Summary
Dette håndskrift indeholder protokoller, der bruger i livmoderen elektroporation (IUE) til at beskrive den strukturelle konnektivitet af neuroner på encellede niveau og ophidselse af fluorescens-mærkede neuroner. Histologi anvendes til at karakterisere dendritiske og axonale projektioner. Helcelle-optagelse i akutte skiver anvendes til at undersøge ophidselse.
Abstract
Nervesystemet består af et enormt udvalg af forskellige neuronale typer. Disse neuronale delpopulationer er karakteriseret ved, blandt andre funktioner, deres distinkte dendritiske morfologier, deres specifikke mønstre af axonal tilslutningsmuligheder, og deres selektive fyring svar. De molekylære og cellulære mekanismer, der er ansvarlige for disse aspekter af differentiering under udviklingen stadig dårligt forstået.
Her beskriver vi kombinerede protokoller for mærkning og karakterisere strukturelle tilslutningsmuligheder og ophidselse af kortikale neuroner. Ændring af i livmoderen elektroporation (IUE) protokol tillader mærkning af en sparsom befolkning af neuroner. Dette på sin side muliggør identifikation og sporing af dendritter og axoner individuelle neuroner, den præcise karakterisering af det laminare placering af axonale projektioner og morfometrisk analyse. IUE kan også anvendes til at undersøge ændringer i ophidselse afvildtype (WT) eller genetisk modificerede neuroner ved at kombinere det med hel-celle optagelse fra akutte skiver af elektroporerede hjerner. Disse to teknikker bidrage til en bedre forståelse af koblingen af strukturelle og funktionelle forbindelse og af de molekylære mekanismer, der styrer neuronal mangfoldighed under udviklingen. Disse udviklingsprocesser har vigtige konsekvenser for axonal ledninger, den funktionelle mangfoldighed af neuroner, og biologi kognitive forstyrrelser.
Introduction
Udviklingen af dendritiske og axonal strukturer er en vigtig facet af kredsløb regulering i nervesystemet, herunder i hjernebarken. Det spiller en afgørende rolle under den selektive ledningsføring af de forskellige neuronale delpopulationer. En række nylige rapporter har vist, at der ud over forbindelsen, er den molekylære mangfoldighed af neuroner afspejles af købet af yderst specifikke former for affyring. Imidlertid er de mekanismer, der bestemmer ophidselse og tilslutning af de distinkte neuronale undertyper under udvikling, samt deres grad af koordinering, stadig dårligt forstået 1, 2.
In vivo tabs- og få af funktion analyser muliggør studiet af forholdet mellem ekspressionsniveauet af specifikke gener og deres indflydelse på udviklingen af kredsløbet. In utero elektroporation (IUE) er en teknik meget anvendt til at studerefunktionen af et gen af interesse i specifikke neuronale populationer og for at undersøge den overordnede mønstre i deres forbindelse. Men for at bestemme de morfologiske karakteristika af axoner og dendritter i kortikale lag i levende mus, er det vigtigt at mærke neuroner tyndt. En Cre rekombination system kombineret med IUE kan anvendes til at markere en sparsom population af neuroner ved en tilstrækkeligt lav densitet til at løse fremspringene udsendes af individuelle celler i de identificerede kortikale lamellerne. Denne metode etiketter et tilstrækkeligt antal neuroner pr cortex at få kvantitative data efter analyse af rimelige antal elektroporerede hjerner (figur 1). Dette håndskrift præsenterer en metode til en sådan fin analyse af tilslutningsmuligheder. Den indeholder også en lignende strategi til at analysere, i separate eksperimenter, de elektriske egenskaber af neuroner ved at udføre strøm-clamp optagelser på grønt fluorescensprotein (GFP) -electroporated celler fra akut kortikale skiver. Disse proprotokoller er alsidige og kan anvendes til studiet af ophidselse og tilslutning af neuroner i WT og transgene dyr, og også af neuroner, hvor tab og gevinster på funktion er indført ved yderligere plasmider under IUE.
Selvom denne protokol beskriver elektroporering af mus ved embryonisk dag (E) 15,5, kan denne teknik udføres på alle alderstrin mellem E9.5 3 og postnatal dag (P) 2 4. Mens elektroporering ved tidlige stadier målrettet neuroner og forstadier for thalamus og dybe lag af cortex, senere stadier elektroporation varemærker mere overfladiske lag (f.eks E15.5 IUE mål lag II-III neuroner). Sammenfattende kombinationen af IUE med enkelt-celle morfologisk analyse og elektrofysiologi er et nyttigt værktøj til at belyse de molekylære mekanismer bag den enorme strukturelle og funktionelle alsidighed neuroner i nervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Madrid Animal Care og brug Udvalg i overensstemmelse med national og europæisk lovgivning (PROEX 118/14; PROEX 331/15). Oprethold sterile forhold under proceduren.
1. I Utero Elektroporation
BEMÆRK: Denne protokol for IUE er tilpasset fra andre, der tidligere er blevet offentliggjort 5, 6, 7. Dette håndskrift beskriver en protokol for IUE af E15.5 embryoer, med modifikationer i reporter strategi, der tillader undersøgelse af morfologien af enkelte neuroner 8 og deres elektrofysiologiske egenskaber i et separat eksperiment ved anvendelse af standard GFP reporter plasmider.
- Forberedelse af DNA
- Forbered DNA plasmider ved anvendelse af en endotoksin-fri isolation kit pr producentens anvisninger og fortyndes dem i 1x phosphate saltvand (PBS).
- Til enkelt-celle mærkning, forberede 10 pi DNA-blandingen pr kirurgi (1 pi per embryo) ved følgende konstruktioner og slutkoncentrationer: plasmid koder for et fluorescerende protein reporter (fx CAG-DsRed2 9), 1 ug / uL som kontrol for elektroporation effektivitet; eksperimentel plasmid, der skal testes, typisk ved 1 ug / pi; LoxP-stop-LoxP-fluorescerende protein plasmid (CALNL-GFP 10), 1 ug / pi; og konstruere-koder Cre 10 1 - 4 ng / uL. Tilsæt 1 pi 0,1% Fast Green i vand (vægt / volumen) for at visualisere det injicerede DNA.
BEMÆRK: Cre rekombination af GFP konstruktion forekommer kun i nogle få neuroner, der tillader visualisering og genopbygning af individuelle axonal projektioner (figur 1A). - For standard patch-clamp studier, forberede 10 uL DNA blanding pr kirurgi (1 uL pr brodeyo) af følgende plasmid koder for et fluorescerende protein (f.eks CAG-GFP 11), 1 ug / uL som reporter kontrol; eksperimentel plasmid, generelt 1 pg / pi; og 1 pi 0,1% Fast Green i vand (vægt / volumen).
BEMÆRK: Det er de standard elektroporeringsbetingelser der analyserer akutte skiver indeholder et stort antal af mærkede excitatoriske neuroner i den ønskede lamina. For at udføre patch-clamp studier i enkelte celler, forberede DNA som beskrevet i trin 1.1.1.1.
- Til enkelt-celle mærkning, forberede 10 pi DNA-blandingen pr kirurgi (1 pi per embryo) ved følgende konstruktioner og slutkoncentrationer: plasmid koder for et fluorescerende protein reporter (fx CAG-DsRed2 9), 1 ug / uL som kontrol for elektroporation effektivitet; eksperimentel plasmid, der skal testes, typisk ved 1 ug / pi; LoxP-stop-LoxP-fluorescerende protein plasmid (CALNL-GFP 10), 1 ug / pi; og konstruere-koder Cre 10 1 - 4 ng / uL. Tilsæt 1 pi 0,1% Fast Green i vand (vægt / volumen) for at visualisere det injicerede DNA.
- Forbered DNA plasmider ved anvendelse af en endotoksin-fri isolation kit pr producentens anvisninger og fortyndes dem i 1x phosphate saltvand (PBS).
2. Forberedelse til Kirurgi
- Udfør en overlevelse kirurgi ved hjælp af aseptiske procedurer. Sørg sterile forhold, herunder masker, handsker, instrumenter og kirurgiske område. Sterilisere kirurgiske instrumenter (skalpel, Adson pincet, hærdede fine saks, krum saks, Dumont pincet, og nål indehaver).
- Vælg borsilikatglas kapillærer af 1 / 0,58 mm ydre / indre diameter. træk capillaries tre. Mål for en optimal spids længde på 1 cm efter trækker. Skær nålespidsen på omtrent 30 ° vinkel ved hjælp af fine pincet (Figur 1B).
- Forbered 500 ml steril isotonisk opløsning (1x PBS eller Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)). Tilføj penicillin-streptomycin 1: 100 og opvarme denne opløsning til 37 ° C. Den kan opbevares ved 4 ° C efter operationen.
- Subkutant indsprøjte en præoperativ dosis af analgetika (f.eks carprofen, 5 mg / kg legemsvægt).
- Holde dyrene varme til kirurgi ved at placere dem på en varmepude. Varm en ren bur til 37 ° C til rekonvalescens efter operationerne.
3. Kirurgi
- Bedøver en C57BL / 6 E15.5 gravid mus med isofluran. Først gennemtrænge et lukket kammer med 3% isofluran ved 0,8 L / min oxygen og forlade musen inde, indtil den er i søvn. Overfør musen til en varmepude og placere næse og mund inden for en maske til at leverey af isofluran. Gradvist at reducere den anæstesi i løbet af operationen til 1,5% isofluran via masken. Bekræft ordentlig bedøvelse ved at observere et tab af pedalen refleks (tå knivspids). Den optimale procedure tager ca. 20 minutter og ikke mere end 45 min.
- Påfør øjensalve at forhindre øjnene tørrer under proceduren.
- Fjerne hår fra en ~ 3-cm region af maven (under anvendelse af enten en elektrisk barbermaskine eller hårfjerningsmiddel). Vask det kirurgiske område med vatpinde infunderes med 70% ethanol, efterfulgt af en jod-infunderes vatpind. Gentag tre gange.
- Dække det kirurgiske område med steril gaze for at forebygge infektioner.
- Brug skalpel til at foretage en lodret åbning gennem huden 2 cm lange og parallelt med midterlinjen. Adskil huden og musklen af maven ved stump krum saks. Hold musklen med pincet og skære det gennem linea alba at blotlægge den abdominale kavitet.
- Find embryoner med hjælp of tangen. Fugt to våde vatpinde med steril saltvandsopløsning fremstillet i trin 2.3 og bruge dem til at manipulere en tilgængelig foster ud af åbningen. Placer vatpinde omkring embryo og forsigtigt udtrække både livmoderhornene fra bughulen. Hold embryoner og den åbnede bughulen hydratiseret med varm saltvandsopløsning hele proceduren for at forhindre dem i at tørre ud.
4. Injektion af DNA og Elektroporation
- Manipulere embryoner forsigtigt med fingrene at lokalisere telencephalon (klart kan visualiseres ved øjet, som de to mere anteriore vesikler af hjernen). Placer en forberedt borsilikat kapillær i en mund pipette. Før enden af nålen gennem uterus, undgå blodkar, indtil den når en lateral ventrikel. Injicer langsomt ca. 1 pi Fast Green-farvet DNA-opløsningen, indtil der observeres en stor blå plet.
- Placer 7 mm platinelektroder sideværts på the leder af embryo (figur 1C).
BEMÆRK: DNA er negativt ladet; derfor, den bevæger sig mod den positive elektrode, når spænding påtrykkes mellem platinelektroder. Ved at variere placeringen af elektroderne, kan forskellige områder af hjernen målrettes. - Påfør spænding via platinelektroder (for E15.5 embryoner:. 5 impulser, 38 V, 50 ms interval cyklus længde, 950 ms interval pause Disse betingelser varierer afhængigt af udviklingsstadiet) 12.
BEMÆRK: Se tabel 1 for spænding betingelser og elektroder til forskellige embryo stadier. - Gentag trin 4.1 - 4.3 for hvert foster.
5. Afslutning af Kirurgi og Postoperation
- Brug vatpinde til at manipulere livmoderen tilbage i moderen. Fyld bughulen med opvarmet saltvandsopløsning (tilsættes ca. 2 ml).
- Sutur musklen med enkle afbrudte sømme eller en kontinuerlig søm. Brug # 6-0 suturs.
- Brug hæfteklammer for at lukke eksterne sår. Vær omhyggelig med at adskille huden fra musklen før hæftning. Fjern næsen maske.
- Lad musen til at komme sig i 30 minutter i den opvarmede, rene bur inden det sættes i dyret facilitet værelse. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Anbring ikke et dyr, der har gennemgået kirurgi i selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
- Overvåge dyret i dagene efter operationen. Anvend analgetika subkutant (carprofen, 5 mg / kg legemsvægt) hver 12. time i 2 dage eller efter lovgivningen dyr. Ingen yderligere postoperativ pleje er nødvendig for hvalpene.
6. Forberedelse og analyse af prøverne
- Valgfrit: På P2, kontrollere ekspressionen af fluorescens i de elektroporerede unger under anvendelse af et fluorescerende mikroskop; når IUE er vellykket, kan fluorescens tydeligt ses in hovedet 13. Varemærke eller adskille mus, der er positivt elektroporeret til anvendelse i de følgende trin. Hold dæmningen og hvalpe i standard dyr facilitet betingelser.
- Ved det ønskede trin af undersøgelsen, perfundere musene transcardialt. Typisk er den mest aktive fase af dendritisk og aksonal vækst svarer til de tre første postnatale uger 2, 14, 15.
- Forbered 30 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS pr mus og chill det på is.
ADVARSEL: PFA er et kendt allergen og kræftfremkaldende. Det er giftigt. Bær egnede personlige værnemidler.
BEMÆRK: behov Mængden af PFA afhænger af alder af musen (fx for P16, 20 ml for perfusion og 10 ml for postfiksering er nødvendigt). - Forbered en ketamin-xylazin mix at bedøve dyret med en 1: 1: 8 volumetrisk forhold på 100 ug / ml ketamin: 100 ug / ml xylazine: PBS (forberede omkring 0,2 ml pr mus).
- Bedøver musen ved intraperitonealt at injicere 0,2 ml af blandingen forberedt i trin 6.2.2.
- Placer bedøvede mus på ryggen. Lav et vandret snit ovenfor thorax ved anvendelse af en skalpel. Skær muskler og mellemgulvet med fine saks, indtil hjertet kan observeres.
- Lave et snit i højre atrium med de fine sakse. Injicer langsomt 20 ml PBS i den venstre ventrikel med en 25-gauge nål for at fjerne blodet. Der indsprøjtes 20 ml PFA (trin 6.2.1), indtil musen er stive og organerne bliver hvidt.
- Fjern straks hovedet og gøre en midtlinjeincision i huden fra halsen til kraniet. Forsigtigt skræl væk kraniet ved buede pincet og udtrække hjernen. Vær særlig opmærksom på ikke at punktere eller beskadige hjernen under fjernelsen af kraniet. Sætte hjernen i 10 ml 4% PFA ved 4 ° C natten over til efterudfastsætte den.
- Forbered 30 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS pr mus og chill det på is.
- Cryoprotect faste hjerner i 10 ml 30% sucrose i PBS ved 4 ° C i 1 - 2 dage indtil de synker. Forbered en-cm 3 aluminiumsfolie terninger. Fyld terninger 2/3 af vejen med oktober Sætte hjernerne inde og fryse dem ved at sætte terninger på tøris. Opbevar de frosne hjerner ved -80 ° C.
- Sted dråbe OLT overfladen af objektpladen, skræl aluminiumsfolie fra histologi terning, og placere terningen på den ønskede orientering til modellen disk oven på væsken OLT. Påfør et fast tryk, indtil den er fast. Sæt prøven disken i prøven leder af kryostaten. Vend prøven (flytte det ind i en gunstig position i forhold til kniven / bladet).
- Afsnittet hjernerne på kryostaten. Vælg 50-100 um tykke Floating kryosektioner 16 med en fin pensel og placere dem i PBS.
- Pletter, hvis det ønskes.
BEMÆRK: studiet af axonal morfologi, anbefales farvning med et GFP antistof kraftigt- Blokere sektionerne i 1 time ved stuetemperatur med 5% føtalt bovint serum i PBS indeholdende 0,5% Triton-X 100 (blokerende opløsning). Inkuber natten over ved 4 ° C med 1: 500 primært antistof (fx kanin-anti-GFP) fortyndet i blokeringsopløsning.
- Vask sektionerne tre gange i PBS. Tilsæt 1: 500 sekundært antistof (fx ged anti-kanin Alexa Fluor 488) fortyndet i blokeringsopløsning og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Vask sektionerne tre gange i PBS.
- Kontrastfarve med DAPI (1: 10.000) i PBS indeholdende 0,5% Triton-X 100 i 10 min. Skyl sektioner med PBS. Monter afsnittene i et vandigt montering medium 16.
7. Billedbehandling og analyse
- Fluorescens eller konfokal mikroskopi
- For at rekonstruere komplette neuroner, erhverve billeder med en høj forstørrelse (mindst 40X) og høj opløsning (minimum 1024 x 1024). Vælg "Tile scan "eller tilsvarende mulighed i købet software til at dække det område af interesse, der spænder over alle dendritter og axonale processer. Anskaf et tilstrækkeligt antal stakke på z-aksen for at undgå tab af information.
BEMÆRK: Generelt mikroskopets software har en "Optimeret stak" valgmulighed, men hvis dette ikke er tilfældet, test manuelt for at bestemme, hvor mange trin er nødvendige for de billeder, der overlapper hinanden for at definere individuelle prognoser korrekt. To afgørende parametre er pinhole og målet; tage hensyn til "større forstørrelse, mere opløsning, og flere nødvendige z-trin."
- For at rekonstruere komplette neuroner, erhverve billeder med en høj forstørrelse (mindst 40X) og høj opløsning (minimum 1024 x 1024). Vælg "Tile scan "eller tilsvarende mulighed i købet software til at dække det område af interesse, der spænder over alle dendritter og axonale processer. Anskaf et tilstrækkeligt antal stakke på z-aksen for at undgå tab af information.
- Analyse
BEMÆRK: Selvom flere parametre kan analyseres, trin 7.2.1 fokuserer på to: dendritceller morfologi og Axon forgrening. Hent Fiji ( http://fiji.sc/ ).- Åbn billedet, skal du vælge "Segmenteret line" fra menuen. Tegn en linje (bevæger sig op og ned langs the z-aksen ved at rulle musen) efter strukturen af neuron. Gå til "Analyser, Værktøj, ROI Manager Tilføj" (alternativt, tryk på "t") for at gemme linjen. Gentag denne proces for hver Axon eller dendritceller af den analyserede neuron 2.
- I ROI manager Menu Tryk på "Measure" knappen for at få længden (eller yderligere parametre). Eksporter målingerne til en tekstfil eller et regneark til at analysere dem.
8. Elektrofysiologi
BEMÆRK: Målet med denne protokol er at opnå hel-celle strøm-clamp optagelser fra lag II / III pyramideformede celle neuroner identificeret visuelt af GFP-ekspression i GFP-elektroporerede musehjerner (eller andre fluorescerende protein tidligere elektroporeret). Det er en tilpasning af tidligere offentliggjorte metoder 17, 18. Brug af denne protokol er det muligt at undersøge effekten af en genetisk modifgement indført ved IUE på de elektriske egenskaber af neuron. Købet af specifikke fyring tilstande er en gradvis proces om differentiering, der involverer den dynamiske udtryk for et bredt repertoire af ionkanaler og som resulterer i ekspressionen af forbigående fyring tilstande før sene postnatale faser. For eksempel er modne elektriske responser ikke observeret i lag II / III af somatosensoriske cortex muse før P16 2, 19.
- Forudsætninger for de akutte skiver
- Fremstille sterile kirurgi værktøj til at fjerne hjernerne fra musene: en guillotine, at fjerne hovedet; lille saks, til at skære gennem kraniet; pincet, for at adskille kraniet fra væv; en spatel, fint at fjerne hjernevæv fra sin kappe; en metallisk pålægsmaskine, at dissekere cortex i to lige store halvdele; og en Pasteur-pipette, at flytte skiver fra vibratome (placere dem i en opløsning indeholdende kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for inspektion, og derefter overføre skiverne fra ACSF til en inkubation bedriftens område).
- Forbered 1 L ACSF anvendelse af vand af høj renhed (dobbelt-destilleret vand) indeholdende 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 11 mM glucose, 2,5 mM KCI, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2 og 1 mM NaH 2 PO fire. pH Titrer til 7,3 - 7,4 med HCl eller NaOH. Juster osmolaritet til 290 mOsm.
- Bubble ACSF med carbogen (95% O2 / 5% CO2) i 15 - 20 min ved anvendelse af Teflon-rør (~ 1 mm), for at stabilisere pH til 7,3 - 7,4.
- Frys 200 ml ACSF opløsning mættet med carbogen ved -80 ° C i 10 - 15 min for at generere en pløret dissektion opløsning. Placer en 100- x 20-mm vævskulturskål på is til udskæring hjernen.
- Fremstilling af 100 ml 1% lav-smeltepunkt agarose opløsning lige før starten af forsøget. Afkøl opløsningen, skære en firkantet stykke agarose (dimensioner: 1 x 1 x 0,5 mm), og superlim den tilbagsiden af platformen, højre bag hvor hjernen er skåret (agarosegel giver støtte til hjernen under udskæring). Udgør for- så fladt som muligt.
- Indhentning akutte skiver
- Immobilisere musen og bedøver den med isofluran 2%. Placer hovedet ind i guillotinen åbning og halshugge det hurtigt. Fjern sin kraniet så hurtigt som muligt med brug af knogle rangers eller fine pincet. Sæt hjernen i kølede ACSF.
BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre dette trin hurtigt. - Placer hjernen i den afkølede dyrkningsskålen. Skær lillehjernen med en lille saks.
- Saml hjernen med en spatel og duppes det tørre på et stykke køkkenrulle.
- Lim ventrocaudal plan af hjernen på en vibratome holder. Anbring holderen på en vibratome fyldt med iskoldt ACSF.
- Opnå akutte skiver ved at skære 300-um koronale sektioner (sikre fortsat carbogenation hele proceduren, fx placere en absorptionskolbe (1-mmpolytetrafluorethylen rør) i vibratome kammer) ved følgende Vibratome indstillinger: 0,06 mm amplitude og 0,08 - 0.10 mm / s hastighed. Indstil forskuddet til den lavest mulige hastighed (~ 22 s pr pass). Ændre disse optimale indstillinger og få optimale betingelser for hver maskine empirisk evt.
- Inkuber de akutte skiver i mindst 60 min i ACSF suppleret med 3 mM myo-inositol, 0,4 mM ascorbinsyre og 2 mM natriumpyruvat mens gennembobling med 95% O2 / 5% CO2 gas. Hold temperaturen ved 25 ° C.
- Udfør udskæring procedure på mindre end 15 min. Om ønsket kan skiverne opbevares i 1 - 7 timer inden overførsel til optagelsen kammer til brug.
- Immobilisere musen og bedøver den med isofluran 2%. Placer hovedet ind i guillotinen åbning og halshugge det hurtigt. Fjern sin kraniet så hurtigt som muligt med brug af knogle rangers eller fine pincet. Sæt hjernen i kølede ACSF.
- Forudsætninger for helcelle-optagelse
- Sørg for, at elektrofysiologi station er udstyret med en optager kammer, et perfusionssystem, et mikroskop, elektroder (optagelse, stimulerende, og jord), makro- og MICRomanipulators, en stiv vibrationsfast bordplade og Faradays bur, en stimulator, en forstærker og analog-til-digital (A / D) konverter, en computer med erhvervelse software, og et GFP (eller enhver anden fluorochrom) filter til analyse genetisk modificerede neuroner 18 (figur 2A).
- Forbered den intracellulære opløsning indeholdende 115 mM kaliumgluconat, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCI, 4 mM Na 2 ATP og 0,3 mM Na 3 GTP, indstillet til pH 7,2 ved KOH og til 290 mOsm ved KCI.
- Gør patch pipetter ved at trække borsilicatglashulsfærer kapillærer. Forbered patch elektroder ved hjælp af en mikropipette aftrækker. Brug borsilicat kapillærer (1,5-mm ydre diameter, 0,86 mm indre diameter, 10 cm længde). Gør patch elektroder viser modstande på 3-10 MQ når den er fyldt med intracellulær opløsning.
- Perfundere optagelsen kammer med ACSF med en hastighed på 2 ml / min. Holde temperaturen af kammeret ved approximbart 33 ° C.
- Helcelle-optagelse
- Overfør skiverne i kontrolapparatet kammer under anvendelse af en Pasteur-pipette (afbrød lang spids) eller en lille børste. Hold skive med en harpe. Perfundere skiverne konstant med ACSF med en hastighed på 2 ml / min.
- Lappe et GFP-positive neuron.
- Sæt skive ind i optagelsen kammer og finde det område af interesse gennem mikroskopet ved lav forstørrelse (10X). Derefter finder en GFP-positive celle til at lappe hjælp af 60x objektiv.
- Fyld registreringselektroden med intracellulær opløsning. Brug sprøjten knyttet til filteret (4-mm filter) og mikro-loader tip at fylde registreringselektroden med intracellulær opløsning.
- Placer glaspipette i holderen pipetten. Placér pipettespidsen i badet og fokusere på spidsen. Når pipetten er i badet, anvende positivt tryk gennem modtrykket kontrolsystem.
- Lappe en neuron, der er fluorescerende (Figure 2B).
- Approach cellen af interesse under visuel vejledning samtidig opretholde modtryk i pipetten. Hvis der forekommer en lille fordybning på celleoverfladen, frigiver trykket. På dette tidspunkt kan der dannes en tæt forsegling (modstand større end 1 GQ). Ellers anvende en lys undertryk (sug) for at lette det.
- Mens forseglingen dannes, bringe bedriften spænding clamp til -60 mV. Når GQ forseglingen er dannet, anvender en puls af sugning til at sprænge cellemembranen under pipette og gå i hel-celle-tilstand. Se reference 20 for flere detaljer.
- Optag aktiviteten ved løbende clamp betingelser 21. Når du er i hel-celle-tilstand, skifter fra spænding-klemme til strøm-clamp-mode og starte optagelsen. For eksempel, for at registrere celle uro, anvende 500 ms-lange depolariserende nuværende injektioner (100-400 Pa).
- Beregn fyring satser by plotte antallet af aktionspotentialer langs toget for at øge input strømme.
BEMÆRK: Resting membranpotentiale, input modstand, og membran kapacitans kan også beregnes fra optagelserne 21.
- Beregn fyring satser by plotte antallet af aktionspotentialer langs toget for at øge input strømme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At karakterisere de morfologiske ændringer af neuroner i detaljer og hele udvikling, er det vigtigt at mærke neuroner tyndt. En Cre-rekombinase fortyndet system giver mulighed for ekspression af et gen af interesse i en sparsom population af neuroner, således at kun de neuroner, der indeholder dette enzym udtrykke GFP (figur 1A). Under anvendelse af denne strategi, er lag II-III målrettet og mærket ved IUE ved E15.5. CAG-DsRed2 ved 1 ng / nl, er coelektroporeret som en kontrol og for at identificere positive elektroporerede hjerner i levende dyr. Vigtigere er det, efter farvning med anti-GFP-antistof, signalet er stærkt nok til at tillade den klare visualisering af deres dendritiske morfologier og axoner (fig 1D og E).
Efter IUE og elektrofysiologi, er analysen af de parametre, der er opnået fra hel-celle optagelser bruges til at coMpare de fyring reaktioner og ophidselse af elektroporerede celler under forskellige betingelser. kan fås flere parametre. Parametrene bør tilpasses til den særlige undersøgelse via bestemte patch-clamp analyse software. Figur 2C er et eksempel på plottet af aktionspotentialer mod input strøm opnået fra optagelser af en WT lag II-III neuron, der blev elektroporeret ved E15.5.
Figur 1. Et Cre-rekombinase Fortyndet strategi Muliggør Sparse Mærkning af Kortikal neuroner. A. Skematisk oversigt over strategien. I neuroner, der bærer både CALNL-GFP og CRE er LoxP-STOP-LoxP kassette udskåret ud af CALNL-GFP, og GFP udtrykkes af den stærke CAG promotor. B. Skematisk tegning af en borsilikat kapillær trukket ved hjælp af en mikropipette aftrækker. Spidsen skæres af forceps, hvilket skaber en 30 ° vinkel. Måle 1 cm fra spidsen til begyndelsen af den smallere del af kapillarrøret. C. Elektrodernes placering til at målrette somatosensoriske cortex. De platinelektroder placeres omtrent over ørerne af embryoet. På grund af sin negative ladning, DNA går mod den positive elektrode, når spændingen anvendes. Variation i den position af elektroderne tillader rettet mod forskellige områder i hjernen. D. billeder opnået efter vektorer blev leveret til lag II-III neuroner med i livmoderen elektroporation ved embryonal dag 15,5; koronale snit blev foretaget på postnatal dag 16. CAG-DsRed2 vektoren blev co-transficeret som en kontrol (venstre). GFP (midten) udtrykkes kun i de neuroner, der også indarbejdet Cre, tillader rekombination af loxP sites i CALNL-GFP-vektoren. Den sparsomme mærkning giver individuelle neuroner at skelne (pilespidser). E. Høj forstørrelse konfokal billede af than dendritiske dorne af en anden tyndt mærket GFP neuron. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Elektrofysiologi Indstillinger og Eksempel på en Firing svar. A. Fotografi viser elektrofysiologi setup bruges til patch clamp-forsøg i akutte skiver. Opsætningen er inkluderet i et Faraday bur for at fjerne støj, og udstyret er oven på en anti-vibration tabel. Controllere af de motoriserede mikromanipulatorer for elektroderne observeres til venstre. B. Pyramidal neuron af en mus elektroporeret med GFP, observeret under lyse felt og grønne fluorescens betingelser. Optagelsen pipette knyttet til en GFP + celle er mærkbar. Scale bar = 10 & #181 m. C. Fyring mønstre af en CAG-GFP elektroporeret kontrollag II-III neuron viser den typiske regulære-spiking respons. Fordelingen af aktionspotentialer nærmer sig en regelmæssig fordeling langs varigheden af indgangsstrøm (X-aksen). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Scene | Spænding | Elektroder | Referencer |
| E9.5 | 7 V, 100 ms, 3 bælgfrugter | Stick platinelektroder | Matsui et al. 2011 3 |
| E12.5 | 30 V, 50 ms, 3 - 5 impulser | Tang-type elektroder 3 mm | Saito, T., 2006 12 | </ Tr>
| E15.5 | 35-48 V, 50 ms, 5 bælgfrugter | Pincet-type elektroder 5-7 mm | Rodriguez-Tornos et al. 2016 2, Saito, T., 2006 12 |
| P2 | 100 V, 50 ms, 5 bælgfrugter | Pincet-type elektroder 5-7 mm | Sonego et al. 2013 4 |
Tabel 1: Spænding Betingelser og elektroder til Elektroporation af embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan at mærke neuroner i somatosensoriske cortex af C75BL / 6-mus for at analysere deres tilslutning og deres ophidselse. Med hensyn til de eksisterende metoder, det visualiserer diskriminerende aspekter af tilslutningsmuligheder, såsom antallet af axonale grene pr neuron, deres præcise topografi, og deres anatomiske placering. Ved at ændre positionen af elektroderne, er det muligt at målrette andre neuron populationer, såsom cingulate cortex (holde den samme vinkel mellem elektroderne og hjernen, men ændre orienteringen af polerne) eller hippocampus 5, og udfører lignende mærkningseksperimenter individuelle neuroner eller bredere populationer, afhængig af den ønskede strategi. Men der er begrænsninger for dette, da ikke alle befolkningsgrupper er lige så tilgængelige eller lige selektivt mærket. For eksempel i hippocampus, er det muligt selektivt at målrette sene-fødte neuroner i CA1-området, men early elektroporering markerer heterogene populationer af indre og ydre pyramideformede celler. I hjernebarken, er neuroner født på en sekventiel måde, så den drægtighedsdag under IUE bestemmer, hvilken kortikal lag påvirkes. Udførelse tidligere IUE mål dybere neuroner (f.eks IUE på E14 etiketter lag IV neuroner) 22.
For en succesfuld IUE, anbefales det at tage hensyn til visse overvejelser. For det første er det vigtigt at gøre operationen i mindre end 30 min for at reducere belastningen på moderen og for at øge chancerne for overlevelse af ungerne. For det andet, den vanskeligste del af proceduren er injektion af DNA-udføre injektionen via borsilicatpartiklerne kapillærer så skånsomt som muligt. Hvis der ikke trykkes embryonerne for hårdt, kan de blive skadet. Med hensyn til fejlfinding død af embryonerne under DNA injektioner, beveling spidsen med en 30 ° vinkel kan øge effekten af denne proces. Hvis en beveller foreligger ikke, og kapillærerne udelukkende skåret med pincet, kan den korrekte vinkel bekræftes i dissektionsmikroskop. Kassér utilstrækkelige kapillærer. Endelig tilpasse elektroporeringsbetingelser til scenen af embryoet er vigtig for at øge overlevelsesraten (se tabel 1).
Nogle betragtninger er nødvendigt med hensyn til genopbygningen af axoner og dendritter. For at mærke individuelle neuroner, den korrekte koncentration af Cre-plasmidet er afgørende for at opnå en god, sparse ekspression og undgå den forvirrende overlapning af neuronale projektioner tilhører forskellige neuroner. Selvom denne protokol foreslår anvendelse af 4 ng / pi, kan det være nødvendigt at justere plasmid koncentration for hvert forsøg, afhængigt af den anvendte promotor, kvaliteten af DNA-præparat, og metoden til DNA kvantificering (f.eks reducere den til 2 ng / pi hvis mærkningen for mange neuroner). I Additiom, for axonal sporing, er det vigtigt at skære i en passende vinkel for at have hele neuron i det samme plan.
Kritiske trin for vellykkede patch-clamp optagelser er sundhed af vævet af de akutte skiver og placeringen og overflod af elektroporerede GFP-positive neuroner. Hvis lappe trin mislykkes eller afvigende svar er fundet under optagelserne, reducere den tid til behandling af de akutte skiver. Hvis GFP neuroner er vanskelige at identificere og lokalisere på grund af deres nedsatte numre i den akutte skive, så der er tilstrækkelig CAG-GFP-plasmidet er inkluderet i elektroporation mix. Med hensyn til de største begrænsninger beskrevne fremgangsmåder heri, patch-clamp teknik muliggør optagelsen af mange forskellige parametre, der beskriver ophidselse af neuronet, men det vurderer ikke aspekter, der afhænger af hele kredsløbet. Også, og som nævnt ovenfor, ikke alle neuronale delpopulationer er tilgængelige via IUE. Sammenfattende i the fremtid, kan disse teknikker bidrage til den videre analyse af den strukturelle og funktionelle konnektivitet af forskellige neuronale delpopulationer i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for R. Gutiérrez og A. Morales for deres fremragende teknisk bistand og til LA Weiss til redigering. CGB er finansieret af den spanske Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra BBVA Foundation og SAF2014-58598-JIN (MINECO) til M. Navarrete og ved en bevilling fra Ramón Areces Foundation og tilskud SAF2014-52119-R og BFU2014-55738-REDT (fra MINECO) til M. Nieto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 | |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Scalpel Handle # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Hardened Fine Scissors - Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14.5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Thin curved tips - Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Needle Holder - Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 | |
| Sutures - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 | |
| Borosilicate glass capillaries (100 mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | - | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Microscope for Fluorescent Imaging - MZ10F | Leica | - | |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | - | |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | - | |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | - | |
| Cryostat - CM 1950 | Leica | - | |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | - | |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A | |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Air Table | Newport | - | |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | - |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
