Summary
تكون الغضروف من الخلايا الجذعية يتطلب ضبط الأوضاع الثقافة. هنا، نقدم نهج المغناطيسي لتكثيف الخلايا، وهي خطوة ضرورية لبدء تكون الغضروف. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن نضوج الحيوي في مفاعل حيوي ينطبق التحفيز الميكانيكي للبنيات الخلوية ويعزز الغضروفية إنتاج المصفوفة خارج الخلية.
Abstract
تبقى الهندسة الغضروف تحديا يرجع إلى صعوبات في خلق زرع في المختبر وظيفية مماثلة لأنسجة الأم. نهج استكشافها مؤخرا لتطوير بدائل ذاتي ينطوي على تمايز الخلايا الجذعية إلى غضروفية. لبدء هذا تكون الغضروف، وعلى درجة من الضغط من مطلوب الخلايا الجذعية. وبالتالي، أثبتنا جدوى خلايا التكثيف مغناطيسيا، سواء داخل السقالات سميكة وخالية من سقالة، وذلك باستخدام مصادر المجال المغناطيسي المنمنمة كما الجذابون الخلية. وقد استخدم هذا النهج المغناطيسي أيضا لتوجيه الانصهار الكلي ولبناء خالية من سقالة، نظمت، ثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة عدة مليمترات في الحجم. بالإضافة إلى وجود حجم المعزز، قدمت الأنسجة التي شكلتها انصهار مدفوعة المغناطيسي زيادة كبيرة في التعبير عن الكولاجين II، ولوحظ اتجاه مماثل للتعبير aggrecan. كما تعرض الغضروف الأصلي للقوات رقبعة أثرت هيكل 3D لها، وقد أجريت أيضا نضوج ديناميكي. تم استخدام مفاعل حيوي التي توفر المحفزات الميكانيكية للثقافة السقالات المصنف مغناطيسيا على مدى فترة 21 يوما. مفاعل حيوي نضوج تحسنت إلى حد كبير تكون الغضروف في السقالات cellularized. وكانت المصفوفة خارج الخلية التي تم الحصول عليها في ظل هذه الظروف الغنية في الكولاجين II وaggrecan. يحدد هذا العمل إمكانات مبتكرة من التكثيف المغناطيسي للخلايا الجذعية وصفت ونضوج الحيوي في مفاعل حيوي لتحسين التمايز مكون للغضروف، سواء خالية من سقالة وضمن السقالات السكاريد.
Introduction
يتم استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية بالفعل في العيادة وكلاء النقيض للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، وتطبيقاتها العلاجية الحفاظ على التوسع. على سبيل المثال، فقد تبين مؤخرا أن الخلايا المسمى يمكن التلاعب في الجسم الحي باستخدام مجال مغناطيسي خارجي، ويمكن أن توجه و / أو الاحتفاظ بها في موقع محدد من زرع 1، 2، 3. في مجال الطب التجديدي، ويمكن استخدامها لهندسة الأنسجة المنظمة في المختبر 4، بما في ذلك الأنسجة الوعائية 5، 6، 7، 8 العظام، والغضاريف 9.
مغمورة الغضروف المفصلي في بيئة اوعائية، مما يجعل إصلاح مكونات المصفوفة خارج الخلية محدودة للغاية عندما تحدث الأضرار. لهذا السبب، researcوتركز حاليا على ح هندسة استبدال غضروف زجاجي يمكن زرعها في موقع الخلل. من أجل إنتاج بديل ذاتي، وبعض المجموعات البحثية واستكشاف استخدام غضروفية ذاتي كمصدر الخلية 10 و 11، في حين يؤكد آخرون قدرة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) على التمايز إلى غضروفية 12 و 13. في الدراسات السابقة خصت هنا، اخترنا MSC، وأخذ العينات نخاع العظام هي بسيطة نسبيا ولا تتطلب التضحية من غضروفية الصحية، التي تخاطر بفقدان النمط الظاهري على 14.
خطوة مبكرة ضرورية لبدء تمايز الخلايا الجذعية المولدة للغضروف هي التكثيف بهم. تتشكل مجاميع الخلايا عادة باستخدام الطرد المركزي أو ثقافة MICROMASS 15؛ ومع ذلك، هذه الأساليب التكثيف neitheص تقديم القدرة على خلق مجموعات الخلايا داخل السقالات سميكة ولا القدرة على السيطرة على مزيج من الركام. في هذه الورقة، ونحن تصف نهجا مبتكرا لتكثيف الخلايا الجذعية باستخدام MSC وضع العلامات المغناطيسي والجذب المغناطيسي. وقد ثبت هذا الأسلوب لتشكيل خالية من سقالة يبني 3D عن طريق مزيج من المجاميع مع بعضها البعض للحصول على الأنسجة الغضروفية ملليمتر النطاق 9. وقد سمح بذر المغناطيسي السقالات سميكة وكبيرة أيضا إمكانية زيادة حجم الأنسجة المهندسة وتصميم شكل بسهولة أكبر فائدة للزرع، وتنويع إمكانية التطبيقات السريرية في إصلاح الغضروف. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لبذر المغناطيسي للجنة السلامة البحرية في السقالات التي يسهل اختراقها مكونة من السكريات الطبيعية، بولولان، وديكستران، السقالات المستخدمة سابقا لحصر الخلايا الجذعية 16 و 17. كان التمايز مكون للغضروف finallيقوم ذ في مفاعل حيوي لضمان المواد الغذائية المستمرة ونشر الغاز في صلب مصفوفة من السقالات المصنف مع كثافة عالية من الخلايا. وإلى جانب توفير المواد الغذائية، والعوامل المولدة للغضروف النمو، والغاز إلى الخلايا، عرضت مفاعل حيوي التحفيز الميكانيكي. وعموما، فإن التكنولوجيا المغناطيسية المستخدمة لحصر الخلايا الجذعية، جنبا إلى جنب مع نضوج الحيوي في مفاعل حيوي، يمكن أن تحسن بشكل ملحوظ التمايز مكون للغضروف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بناء الأجهزة المغناطيسية
ملاحظة: الأجهزة المستخدمة لزرع الخلايا تختلف تبعا لتطبيق (الشكل 1). لتشكيل المجاميع، ويقتصر عدد الخلايا إلى 2.5 × 10 5 / مجموع المباراتين، وبالتالي فإن نصائح المغناطيسية يجب أن تكون رقيقة جدا (750 ميكرون في القطر). البذور 1.8 سم 2/7 السقالات ملم سميكة، ويجب أن يكون المغناطيس أكبر (3 مليمتر في القطر)، وسوف تضمن الهجرة الخلية من خلال مسام السقالة.
- بناء جهاز مع المغناطيس الصغيرة للتشكيل الكلي (الشكل 1A)
- جعل ثقوب صغيرة مع حفر 0.8 ملم من خلال لوحات الألومنيوم (3 سم وقطرها 6 مم).
- إدراج غيض المغناطيسي (750 ميكرون في القطر) في كل حفرة من لوحة.
- وضع هذا القرص على المغناطيس النيوديميوم الدائم الذي يضمن مغنطة من التشبع.
- بناء جهاز لالبذر سقالة (
- قطع البوليسترين الثابت إلى 2.4 سم 2 الساحات.
- إدراج 9 مغناطيس صغير (3 ملم وقطرها 6 مم لونغ) على مسافة متساوية على مساحة 1.6 سم 2.
- وضع هذا الجهاز على المغناطيس النيوديميوم دائم.
2. الجذعية وسم الخلية
ملاحظة: وصفت الخلايا الجذعية مع 0.1 ملي النانوية المغناطيسية لمدة 30 دقيقة (2.6 ± 0.2 خريج الحديد / خلية) لتشكيل مجاميع، في حين أنها وصفت مع 0.2 ملي النانوية المغناطيسية لمدة 30 دقيقة (5 ± 0.4 خريج الحديد / خلية) البذور السقالات. وقد استخدمت هذه التركيزات جسيمات متناهية الصغر وحضانة مرات سابقا، ونشرت لجنة السلامة البحرية والخلايا الأخرى 18 و 19، وتقرر أن الجسيمات النانوية أثرت ولا خلية حيوية ولا قدرة التمايز MSC. وقد تم قياس كتلة الحديد تأسست من قبل الخلايا الجذعية عن طريق واحد مmagnetophoresis 19 و 20 ليرة لبنانية.
- ثقافة الخلايا البشرية الجذعية الوسيطة (MSC) في كامل الجذعية الوسيطة المتوسطة نمو الخلايا (MSCGM) عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ حتى بالقرب من التقاء (~ 90٪).
- إعداد وضع العلامات حل المغناطيسي عن طريق خلط 0.1 أو 0.2 ملي maghemite المغلفة سترات أكسيد الحديد (γFe 2 O 3؛ الأساسية: 8 نانومتر القطر) في وسط 5A مكوي وخالية من المصل تعديل في معهد الحديقة التذكارية روزويل (RMPI) دون الجلوتامين وتحتوي على 5 ملي سيترات الصوديوم.
- تجاهل المتوسطة، وشطف الخلايا مع المصل خالية RPMI المتوسطة دون الجلوتامين، وإضافة 10 مل من الحديد الحل أكسيد جسيمات متناهية الصغر في 150 سم 2 قارورة الثقافة، الحد الأدنى للحجم المطلوب لتغطية جميع الخلايا.
- احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ ثم تجاهل الحل جسيمات متناهية الصغر. شطف لمدة 5 دقائق مع خالية من المصل RPMI المتوسطة دون الجلوتامين لاستيعاب نانoparticles لا تزال تعلق على غشاء البلازما.
- تجاهل المتوسطة RPMI وإضافة 25 مل من المتوسط MSCGM الكامل في قارورة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
3. المغناطيسي البذر الخلية
- طازجة إعداد المتوسطة المولدة للغضروف باستخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) ارتفاع نسبة الجلوكوز مع L-الجلوتامين بإضافة 50 ميكرومتر حمض L-الاسكوربيك 2-فوسفات و 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون، 1 ملم البيروفات الصوديوم، 0.35 مم L-البرولين والثقافة العالمية 1٪ ملحق يحتوي على الأنسولين، ترانسفيرين الإنسان وحمض selenous (ITS-بريمكس)، و 10 نانوغرام / مل النمو التحويلي عامل بيتا 3 (TGF-β3).
- فصل الخلايا المغناطيسية باستخدام 8 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لكل 150 سم 2 الثقافة قارورة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا فصل في 260 × ز لمدة 5 دقائق. نضح المتوسطة وعدد الخلايا مع وقف التنفيذ إعادة.
- وضع طبق بتري زراعة الخلايا القاع الزجاجي (35 ملم) على رأس كل من الأجهزة المغناطيسية.
- إلى mتشكيل agnetically المجاميع، وإضافة 3 مل من المتوسط مكون للغضروف إلى طبق بتري وبلطف إيداع أصغر حجم ممكن (لا يزيد عن 8 ميكرولتر) تحتوي على 2.5 × 10 5 الخلايا المسمى في مجموع المباراتين (ما يصل الى 16 المجاميع يمكن أن تودع). ترك طبق بيتري لمدة 20-30 دقيقة دون نقله، والسماح لها لتشكيل الأجسام الشبه الكروية، ثم ضع الجهاز كاملة، بما في ذلك طبق بتري تحتوي على 16 المجاميع، في حاضنة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
- المجاميع تحكم النموذج باتباع نفس البروتوكول واستبدال المتوسطة كاملة مع المتوسطة المولدة للغضروف بدون TGF-β3.
- لتوليد مجموعها بناء 3D، ضع 2 المجاميع على اتصال في يوم 8 إلى تشكيل 8 الحلل، والشروع في الانصهار. في يوم 11، ودمج 2 الحلل لتشكيل 4 تواءم. وأخيرا، صهر 4 تواءم في يوم 15 للحصول على الهيكل النهائي.
- وفي الوقت نفسه، تشكل الحصى بواسطة الطرد المركزي 2.5 × 10 5 وصفت الخلايا الجذعية في 26015؛ ز لمدة 5 دقائق في 15 مل الأنابيب مع 1.5 مل من المتوسط مكون للغضروف مع أو بدون TGF-β3 (لعينة والسيطرة على التوالي).
- لمغناطيسيا السقالات البذور، ووضع كل سقالة المجفف في طبق بتري. استخدام السكاريد السقالات مسامية مصنوعة من بولولان / ديكستران 21. لكل سقالة، وتمييع 2 × 10 6 خلايا الجذعية المسمى في 350 ميكرولتر من المتوسطة المولدة للغضروف بدون TGF-β3 وبعناية ماصة الخلايا على منصة الاعدام.
- احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية للسماح لاختراق خلية كاملة داخل سقالة ثم إضافة بلطف 3 مل من المتوسط مكون للغضروف مع أو بدون TGF-β3 (لعينة أو السيطرة، على التوالي) إلى طبق بيتري.
- احتضان سقالة cellularized على جهازها المغناطيسي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 4 أيام للسماح للهجرة الخلايا من خلال المسام سقالة والحبس.
- وفي الوقت نفسه، البذور السقالات مع 2 × 10 6
4. التمايز إلى غضروفية
ملاحظة: بعد 4 أيام من الحضانة، وإزالة المغناطيس ومواصلة النضج مكون للغضروف إما في طبق بتري (شروط ثابتة) أو في مفاعل حيوي (الظروف الديناميكية). ونضجت عينات السيطرة السلبية في ظروف ثابتة مع المتوسطة المولدة للغضروف بدون TGF-β3.
- في ظروف ثابتة، والحفاظ على السقالات cellularized أو المجاميع في نفس طبق بيتري. تغيير المتوسطة المولدة للغضروف مرتين في الأسبوع لمدة 21 يوما.
- في الظروف الديناميكية، وإعداد مفاعل حيوي.
- قطع أنابيب السيليكون في الطول المناسب وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- الأوتوكلاف جميع المواد: 500 مل غرفة الثقافة، وأنابيب، الدوارات 2-الطريقة، وأقفاص.
- وضع أجزاء مفاعل حيوي في microbio معقم محطة سلامة المنطقية. قم بتوصيل أنابيب إلى 2 في اتجاه والدوارات وإلى غرفة الثقافة باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- نقل بعناية السقالات cellularized في أقفاص تعقيمها باستخدام ملعقة معقمة. ضع 2 السقالات في قفص. عندما أقفاص جاهزة، إدراجها في إبر من غطاء لمنعهم من التحرك خلال مزيد من التناوب. تملأ الغرفة الثقافة مع المتوسطة المولدة للغضروف وإغلاقه مع غطاء تحتوي على أقفاص.
- بدوره على مضخة تحوي لملء الأنابيب مع المتوسطة المولدة للغضروف والقضاء على فقاعات الهواء.
- وضع وتأمين غرفة شغل في السيارات من مفاعل حيوي وتشغيل الكمبيوتر، والتي تسيطر على تناوب كل من الذراع ومن الغرفة.
- تطبيق سرعة دوران من 5 التناوب في الدقيقة (دورة في الدقيقة) على كل من الذراع والغرفة. ضبط مضخة تحوي بمعدل تدفق 10 دورة في الدقيقة لتغذية مستمرة من السقالات cellularized.
الحمار = "jove_title"> 5. استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني
ملاحظة: قبل استخراج الحمض النووي الريبي، هضم السقالات مع حل الأنزيمية.
- إعداد 1 مل من محلول الأنزيمية وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من pullulanase (40 U / مل) و 50 ميكرولتر من دكستراناز (60 ملغ / مل) إلى 850 مل من مصل خالية DMEM المتوسطة.
- شطف السقالات مرتين مع المصل خالية DMEM المتوسطة، تجاهل المتوسطة، وإضافة 800 ميكرولتر من الحل الأنزيمي في السقالة. احتضان لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت الإثارة لطيف.
- عندما يذوب السقالة تماما، ونقل محلول يحتوي على خلايا لأنبوب 1.5 مل، أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، ونضح بعناية المتوسطة، وشطف مرتين مع العقيمة 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، وإعادة تعليق الخلايا في حل RNA العزلة.
- لاستخراج الحمض النووي الريبي من المجاميع، ووضع الكروية في حل RNA العزلة وسحقهم تماما باستخدام الخالط قبل تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي.
- عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم لمجموع استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- توليف الحمض النووي مكملة من 400 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الناسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وذلك باستخدام 250 نانوغرام الاشعال عشوائية، 1 ميكرولتر من مزيج dNTP (10 ملم لكل منهما)، و 40 U / مل ريبونوكلياز المانع. الحجم النهائي من التفاعل 20 ميكرولتر. في نهاية التفاعل، إضافة 80 ميكرولتر من الماء المقطر للحصول على الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
- لالكمي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، واستخدام مزيج PCR التي تحتوي على كاشف الفلورسنت لقياس التعبير النسبي للجينات الفائدة، مثل aggrecan (AGC) والكولاجين II (العقيد II)، مع 10 × المخفف [كدنا]. تطبيع مستويات التعبير الجيني مع بروتين خاص بالريبوسوم الجين المرجعية، كبير، P0 (RPLP0). إجراء العمليات الحسابية مع 2 - صيغة ΔΔCTحيث ΔΔCT = ΔCT من حالة متباينة - يعني ΔCT من حالة السيطرة، وكل ΔCT يمثل CT من الجينات في المصالح - وCT من الجين المرجعية (RPLP0).
- تحديد القياسات الإحصائية كما ± القيم يعني الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). إجراء تحليل مع ن ≥ 2 تجارب مستقلة. استخدام اختبار t الطالب على تحليل فروق ذات دلالة إحصائية بين الكريات طرد واندماج المغناطيسي (* ف <0.05). تحديد أهمية مع اختبار كروسكال واليس (في اتجاه واحد ANOVA امتثابت) لتحليل فروق ذات دلالة إحصائية بين السقالات متباينة، ومع سقالة التحكم (* ف <0.05).
6. تحليل النسيجي
- شطف السقالات cellularized أو المجاميع مع معقم 1 × PBS، اصلاحها في 10٪ من محلول الفورمالين لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وشطف مع 1 × PBS.
- إزالة PBS، تضمين العينات في cuttin الأمثلز درجة حرارة مجمع (أكتوبر)، وتجميدها في حمام نظير البنتان مغمورة في النيتروجين السائل. تخزين العينة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. قطع العينات مع ناظم البرد الحصول على cryosections 8 ميكرون وحدات لأو 12 ميكرون لالسقالات cellularized.
- وصمة عار في cryosections مع 0.5٪ طولويدين حل الأزرق لمدة 2 دقيقة ثم يشطف في ماء الصنبور، يذوى مع الإيثانول بنسبة 100٪، وتوضيح باستخدام التولوين، وتركيب الشرائح مع وسيلة متزايدة لالمجهر الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أولا، وحدات يمكن تشكيلها على حدة باستخدام المغناطيس الصغيرة عن طريق إيداع 2.5 × 10 5 الخلايا الجذعية المسمى (الشكل 2A). هذه المجاميع واحدة (~ 0.8 مم في الحجم) ويمكن بعد ذلك أن تنصهر في الهياكل أكبر بفضل متتابعة، والانصهار الناجم مغناطيسيا. على سبيل المثال، في يوم 8 من النضج مكون للغضروف، وضعت المجاميع على اتصال في أزواج لتشكيل الحلل. تم تجميع تواءم في يوم 11 عن طريق دمج 2 الحلل. وأخيرا، في يوم 15، وتنصهر 4 تواءم لتشكيل بناء 3D تحتوي على 16 من المجاميع شكلت في البداية، مع ما مجموعه 4 × 10 6 خلايا (~ 4 مم في الحجم) (الشكل 2B). ثانيا، تم استخدام نفس الأسلوب الجذب المغناطيسي لتشكيل المجاميع خلية داخل السقالات. وكانت المصنفة السقالات على الجهاز المغناطيسي وأظهرت مكثف كثافة الخلايا داخل مسام سقالة، في مواقع المغناطيس الصغيرة الدقيقة (الشكل 2C). على النقيض من ذلك، عندما كان المصنف الخلايا داخل سقالة دون الجذب المغناطيسي (البذر السلبي)، وجدت فيها ليتم توزيعها بالتساوي. ثم تم إدخال السقالات Cellularized في أقفاص (الشكل 3A) تعلق على غرفة مفاعل حيوي لتنفيذ عملية المولدة للغضروف في ظل ظروف نضوج الحيوي (الشكل 3B). هذا مفاعل حيوي يحسن تبادل المواد الغذائية والغاز ويوفر التحفيز الميكانيكي بواسطة تنبيغ. تم تعديل سرعة دوران كل من الذراع وغرفة ل5 دورة في الدقيقة، على النحو الموصى به من قبل منشئ لينة تجديد الأنسجة 3D. تم تعيين مضخة تحوي الذي يوفر امدادات مستمرة من المتوسط في 10 دورة في الدقيقة.
لجميع شروط منظمة الخلية (المجاميع تنصهر والبذر في السقالات) ونضوج الأنسجة (داخل أو بدون مفاعل حيوي)، تم تحليل التعبير الجيني في يوم 25. وأظهرت الأنسجة التي شكلتها الاندماج المغناطيسي وجوهريزيادة ficant في الكولاجين II التعبير مقارنة بيليه الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي (الشكل 4A)، جنبا إلى جنب مع الاتجاه المتزايد نحو التعبير aggrecan. لالسقالات cellularized، حصلنا على زيادة في aggrecan والكولاجين II-II عندما تم استخدام تعبير عن كبير لالكولاجين البذر المغناطيسي، بالمقارنة مع السقالات المصنفة دون القوى المغناطيسية. وبالإضافة إلى ذلك، كان التعبير عن كل من الجينات أعلى بكثير (هام للالعقيد II) عندما تم الجمع بين البذر المغناطيسي مع التفريق الحيوي (الشكل 4B).
أجريت التحاليل النسيجية أيضا، على سبيل المثال باستخدام صمة عار الزرقاء طولويدين للكشف عن الجليكوسامينوجليكان (GAG). الانصهار المغناطيسي متتابعة من 16 المجاميع عرضت ترسب وفيرة من GAG، كما تجلى من خلال اللون الأزرق الأرجواني (الشكل 5A). لالسقالات، فقط تلك المصنفة مغناطيسيا كانت ملطخة طولويدين الأزرق. conten الكمامةتي كان اعلى عندما كانت متباينة السقالات في مفاعل حيوي (الشكل 5B) بدلا من ثابت (الشكل 5C). أخذت معا، وتظهر هذه النتائج إمكانات تجميع المغناطيسي والبذر المغناطيسي داخل السقالات لتعزيز تكون الغضروف. كما يشير إلى أن الظروف نضوج دينامية داخل مفاعل حيوي هي أفضل بكثير للتمايز كفاءة.
الشكل 1. بناء الأجهزة المغناطيسية. (A) مثال على جهاز مغناطيسي لتشكيل الكلي: تم حفر لوحة الألومنيوم (0.8 ميكرون ثقوب قطرها) وتم إدراج النصائح في كل حفرة ثم وضعت على المغناطيس النيوديميوم الدائم، والذي يكفل مغنطة من التشبع. (B) جهاز المغناطيسي البذور السقالة: البوليستيرين الصلب (24 ملم 2) مع ان 9 فتحات يدوياوضعت على المغناطيس النيوديميوم الدائم، والذي يكفل مغنطة من التشبع. ثم تم إدخال مغناطيس صغير (3 مليمتر في القطر) في كل حفرة لتشكيل الجهاز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. وضع العلامات المغناطيسي للخلايا الجذعية والبذر. (A) الجذعية وصفت الخلايا مع جزيئات أكسيد الحديد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وتم تشكيل (B) الأجسام الشبه الكروية من الخلايا المسمى تجذبهم شبكة من 16 المغناطيس الصغيرة. تم دمج المجاميع إلى تواءم في يوم 11 من الانصهار من الحلل شكلت قبل 3 أيام. ثم تم تنصهر تواءم في يوم 15 لبناء الأنسجة المهندسة النهائية. وكان المصنف (C) سقالة، توضع في طبق زجاج القاع، مع أو معالقوى المغناطيسية خارج. في يوم 4، لوحظت بقع من الخلايا الجذعية المتراصة في سقالة المصنفة مغناطيسيا، في حين أن خلايا بدا موزعة بشكل متجانس في سقالة المصنف دون المغناطيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. نضوج الحيوي السقالات cellularized. (A) بعد البذر المغناطيسي أو الضمني، وضعت السقالات cellularized في أقفاص لتجنب انقطاع. (B) أقفاص، الثابتة باستخدام الإبر من الغطاء وضعت، في الإناء من مفاعل حيوي مليئة المتوسطة المولدة للغضروف. مفاعل حيوي تطبيق دوران ذو محورين مع سرعة التحكم بشكل مستقل (1-12 دورة في الدقيقة و 1-35 دورة في الدقيقة للذراع والغرفة، على التوالي). مضخة تحوي تقديمها بشكل مستمر ميديأم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
(A) وأظهر الشكل 4. التعبير عن الجينات المولدة للغضروف محددة في يوم 25. والانصهار الناجم مغناطيسيا من الكروية MSC زيادة كبيرة في الكولاجين II مقارنة بيليه شكلت بواسطة الطرد المركزي. * يدل على الفرق الإحصائي باستخدام اختبار (ت) للطالب (ع القيمة <0.05). (B) التعبير عن aggrecan والكولاجين II وزادت بشكل واضح في السقالات متباينة مع مزيج من البذر المغناطيسي ونضوج الحيوي في مفاعل حيوي. كان التعبير الجيني تطبيع لRPLP0 مرنا وأعرب في وحدات التعسفي نسبة إلى السيطرة (~ 1 ± SEM). وتعرض النتائج على النحو يعني ± SEM من 2-4 تجارب مستقلة. * DENOTES فرقا إحصائيا باستخدام اختبار كروسكال واليس (في اتجاه واحد ANOVA اختبار اللامعلمية) (ص القيمة <0.05). (-): البذر دون المغناطيس. (+): البذر مع القوى المغناطيسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. النسيجية تلطيخ الجليكوسامينوجليكان في يوم ويدل 25. جلايكان (GAG) الودائع بنسبة تلوين الأزرق الأرجواني. (A) لوحظ وصمة عار الزرقاء طولويدين إيجابي في cryosections 8 ميكرون من هيكل غضروفي النهائي تم الحصول عليها من الانصهار متتابعة من 16 الركام. أظهر cryosections 12 ميكرون السقالات المصنف مغناطيسيا بعد ثابت (B) أو الظروف الديناميكية (C) بشكل واضحكان هذا المحتوى GAG العالي في السقالات متباينة في مفاعل حيوي. تشير الأسهم مجاميع من الخلايا المتمايزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أولا، لأن التقنيات المعروضة هنا تعتمد على استيعاب النانوية المغناطيسية، وقضية واحدة مهمة هي نتائج النانوية بمجرد توطين داخل الخلايا. صحيح أن جزيئات الحديد قد يؤدي السمية المحتملة أو ضعف القدرة على التمايز اعتمادا على حجمها، والطلاء، ووقت التعرض 19 و 22. ومع ذلك، فقد أظهرت العديد من الدراسات أي تأثير على وظائف الخلية عندما تم استخدام الجسيمات النانوية الحديد مغلفة 23 في شكل magnetoferritin، وهي جسيمات نانوية مغناطيسية بيولوجية 24، أو استخدمت مع طلاء سترات بسيطة وتركيزات كافية 18. وبالإضافة إلى ذلك، عندما استخدمت جزيئات أكسيد الحديد في ظروف مماثلة لتلك التي وصفها في هذه الورقة (مع MSC ولتكون الغضروف)، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن التدهور السريع والكامل تقريبا من nanopartiيحدث CLES داخل الإندوسومات في حوالي 10 يوما عند التأسيس الخلوي وتكوين كروي MSC. ومن المثير للاهتمام، وارتبط هذا التدهور الهائل مع التخزين الفعال للحديد مجانا داخل البروتين فيريتين وأدى إلى تأثير محدود جدا على استقلاب الحديد الخلوي مما لا يبشر بالخير بالنسبة التطبيقات السريرية في المستقبل 25.
نقطة حرجة أخرى هي شرط من الضغط خلية لبدء تكون الغضروف. عادة، يتم تحقيق التكثيف من الخلايا من خلال الطرد المركزي. ومع ذلك، يقتصر هذا الأسلوب من قبل عدد قليل من خلايا (لا يزيد عن 2.5 × 10 5 الخلايا). بعد هذا العدد، والمواد الغذائية والغاز لا يمكن منتشر إلى وسط الركام واثار نخر الخلية. هنا، والتكثيف المغناطيسي للخلايا الجذعية وصفت في المجاميع يبدو كوسيلة هامة لتشكيل 3D يبني لتجديد أنسجة الغضروف. وقد استخدم هذا الإجراء المغناطيسي من قبل مؤلفين آخرين لبناء الأجسام الشبه الكروية 3D: من خلال المغنطيسى مع المغناطيس ضعها على الجزء العلوي من لوحة بعد تفكك خلايا 23 أو مع دبابيس الحديد في توطين المجال المغناطيسي 26. ومع ذلك، لا يظهر المغنطيسى لتكون مناسبة لمراحل مزيد من الانصهار الكلي. على النقيض من ذلك، مع أسلوب المغناطيسي اقترح هنا، يمكننا السيطرة على كل الخطوات الانصهار للحصول على بناء الأنسجة الغضروف خطوة بخطوة. وباختصار، تبدأ هذه العملية متعددة الخطوات مع الحبس من الخلايا الجذعية إلى كتل بناء إجمالية وتبعتها اندماج هذه الكتل إلى كيان أكبر. الخطوات الحاسمة لهذه الجذعية إجراء خلية تجميع خالية من سقالة هي التالية: أولا، لا بد من تشكيل كل مجموع المباراتين مع حجم صغير كما في الخلايا وقت ممكن وثانيا، لا بد من السيطرة على الخطوات الانصهار لتجنب تشكيل واحد، كبيرة مجموع. وكانت الأنسجة التي تم الحصول عليها هنا غنية الكولاجين II وaggrecan. وقدمت أيضا الميزهوفاق وجود هندسة مرنة وحجم ومن كونها خالية من سقالة.
تم استخدام نهج المغناطيسي أيضا لتوجيه الخلايا الجذعية داخل السقالات سميكة وكبيرة. بديل آخر للتصميم من مختلف الأشكال والأحجام. الخطوة الحاسمة هنا هي البذور السقالات مع حجم مناسب من الخلايا: لا القليل جدا أن يكون هناك توزيع متجانس العام من الخلايا، ولا أكثر من اللازم لتجنب أي فقدان الخلية. استخدمت القوى المغناطيسية سابقا لاجتذاب واستبقاء الخلايا داخل السقالات وتعزيز خلية البذر 27 و 28. هنا، أدى التكثيف خلية كافية داخل مسام السقالات السكاريد لتكون الغضروف بنجاح. تم تحسين إنتاج المصفوفة خارج الخلية بشكل ملحوظ عندما تعرضوا السقالات cellularized مغناطيسيا لتنبيغ / القص محفزات الإجهاد التي تقدمها بفضل مفاعل حيوي لدورانه ثنائية المحوري. ولقد ثبت في دراسات أخرى أن مولتحسنت ظروف التحميل TI-المحورية نوعية الأنسجة التي تشكلت من غضروفية 29. يعرض هذا المفهوم مفاعل حيوي رواية مكسبا حقيقيا بالمقارنة مع التقنيات الموجودة، حيث تطبق قوات الضغط فقط 30 و 31 و 32.
في الختام، للتمييز بين مكون للغضروف، واستخدام الحبس المغناطيسي للخلايا الجذعية وصفت لتشكيل والتلاعب المجاميع وكذلك البذور السقالات يسمح لإنشاء الحجم ملليمتر الغضروف البنى الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، والجمع بين البذر خلية المغناطيسي مع التمايز ديناميكي يوفر أداة جديدة قيمة لتطبيقات الطب التجديدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف QuinXell تقنيات وCellD، ولا سيما لوثار غرانيمان ودومينيك غزلان لمساعدتهم في مفاعل حيوي. نشكر كاثرين لو سيماء، الذين قدموا لنا مع بولولان / السقالات السكاريد ديكستران. وأيد هذا العمل من قبل الاتحاد الأوروبي (مشروع ERC-2014-الترس ماتيس 648779) والتي AgenceNationalede للبحوث (ANR)، فرنسا (مشروع MagStem ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
