wiederholte erhalten mehrere Generationen Einkreuzung über. Für Triple-transgenen osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP Fisch, homozygot RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP Fische wurden mit homozygot osx gekreuzt: mCherry Träger. Die resultierende heterozygote triple-transgenen Nachkommen wurden angehoben und incrossed Embryonen für RANKL homozygot zu erhalten: HSE: GFP. Die RANKL: HSE: GFP - Transgen muss, um homozygot sein , um die effiziente Induktion der ektopischen Osteoklasten zu erhalten.

Abbildung 1

Abbildung 1: WT und transgener Medaka Embryonen bei 7 D Postfertilization (DPF). A. WT Embryonen mit Hellfeldbeleuchtung beobachtet. B. Transgene Embryonen zeigt osx: mCherry Ausdruck um den Cleithrum (Pfeil) und Parasphenoid (Pfeilspitze). C. Transgene Embryonen zeigt cSt: nlGFP Ausdruck im Kopf (Pfeil) und Schwanz (Pfeilspitze). Maßstabsbalken: 500 & mgr; m.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Bisphosphonat Behandlung von Medaka Larvae

  1. Herstellung von Lösungen, die verschiedene Konzentrationen an Bisphosphonaten (BPs) zur Dosis-Wirkungs-Studien.
    HINWEIS: Die beispielhafte BP in diesem Protokoll verwendet ist Alendronat.
    1. Löse Alendronat in Fisch Medium in einer Konzentration von 100 ug / ml einer Stammlösung herzustellen.
    2. Mit einem Wirbelmischer eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Bewahren Sie die Stammlösung bei 4 ° C.
    3. Bereiten verschiedene Arbeitslösungen durch Verdünnen der Stammlösung mit Fisch Medium zu einer Reihe von Konzentrationen (dh, 25, 37,5, 50, 62,5 und 75 & mgr; g / ml).
      HINWEIS: Verschiedene Medikamente können unterschiedliche Absorption, Verteilung, Metabolismus haben und Ausscheidung (ADME) Parameter, die während des Tests mit dieser Medaka Larven System berücksichtigt werden müssen. Auch Arzneistofflöslichkeit und Stabilität kann variieren, wennals wässrige Lösung aufgetragen. Weniger wasserlösliche Verbindungen können müssen zunächst in organischen Lösungsmitteln, wie DMSO, gelöst werden. In diesem Fall wird eine Stammlösung in DMSO hergestellt, die weiter wird dann in Fischmedium verdünnt. Beachten Sie, dass die Arbeitslösungen in Wasser (Fisch mittel) kann im Kühlschrank für mehrere wk gespeichert werden. Jedoch DMSO enthaltende Lösungen müssen bei RT gelagert werden, um Kristallisation zu verhindern.
  2. Transfer Medaka Larven in Sechs-Well-Platten (sechs Larven / Vertiefung) für nachfolgende BP (Alendronat) Behandlung.
  3. Entfernen Sie den Fisch Medium vorsichtig mit einem sauberen Plastikpipette und fügen Sie ein kleines Volumen (ca.. 0,5 ml) von Alendronat-Lösung in jede Vertiefung.
  4. Vermeiden Sie übrig gebliebenen Fischmedium, wie der zusätzliche BP Lösung könnte verdünnt werden, was besonders wichtig ist für weniger konzentriert Alendronat-Lösungen.
  5. Entfernen Sie ein kleines Volumen von Alendronat-Lösung (bis zu 0,5 ml) von jeder Vertiefung mit einem sauberen Plastikpipette und ersetzen Sie es mit einem größeren Volume (4 ml) von Alendronat-Lösung.
  6. Ändern Medium täglich normalen Embryonen Entwicklung zu gewährleisten.

4. Live-Färbung von mineralisierte Knochenmatrix

  1. Man löst 0,5 g Alizarin-Komplexon (ALC, Alizarin-3-Methyliminodiessigsäure) oder 0,05 g von Calcein in 50 ml Fischmedium 1% und 0,1% ige Stammlösungen herzustellen, respectively. Mit einem Wirbelmischer eine vollständige Auflösung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Fisch Medium ohne Zusatz von Methylenblau wird in diesem und in den nachfolgenden Schritten verwendet Autofluoreszenz in den Larven zu reduzieren.
  2. Verwenden Sie eine Spritze und Einwegfilter (0,2 & mgr; m), um die Farblösung zu filtern. Bewahren Sie die gefilterten Lösung im Dunkeln bei RT.
    HINWEIS: Die Farbe des gefilterten, klare ALC-Färbelösung ist dunkelgelb bis orange. Die Farbe des gefilterten, klar Calcein Lösung ist leuchtend gelb. Lösungen können für mehrere Monate verwendet werden.
  3. Verdünnen Sie die gefilterten ALC oder Calcein Stammlösung 1:10 in Fisch Mediumund brüten die Medaka Larven für 1,5 bis 2 h (0,1% ALC-Lösung) oder 2-2,5 h (0,01% Calcein-Lösung) in einem 28 ° C Inkubator, wenn Larven zwischen 9 und 17 DPF verwendet werden. Halten Sie die Proben im Dunkeln.
  4. Übertragen Sie die Larven zu frischem Fisch Medium, das eine saubere Plastikpipette.
  5. Entfernen Sie den Fisch Medium mit einem sauberen Plastikpipette und fügen Sie frischen Fisch Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt für 3 bis 4-mal, bis keine rot- oder gelb-gefärbte Lösung (ALC oder Calcein, beziehungsweise) übrig bleiben. Lassen Sie die Larven in Fisch Medium für 30 - 60 Minuten vor dem sie für die Bildgebung zu vermeiden Epifluoreszenz aus dem Medium Montage.
    HINWEIS: 0,1% ALC-Färbelösung ist schädlich für die Medaka Larven für längere Belichtungszeiten. Inkubationszeiten von mehr als 2 h beeinflussen das Überleben der Larven. Konzentration und Färbezeit müssen daher für verschiedene Stufen optimiert werden, um eine optimale Embryo Überleben und Färbung Ergebnisse zu erzielen.

5. Live-Fluoreszenz-Imaging p>

  1. Anesthetize die Medaka Larven mit 0,01% Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoat methansulfonat) in Fisch Medium.
    HINWEIS: Narkotisierte Larven immobilisiert werden nach 5 - 10 min in Tricaine Lösung und sind in der Regel liegen entweder auf ihren Seiten oder den Rücken.
  2. Verwenden Sie einen Kunststoff Micro die Larven zu orientieren nach der Region von Interesse. Die Orientierung der Larven in diesem Protokoll verwendet ist lateral.
  3. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit Fluoreszenzbeleuchtung für die Bildgebung. Verwenden hoher Vergrößerung, wenn die Aufnahme von Bildern, auf verschiedenen Teilen der Larven Fokussierung (Kopf, vordere Rumpf, hintere Rumpf und Schwanz). Sticheinzelbilder zusammen an überlappenden Bereichen unter Verwendung eines geeigneten Bildverarbeitungssoftware (Einfügungen in Figur 3G).
    HINWEIS: Dies hilft, die Bildqualität aller relevanten Körperteile in der richtigen Brennebene zu verbessern.
  4. Bringen Sie die Larven zum Fisch Medium für die Erholung nach der Abbildung.
tle "> 6. Live-konfokale Imaging

  1. Anesthetize die Larven mit 0,01% Tricaine in Fisch Medium 5 - 10 min, bis sie immobilisiertem werden.
  2. Auflösen niedrigschmelzenden Agarose zu 1,5% in Fischmedium durch sie in einem Mikrowellenofen erhitzt wird. Kühle die Lösung auf etwa 30 ° C.
  3. In 0,5-1 ml Flüssigkeit 1,5% niedrig schmelzenden Agarose in Fischmedium zu einem Glasboden-Petrischale. Übertragen Sie die betäubten Larven in die Lösung eine saubere Plastikpipette.
    HINWEIS: Besondere Vorsichtsmaßnahme, dass die Temperatur der Flüssigkeit mit niedrigem Schmelz Agarose niedrig genug ist, nicht die Larven zu schaden.
  4. Bevor die Agarose erstarrt, mit einem Kunststoff Micro die Larven auf den Boden der Petrischale zu schieben und zu orientieren, die Larven nach der Region von Interesse. Die Orientierung der Larven in diesem Protokoll verwendet ist lateral.
    HINWEIS: Die Proben sind bereit für die konfokale Live-Bildgebung, nachdem die Agarose vollständig erstarrt.
  5. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop zu ACQuire Bilder.
  6. Verwenden Sie einen 543-nm-Laserlinie für mCherry und ALC-Färbung analysiert. Verwenden Sie einen 488-nm-Laserlinie für nlGFP und Calcein-Färbung analysiert.
  7. Nach der Bebilderung Fischmedium auf die Petrischale hinzufügen und ein Paar von feinen Injektionsnadeln (27 G x 1 ½ ") verwenden, um sorgfältig die Larven aus der Agarose zu entfernen. Übertragen Sie die Larven mit residually Agarose gebunden in eine Petrischale mit Fisch Medium zu erholen .
  8. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware 27 verwendet wird .

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Representative Results

Reichlich Ei Zahlen, sowie die geringe Größe der Larven, machen Medaka ein hervorragendes Modell für Wirkstoff-Screening. Eine einzige Sechs-Well-Platte wurde bis zu 36 Larven zur Kultur verwendet, die statistisch signifikante Daten zu liefern ausreichend war. Ein weiterer großer Vorteil der Verwendung von Fisch für Skelett-Analyse ist die Möglichkeit der Live-Bildgebung zu tun. Die Transparenz von Fischlarven ermöglicht die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen Knochenzellen zu kennzeichnen, sowie die Verwendung von Farbstoffen, die Knochenmatrix binden, um die Mineralisierung zu visualisieren. Fischlarven sind leicht zu handhaben , und die Probenvorbereitung für die Bildgebung ist einfach (Abbildung 2).

A RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP doppelt transgene Linie verwendet , um die ektopische Bildung von RANKL-induzierte Osteoklasten zu visualisieren. Zusätzlich osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP triple-transgenen Larven wurden für die gleichzeitige verwendet detektierenIonen von vorzeitigem Osteoblasten und Osteoklasten differenzier (Abbildung 3). Übersichtsbilder wurden mit einem Stereomikroskop (3A - C und F - H) entnommen, während der konfokalen Mikroskopie wurde verwendet Prozesse auf zellulärer Ebene sichtbar zu machen (Figur 3D, E, I, J Pfeilspitzen). ALC-gefärbten Knochenmatrix entlang der neuralen Bögen (na) und Centra (c) (Figur 3D) wurde als Referenz verwendet , um die Position des fluoreszierend markierten Knochenzellen (3D und I) zu bestimmen.

Ein Vorteil gleichzeitig Osteoklasten und Osteoblasten in der gleichen intakten Larven Visualisierung ist, dass die antiresorptive vs. Knochen-anabolische Aktivitäten einer getesteten Verbindung unterschieden werden können. Hierzu wird die Verteilung von Osteoklasten und Osteoblasten an bereits bestehenden und neu gebildeten mineralisierten Knochenmatrix bestimmt. Sucfolgenden Anfärbung von Knochenmatrix mit ALC (rot) (4A, B) , gefolgt von Calcein (grün) (4C, D) zeigt , de novo mineralisierter Knochenmatrix (grün) (4E, F Pfeilspitzen). Dieser Assay ermöglicht die Quantifizierung der Geschwindigkeit der Knochenbildung. Erhöhte de novo Raten nach der medikamentösen Behandlung zeigen einen Knochen-anabole Wirkung der getesteten Verbindung. Im Gegensatz dazu Persistenz von vorbestehenden Knochenmatrix zeigt auf eine antiresorptive Aktivität des Arzneimittels 27. Beide ALC und Calcein Etiketten in den Larven sind für mindestens zwei Wochen stabil, so dass eine kontinuierliche Beobachtung der neuen Knochenbildung in Medaka - Larven in vivo.

Figur 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der medikamentösen Behandlung, Live - ALC - Färbung und Montage für die konfokale Live - Imaging. A. Ein Sechs-Well-Plattewird für die Arzneimittelbehandlung verwendet ausreichenden Raum für die Larven zu gewährleisten. 2 h im Dunkeln - Die mineralisierte Knochenmatrix wird für 1,5 durch Inkubation Medaka Larven in 0,1% ALC gefärbt. Stained Larven werden mehrmals mit Fisch Medium gespült. 0,01% Tricaine wird verwendet, Larven zu betäuben. B. Nach der Übertragung der betäubten Larven zu lau und Flüssigkeit 1,5% niedrig schmelzenden Agarose, ihre Position mit einem Kunststoff-Micro eingestellt wird. Die Larven werden dann entsprechend dem interessierenden Bereich angebracht ist (beispielsweise der wirbel Säule am besten in der Seitenansicht abgebildet ist). Nachdem die Agarose erstarrt ist, wird die montierte Probe für konfokale Bildgebung bereit. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Figur 3: cSt: nlGFP und osx: mCherry Expression in transgenen Medaka Larvae bei 10 DPF, ohne und nach Hitzeschock-induzierte RANKL Expression. AC. Kontrollarven ohne RANKL Induktion. ALC-gefärbten Skelett-Matrix (A); beachten Sie die unspezifische Autofluoreszenzsignals in der dorsal lokalisierten Reihe von Pigmentzellen. cSt: nlGFP Ausdruck im Kopf und Schwanz (B) und die Verteilung der osx: mCherry-positive vorzeitige Osteoblasten im Schädel, Wirbelsäulen und Schwanzflosse (C). D. Die konfokale Stapel der Fläche eingerahmt in A und B die Abwesenheit von ektopischen Osteoklasten um die Wirbelbögen (na) und Centra (c) in diesem Entwicklungsstadium zeigt. E. Die konfokale Stapel der Fläche eingerahmt in C zeigt osx: mCherry-exprimierenden vorzeitige Osteoblasten entlang der NEURAl Bögen und an den Rändern des Centra. Osteoklasten sind aus dem Kofferraum ohne RANKL Induktion fehlt. FJ. Larvae nach RANKL-Induktion durch Hitzeschock bei 9 DPF. F. ALC-gefärbten Skelett-Matrix. G. cSt: nlGFP exprimierenden in der Wirbelsäule bildet Osteoklasten. Einfügungen in G zeigen einzelne Bilder mit höherer Vergrößerung aufgenommen , die zusammengenäht werden in der zusammengesetzten Bild in G zu führen. H. Die Verteilung der osx: mCherry-exprimierenden Zellen nicht 1 d nach RANKL Induktion verändert. I. Konfokalen Stapel der Fläche eingekeilt F und G zeigt RANKL-induzierte Osteoklasten um die neurale Bögen bilden, sowie die Centra (Pfeilspitzen). J. Die konfokale Stapel der Fläche eingerahmt in H zeigt cSt: Osteoklasten neben osx nlGFP-exprimierenden: mCherry-markierte vorzeitige Osteoblasten entlangdie Wirbelbögen und die Centra. Maßstabsbalken in A, B, C, F, G und H: 100 & mgr; m. Maßstabsbalken in D, E, I und J: 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Analyse von De Novo Mineralisation von Knochenmatrix durch die sukzessive Anfärbung von Larven mit ALC und Calcein bei 12 und 15 DPF, respectively. A, B. ALC-gefärbten Skelett-Matrix bei 12 DPF. C, D. Calcein-gefärbte Skelett Matrix bei 15 DPF in der gleichen Larven. E, F. Zusammengefügte Bild der neu Minera zeigtlized Knochenmatrix an den Spitzen der Wirbelbögen (grün, Pfeile). B, D und F. Konfokalen Stapel Bereich geschachtelt in A, C und E sind. Maßstabsbalken in A, C und E: 100 & mgr; m. Maßstabsbalken in B, D und F: 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Es werden repräsentative Bilder ein erfolgloser und eine erfolgreiche Montage für die konfokale Abbildung: Abbildung 5. AC. Erfolglos Montage in niedrig schmelzenden Agarose-Ergebnisse in einem Teil der Probe (links) außerhalb der Fokusebene liegen. DF. Erfolgreiche Montage aller regi zeigtons von Interesse in der gleichen Brennebene. Maßstabsbalken: 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Alendronat Behandlung verhindert Knochenresorption. ALC-gefärbten Skelettmatrix und cSt: nlGFP exprimierenden Osteoklasten in transgenen Medaka Larven ohne RANKL Induktions (AC), mit Hitzeschock-induzierte RANKL Ausdruck (DF), und mit dem Zusatz von Alendronat am selben Tag wie RANKL Induktions (GI) . C, F und ich. Konfokalen Stapeln der Bereiche geschachtelt in A und B, D und E, G und H, respectively.C. ALC-gefärbten intakten Wirbelsäulen ohne RANKL Induktion. F. RANKL-induzierte, cSt exprimierenden Osteoklasten Form um die neurale Bögen und der Centra, was zur vollständigen Resorption des mineralisierten Matrix der neuralen Bögen (Pfeile) und Mängel der Centra (Pfeilspitzen). G. Die Zugabe von Alendronat hat keine Wirkung auf die Bildung von cSt: nlGFP exprimierenden Osteoklasten, aber es blockiert Knochenresorption und lässt die neurale Bögen und die Centra intakt. Maßstabsbalken in A, B, D, E, G und H: 100 & mgr; m. Maßstabsbalken in C, F und I: 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Es ist wichtig, dass die Bedingungen für die Hitzeschockbehandlung sind konsistent und stabil, wenn verschiedene Proben zu vergleichen. Stabile Temperaturbedingungen garantieren ähnliche Niveaus von RANKL - Induktion in transgenen Larven und damit vergleichbar Osteoklastenbildung, die durch Screenen auf cSt bestätigt werden kann: nlGFP Ausdruck. Letztendlich führt dies zu einem ähnlichen Grad an induzierter ectopic Knochenresorption und Osteoporose artige Läsionen, wie ALC-Färbung bestätigt. Eine solche Versuchsanordnung ermöglicht dann die Bestimmung und der Vergleich der Wirkungen von verschiedenen anti-resorptive Drogen oder das gleiche Medikament bei verschiedenen Konzentrationen angewandt.

Technische Änderungen und Fehlerbehebung

Fischlarven sind sehr empfindlich und müssen sorgfältig während des Montageprozesses für die Bildgebung behandelt. Für eine optimale Live-konfokale Abbildung, sind Larven sorgfältig positioned mit einem Kunststoffmicro, anstatt Zange, Verletzungen (2B) zu verhindern. Die Dotter-Erweiterung ist weniger empfindlich Stimuli zu berühren und verwendet werden, können die Larven mit einem Micro zu orientieren, wodurch Larvenbewegung vermieden bei der Montage. Die Region von Interesse sollte flach montiert werden , um sicherzustellen , dass die Probe während der Bildgebung (Abbildung 5) in einer Fokusebene fokussiert werden. Knochenzellverhalten ist sehr dynamisch und erfordert einen hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung während der Live-Bildgebung. Optimal, Zeitraffer-Bildgebung durch konfokale Analyse gewünscht wird Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen im Laufe von mehreren Stunden in der lebenden Larven zu folgen. Allerdings verlangt diese besondere Bedingungen für die Larven am Leben und in einer festen Position zu halten. Für verlängerte Anästhesie wurde eine Lösung von 0,001% Tricaine in Fischmedium wird zugesetzt, um die Agarose verfestigt während der Bildgebung zu bedecken. Dies verhindert, dass die Agarose vor dem Austrocknen und verhindert plötzliche Zucken der Larven während imaging über mehrere Stunden.

Einschränkungen der Technik

Osteoporose ist eine Krankheit, die hauptsächlich ältere Menschen betroffen sind. Daher sollte ein ideales in - vivo - Modell für Osteoporose - Medikament Screening erwachsenen Fischen einzubeziehen. Bisher ist jedoch die Technik der Echtzeit-Bildgebung in diesem Bericht beschrieben wird auf die Embryonal- und Larvenstadien beschränkt. Derzeit erhältliche konfokale Bildgebung erlaubt es nicht, die Live-Darstellung von genetisch markierten Knochenzellen in ausgewachsene Fische wegen der Beschränkungen in Eindringtiefe. Die jüngste Entwicklung des Lichtblattes Fluoreszenzmikroskopie (LSFM), die Bildgebung ermöglicht tief in lebendem Gewebe, zusammen mit der Verfügbarkeit von weniger pigmentiert "Durchsicht" Medaka-Stämme, macht es denkbar, dass diese Einschränkung wird bald überwunden werden, und die Live-Darstellung von Knochenzellen bei Erwachsenen Medakafisches nach Wirkstoff-Screening möglich sein wird.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternative METHODEN

Knochenforschung im Besonderen - - und in vivo Modellen für Wirkstoff - Screening Eine einzigartige Kombination aus Echtzeit- Bildgebung und fortschrittliche genetische Werkzeuge hat kleine Knochenfische beliebt für die biomedizinische Forschung gemacht. Mit der Möglichkeit, Zell-Zell-Wechselwirkungen in einem intakten Organismus, transgenen Medaka Linien sind in einzigartiger Weise geeignet für die Live-Darstellung von dynamischen zellulären Prozessen während der Knochenmodellierung und Umbau zu analysieren. Weil sie viele Gen-regulatorische Netzwerke zur Bekämpfung von Knochenhomöostase mit Säugetieren in vivo - Studien in Medaka teilen können ergänzen und auch in - vitro - Studien unter Verwendung von Säugetier-Osteoblasten und Osteoklasten - Zellkultur - Assays nicht überschreiten.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering

Anders als die Prüfung einzelne Verbindungen in einem transgenen Hintergrund, wie in diesem Protokoll beschrieben, Fisch bieten auch einfache Ansätze Kombinationen von va zu untersuchenrious Medikamente für mögliche Synergien oder Störungen von Verbindungen. Weiterhin stellt die Verwendung einer Kombination von verschiedenen Reporterlinien, beispielsweise im Rahmen eines bestimmten mutanten Hintergrund, zahlreiche Möglichkeiten, das Verhalten von Knochenzellen in verschiedenen Stadien der Knochenabbau und Reparatur, oder in Gegenwart eines Knochens zu studieren -modulating Droge. Mit seiner einzigartigen Eigenschaften , die Maus - Assays ergänzen, stellt die Medaka Osteoporose - Modell eine hervorragende In - vivo - Ansatz zu testen und die anabole und antiresorptiv Wirkungen von neuartigen Knochen modulierende Verbindungen zu quantifizieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine oder finanzielle Interessen haben.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem Singapur Bildungsministerium (MOE, Grant-Nummer 2013-T2-2-126) und das National Institute of Health, USA finanziert (NIH gewähren Nummer 1R21AT008452-01A1). TY erhielt ein Diplom-Stipendium der NUS Department of Biological Sciences. Wir danken der konfokalen Einheit der NUS Zentrum für Bioimaging Sciences (CBIS) für ihre ständige Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alendronate  Sigma A4978
alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone Sigma A3882
Calcein Sigma C0875
ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) Sigma A5040
ImageJ (1.4.3.67) National Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
LSM 510 Meta confocal  Zeiss
LSM Image Browser (4.2.0.121) Zeiss http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html
Micro-loader Eppendorf 5242956003 Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL
NIS-Elements BR 3.0 software Nikon
Photoshop CS6 (13.0.0.0) Adobe
SMZ1000 stereomicroscope  Nikon

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 119 die Live-Darstellung Osteoblasten Osteoklasten Live-Knochen-Färbung Knochenumbau Osteoporose Medaka Bisphosphonate anti-resorptive Drogen
Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell
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Yu, T., Winkler, C. Drug Treatment… More

Yu, T., Winkler, C. Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model. J. Vis. Exp. (119), e55025, doi:10.3791/55025 (2017).

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