Introduction
De correcte identificatie van cardiomyocyt kernen en de celcyclus status van cruciaal belang voor het bepalen van de cardiale omzet en regeneratie spier. Dit geldt met name voor het gebruik van nucleaire merkers, zoals pHH3, Ki-67, of thymidine analogen, voor het identificeren celcyclusactiviteit. Aangezien de proliferatieve capaciteit van zoogdier volwassen hartspiercellen zeer klein 1, een valse identificatie van een kern voor een positieve marker proliferatie van cardiomyocyten kern kan een wezenlijk verschil in de uitkomst van een proliferatie assay maken. Bovendien cardiomyocyten zijn gevoelig voor variaties in de celcyclus, zoals endoreduplicatie en acytokinetic mitose, die resulteren in polyploïde en meerkernige cellen dan bij de celdeling. Daartoe is de interpretatie van antilichaamkleuring tegen gemeenschappelijke celcyclus markers is niet beslissend in alle gevallen.
Hier presenteren we methoden voor de straight-forwa rd erkenning van de muis hartspiercellen en hun nucleariteit in de moedertaal geïsoleerde cellen en dikke weefselcoupes bij postnatale en volwassen stadia door de ondubbelzinnige identificatie van hun kernen. Daartoe een transgene muis lijn cardiomyocyt- specifieke expressie van een fusieproteïne bestaande uit humaan histon H2B en mCherry onder controle van de promoter Myh6 (Myh6-H2B-MCH) werd 2. Kruisen deze muis lijn met een transgene proliferatie indicator muizenlijn, waarin de expressie van een eGFP-anillin fusie-eiwit onder controle van de alomtegenwoordige kip actine promoter een CMV enhancer (CAG-eGFP-anillin), maakt de bepaling van de status van celcyclus. De steiger anillin proteïne specifiek tot expressie gebracht in celcyclus actieve cellen 3 en het differentieel subcellulaire lokalisatie tijdens de celcyclus maakt live tracering celcyclusprogressie met een hoge resolutie van de M-faseef "> 4. Derhalve dubbele transgene muizen kunnen worden gebruikt om te discrimineren tussen prolifererende hartspiercellen en die celcyclus variaties ondergaan. Dit bewijst vooral nuttig bij het screenen op proliferatie-inducerende stoffen in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures van dit protocol bij dieren waren in overeenstemming met de ethische normen van de Universiteit van Bonn en in overeenstemming met de richtlijnen van Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement over de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt.
1. In Vitro Visualisatie van celcyclusactiviteit in Postnatale Cardiomyocytes
- Postnatale cardiomyocyt dissociatie
- Pre-experimentele voorbereidingen
- Bereid kweekmedia (IMDM, 1% penicilline / streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren, 0,1% β-Mercaptoethanol); medium 1: voeg FCS tot 2%; medium 2: voeg FCS tot 20%.
- Coat een 96-well kweekplaat (halve groeigebied: 15 mm 2) met 0,1% gelatine in PBS oplossing.
- hart dissectie
- Bereid een petrischaal met 15 ml PBS en op te slaan op ijs. Steriliseren twee pincet en kleine schaar door ze in een droge glazen kraal sterilisator. Sacrifice neonatale transgene muizen (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) door onthoofding. Open de thorax, ontleden het hart uit, zoals beschreven in Ehler et al. 2013 (J Vis Exp .; (79):. 50.154 doi: 10,3791 / 50.154), en over te dragen aan de ijskoude PBS. Ga verder met de volgende muis.
- Bij het gebruik van niet-homozygote broedparen, het identificeren van de transgene harten met een fluorescentiemicroscoop. Zet de harten in PBS onder een fluorescentiemicroscoop. Controleer op eGFP-anillin expressie (Bijv .: 488 nm; Em .: 509 nm) en H2B-MCH expressie (Bijv .: 587 nm; Em .: 610 nm) met de juiste filter sets.
- cardiomyocyte isolatie
- Distantiëren de geselecteerde harten met behulp van de neonatale hart dissociatie kit. Incubeer het enzymmengsel 1 bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Tot 1 ml te verkrijgen van de uiteindelijke enzymmengsel, voeg 945 ul van enzymmengsel 1-55 pl enzymmengsel 2.
- Transfer tot 4 harten van P1 - P3 muizen en tot 2 harten van P4 - P6 muizen een 1,5 ml reaction buis met 1 ml enzymmengsel en snijd het hart in kleine stukjes met een schaar. De oplossing wordt in 15 ml reactiebuizen.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Om het contact tussen het weefsel en de enzymen te maximaliseren, zet de 15 ml buis nagenoeg horizontaal in de incubator. Meng door pipetteren 5-10 keer op en neer met een 5-mL pipet. Herhaal deze stap drie keer.
- Voeg 7,5 ml medium 2 (20% FCS) om de enzymreactie te stoppen. Filter de celsuspensie door een 70-um zeef cel. Spoel de cel zeef met 3 ml medium 2.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 15 min en gooi de supernatant. Resuspendeer de pellet in 500 ul medium 1; lysis van rode bloedcellen is niet vereist voor verdere experimenten. Pipet 10 pi van de celsuspensie in een cel telkamer bepalen en het aantal cellen.
- Voor een 96-wells plaat: zaad 10.000 cellen per putje in 120 ul medium 1 (2% FCS). Plaatsde cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2), waarna onmiddellijk de transfectie.
- Pre-experimentele voorbereidingen
- Transfectie van neonatale cardiomyocyten met siRNA of miRNA
- Veeg een bankje met RNase decontaminatie oplossing voor het RNasen verwijderen. Reinig de volgende materiaal met RNase decontaminatie oplossing: 10-pl, 100-pi, en 200-pi pipetten en een ice box. Dooi siRNA voorraad porties (100 uM) op ijs.
- Bereid 2 micrometer werkvoorraden van si / miRNAs in een verminderde serum medium (98 ul van verminderde serum medium + 2 pl van siRNA 100 uM voorraad). De werkvoorraad moet dezelfde dag worden gebruikt. Bevriezing wordt niet aanbevolen.
- Voeg 4 pi van de 2 urn voorraad tot 6 pl gereduceerd serum medium tot een 0,5-mL reactie buis (bedrag voor een 96-well; finale si / miRNA concentratie in 140 pi: ~ 57 nm). Kies een geschikt volume voor het aantal putten te transfecteren met een bepaalde Si / miRNA.
- Bereid een master mix van de transfectiereagens. Gebruik 10 pl (0,6 pi van transfectiereagens + 9,4 ui gereduceerd serum medium) voor elk putje (96 putjes in totaal).
- Voeg de si / miRNA te mixen om de transfectiereagens mix. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Pipet 20 ul in elk putje. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 en plaats het medium in elk putje met 120 ul drager 1. Na 24 uur of meer, overgaan tot fixatie en immunofluorescentiekleuring.
- Fixatie en immunofluorescentiekleuring
- Verwijder het medium en was de cellen eenmaal met PBS. Bedek de cellen met 4% formaldehyde oplossing 20 min. Haal de formaldehyde-oplossing en was de cellen eenmaal met PBS, en vervolgens bedek ze met PBS voor opslag of overgaan tot immunokleuring.
- Incubeer met primaire antilichaam (concentratie overeenkomstig de instructies van de fabrikant) in 0,2% Triton-X en 5% donkey serum gedurende ten minste 2 uur.Indien kleuring α-actinine (verdunning 1: 400, monoklonaal anti-α-actinine), beits nacht bij 4 ° C.
- Verwijder het primaire antilichaam en was 3 maal met PBS. Verdun het secundaire antilichaam Hoechst oplossing 1: 400 en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Verwijder het antilichaam, wassen met PBS 3 keer, en bedekken de cellen met PBS gedurende opslag bij 4 ° C.
- Confocale microscopie video
- Gebruik een confocale microscoop voor de afbeelding overname. Open de imaging software. Open "A1plus Settings" en controleer de dozen voor Ch1, Ch2 en Ch3. Stel Ch1 te DAPI, Ch2 om eGFP, H3 tot Cy3 en CH4 tot Cy4 door te klikken op het pulldown menu.
- Voor elk kanaal, klikt u op de HV en zet deze op 80 met behulp van de schuifbalk. Stel de Offset op 0 met behulp van de schuifbalken, en klik op de knop "Start" om de pinhole naar huis positie in te stellen. Stel de scan grootte 1024 x 1024 door te klikken op het pulldown menu.
- Klik optimaliseren om te openenvenster "XYZ Size Setup". Selectievakje "Perfect Voxel" onder "Suggested Step (z)". Verhoog de laser intensiteiten totdat het beeld is niet onderbelicht of overbelicht.
LET OP: Bijvoorbeeld; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (eGFP): 12%, Ch3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%. Stel de Offset voor alle kanalen op 0.
- Maak foto's met behulp van een 20X objectief (200X vergroting). Scan een grote afbeelding die bestaat uit tegels afbeeldingen (bijvoorbeeld 3 x 3).
- In de imaging software, ga naar "Acquire" en kies "grote afbeelding scannen" uit het pulldown menu. Onder "Area," kies "huidige positie in de linkerbovenhoek 'uit het pulldown menu en stel" Aantal velden in X en Y "tot 3 x 3. Klik op" Scan ".
- Gebruik een confocale microscoop voor de afbeelding overname. Open de imaging software. Open "A1plus Settings" en controleer de dozen voor Ch1, Ch2 en Ch3. Stel Ch1 te DAPI, Ch2 om eGFP, H3 tot Cy3 en CH4 tot Cy4 door te klikken op het pulldown menu.
- beeldanalyse
- Bepaal het aantal cardiomyocyten kernen door het tellen van H2B-Ch signalen en het aantal cardiomyocyten door het tellen van α-actinine signalen.
- <li> Klik op "Measure" en kies "handmatige meting" uit het pulldown menu. Kies "Counts" van de volgende pulldown menu. Klik op kernen met H2B-MCH signalen, waardoor merken en ze te tellen. Doe hetzelfde voor α-actinine-positieve cellen om het aantal cardiomyocyten krijgen.
- Bepaal het aantal cardiomyocyten kernen door het tellen van H2B-Ch signalen en het aantal cardiomyocyten door het tellen van α-actinine signalen.
- Count S / G2 fase hartspiercellen met nucleaire eGFP-anillin signalen (eGFP-anillin + / H2BmCh + kernen). Klik op "Measure" en kies "handmatige meting" uit het pulldown menu. Kies "Counts" van de volgende pulldown menu. Markeer de kernen met eGFP-anillin signalen en H2B-MCH signalen door te klikken op hen.
- Tel de cardiomyocyten met mitose specifieke eGFP-anillin signalen (bijvoorbeeld figuur 1 F en G), zoals cytoplasmatische signalen contractiele ringen en midbodies. Klik op "Measure" en kies "handmatige meting" uit het pulldown menu. Kies "Counts" van de volgende pulldown menu. Mark hartspiercellen met mitose specifieke eGFP-anillin signalen (bijvoorbeeld figuur 1 F en G), cytoplasmatische signalen, contractiele ringen, en midbodies door erop te klikken.
2. Bepaling van Nucleatie in het volwassenenonderwijs Cardiomyocytes door Langendorff dissociatie en dikke weefselcoupes
- Isolatie van volwassen hartspiercellen door Langendorff dissociatie
- Voorbereidingen voor hart dissectie
- Vul een insulinespuit (30-gauge naald) met heparine (20 eenheden / g lichaamsgewicht). Pak de muis door het nekvel. Til en draai de muis naar achteren om de buik voor injectie bloot te leggen.
- Voer een intraperitoneale injectie. Zet de gehepariniseerde muis terug in de kooi en wacht ten minste 15 minuten vóór het begin van het hart dissectie. Spoel en ventileer de Langendorff apparaat met 5-10 ml perfusie buffer (perfusie buffer: 135 mm NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,5 mM HEPES, 5 mM glucose en 25 mM BDM in DDH 2 O op pH 7,4 met NaOH).
- hart dissectie
- Bereid een 10-cm petrischaal met gekoeld (4 ° C) PBS en plaats het op ijs. Vullen en ventileren van een 1-ml spuit verbonden met een canule (20 gauge) met PBS. Bevestig de canule met boetseerklei op de grens van de petrischaal. Plaats de canule tip iets onder het PBS oppervlak.
- Offer de muis door cervicale dislocatie. Veeg de buik met 70% ethanol-oplossing. Een insnijding van het midden buik om het borstbeen met chirurgische schaar. Verwijder het membraan en snijd de thorax bilateraal met chirurgische schaar.
- Til en bevestig het borstbeen met een 20-gauge naald, opent de borstholte, en voorzichtig grijpen van de hart met anatomische pincet. Til het hart en haal hem uit de longen en bloedvaten door het snijden van de vaten van de uitstroom-darmkanaal.
OPMERKING: Om de aorta te identificeren, plaatst het hart metde ventrale kant naar boven. Dit vermindert de afstand tussen beide atria, waardoor de aorta met vestigingen vindt tussen de atria. Afhankelijk van de individuele hart architectuur, kan de takken worden verwijderd als de belangrijkste tak van de aorta is nog lang genoeg. - Transfer het hart naar de 10-cm petrischaal met gekoelde PBS (zie stap 2.1.2.1). Canule het hart door het trekken van de stijgende aorta op G20x1 ½ injectie canule, die werd afgestompt door een oscillerende multi-tool om weefselschade te voorkomen. Bevestig de aorta met een schroefdraad op de canule. Voorzichtig het hart spoelen met PBS om overtollig bloed te verwijderen door op de zuiger. Een lichte vergroting van het hart moet zichtbaar zijn.
- Langendorff hart dissociatie
- Sluit de canule hart snel op het Luer lock-adapter op het Langendorff perfusie apparaat. Perfuseren het hart met 30 ml geoxygeneerde perfusie buffer bij 37 ° C gedurende 5 minuten met een stroomsnelheid van 1 druppel / s. the stroomsnelheid kan worden aangepast door het regelen van de stroming O 2 in de inrichting met de Langendorff-drukreduceerventiel (druk tussen 0 en 200 mbar).
- Bereid de spijsvertering buffer onmiddellijk voor gebruik: perfusie buffer met 6 Collagenase B U, 10.000 eenheden trypsine en 50 pM CaCl2. Verwijder de perfusie buffer en start de enzymatische digestie door het toevoegen van 30 ml warme (37 ° C) en geoxygeneerde digestiebuffer.
OPMERKING: De hoeveelheid Collagenase B moet worden getitreerd afhankelijk van de activiteit van de verschillende partijen. - Stel de stroom naar een snelheid van 1 druppel / s en verteren het hart voor 10-13 min. Om besmetting te voorkomen, niet weer gebruik maken van de uitstroom. Breng het hart een 10 cm Petrischaal met 5 ml digestiebuffer. handmatig ontleden het weefsel met een tang door dat het hart met een pincet en gebruik het andere paar in het hart scheuren in kleine stukjes.
Opmerking: In deze stap wordt de atria kan worden gescheiden in kleinestukken (met irisschaar) en gedigereerd gedurende 30 minuten in 750 pl digestiebuffer in de incubator bij 37 ° C om geïsoleerde atriale cellen te verkrijgen. Om pure atriale hartspiercellen, pipet op en neer meerdere malen te krijgen met behulp van een 1-mL pipet. Stop de enzymreactie door het toevoegen van 750 pi van stop-oplossing. - Stop de digestie door het toevoegen van 5 ml stopoplossing (perfusie buffer met 5% FBS en 50 pM CaCl2). Met behulp van een serologische pipet, filter de celsuspensie door een 100-um zeef cel en het verzamelen van de cellen in een 50 ml centrifugebuis. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie bij 80 x g gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 10 ml stopoplossing met behulp van een 10 ml serologische pipet. Centrifugeer de celsuspensie bij 80 x g gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Na centrifugeren, gooi het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium (IMDM met 20% FCS, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 50 ug / ml van zowel penicilline als streptomycine en 0,1 mM β-mercaptoethanol) voor kweken. Anders, ga dan naar stap 2.2, "immunofluorescentiekleuring," en bevestig de cellen.
- Voor bevestiging aan 24-well platen, plaat 10.000 van de geïsoleerde cellen per putje aan 8 ug / ml laminine beklede dekglaasjes in 24-well platen met 500 pl cultuurmedium bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 3 uur .
- Voorbereidingen voor hart dissectie
- Immunofluorescentiekleuring op Langendorff geïsoleerde cardiomyocyten als suspensie
- Fix Langendorff geïsoleerde cardiomyocyten in 1 ml 4% PFA in PBS, pH 7,4, gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de celsuspensie bij 800 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, verwijder het fixeermiddel, en was de cellen tweemaal met PBS.
- Resuspendeer de vaste cardiomyocyten in 1 ml PBS en ofwel doorgaan met de immunofluorescentiekleuring of op te slaan in 500 pi PBS per putje opeen 24-puts plaat bij 4 ° C. Transfer deel van de celsuspensie (~ 100-200 ui) een microcentrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 800 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant.
- Permeabilize, blok, en vlekken op de cellen met het primaire antilichaam tegen α-actinine door toevoeging van 200 ul van primair antilichaam verdund 1: 400 in PBS met 0,2% Triton X-100 en 5% ezel serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Centrifugeer bij 800 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. Was de celpellet met PBS en centrifugeer bij 800 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en incubeer in 200 pl Alexa-Fluor-geconjugeerd secundair antilichaam (anti-muis IgG1) verdund 1: 400 in Hoechst kleurstof (werkoplossing: 1 ug / ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd, beschermd tegen licht.
- Centrifugeer bij 800 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. Herhaal deze stap. Bescherm het monster van licht. Resuspend de cellen in 200-500 ui PBS en overdracht 100-300 pi van de celsuspensie aan een putje van een kamer microscopie. Sluit het deksel van de kamer en bewaar de cellen bij 4 ° C tot beeldvorming. Beschermen tegen licht.
- Analyse van de nucleariteit van Langendorff geïsoleerde cardiomyocyten
- Neem beelden van-α-actinine gekleurd cardiomyocyten met een 25X objectief, overeenkomend met een 250X vergroting. Tel het aantal H2B-MCH + kernen alleen in de cardiomyocyten die regelmatig worden gekleurd door α-actinine en ver- tonen staafvormige morfologie en derhalve onbeschadigd worden beschouwd.
- Telling tenminste 100 hartspiercellen uit drie verschillende hart. Bereken het percentage mononucleaire, binucleaire en trinucleair cardiomyocyten.
OPMERKING: Gewoonlijk binucleaire cellen moeten vormen ongeveer 80 - 90%, terwijl trinucleaire cellen en die met grotere aantallen kernen zijn zeldzaam (<1% in Langendorff-geïsoleerde cardiomyocyten, <3% in dikke plakken). Atriale hartspiercellen aanzienlijk kleiner zijn dan ventriculaire cardiomyocyten. Gewoonlijk mononucleaire cellen vormen 90% van de totale bevolking.
- Isolatie, fixatie, en cryopreservatie van volwassen harten als voorbereiding op dikke plakken
- Monteer een inrichting voor perfusie fixatie door er een 50 ml spuit met een 3-weg kraan met een Heidelberger verlengbuis en een tweede 3-weg kraan. Bevestig de spuit in een stand zodanig dat doorstroming geactiveerd door zwaartekracht. Vul het systeem met 15 ml PBS.
- Volg de stappen 2.1.2.1-2.1.2.4, "hart voorbereiding." Sluit de G20x1 ½ injectie cannula met het hart naar de Luer lock adaptor van de bubble-vrij PBS gevulde perfusie inrichting en perfuseren met PBS. Vul het systeem met 10 - 15 ml 4% formaldehyde in PBS, dat vervolgens wordt geperfuseerd door het hart. Immersion fix het hart in 4% formaldehyde oplossing 's nachts.
- Vervang de 4% formaldehydeoplossing met PBS en was het hart in PBS op een horizontale schudinrichting bij 150 rpm gedurende 8 uur bij kamertemperatuur geroerd. Vervang de PBS met 20% sucrose oplossing voor het hart 's nachts dehydrateren bij 4 ° C.
- Freeze het hart in-cryo inbeddingmedium in een kleine vorm.
- Het opzetten van een beker gevuld met 2-methylbutaan en plaats het in een doos met droogijs. Zet het hart in een bevriezing mal eerder de helft gevuld met cryo inbedding medium en bedek het volledig met cryo inbedding medium. Plaats voorzichtig de mal in de koude beker, het voorkomen van contact van de cryo-inbedding medium met de 2-methylbutaan. Bewaar het bevroren weefsel op -80 ° C tot gebruik.
- Voorbereiding van de dikke plakken hart
- Gebruik de volgende instellingen in een cryotoom: een object temperatuur van -18 tot -20 ° C, een kamertemperatuur van -21 tot -23 ° C, een clearing hoek op de meshouder van 4 °, R35 en veren microtoom messen.
- Neem de gecryopreserveerde organ uit de bevriezing container en plaats deze op het monster schijf met cryo-inbedding medium met behulp van de snel invriezen plank. Plaats het hart zodanig dat snijden begint aan de top.
- Knip 50-um plakken totdat een gelijkmatige snijvlak wordt bereikt en het orgel zichtbaar. Cut-50 uM weefselcoupes door het cryotoom in handmatige modus met een langzame snelheid en de coupestrekplaat geplaatst op het mes. Mount plakjes op met zoutoplossing behandelde microscoopglaasjes. Laat de plakjes drogen 30 minuten bij kamertemperatuur en de glijbanen bewaren bij -80 ° C of vlekken direct.
- Kleuring van dikke hart plakken (kernen en celmembranen)
- Behandel hartcoupes met RNAse A (20 ug / ml) in wasbuffer (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5, en 50 mM EDTA) in een cuvette gedurende 1 uur bij 37 ° C. Incubeer de plakjes in 0,2% Triton-X in wasbuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de plakjes tweemaal gedurende 5 minuten elk in wasbuffer in een cuvette op eenhorizontale schudinrichting bij kamertemperatuur.
- Vlek overnacht met 1 uM TO-PRO3 jodide (642/661) en fluoresceïne-gekoppelde tarwekiem agglutinine (WGA, 1: 100) in wasbuffer bij 4 ° C. Was de schijfjes driemaal gedurende 5 minuten elk met wasbuffer in cuvettes op een horizontale schudinrichting en bedek ze met polyvinylalcohol fixeermiddel met een anti-fading reagens en een glazen dekglaasje.
- Afbeeldingen verwerving
- Gebruik bij voorkeur een omgekeerde confocale laser scanning microscoop uitgerust met een NA water dompelen objectief 40X / 1.15. Zoeken op oog voor een gebied binnen het segment dat bestaat uit in langsrichting bekleed cardiomyocyten; daartoe, de fluoresceïne-WGA kanaal (Bijv .: 488 nm) is geschikt.
Opmerking: Deze stap is noodzakelijk, omdat de boven- en ondergrenzen van de hartspiercellen toegankelijk in de z-stack voor latere analyse dient. Als de beeldvormende is gelimiteerd tot ~ 30 nm en de dikte van het deel is 50 um, is het niet mogelijk om imleeftijd dwarsdoorsneden van deze cellen (cell lengte: ~ 120 pm). - Pas de instelling binnen de imaging software. Open de imaging software. Open A1plus Instellingen en controleer de dozen voor CH2, CH3, en CH4. Stel Ch2 aan EGFP, Ch3 te Alx546 en CH4 tot Alx647 door te klikken op het pulldown menu.
- Voor elk kanaal, klikt u op de HV en zet deze op 80 met behulp van de schuifbalk. Stel de Offset op 0 met behulp van de schuifbalken. Klik op de knop "Home" om de pinhole naar de uitgangspositie in te stellen. Stel de scan grootte 1024 x 1024 door te klikken op het pulldown menu en klik optimaliseren om het venster "XYZ Size Setup" te openen. Vink het vakje "Perfect Voxel" onder "Suggested Step (z)".
- Klik op "live-scan" en stel de laser intensiteiten door te klikken op de schuifbalken op de afzonderlijke kanalen. Vink het vakje "Z-serie" op het venster "ND Acquisition" en klik op de "gedefinieerd door bovenste knop" box. de top te definiëren entoets van de z-stack door te klikken op de juiste knoppen na het aanpassen van de focus op de microscoop. De breedte z-stap 0,5 urn.
OPMERKING: De diepte van de z-stack wordt beperkt door de optische penetratie in het weefsel en de signaal-ruisverhouding. - Ga naar "A1plus Settings" en zet de Line Gemiddelde / Integral tot 2-4 door te klikken op het pulldown menu. Fine-tunen van de laser intensiteiten; pengat moet zo klein mogelijk zijn om afbeeldingen in een brandvlak.
- Gebruik bij voorkeur een omgekeerde confocale laser scanning microscoop uitgerust met een NA water dompelen objectief 40X / 1.15. Zoeken op oog voor een gebied binnen het segment dat bestaat uit in langsrichting bekleed cardiomyocyten; daartoe, de fluoresceïne-WGA kanaal (Bijv .: 488 nm) is geschikt.
- Analyse van kiemvorming
- Open de beeldanalyse software en laadt de z-stack van belang.
- Handmatig vast nucleatie in de z-stacks door te scrollen door de verschillende lagen van de stapel om cellen die volledig liggen binnen de stack identificeren; Dit is het geval wanneer de WGA kleuring zichtbaar in alle dimensies. Tel het aantal kernen (de meeste van hen zullen binucleaire zijn) en markeer de geanalyseerde cel door een aantekening in de software. <li> Bepaal het aantal CM kernen (H2B-MCH +) en de totale kernen (TO-PRO3 +) in 3D-reconstructies voor de interne kanalen (figuur 2D). In de imaging software, klik op "Binary" en kies "definiëren Threshold 3D" uit het pulldown menu. Kies uit het kanaal pulldown menu ofwel Alx546 voor het aantal CM kernen of Alx647 voor het totale aantal kernen. Door te klikken op de juiste pijlen, stelt het programma "Smooth 4x", Clean 1x, en Fill gaten op. Controleer de "Size" doos en zet deze op 5 urn met behulp van de schuifbalk. Stel de drempel met behulp van de schuifbalk tot afzonderlijke objecten verschijnen.
LET OP: Na het aanbrengen van de versnippering, het venster resultaten toont een tabel van gekwantificeerde evenementen en een gekleurde versnippering van het beeld. Aangezien sommige kernen direct contact met elkaar, handmatig automatische analyseresultaat doubletten, die niet correct kunnen worden gescheiden door de software te corrigeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de effecten van siRNAs / miRNAs de celcyclusactiviteit postnatale cardiomyocyten in vitro cardiomyocyten van dubbel transgene Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin muizen te analyseren werden geïsoleerd op postnatale dag 3 (P3) en getransfecteerd met celcyclus activiteit-inducerende miR199 5, siRNA p27 en siRNA Fzr1. In vergelijking met de negatieve controle (Figuur 1A), de Foto miR199- (figuur 1B) en p27- siRNA (figuur 1C) getransfecteerde cardiomyocyten tonen een inductie van celcyclus activiteit. In het eGFP-anillin muismodel kan siRNAs tegen Fzr1 worden gebruikt als transfectie vallen, als de remming van Fzr1 leidt tot de accumulatie van eGFP-anillin fusieproteïne in de kernen van getransfecteerde cellen en verlies van Fzr1 leidt tot de remming van APC Fzr1. Fzr1 is een cofactor van de anafase het bevorderen complex E3 ligase, die anillin doelstellingen voor ProteasOmal degradatie. Figuur 1D toont een confocale overzichtsbeeld van siRNA Fzr1 getransfecteerde cardiomyocyten 3 dagen na transfectie geeft aan een transfectie efficiëntie van ~ 45%. Hartspiercellen die endoreduplicatie bekleden (bijv, na knock-down van p27 6) tonen eGFP-anillin expressie uitsluitend nucleaire (figuur 1E) of zijn eGFP-anillin negatief (zie bespreking). Zij spreken zich niet uit eGFP-anillin in M-fase-typische lokalisaties (figuur 1F en G), zoals endoreduplicatie slechts bestaat uit een endo-S-fase (eGFP-anillin-positief) en een endo-G fase (eGFP-anillin-negatief ). In het endo-G fase, de APC actief, waardoor de ubiquitinatie en afbraak van eGFP-anillin in het proteasoom.
Kwantificering van mono- en binucleaire cardiomyocyten porties tegen het volwassen stadium kan worden uitgevoerd bij de enkele-celniveau na Langendorff dissociatie van Myh6-H2B-MCH transgene harten of in dikke cryoslices van transgene harten. Na de enzymatische digestie van het hartweefsel bij de Langendorff inrichting atria en ventrikels kunnen mechanisch worden gescheiden en onafhankelijk van elkaar geanalyseerd. Figuur 2A toont een representatief beeld van niet-vaste-H2B MCH transgene ventriculaire cardiomyocyten na Langendorff isolatie met een hoge mate van binucleaire cardiomyocyten, zoals door nucleaire H2B-MCH expressie. Daarentegen, de meeste atriale cardiomyocyten mononucleaire (figuur 2B). Als de enzymatische vertering niet tot 100% afzonderlijke cellen, het patroon van cross-strepen blijkt uit α-actinine kleuring maakt onderscheid tussen binucleaire cardiomyocyten (doorlopend patroon van cross-strepen, figuur 2C) en cellen wambuizen. Figuur 2D toont een voorbeeld van de identificatie van een binucleaire cardiomyocyten in tenhick slice.
3D-reconstructies van dikke plakjes van volwassen Myh6-H2B-MCH transgene harten kunnen worden gebruikt om het aandeel van cardiomyocyten kernen onder fysiologische omstandigheden in het weefsel bepalen. De 3D-module van beeldverwerkingssoftware, Hoechst-gekleurde kernen en H2B-MCH-positieve kernen kunnen worden gedetecteerd en geteld automatisch, zie figuur 2E. Het uiteindelijke resultaat moet handmatig worden gecorrigeerd voor wambuizen, betekent kernen die rechtstreeks elkaar raken, in dit geval. De nucleatie-index van cardiomyocyten als dikke plakken analyseren moet handmatig door de stapel te schakelen als de kernen niet nodig liggen binnen een z-vlak. WGA kleuring maakt de detectie van celranden.
Figuur 1: Voorbeelden van inVitro Visualisatie van celcyclus-activiteit in postnatale cardiomyocyten na transfectie met siRNA. (AD) P3 hartspiercellen van eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH harten gekleurd voor α-actinine (wit). Cardiomyocyte kernen worden geïdentificeerd door de H2B-MCH signaal (rood), celcyclus-activiteit door eGFP-anillin signalen (groen) en kernen door Hoechst nucleaire kleurstof (blauw). (A) P3 hartspiercellen getransfecteerd met scramble siRNA dienen als de negatieve controle. De bar is 100 micrometer. (B) P3 cardiomyocyten getransfecteerd met 199 miRNA-scherm aanzienlijk eGFP-anillin signalen dan de controle (A). De bar is 100 micrometer. (C) Voorbeeld van uitsluitend nucleaire eGFP-anillin signalen na transfectie met siRNA p27, wat aangeeft endoreduplicatie. De bar is 80 micrometer. (D) transfectie met siRNA tegen Fzr1 voor de bepaling van transfectie-efficiëntie. Als eGFP-anillin accumuleert het aantal eGFP-anillin + cardiomyocyten geeft de transfectie-efficiëntie. De bar is 80 micrometer. (EG) Verschillende lokalisatie van eGFP-anillin (groen) in hartspiercellen tijdens de celcyclus: nucleaire lokalisatie (pijl in E), contractiele ring (pijlen in F), en midbody lokalisatie (pijl in G). De balk 20 pm (E) en 10 pm (F en G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden voor de beoordeling van Multinucleation door de Langendorff Isolatie van Cardiomyocytes uit H2B-MCH Muizen en door de 3D analyse van dikke plakken. (A, B) Ventriculaire (A) en atriale (B) uit harten cardiomyocyten van volwassen H2B-MCH transgene muizen na isolatie door Langendorff dissociatie. De bars zijn 50 urn. (C) Cardiomyocytes van Myh6-H2B-MCH harten gekleurd voor α-actinine (groen). Cardiomyocyte kernen worden geïdentificeerd door de H2B-MCH signaal (rood). De bar is 10 micrometer. (D) binucleaire cardiomyocyt in een dikke slice (pijlen). Cardiomyocyte kernen worden geïdentificeerd door de H2B-MCH signaal (rood), celranden door WGA kleuring (groen) en kernen door ToPro3 (wit). De bar is 50 micrometer. (E) Workflow voor de 3D analyse van binucleation in dikke plakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is een discussie over de vraag of cardiomyocyten kunnen de celcyclus opnieuw invoeren en verdelen en na beschadiging tijdens weefsel homeostase. Waarden voor de basisomzet cardiomyocyten werden gegeven in het traject tussen 1% en 80% 1 7. Ook na een cardiale laesie, is de inductie van celcyclus-activiteit en het scheppen van nieuwe cardiomyocyten gerapporteerd in het grensgebied, met waarden tussen 0,0083% 8 en 25 - 40% 7. Deze verschillen kunnen deels worden verklaard door verschillende experimentele benaderingen voor cardiale kernen te identificeren, een proces dat is zeer uitdagend op histologische secties 9 en tijdens de celdeling. Aangezien cardiomyocyten zijn gevoelig voor variaties van de celcyclus, is het van cruciaal belang om authentieke celdeling onderscheiden van endoreduplicatie en acytokinetic mitose, die leiden tot polyploïde en meerkernige cellen. Voorde identificatie van celdeling, is het noodzakelijk om kenmerken van celdeling, zoals contractiele ringen en midbodies visualiseren, alsook het percentage binucleaire cardiomyocyten bepalen. We hebben technieken ontwikkeld om de celcyclus activiteit in hartspiercellen in detail te analyseren en om de mate van nucleariteit in geïsoleerde cellen of in dikke secties te bepalen.
Het is belangrijk op te merken dat de eGFP-anillin biedt rechtstreeks bewijs van de celdeling door visualisatie van een symmetrische contractiele ring (Figuur 1F) en de midbody (figuur 1G) en indirect bewijs endoreduplicatie en acytokinetic mitose. Zoals eerder beschreven, het optreden van een eenzijdige indringen van de contractiele ring is een indicator van binucleation 10, en kan worden waargenomen met de eGFP-anillin systeem.
Endoreduplicatie wordt voorgesteld zolang er geen contractiele ring of midbody worden waargenomen, welke berekeningen van de waarschijnlijkheid van het opsporen van deze lokalisaties verplicht maakt. Uitgaande van een celcyclus duur van 25 uur, een gemiddelde duur van contractiele ring zichtbaarheid van 20 min en een midbody persistentie van 1 uur, moet er 1 contractiele ring in 100 delen eGFP-anillin-positieve cellen en 4 midbodies. Statistisch gezien, ten minste 25 eGFP-anillin-positieve cellen zou moeten worden geanalyseerd om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus. Dit aantal verandert dienovereenkomstig de celcyclus duur (vaak bekend) toeneemt of afneemt. Dit betekent ook dat de meeste eGFP-anillin signalen nucleaire (figuur 1E) zal, als M-fase de enige fase met niet-nucleaire lokalisatie, duurt slechts ongeveer 1 uur.
Tijdens de postnatale ontwikkeling, binucleation vindt plaats in de muis harten en neemt toe tot 90% in ventriculaire hartspiercellen (~ 25% bij de mens) 11. for de analyse van regeneratie in het hart, is het belangrijk de mate van binucleation bepalen. We beschrijven twee methoden voor de aanpak van deze belangrijke morfologische functie: namelijk, Langendorff dissociatie en de creatie van dikke lagen van hartweefsel. Terwijl Langendorff isolatie makkelijker en sneller, de morfologie van de dikke gedeelten is tijdrovend, maar ook nauwkeuriger. Interessant is dat we vonden dat Langendorff isolatie overschat het percentage binucleaire cardiomyocyten. Dit zou te wijten zijn aan verschillende overlevingskansen van mononucleaire en binucleaire cellen tijdens deze nogal stijve procedure.
Als de inductie van proliferatie in postnatale cardiomyocyten is een nieuwe aanpak in cardiale regeneratie, dit protocol beschrijft een screening systeem door het combineren van twee transgene muis lijnen, Myh6-H2BmCh en CAG-eGFP-anillin. Hartspiercellen geïsoleerd uit harten op postnatale dagen P1 - P6 kunnen gemakkelijk worden gekweekt en getransfecteerd met miRNAs ofsiRNAs of behandeld met bibliotheken van kleine moleculen. Cardiomyocyten kernen kunnen handmatig of automatisch worden gedetecteerd door software-algoritmen en mogelijke "hits" worden bepaald door een toename van het aantal kernen MCH +. Discriminatie van celdeling van endoreduplicatie en acytokinetic mitose kan door kwantificering van de verschillende lokalisaties van het eGFP-anillin signalen. Dit systeem moet wat nieuw licht werpen op de regulerende mechanismen onderliggende postnatale cardiomyocyt proliferatie en kunnen leiden tot de ontdekking van nieuwe therapeutische middelen voor de behandeling van hartziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 mL syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
- Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
- Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
- Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
- Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
