Summary
Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ Ψm) pour séquestrer le calcium (Ca2 +), ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique 2+ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries Ca2 + d'absorption et ΔΨ m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.
Abstract
En dehors de leur rôle essentiel dans la création de l' ATP, les mitochondries jouent également le rôle du calcium local (Ca2 +) tampons à bien réguler la concentration intracellulaire de Ca2 +. Pour ce faire, les mitochondries utilisent le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (ΔΨ m) pour séquestrer le Ca 2+. L'afflux de Ca2 + dans les mitochondries stimule trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l' acide citrique, ce qui augmente le transfert d'électrons à travers la phosphorylation oxydative (OXPHOS) complexes. Cette stimulation maintient ΔΨ m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale.
Nous décrivons ici une méthode pour les mitochondries de mesure simultanément Ca 2+ d'absorption et ΔΨ m dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale. En perméabilisant les cellules, Ca 2+ mitochondrial peutmesurer à l' aide de Ca 2+ indicateur fluorescent Fluo-4 AM, avec mesure de ΔΨ m à l' aide du colorant fluorescent tétraméthylrhodamine, l' ester méthylique, le perchlorate (TMRM). L'avantage de ce système est qu'il existe très peu de chevauchement spectral entre les colorants fluorescents, ce qui permet simultanément une mesure précise de la mitochondrie Ca 2+ et ΔΨ m. En utilisant l'addition séquentielle d'aliquotes de Ca 2+, Ca 2+ absorption mitochondriale peut être contrôlée, et la concentration à laquelle Ca2 + mitochondrial induit une transition de perméabilité de la membrane et la perte de m ΔΨ déterminée.
Introduction
Les mitochondries jouent un rôle important dans la régulation de la concentration intracellulaire de Ca2 + en agissant comme locaux Ca 2+ tampons 1. Ca 2+ entre les mitochondries via le uniport Ca 2+, un processus piloté par le gradient électrochimique qui existe à travers la membrane mitochondriale interne (ΔΨ m) 2. Une fois dans la matrice mitochondriale, Ca 2+ peut activer la phosphorylation oxydative en stimulant trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l' acide citrique 3. Cette stimulation maintient ΔΨ m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale. Si la concentration de Ca2 + dans les mitochondries devient très élevée, la transition de perméabilité mitochondriale peut être déclenchée, entraînant la dissipation de ΔΨ m, la cessation de la phosphorylation oxydative et l'induction de la mort cellulaire des voies de signalisation 4.
Le rôle important que jouent les mitochondries dans la mémoire tampon spatiale du calcium cellulaire rend le contrôle précis du calcium mitochondrial critique. Diverses méthodes ont été mis en place pour surveiller le calcium mitochondrial, y compris l'utilisation de colorants à base de rhodamine. Un tel colorant, Rhod-2, AM, est très efficace au partitionnement des mitochondries pour mesurer mitochondriales niveaux de Ca2 + 5, 6. Cependant, les soins doit être utilisé comme certains colorants accumulera dans d'autres organites, tels que les liposomes, ou de rester dans le cytosol des cellules. Cependant, des analyses en aval peuvent être utilisés pour distinguer ces signaux de ceux de la mitochondrie 7.
Une autre technique pour surveiller le calcium mitochondrial utilise rapporteur fluorescent construit 8 up>. L'avantage de ces sondes codées génétiquement est qu'ils peuvent être spécifiquement ciblé vers les mitochondries en utilisant des peptides endogènes N-terminal, par exemple le signal de ciblage N-terminal de la sous-unité VIII de la COX humaine. Ce système a été utilisé pour générer une sonde aequorine mitochondriale ciblée qui a révélé extrêmement utile pour étudier le calcium mitochondrial de signalisation 9. Le principal inconvénient de ces sondes codées génétiquement est qu'ils doivent être introduits dans les cellules par l'expression transitoire (ce qui est impossible pour certains types de cellules et peuvent produire des résultats variables) ou en créant des systèmes d'expression stables (qui prend du temps).
Pour contourner les problèmes décrits ci - dessus, nous avons développé un nouveau protocole pour mesurer mitochondrial Ca 2+ et ΔΨ m simultanément. Ce protocole est basé sur une méthode décrite précédemment qui ajoute du calcium exogène à des cellules perméabiliséess = "xref"> 10. Notre protocole a trois principaux avantages par rapport aux autres méthodes: tout d' abord, nous utilisons Fluo-4, AM et TMRM pour surveiller Ca 2+ et mitochondrial ΔΨ m, deux colorants qui ont des propriétés spectrales très distinctes; d' autre part, les cellules sont perméabilisées afin que le signal Fluo-4 est seulement détecter mitochondrial Ca2 + et Ca2 + non localisé à d' autres organelles ou dans le cytosol des cellules; et troisièmement, l'utilisation de Fluo-4 pour détecter Ca 2+ mitochondrial permet de coloration cellulaire simple et rapide, éliminant tous les problèmes de transfection ou de transformation cellulaire qui existent si l'on utilise des sondes codées génétiquement.
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Protocol
1. Préparation des cellules
- Cultiver les cellules sur 10 cm des boîtes de culture cellulaire ou flacons de 75 cm2 dans les milieux de culture [10 ml Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco supplémenté avec 5% (v / v) de sérum de veau fœtal (FBS) et 1x pénicilline / streptomycine (p / s )] à 37 ° C / 5% de CO 2.
- Pour récolter les cellules, retirer le support par aspiration, puis laver avec 5 ml 1x tampon phosphate salin (PBS 1x). Retirer PBS 1x par aspiration, puis ajouter 1,5 ml de 0,25% (p / v) de trypsine / 0,25% (p / v) d' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et on incube à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 2 min. Appuyez sur plat ou flacon doucement pour éliminer les cellules, puis remettre en suspension dans 5 ml de milieux de culture.
- Compter les cellules en ajoutant 12 pi de cellules remises en suspension sur un hémocytomètre.
- cellules en plaques dans des boîtes ou des lamelles chambré pour l'imagerie confocale.
NOTE: Ceux-ci auront un fond en plastique ou en verre approprié qui a été conçu pour être utilisé avec des microscopes inversés. - cellules de la plaque de sorte thà ~ 80% de confluence est atteinte le jour de l'image. Par exemple, environ 2 x 10 4 cellules d'ostéosarcome 143B peuvent être étalées dans un puits d'une lame de chambre 8 puits un jour avant l' imagerie.
- Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C / 5% de CO2 pour permettre aux cellules de se fixer et de se rétablir.
2. Tampons pour TMRM et Fluo-4 Imaging
- Préparer la solution d'enregistrement (RS) contenant du NaCl 156 mM, KCl 3 mM, 2 mM de MgSO4, 1,25 mM de KH 2 PO 4 10 mM , D-glucose, 2 mM de CaCl2 et 10 mM de HEPES à pH 7,35. Magasin RS à -20 ºC.
- Préparer Intracellulaire moyenne (IM) contenant 6 mM de NaCl, KCl 130, 7,8 mM de MgCl2, 1 mM de KH 2 PO 4, 0,4 mM de CaCl2, 2 mM d' EGTA mM HEDTA 10 mM malate de 2 mM de glutamate 2, 2 mM ADP et de l'HEPES 20 mM pH 7,1. 200 solutions mM d'actions de malate, le glutamate et l'ADP peuvent être préparés séparément, aliquotés et conservés à -20 ° C. Ces sttroupeaux peuvent être ajoutés à l'IM juste avant utilisation.
- Ca solution saline tamponnée 2+ libre de Hank (HBSS) peut être obtenu de pré-préparé à partir de fournisseurs commerciaux. Ajouter de l'éthylène glycol-bis (éther β-aminoéthyl) -N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA) à une concentration finale de 500 uM.
- Préparer une solution mère de tétraméthylrhodamine 10 mM, ester méthylique, perchlorate (TMRM) dans 100% de méthanol. De ce stock, faire un stock de travail de 2 uM dans l' eau distillée 2 O.
- Préparer une solution mère de vérapamil mM 10 dans 100% d'éthanol.
- Préparer un 1 mg / ml (p / v) solution mère de Fluo-4 ester acétoxyméthyle (Fluo-4, AM) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
NOTE: Fluo-4 AM est un indicateur de calcium qui présente a augmenté la fluorescence lors de la liaison Ca 2+. Fluo-4 est un analogue de Fluo-3, les deux substituants chloro remplacés par des atomes de fluor. Il en résulte une augmentation de l'excitation de fluorescence à 488 nm et des niveaux de signal de fluorescence plus élevé. leun groupe ester AM se traduit par une Fluo-4 molécules non chargées qui peuvent pénétrer dans les membranes cellulaires. Une fois dans la cellule, l'ester AM est clivée par des esterases non spécifiques, résultant en une forme chargée de Fluo-4 qui est emprisonné à l'intérieur de la cellule. - Préparer une solution mère de 1 mM carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) dans 100% d'éthanol.
- Préparer une solution mère de 25 mg / ml (p / v) digitonine en H distillée 2 O.
- Préparer une solution stock de 100 pM thapsigargine dans le DMSO.
- Préparer une solution mère de 40 mM de chlorure de calcium (CaCl 2) dans l' eau distillée 2 O.
3. Coloration des cellules avec TMRM et Fluo-4, AM
- Préparer une solution RS coloration avec 20nM TMRM, 5 ug / ml (p / v) de Fluo-4 AM et 0,005% de tensioactif tel que le Pluronic F-127 RS.
NOTE: L'agent tensio-actif non ionique est un polyol qui facilite la solubilisation de Fluo-4 AM. Note: 10 uM vérapamil peut également être ajouté à INHIBIt TMRM exportation par le transporteur multidrogues de la membrane plasmique, si elle est exprimée dans le type de cellules en cours d'analyse. - Retirer les milieux de culture de cellules à la pipette et laver avec 100 pi 1x PBS.
- Retirer PBS 1x à la pipette et laisser incuber les cellules dans une solution de coloration RS 250 pi pendant 45 min à température ambiante.
Remarque: Une fois que le Fluo-4 AM pénètre dans la cellule, l'ester AM est clivée par des esterases cellulaires. Incubant à la température ambiante, inhibe l'activité d'estérase, ce qui permet Fluo-4 AM à pénétrer dans les mitochondries. - Retirer la solution RS de coloration par pipette et laver les cellules dans 100 ul de Ca 2+ libre HBSS pour éliminer l' excès Fluo-4, AM et TMRM.
- Préparer une solution d'imagerie IM avec 25 pg / ml (p / v) digitonine, 200 nM TMRM et 1 uM thapsigargine dans IM.
Remarque: la concentration de la digitonine peut devoir être ajusté pour faire en sorte que la perméabilisation de la membrane mitochondriale interne ne se produit pas. Ceci peut être déterminé de façon empirique par l'évaluation de l'intensitéTMRM du signal à différentes concentrations de digitonine. - Retirer le Ca2 + libre HBSS par pipette et ajouter 300 ul d' une solution IM d'imagerie vers les cellules. Laisser les cellules à l'équilibre à la température ambiante pendant 10 min. Les cellules sont maintenant prêts pour l' imagerie avec CaCl 2 ajouts.
4. imagerie cellulaire
- Placer un plat ou lamelle couvre-chambré avec des cellules dans une solution IM d'imagerie sur un microscope confocal à balayage laser inversée.
- Utiliser le réglage sur les lasers à microscope pour l'excitation et l'émission de spectres TMRM et Fluo-4. Par exemple, utiliser 543 nm He-Ne et 473 nm lignes laser d'argon pour exciter TMRM et Fluo-4 respectivement. Utiliser une faible puissance laser d'environ 5% afin de minimiser toute photo-endommagement des cellules.
- Set microscope pour numériser des images toutes les 25 sec. cellules d'analyse pour 10 min pour établir des lectures de référence pour la TMRM et Fluo-4 signaux.
NOTE: Le signal Fluo-4 peut être faible ou indétectable au repos concent de calciumrations. - Ajouter 3 pi de mM CaCl2 solution mère 40 directement aux cellules dans 300 pi de solution d'imagerie IM (1: 100 de dilution) et mélanger doucement avec une pipette. Pause de la numérisation de l' image tout en ajoutant et en mélangeant le CaCl 2 si nécessaire.
NOTE: La libre concentration finale d'ions Ca 2+ [Ca 2+] dans la solution d'imagerie IM peut être calculé à l' aide de logiciels tels que Maxchelator WEBMAXC ETENDU ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou chélateur 11. Une description détaillée de la façon de calculer la libre concentration finale d'ions Ca 2+ [Ca 2+] est décrite dans la section 6 ci - dessous. - Poursuivre l' analyse de l' image pendant environ 4 min, puis répétez CaCl 2 ajouts toutes les 4 min jusqu'à ce que la TMRM désirée ou Fluo-4 signaux sont atteints, généralement autour de 8 à 10 additions.
- En utilisant une pipette, ajouter une dilution 1: 100 de 1 mM FCCP (c finaleoncentration de 10 uM) directement aux cellules de se dissiper ΔΨ m. cellules d'image pour un autre 5 min. L'expérience est maintenant terminée.
5. Analyse de l'image
- Une fois que l'imagerie est terminée, déterminer l'intensité des signaux Fluo-4 et TMRM en utilisant un logiciel d'analyse d'image, par exemple un logiciel ImageJ avec le plugin Bio-formats (download 'bioformats_package.jar' de http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / et enregistrez-le dans: le dossier 'C plugins Program Files ImageJ s).
- Ouvrez le fichier d'image (par exemple un fichier .oif) dans ImageJ. Cliquez sur l'outil de sélection et sélectionnez une région d'intérêt (ROI) qui contient des mitochondries. Utilisez le signal de TMRM initial pour sélectionner le retour sur investissement.
- Ouvrir 'Analyse> Outils> Gestionnaire de retour sur investissement », cliquez sur« Ajouter »pour inclure le ROI sélectionnée pour la mesure de l'intensité. ROIs multiples peuvent être sélectionnés sur une seule image pour la mesure. Répétez les étapes précédentes jusqu'à ce que tous les ROIs ont été ajoutés au gestionnaire de ROI.
- Cliquez sur "Plus> Multi Mesure ', assurez-vous que« Mesurer toutes les tranches "est sélectionné et que« une ligne par tranche' est désactivée, puis cliquez sur 'OK' pour obtenir une table d'intensité de fluorescence moyenne des TMRM et Fluo-4 signaux pour chaque ROI à chaque point de temps.
- Utiliser les données de tous les ROIs pour calculer les intensités moyennes et écart-type pour le TMRM et Fluo-4 signaux.
6. Calcul de la finale Ca 2+ gratuit Ion Concentration [Ca 2+]
- La libre Ca 2+ concentration d'ions [Ca 2+] dans la solution d'imagerie IM peut être déterminée en utilisant des logiciels tels que Maxchelator WEBMAXC ETENDU ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou chélateur 11. Par exemple, définir les variables dans WEBMAXC prorogés comme suit: Température = 24 ° C, pH = 7.1, la force ionique = 0,162, 0,002 M d' EGTA =, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M et Mg 2+ = 0,0078 M. Il en résulte une concentration en Ca2 + libre finale d'ions [Ca2 +] de 62 nm . Notez que ces programmes ne peuvent pas prendre en compte toutes les variables, telles que la pureté des réactifs, la précision des mesures et la détermination du pH. La méthode la plus précise pour déterminer la libre concentration Ca 2+ est d'utiliser une électrode sélective d'un Ca étalonné.
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Representative Results
Nous avons utilisé ce protocole pour examiner les effets d'une mutation MT-ND5 sur la capacité des mitochondries des cellules 143B au tampon augmente en calcium 12. Dans l'exemple représenté ici, les cellules 143B de commande ont été chargées avec Fluo-TMRM et 4, AM avant de perméabilisation à la digitonine. Après 5 min d'imagerie, huit additions séquentielles d'une dilution 1: 100 de 40 mM de CaCl 2 exogènes ont été faites, la libre concentration finale en ions Ca2 + [Ca2 +] calculée.
Après chaque addition de CaCl 2, le signal de TMRM diminue à mesure que l'afflux d'ions Ca 2+ dans les mitochondries dissipant la membrane mitochondriale potentiel ΔΨ m (figure 1). ΔΨ m récupère alors que la respiration est augmentée pour maintenir ΔΨ m. Cela se produit quatre fois après chaque CaCl
La concentration de calcium mitochondrial (Fluo-4 Signal) commence à augmenter après la deuxième CaCl2 outre , lorsque la libre [Ca 2+] dans les médias atteint 0,32 uM (Figure 2). Chaque addition subséquente CaCl 2 a provoqué une augmentation progressive du calcium mitochondrial.
Images des mesures simultanées de ΔΨ m (TMRM, le signal rouge) et de calcium mitochondrial (Fluo-4, sig vertnal) sont représentés (figure 3).
Figure 1: Mesure de mitochondrial ΔΨ m de digitonine perméabilisées 143B cellules en utilisant TMRM. les cellules 143B ont été préchargés avec Fluo-4, AM et TMRM avant perméabilisation à la digitonine. Une dilution 1: 100 de 40 mM de CaCl 2 exogène a été ajouté en portions aliquotes successives. La finale libre [Ca 2+] dans les médias est indiqué pour chaque addition (*). FCCP a été ajouté à une concentration finale de 10 uM après environ 40 min. ΔΨ m est représenté en rouge, représentée par l'intensité relative (RI) du signal TMRM. Les données sont la moyenne ± sd n = 3. La figure est adapté avec la permission de la référence 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 2: Mesure de calcium mitochondrial dans digitonine perméabilisées 143B cellules en utilisant Fluo-4, AM. les cellules 143B ont été préchargés avec Fluo-4, AM et TMRM avant perméabilisation à la digitonine. Une dilution 1: 100 de 40 mM de CaCl 2 exogène a été ajouté en portions aliquotes successives. La finale libre [Ca 2+] dans les médias est indiqué pour chaque addition (*). FCCP a été ajouté à une concentration finale de 10 uM après environ 40 min. calcium mitochondrial est représenté en vert, représenté par l'intensité relative (RI) du signal Fluo-4. Les données sont la moyenne ± sd n = 3. La figure est adapté avec la permission de la référence 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Mesure simultanée de calcium mitochondrial et ΔΨ m de digitonine perméabilisées 143B cellules en utilisant Fluo-4, AM et TMRM. les cellules 143B ont été préchargés avec Fluo-4, AM et TMRM avant perméabilisation à la digitonine. Une dilution 1: 100 de 40 mM de CaCl 2 exogène a été ajouté en portions aliquotes successives. La finale libre [Ca 2+] dans les médias est indiqué pour chaque addition. Images confocales représentatives montrant la coloration simultanée de ΔΨ m (TMRM, rouge) et de calcium mitochondrial (Fluo-4, vert). Notez que le signal Fluo-4 est difficile à détecter à la concentration de calcium de repos de 0,062 uM. Blanc barres d'échelle = 10 pm. Figure est adapté avec la permission de la référence 12.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le calcium joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, y compris la contraction musculaire, la signalisation neuronale et la prolifération cellulaire 13. L' augmentation des concentrations de calcium cellulaire sont souvent associés à la demande d'énergie, avec le calcium capable de stimuler directement la phosphorylation oxydative mitochondriale pour augmenter la génération d' ATP 3. Il est donc essentiel que nous avons la capacité de surveiller efficacement l'accumulation de calcium mitochondrial et d'être en mesure de comparer la façon dont cette fonction est affectée par des facteurs génétiques et des agents pharmacologiques.
Les étapes critiques au sein du protocole
Ce protocole décrit la possibilité de surveiller l' accumulation de calcium dans les mitochondries et ΔΨ m simultanément avec Fluo-4 AM et TMRM. Au cours du processus de coloration, il est essentiel de faire incuber les cellules à température ambiante afin d'optimiser l'efficacité de Fluo-4 AM à détecter mitochondrialecalcium. L'incubation à la température ambiante réduit l'activité de esterases cytosoliques, permettant l'inculpation Fluo-4, AM à traverser les membranes mitochondriales et entrer dans la matrice mitochondriale. A l'inverse, l'incubation à 37 ° C améliore l'activité d'estérase dans le cytosol, cliver l'ester AM à laisser un chargé Fluo-4 colorant qui ne serait pas capable de traverser les membranes mitochondriales efficacement.
Une fois que la coloration des cellules a été effectuée, les cellules sont immergées dans une solution d'imagerie IM. Cette solution présente une concentration en TMRM supérieure par rapport à la solution initiale de coloration RS. Maintenant que les cellules sont perméabilisées, la TMRM ne s'équilibre à travers la membrane plasmique. Par conséquent, la concentration en TMRM est soulevée dans la solution d'imagerie IM pour atteindre l'équilibre correct à travers la membrane mitochondriale interne. Il est également essentiel à ce stade d'inclure thapsigargine dans la solution d'imagerie IM. Thapsigargin bloque le réticulum endoplasmique (RE) Ca 2+ ATPase, veiller à ce que le signal Fluo-4 ne détecte pas ER calcium.
Modifications et dépannage
Certains types de cellules peuvent exprimer le transporteur de la multirésistance aux médicaments (également connu sous le MDR1 ou glycoprotéine-P) sur leurs membranes plasmiques. Cette protéine est connue pour exporter des indicateurs fluorescents, y compris les dérivés d'ester AM, du cytosol de la cellule 14. Si le transporteur est exprimé, à la fois Fluo-4, AM et TMRM peut être exportée à partir du cytosol des cellules, ce qui entraîne une coloration sous-optimale. Pour bloquer cet effet, vérapamil peut être ajouté à la solution RS de coloration à bloquer le transporteur de la multirésistance, l'inhibition de Fluo-4, AM et TMRM export pendant le processus de coloration.
Perméabilisant par les cellules à analyser, Fluo-4 AM peut être utilisé pour détecter Ca2 + mitochondrial, sans signaux concurrentes provenant d' autres organites ou le cytosol. Nous utilisons régulièrement le detergen non ioniquet digitonine pour la perméabilisation à une concentration de 25 pg / ml. Cette concentration peut avoir besoin d'être ajusté pour faire en sorte que la solubilisation des membranes mitochondriales n'a pas lieu. Ceci peut être déterminé de manière empirique par l'évaluation de l'intensité du signal TMRM à différentes concentrations de digitonine. Si la concentration de la digitonine est trop élevée, la membrane mitochondriale sera partiellement solubilisée, ce qui réduit le signal de TMRM.
Limites de la technique
L' un des principaux avantages de ce protocole est que , en utilisant Fluo-4, AM pour détecter le calcium mitochondrial, TMRM peut être utilisé pour mesurer simultanément ΔΨ m, avec chevauchement spectral négligeable entre les deux colorants. nécessité de garantir la spécificité de Fluo-4 pour le calcium mitochondrial, les cellules en cours d'examen à perméabilisées pour éliminer le signal Fluo-4 cytosolique. Cette perméabilisation est une limitation de cette technique. Alors que la solution imagerie IM closely correspond à la force ionique du cytosol de la cellule, il ne peut pas reproduire complètement l'ensemble de ses constituants. Cela peut affecter les résultats si les composants cytosoliques spécifiques sont nécessaires dans le système expérimental en cours d'examen. En outre, comme les cellules sont perméabilisées, le protocole peut ne pas être approprié pour les longues expériences supérieures à 1 h.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
Divers colorants fluorescents ont été mis au point pour l' évaluation du calcium mitochondrial 8. Ces colorants sont simples à utiliser et peuvent fournir des données utiles dans un court espace de temps. Bien que ces colorants accumulent principalement dans les mitochondries, dont certains peuvent également s'accumuler dans d'autres organites, y compris des liposomes, ou rester dans le cytosol des cellules. Par conséquent, il faut veiller à ce que ces autres signaux n'influencent pas le signal de calcium mitochondrial.
Dans ce protocole, mitochondrial Ca2 + est mesurée dans des cellules perméabilisées en présence d'thapsigargine. L'avantage de cette méthode est que les signaux calciques cytosoliques et ER sont éliminés. En outre, la perméabilisation permet l'utilisation de Fluo-4 AM pour détecter Ca2 + mitochondrial. Fluo-4, AM a très peu de chevauchement spectral avec TMRM, ce qui signifie que mitochondrial Ca 2+ et ΔΨ m peuvent être mesurent simultanément l' utilisation de ces deux colorants.
Mitochondrial Ca2 + peut également être mesurée en utilisant des journalistes fluorescentes codées génétiquement 8. Ces journalistes peuvent être ciblées sur les mitochondries, ce qui mitochondriales Ca 2+ signaux spécifiques. Les sondes génétiquement codés doivent être introduits dans les cellules à l'étude, qui, dans certains cas, peut prendre du temps et des efforts considérables. A l'inverse, notre protocole utilise les colorants Fluo-4, AM et TMRM, permettant la coloration des cellules simple et rapide pour mesurer mitochondrial Ca
Les applications futures ou directions après la maîtrise de cette technique
Mitochondrie agissent comme des tampons de calcium locale pour réguler les concentrations de calcium intracellulaire et les besoins énergétiques de la cellule. Lorsque ce processus est perturbé, excessive absorption de calcium mitochondrial peut induire la transition de perméabilité mitochondriale, ce qui entraîne l'effondrement de ΔΨ m et la libération de molécules pro-apoptotiques qui déclenchent la mort cellulaire induction 4.
Nous présentons un protocole rapide et directe pour l'examen du calcium mitochondrial et sa relation avec ΔΨ m et l'induction de transition de perméabilité mitochondriale. Cela peut être utilisé pour étudier la façon dont ces paramètres mitochondriaux influencent la pathogenèse dans un large éventail de maladies humaines, y compris le diabète 15 et liée à l' âgeconditions de neurodégénérescence telles que la maladie d' Alzheimer et la maladie de Parkinson 16. En outre, ce protocole peut être utilisé pour examiner comment le calcium mitochondrial et ΔΨ m sont affectées par des défauts génétiques ou des toxines environnementales, et aussi comment ces effets peuvent être modulées par des thérapies ou des médicaments qui ciblent les mitochondries. Ces types d'expériences futures peuvent fournir de nouvelles informations importantes sur le rôle que le calcium mitochondrial joue dans la santé humaine et de la maladie.
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Acknowledgments
Nous remercions Dr Kirstin Elgass et le Dr Sarah Creed de Monash Micro Imaging pour l'assistance technique, et le Wellcome Trust et Medical Research Council du Royaume-Uni pour un soutien financier. MMcK soutient le Conseil de recherches Future Fellowship Scheme australien (FT120100459), la Fondation William Buckland, La Fondation des maladies mitochondriales australien (AMDF), l'Institut Hudson de la recherche médicale et de l'Université Monash. Ce travail a été soutenu par le régime de soutien de l'infrastructure opérationnelle du gouvernement de Victoria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
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- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
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