Abstract
Bone-vormende osteoblasten interageren met botresorberende osteoclasten aan de omzet van het bot matrix te coördineren en het skelet homeostase controleren. Medaka en zebravis larven worden veel gebruikt om het gedrag van botcellen tijdens botvorming, degeneratie en reparatie analyseren. De optische helderheid maakt de visualisatie van fluorescent gelabelde botcellen en fluorescerende kleurstoffen gebonden aan het skelet gemineraliseerde matrix. Ons laboratorium heeft transgene medaka vis die de osteoclasten-inducerende factor Receptor Activator van de Nucleaire-factor KB Ligand (RANKL) onder de controle van een heat shock-induceerbare promoter uit te drukken gegenereerd. Ectopische expressie van RANKL resulteert in de vorming van overmaat geactiveerde osteoclasten, die reporter lijnen kunnen worden gevisualiseerd met nlGFP expressie onder controle van de cathepsine K (ctsk) promoter. RANKL inductie en buitenbaarmoederlijke vorming van osteoclasten leidt tot ernstige osteoporose-achtige fenotypes. Samengestelde transgene medaka lines die expressie ctsk: nlGFP in osteoclasten, alsmede mCherry onder controle van de osterix (osx) promotor in premature osteoblasten, kan worden gebruikt om de interactie van beide celtypen te bestuderen. Dit vergemakkelijkt het in vivo waarneming van cellulair gedrag onder omstandigheden van botdegeneratie en reparatie. Hier beschrijven we het gebruik van dit systeem een geneesmiddel algemeen in menselijke osteoporosetherapie testen en beschrijven een protocol voor levende beeldvorming. De medaka model vormt een aanvulling op studies in celcultuur en muizen, en biedt een nieuw systeem voor de in vivo analyse van de werking van het geneesmiddel in het skelet.
Introduction
De vertebraat skelet geeft structurele steun en bescherming van organen, maakt de mobiliteit, en dient als een bron van calcium. Gedurende het hele leven, wordt de extracellulaire botmatrix continu overgedragen aan het bot stabiliteit en stijfheid te behouden. Dit proces vereist de strak gecoördineerde activiteit en samenspel van botvormende osteoblasten en botresorberende osteoclasten. Osteoblasten afgeleid van multipotente mesenchymale voorlopercellen en produceren collageen de osteoid het eiwitachtige deel van het bot matrix 10 te vormen. Osteoblasten interactie met osteoclasten een evenwichtige activiteit van beide celtypen, die nodig is om bothomeostase 7 controle. Vanwege deze complexe regulerende interacties respons op behandeling met geneesmiddelen en bothomeostase niet volledig onderzocht onder toepassing van in vitro studies. Er is dus een sterke behoefte aan diermodellen. Vergeleken met de celkweek instellingen in vivo modellen kunnenwaardevol inzicht in de meercellige netwerken binnen het bot milieu.
Talrijke muismodellen aanwezig voor diverse humane botaandoeningen waaronder osteoporose 16. De omvang en de toegankelijkheid van muizenembryo's vertegenwoordigen belangrijke beperkingen voor levende beeldvorming van het skelet processen. Kleine beenvissen, anderzijds, dienen als een aantrekkelijk alternatief voor in vivo beeldvorming. De zebravis (Danio rerio) en medaka (Oryzias latipes) zijn populair geworden diermodellen voor skeletale onderzoek in de afgelopen twee decennia 17, 19, 22, 24. Been beenvissen en zoogdieren heel gelijkaardig, zowel structureel en een fysiologisch niveau, en veel van de belangrijkste regulerende genen en signaalwegen geconserveerd 3. Zoals in zoogdieren, beenvissen zorgvuldig reguleren van de activiteit van osteoblasten en osteoclasten vorming en resorptie 26 botbalans. Belangrijker, de optische helderheid van fish larven maakt het gebruik van fluorescente reporters op botcellen en het gecalcificeerde skeletachtige matrix 8, 9, 12, 21, 23, die de waarneming van cellulaire processen in het levende dier vergemakkelijkt labelen. Daarnaast is een aantal genetische hulpmiddelen gegenereerd voor biomedisch relevant onderzoek bij vissen te vergemakkelijken. Voor medaka in het bijzonder methoden voor gerichte genmutatie door CRISPR / Cas9 2, cell-lineage tracing 6, en site-specific transgenese 14 zijn onlangs opgericht en zijn nu op grote schaal in gebruik 15.
Kleine teleost larven zijn met succes gebruikt voor chemische schermen, wat leidde tot de ontdekking van verschillende farmacologisch relevante drugs 1, 18.
Vislarven tolerant lage concentraties DMSO en kunnen verbindingen absorberen uit hun aquatische milieu, hetzij door de huid of door het maagdarmkanaal 1, 5. Ons laboratorium eerder reported medaka transgene lijnen die fluorescente reporters in botcellen tot expressie onder de controle van verschillende osteoblast- en osteoclast-specifieke promoters. Deze omvatten premature osteoblasten (collageen 10A1, col10a1; osterix, osx) 20, 21, mature osteoblasten (osteocalcine, OSC) 27, en osteoclasten (cathepsine K, ctsk) 24. We genereerden ook een transgene lijn die de osteoclast-inducerende factor Receptor Activator van nucleaire factor KB ligand (RANKL) onder de controle van een hitteschok-induceerbare promoter 24 uitdrukt.
Inductie van RANKL in dit systeem leidt tot de vorming van ectopisch actieve osteoclasten. Dit leidt tot verhoogde botresorptie en ernstige osteoporose fenotype, met drastisch verminderd mineralisatie in de wervellichamen. We hebben onlangs bleek dat de osteoclastische activiteit in dit model kan worden geblokkeerd door de bisfosfonaten etidronaat en alendronaat, two geneesmiddelen die vaak gebruikt in de menselijke osteoporosetherapie, waardoor valideren medaka een geschikt modelsysteem voor osteoporose 27.
Door hun grote kroost omvang, snelle ontwikkeling, en de geringe afmetingen van de embryo's, transgene medaka larven zijn bij uitstek geschikt voor de grootschalige screening van osteoporose drugs en voor de in vivo analyse van het bot cel gedrag. Studies in medaka dus efficiënt experimenten aanvullen in celkweken en in muizen die gericht zijn op het ontdekken van nieuwe therapeutische targets en nieuwe therapieën voor menselijke botaandoeningen.
In de huidige studie beschrijven we een protocol voor de behandeling van medaka bot-reporter larven met de gemeenschappelijke osteoporose drug, alendronaat. We hebben ook in detail beschrijven hoe behandelde larven zijn gemonteerd en voorbereid op de live-beeldvorming van botmatrix en botcellen. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere kleine chemische verbindingen die ofwel werken bot anabole of antiresorptieve middelen. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocollen van de National University of Singapore (R14-293).
1. Vis Veehouderij en het winnen van embryo's
- Raise WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: GVB 24 en osx: mCherry 21 single- of samengestelde-transgene medaka vis op 26 ° C onder een gecontroleerde lichtcyclus (14 uur licht, 10 uur donker) te paaien induceren.
- Dagelijks paaien vindt plaats tijdens de eerste 30 minuten nadat het licht wordt ingeschakeld. De eieren plakken aan elkaar door middel van filamenten en hechten aan de buik van het vrouwtje voor enkele uren. Gebruik een fijnmazig net van een vrouwelijke volwassen dragen een ei cluster te vangen. Laat de vis even rusten in het net en dan zachtjes masseren de buik van de vis zorgvuldig strippen de bevruchte eicel cluster uit de buik van het vrouwtje.
LET OP: Een gezonde medaka vrouwelijkekan produceren 10-20 eieren per dag gedurende ongeveer 5 maanden. - Plaats de eieren in een 60 mm plastic petrischaal. Met een kunststof pipet om de embryo spoelen met 5-10 ml 0.3x Danieau's oplossing (vis medium; 19,3 mM NaCl, 0,23 mM KCl, 0,13 mM MgSO4, 0,2 mM Ca (NO 3) 2 en 1,7 mM HEPES, pH 7,0). Voeg 1 ml van een 0,25% (w / v) methyleenblauw stockoplossing aan 2,5 L van medium vis schimmelgroei te voorkomen.
- Schud ei cluster om een knoop van gehechtheid filamenten te vormen. Gebruik een tang om verwijder voorzichtig de bevestiging filamenten van de bevruchte eicel clusters aan individuele embryo's (Figuur 1A) te verkrijgen.
- Stadium de embryo volgens Iwamatsu 2004 13.
- Cultuur 20-30 embryo's per 60 mm plastic petrischaal in een 28 ° C incubator. Verander het medium dagelijks normale ontwikkeling van het embryo te verzekeren.
LET OP: De tijd rond het uitkomen stadium (8-9 d postfertilization,DPF) is vooral van belang om te overleven. Verwijder vrij zwevende chorions aan het medium schoon te houden en te zorgen voor een goede larvale overlevingskansen.
2. Transgene Embryo Screening
- Gebruik een stereomicroscoop voorzien van een kwiklamp voor fluorescentie beeldvorming en GFP, RFP, en CFP filters om transgene embryo's voor fluorescente reporter expressie middels vergroting van 40x screenen.
- Visueel identificeren osx: mCherry embryos mCherry reporterexpressie begin vormende schedelbotten, zoals cleithrum, aan beide zijden van de achterste kop (Figuur 1B, pijl) en de parasphenoid op een centrale positie in de ventrale cranium ( Figuur 1B, pijlpunt).
LET OP: Reporter expressie start vanaf 5 DPF vanaf 21. - Identificeer ctsk: nlGFP embryo's door een sterke nlGFP uitdrukking in het hoofd (figuur 1C, pijl) en de staart (figuur 1C, pijlpunt), uitgaande van6 DPF.
LET OP: Endogene osteoclasten vormen pas na 21 DPF. nlGFP tot expressie brengende cellen in dit vroege stadium (6 DPF) niet osteoclasten maar andere, tot nu toe niet gekarakteriseerd, ctsk-positieve cellen 24. - Identificeer RANKL: HSE: CFP transgene embryos alomtegenwoordige CFP expressie na korte hitteshockbehandeling gedurende 20 minuten bij 39 ° C, uitgevoerd bij 2 DPF of hoger voor screening doeleinden.
OPMERKING: De RANKL en CFP transgenen staat onder controle van dezelfde bidirectionele Heat Shock Element (HSE). GVB uitdrukking geeft aan succesvolle RANKL inductie 24. - Voer een 1,5-2 uur hitteshockbehandeling op 9 DPF of later grote aantallen osteoclasten ectopische induceren in het heupgebied, die vervolgens leidt tot een osteoporose-fenotype 24.
OPMERKING: Transgene RANKL expressie geïnduceerd bij 9 DPF resulteert in een ectopische activatie van slapende osteoclast voorlopercellen, die niet endogeen geactiveerdvóór 21 DPF. Gebruik een waterbad tot een stabiele 39 ° C omstandigheden te verkrijgen. Laat de petrischaal met medaka embryo's drijven op het wateroppervlak. Zorg ervoor dat het deksel van de petrischaal droog is om het zinken van het gerecht te voorkomen. - Scherm embryo's uit samengestelde lijnen, zoals RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP dubbel-transgene en osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP triple-transgene, op basis van de expressie patroon van elk individueel transgene.
LET OP: hemizygoot en homozygote transgene embryo's werden onderscheiden door verschillende niveaus van fluorescentie van de reporter transgen. Homozygote embryo had een fluorescentie-intensiteit die ongeveer verdubbeld vergeleken met die van hemizygoot transgenen. Samengestelde lijnen die homozygoot zijn voor beide RANKL waren: HSE: GVB en ctsk: nlGFP werden verkregen door herhaalde incrossing over meerdere generaties. Voor de triple-transgene osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP vissen, homozygote RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP vissen werden gekruist met homozygote osx: mCherry dragers. De resulterende heterozygote triple-transgeen nageslacht zijn gerezen en incrossed om embryo's homozygoot voor RANKL te verkrijgen: HSE: GVB. De RANKL: HSE: GVB transgene homozygote moet met het oog op een efficiënte inductie van buitenbaarmoederlijke osteoclasten te verkrijgen.
Figuur 1: WT en transgene Medaka Embryo 7 D Postfertilization (DPF). A. WT embryo waargenomen met helderveld belichting. B. Transgene embryo's laten zien osx: mCherry uitdrukking rond de cleithrum (pijl) en parasphenoid (pijlpunt). C. Transgene embryo's laten zien ctsk: nlGFP uitdrukking in het hoofd (pijl) en de staart (pijlpunt). Schaal bars: 500 pm.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. bisfosfonaat Behandeling van Medaka Larven
- Worden de oplossingen die verschillende concentraties van bisfosfonaten (bp) voor de dosis-respons studies.
LET OP: De voorbeeldige BP gebruikt in dit protocol is alendroninezuur.- Oplossen alendronaat bij vissen medium bij een concentratie van 100 ug / ml van een voorraadoplossing bereid.
- Gebruik een vortex mixer volledig oplossen te waarborgen. Bewaar de stock oplossing bij 4 ° C.
- Bereid verschillende werkoplossingen door verdunning van de voorraadoplossing met vis medium om een reeks concentraties (dat wil zeggen, 25, 37,5, 50, 62,5 en 75 ug / ml).
OPMERKING: De verschillende geneesmiddelen kunnen verschillende absorptie, distributie, metabolisme en excretie (ADME) parameters, die in tests volgens deze medaka larven systeem moet worden beschouwd hebben. Ook kunnen de oplosbaarheid en stabiliteit geneesmiddel variëren bijtoegepast als een waterige oplossing. Minder water oplosbare verbindingen Mogelijk moet eerst worden opgelost in organische oplosmiddelen zoals DMSO. In dit geval wordt een voorraadoplossing bereid in DMSO, wordt vervolgens verder verdund in medium vissen. Merk op dat de werkoplossingen in water (vis gemiddeld) kunnen worden opgeslagen in de koelkast gedurende enkele week. Wel moet oplossingen met DMSO bij kamertemperatuur worden bewaard om kristallisatie te voorkomen.
- Transfer medaka larven in zes-well platen (zes larven / putje) voor verdere BP (alendronaat) behandeling.
- Verwijder de vis medium voorzichtig met een schone plastic pipet en voeg een klein volume (. Ongeveer 0,5 ml) van alendronaat oplossing in elk putje.
- Vermijd overgebleven vissen medium, de toegevoegde BP oplossing kan worden verdund, hetgeen vooral van belang voor minder geconcentreerde oplossingen alendronaat.
- Verwijderen van een kleine hoeveelheid alendronaat oplossing (tot 0,5 ml) van elk putje met een schone plastic pipet en vervangen door een grotere volume (4 ml) oplossing van alendronaat.
- Veranderen medium elke dag om ervoor te zorgen een normale embryo ontwikkeling.
4. Levende kleuring van Gemineraliseerd-bone Matrix
- Los op 0,5 g Alizarine complexone (ALC, alizarine-3-methyliminodiacetic zuur) of 0,05 g calceïne in 50 ml fish medium tot 1% en 0,1% voorraadoplossingen bereid, respectievelijk. Gebruik een vortex mixer volledig oplossen te waarborgen.
OPMERKING: Fish medium zonder toevoeging van methyleenblauw wordt in deze en de volgende stappen om autofluorescentie in het larven verminderen. - Met een spuit en single-use filter (0,2 pm) waardoor de kleuroplossing filteren. Bewaar de gefiltreerde oplossing in het donker bij kamertemperatuur.
LET OP: De kleur van de gefilterde, heldere ALC kleuroplossing is donker geel tot oranje. De kleur van de gefiltreerde heldere calceïne oplossing is helder geel. Oplossingen kan worden gebruikt voor meerdere maanden. - Verdun de gefilterde ALC of calceïne stockoplossing 01:10 in vis mediumen incubeer de medaka larven van 1,5-2 uur (0,1% ALC oplossing) of 2-2,5 uur (0,01% calceïne oplossing) in een 28 ° C incubator wanneer larven tussen 9 en 17 DPF gebruikt. Houd de monsters in het donker.
- Breng de larven om verse vis medium met behulp van een schone plastic pipet.
- Haal de vis medium met een schone plastic pipet en voeg verse vis medium. Herhaal deze stap voor 3-4 keer totdat er geen rood- of geel gekleurde oplossing (ALC of calceïne, respectievelijk) overblijft. Laat de larven in vis medium voor 30-60 minuten voordat ze aan te koppelen voor beeldvorming aan epifluorescentie uit het medium te voorkomen.
OPMERKING: 0,1% ALC kleuroplossing schadelijk is medaka larven voor langere blootstellingstijden. Incubatietijden van meer dan 2 h beïnvloeden de overleving van de larven. Concentratie en kleurtijd moeten derhalve worden geoptimaliseerd voor verschillende fasen om optimale embryo overleving en kleuring resultaten.
5. Live-Fluorescence Imaging p>
- Verdoven de medaka larven met 0,01% tricaïne (ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat) in vis medium.
LET OP: Verdoofde larven worden geïmmobiliseerd na 5-10 min in tricaïne oplossing en meestal liggen, hetzij op hun zij of hun rug. - Gebruik een plastic microloader de larven oriënteren naar het interessegebied. De oriëntatie van de larven die in dit protocol lateraal.
- Gebruik een stereomicroscoop met fluorescentie verlichting voor beeldvorming. Gebruik een sterke vergroting bij het nemen van foto's, met de nadruk op verschillende delen van de larven (hoofd, romp voorste, achterste romp en staart). Stitch afzonderlijke beelden samen in overlappende gebieden met behulp van een geschikte afbeelding-processing software (inzetstukken in figuur 3G).
LET OP: Dit helpt om de beeldkwaliteit van alle relevante delen van het lichaam in de juiste focal plane verbeteren. - Zet de larven om de vis medium voor herstel na beeldvorming.
- Verdoven de larven met 0,01% tricaïne in vis medium voor 5-10 min, totdat ze geïmmobiliseerd worden.
- Oplossen laagsmeltende agarose 1,5% bij vissen medium door het te verwarmen in een magnetron. Koel de oplossing tot ongeveer 30 ° C.
- Voeg 0,5-1 ml vloeibaar 1,5% laagsmeltende agarose in vis medium om een glazen bodem petrischaal. Breng de narcose larven in de oplossing om met een schone plastic pipet.
LET OP: Wees extra voorzorgsmaatregel dat de temperatuur van de vloeistof laagsmeltende agarose laag genoeg is om niet schadelijk voor de larven. - Voordat de agarose stolt, met een kunststof microloader de larven duwen naar de bodem van de petrischaal en oriënteren de larven naar het interessegebied. De oriëntatie van de larven die in dit protocol lateraal.
LET OP: De monsters zijn klaar voor confocale live-beeldvorming na de agarose volledig stolt. - Gebruik een confocale microscoop ACQuire beelden.
- Gebruik een 543 nm laser lijn voor mCherry en ALC kleuring analyses. Gebruik een 488 nm laser lijn voor nlGFP en calceïne kleuring analyses.
- Na de belichting, voeg vis medium aan de petrischaal en gebruik een paar fijne injectienaalden (27 G x 1½ ") aan de larven voorzichtig uit de agarose. Breng de larven residueel agarose gekoppeld aan een petrischaal met vis medium herstellen .
- Verwerk de beelden met behulp van een beeld analyse software 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overvloedige ei nummers, alsook de geringe omvang van de larven maken medaka een uitstekend model voor het screenen van geneesmiddelen. Een enkelvoudige zes-well plaat werd gebruikt om kweken tot 36 larven, die voldoende is om statistisch significante gegevens was. Een ander groot voordeel van vis voor skeletale analyse verkleinen de mogelijkheid om levende imaging. De transparantie van vislarven maakt het gebruik van fluorescerende eiwitten tot botcellen, alsmede het gebruik van kleurstoffen die binden aan botmatrix om mineralisatie zichtbaar label. Vislarven zijn gemakkelijk te hanteren, en monstervoorbereiding voor de beeldvorming is eenvoudig (figuur 2).
A RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP dubbel-transgene lijn werd gebruikt om de vorming van een buitenbaarmoederlijke-RANKL geïnduceerde osteoclasten te visualiseren. Bovendien osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP triple-transgene larven werden gebruikt voor het gelijktijdig detecterenion van voortijdige osteoblasten en gedifferentieerde osteoclasten (figuur 3). Overzichtsbeeld werden genomen met een stereomicroscoop (figuur 3A - C en F - H), terwijl confocale microscopie werd gebruikt om processen op cellulair niveau (Figuur 3D, E, I, J pijlpunten) te visualiseren. ALC-bevlekte botmatrix langs de neurale bogen (na) en Centra (c) (Figuur 3D) werd gebruikt als referentie om de positie van fluorescent gelabelde botcellen (Figuur 3D en I) te bepalen.
Een voordeel van gelijktijdig visualiseren osteoclasten en osteoblasten in dezelfde intacte larven is dat antiresorptieve vs. been-anabolische activiteiten van een geteste verbinding worden onderscheiden. Hiervoor wordt de verdeling van osteoclasten en osteoblasten bepaald aan reeds bestaande en nieuw gevormde gemineraliseerde botmatrix. sucovermatige kleuring van het bot matrix met ALC (rood) (Figuur 4A, B), gevolgd door calceïne (groen) (Figuur 4C, D) onthult de novo gemineraliseerd bot matrix (groen) (Figuur 4E, F pijlpunten). Deze test maakt de kwantificering van de snelheid van botvorming. Verhoogde de novo tarieven na de behandeling met geneesmiddelen te geven een bot-anabole werking van de geteste verbinding. Daarentegen persistentie reeds bestaande botmatrix wijst op een botafbraakremmende activiteit van het geneesmiddel 27. Zowel ALC en calceïne labels in de larven stabiel gedurende ten minste twee weken, waardoor een voortdurende aandacht van nieuwe botvorming in medaka larven in vivo.
Figuur 2: Schematische weergave van de Drug Treatment, Live ALC kleuring, en montage voor confocale Live-Imaging. A. Een zes-well plaatwordt gebruikt voor de behandeling drug voldoende ruimte voor de larven te waarborgen. De gemineraliseerde bot matrix wordt gekleurd door incubatie medaka larven in 0,1% ALC voor 1,5-2 uur in het donker. Stained larven worden meerdere malen gespoeld met vis medium. 0,01% tricaïne wordt gebruikt om larven verdoven. B. Na de overdracht van verdoofde larven lauw en vloeibare 1,5% laagsmeltende agarose, wordt hun positie ingesteld met een plastic microloader. De larven worden vervolgens gemonteerd naar het gebied van belang (bijvoorbeeld is de gewervelde kolom best afgebeeld in het zijaanzicht). Nadat de agarose is gestold, de gemonteerde monster is klaar voor confocale beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:
Figuur 4: Analyse van De Novo mineralisatie van botmatrix door Opeenvolgende Kleuring van Larven met ALC en calceïne op 12 en 15 DPF, Respectievelijk. A, B. ALC-bevlekte skeletachtige matrix op 12 DPF. C, D. Calceïne-gekleurde skelet matrix 15 DPF dezelfde larven. E, F. Samengevoegde afbeelding toont de nieuw mineraseerd botmatrix aan de uiteinden van de neurale bogen (groen, pijlen). B, D en F. Confocale stapel het gebied ingesloten A, C en E, resp. Schaalbalken in A, C en E: 100 urn. Schaalbalken in B, D en F: 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve beelden die een mislukte en een succesvolle montage voor Confocale Imaging. AC. Mislukte montage in laagsmeltende agarose resulteert in een deel van het monster (links) die buiten de focal plane. DF. Succesvolle montage met alle regions van belang binnen dezelfde focal plane. Schaalbalken: 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Alendronat behandeling voorkomt botresorptie. ALC-bevlekte skelet matrix en ctsk: nlGFP expressie osteoclasten in transgene medaka larven zonder RANKL inductie (AC), met warmte-shock geïnduceerd RANKL expressie (DF), en met toevoeging van alendronaat op dezelfde dag als RANKL inductie (GI) . C, F, en ik. Confocale stapels gebieden ingesloten A en B, D en E, G en H respectievelijk.C. ALC-bevlekte intact wervelkolommen zonder RANKL inductie. F. RANKL-geïnduceerde osteoclasten ctsk -expressie vorm rond de neurale bogen en de centra, waardoor de volledige resorptie van de gemineraliseerde matrix van de neurale bogen (pijlen) en defecten aan de centra (pijlpunten). G. De toevoeging van alendronaat heeft geen invloed op de vorming van ctsk: nlGFP-expressie osteoclasten, maar blokkeert botresorptie en verlaat de neurale bogen en de centra intact. Schaalbalken in A, B, D, E, G en H: 100 urn. Schaal bars in C, F en I: 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Het is essentieel dat de voorwaarden voor hitteshockbehandeling consistent en stabiel bij het vergelijken van verschillende monsters. Stabiele temperaturen garanderen soortgelijke niveaus van RANKL inductie in de transgene larven en bijgevolg vergelijkbaar osteoclastvorming, die kan worden bevestigd door te screenen op ctsk: nlGFP expressie. Uiteindelijk leidt dit tot een gelijke mate van ectopische geïnduceerde botresorptie en osteoporose-achtige laesies, zoals bevestigd met ALC kleuring. Een dergelijk experimenteel ontwerp zorgt dan voor de bepaling en vergelijking van de effecten van verschillende anti-resorptie middelen of hetzelfde geneesmiddel aangebracht in verschillende concentraties.
Wijzigingen en problemen oplossen
Vislarven zijn zeer broos en moet voorzichtig worden behandeld gedurende het montageproces voor beeldvorming. Voor een optimale live-confocale imaging, larven zijn zorgvuldig positioned met een plastic microloader plaats van forceps, blessures (figuur 2B) voorkomen. De dooier uitbreiding minder gevoelig voor prikkels raken en kan worden gebruikt om de larven oriënteren een microloader, waardoor larvale beweging voorkomen tijdens de montage. Het gebied van belang moeten liggend worden geplaatst zodat het monster kan worden geconcentreerd in een brandvlak bij beeldvormend (Figuur 5). Bot cel gedrag is zeer dynamisch en vereist hoge temporele en ruimtelijke resolutie tijdens de live-imaging. Optimaal, wordt time-lapse beeldvorming door confocale analyse gewenst is om osteoblast osteoclasten interacties in de loop van enkele uren in de levende larven te volgen. Dat vereist echter wel bijzondere voorwaarden aan de larven levend en in een vaste positie te houden. Bij langdurig anesthesie wordt een oplossing van 0,001% tricaïne bij vissen medium toegevoegd ter dekking van de agarose vast werd tijdens het belichten. Dit voorkomt dat de agarose uitdroogt en voorkomt plotselinge trillen van de larven tijdens imaging gedurende een aantal uren.
Beperkingen van de Techniek
Osteoporose is een ziekte die meestal oudere mensen treft. Derhalve zou een ideale in vivo model van osteoporose geneesmiddelscreening volwassen vissen omvatten. Tot nu toe echter, de techniek van in dit rapport beschreven levende beeldvorming wordt beperkt tot de embryonale en larvale stadia. Op dit moment beschikbare confocale imaging niet live-imaging van genetisch gelabelde botcellen bij volwassen vis mogelijk te maken als gevolg van beperkingen in de penetratie diepte. De recente ontwikkeling van lichtwaaier fluorescentiemicroscopie (LSFM), die beeldvorming toelaat diep in levend weefsel, evenals de beschikbaarheid van minder gepigmenteerd "doorkijk" medaka stammen, maakt het mogelijk dat deze beperking binnenkort worden overwonnen en levende beeldvorming van botcellen bij volwassen medaka vis na drugonderzoek mogelijk.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methoden
Een unieke combinatie van live-imaging en geavanceerde genetische instrumenten heeft kleine beenvissen populair voor biomedisch onderzoek gedaan - bone onderzoek in het bijzonder - en in vivo modellen voor drug discovery. Met de mogelijkheid om cel-cel interacties te analyseren in een intact organisme, medaka transgene lijnen zijn uniek geschikt voor de live beeldvorming van dynamische cellulaire processen tijdens botmodellering en hermodellering. Omdat ze veel gen-regulatorische netwerken te delen voor het regelen van bothomeostase met zoogdieren, in vivo studies in medaka kunnen aanvullen en zelfs in vitro studies met behulp van zoogdieren osteoblast en osteoclast celcultuur assays overschrijden.
Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering deze techniek
Anders dan testen afzonderlijke componenten in een transgene achtergrond, zoals beschreven in dit protocol, vis bieden ook eenvoudige benaderingen combinaties va onderzochtrious drugs voor mogelijke synergie of interferentie van verbindingen. Bovendien is het gebruik van een combinatie van verschillende reporter lijnen, bijvoorbeeld in het kader van een specifieke mutant achtergrond, geeft ruime mogelijkheden om het gedrag van botcellen tijdens verschillende stadia van botdegeneratie en reparatiestudie, of in aanwezigheid van een bot -modulating drug. Met zijn unieke kenmerken die muis assays te vullen, de medaka osteoporose model biedt een uitstekende in vivo benadering van testen en kwantificeren van de anabole en botafbraakremmende effecten van nieuwe bot-modulerende verbindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende of financiële belangen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door subsidies van de Singapore Ministerie van Onderwijs (MOE, licentienummer 2013-T2-2-126) en het National Institute of Health, USA (NIH, verlenen nummer 1R21AT008452-01A1). TY kreeg een afgestudeerde beurs van de NUS Department of Biological Sciences. Wij danken de confocale eenheid van de NUS Centrum voor Bio-imaging Wetenschappen (CBIS) voor hun voortdurende steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O.
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F.
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T.
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
