Summary
Udvidelse af humane pædiatriske øsofageale epitelceller anvender betinget omprogrammering giver undersøgere med en patient-specifik population af celler, der kan anvendes til manipulering esophageal konstruktioner til autolog implantation til behandling defekter eller skade og tjene som et reservoir til terapeutiske screeningsassays.
Introduction
Esophageal tissue engineering og eosinofil esophagitis (EoE) har været i fokus for forskning i mange laboratorier i det seneste årti. Medfødte defekter, såsom esophageal atresia, ses hos ca. 1 i 4000 levendefødte, hvilket resulterer i ufuldstændig udvikling af spiserøret fører til manglende evne til at spise 1. Forekomsten og udbredelsen af EoE har været stigende lige siden identifikation af sygdommen enhed i 1993. Forekomsten af EoE varierede fra 0,7 til 10 / 100.000 per person-år, og forekomsten varierede fra 0,2 til 43 / 100.000 2. En ny attraktiv kirurgisk tilgang til behandling af dyb kløft esophageal atresia består i at generere vævskonstruktioner til implantation udnytte patientens egne celler. Disse celler sammen med syntetisk stillads vil generere et autologt konstrukt, der ikke kræver immunsuppression. Nogle grupper er allerede begyndt at undersøge ose af stamceller-lignende celler til esophageal vævsmanipulering 3 samt anvendelse af native øsofageale epitelceller at genbefolke slimhinden 4 - 7. Sygdomme, som er til stede i spiserøret af pædiatriske patienter er ofte svære at diagnosticere eller studere uden indgriben. Desuden udnytter dyremodeller eller in vitro udødeliggjort cellelinje modeller for pædiatriske sygdomme som EoE omfatter ikke den præcise sygdom patogenese eller patientspecifikke 8 forskelle. Derfor, evnen til at studere en patients sygdom proces in vitro med henblik på at identificere specifikke sygdomstilstande udløser antigener, evaluere underliggende mekanismer og undersøge lægemiddelbehandlinger ville være hidtil ukendte og give klinikere med oplysninger, der kan støtte i patientbehandlingen.
Der har været mange autologe eller patientspecifikke celletyper, der er blevet foreslået til anvendelse i tissue teknik og forskning i menneskers sygdomme patogenese. Imidlertid har nogle af disse celletyper er begrænset i deres evne til at generere nok celler af en specifik fænotype til frø et stort stillads eller udføre high throughput in vitro-undersøgelser. Anvendelsen af pluripotente eller multipotente stamceller har været emnet for megen forskning diskussion imidlertid begrænsninger og mangler til anvendelse af disse celler er blevet godt beskrevet 9. Brugen af humane embryonale stamceller er meget omdiskuteret og præsenterer mange etiske spørgsmål. Vigtigst er disse celler danner teratomer, som svarer til en tumor, hvis de ikke skelnes fra deres pluripotent tilstand før leverer dem ind i en levende vært 10. Endvidere ville anvendelse af embryonale stamceller ikke være patient-specifikke og kan fremkalde en allogen reaktion og behovet for immunsuppression 10. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er pluripotente celler, der kanvære afledt af en patientens egne celler. Somatiske celler, såsom hudceller, kan induceres til en pluripotent tilstand under anvendelse af en række integrative og ikke-integrative teknikker. Disse celler så tjene som en patient-specifikke celle kilder til tissue engineering eller sygdom undersøgelse. Integrationen af uønsket genetisk materiale i disse celler er en bekymring mange har beskrevet og selv hvis sekvenser er fuldstændigt fjernet iPSCs synes at bevare en epigenetisk "hukommelse" mod celletype, hvorfra de blev afledt 11. Disse celler vil også danne teratomer in vivo hvis ikke differentieres før transplantation 11. Mange differentieringsfaktorer protokoller er blevet undersøgt med fokus på epiteliale slægter 12, 13, 14, er det imidlertid meget vigtigt at bemærke, at de celletyper, der følger i slutningen af differentiering ikke homogene og oun besidder en brøkdel af celletypen af interesse. Dette resulterer i lavt udbytte og behovet for at oprense den ønskede celletype. Selvom iPSCs er en potentiel patient-specifikke cellekilde, at processen opnå en celletype af interesse for enten vævskonstruktion eller sygdom undersøgelse er meget ineffektiv.
Humane epitelceller med succes er blevet isoleret fra en række både syge og ikke sygdomsangrebne væv i den menneskelige krop, herunder: lunge 15, bryst 16, tyndtarm 17, colon 18, blære 19 og spiserøret 20. Det er vigtigt at bemærke, at humane primære celler har et endeligt antal passager, hvor fænotypen opretholdes 21, 22. Det betyder desværre, at antallet af celler er nødvendige for sygdom undersøgelse eller til såning en manipuleret stilladstil implantation kan ikke opnås. Derfor er der behov nye teknikker til at udvide patientens celler og samtidig bibeholde en epitelial fænotype. Betinget omprogrammering af normale og kræft epitelceller udnytte feeder celler og ROCK inhibitor blev beskrevet i 2012 af Liu et al. 2 3. Denne teknik blev anvendt til at udvide cancerøse epitelceller opnået fra biopsier af prostata og brystkræft ved hjælp bestrålede feeder-celler, ROCK inhibitor og betinget omprogrammering medium. Målet var at generere nok celler til in vitro-assays, såsom screening narkotika. Denne teknik er i stand til at udvide epitelceller ubestemt tid med "omprogrammering" disse celler til en stam- eller progenitor-lignende tilstand, som er meget proliferativ. Det er blevet påvist, at disse celler er ikke-tumorigene og ikke har evnen til at danne teratomer 23, 24. Endvidere er der ingenkromosomafvigelser eller genetiske manipulationer var til stede efter passage af disse celler i kultur ved hjælp af denne teknik 23, 24. Vigtigst er disse celler kun i stand til at differentiere til den native celletype af interesse. Derfor er denne teknik giver et stort reservoir af patientspecifikke epitelceller for sygdom undersøgelse eller tissue engineering uden behov for immortalisering.
Opnåelse epithelvæv fra et specifikt organ for at studere sygdomsprocesser er ofte begrænsede og ikke altid mulig på grund af patientens risiko. For de patienter, der lider esophageal sygdom eller defekter, endoskopisk biopsi hentning er en minimalt invasiv fremgangsmåde til opnåelse epitelvæv, der kan adskilles og betinget omprogrammeres til at give et ubestemt cellekilde, der er specifik til slimhinden i denne patientens spiserør. Dette tillader derefter for in vitro-undersøgelseraf epitelcellerne at evaluere sygdomsprocesser og en skærm til potentielle lægemidler. En sygdomsproces der i høj grad kunne drage fordel af denne fremgangsmåde er eosinofil oesophagitis som er blevet beskrevet som allergisk sygdom i spiserøret 8. Allergi test samt terapeutiske metoder kan evalueres in vitro ved hjælp af patientens egne epitelceller og disse data kan derefter overført til den behandlende læge til at udvikle individualiserede behandling planer. Teknikken med betingede omprogrammering sammenholdt med opnåelse endoskopiske biopsier fra pædiatriske patienter giver mulighed for at udvide normale øsofageale epitelceller ubestemt tid fra enhver patient. Denne celle kilde kunne derfor gået sammen med naturlige eller syntetiske stilladser til at give en patient-specifikke kirurgisk mulighed for mangler, sygdom eller traumer. Under en ubestemt celle nummer ville hjælpe ingeniør esophageal konstruktioner, der besidder en helt reseededlumen med esophageal epitelceller med henblik på at hjælpe med at fremme regenerering af de resterende celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Esophageal biopsier blev opnået efter informeret samtykke blev opnået fra forældre / værger for de pædiatriske patienter og i overensstemmelse med den institutionelle Review Board (IRB # 13-094).
1. sterilisering af instrumenter og gelatineopløsning
- Autoklave pincet, barberblade og sakse forud for håndtering af væv for at forhindre forurening.
- For at gøre 200 ml 0,1% gelatineopløsning, kombinere 200 ml destilleret vand med 0,2 g gelatine. Autoklave og afkøles før brug.
2. Coating vævsdyrkningsplader
- Ca. 2 timer før celleisolering tilsættes nok 0,1% gelatine at dække en vævsdyrkningsskål (100 mm) og inkuberes ved 37 ° C i en cellekultur inkubator.
BEMÆRK: Disse plader kan også foretages forud for tid og holdt i inkubatoren før brug.
3. Gør Enzyme løsning til Dissociation
- Ca. 30 minutter før celleisolering afvejes10 enheder af dispase på en balance baseret på enheder pr milligram koncentration på hætteglasset. Anbring pulveret i en 15 ml konisk rør med 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) og anbringes i et 37 ° C vandbad.
4. Making Cell Culture Medium
- For at gøre 50 ml betinget omprogrammering medium, bland følgende ingredienser i en steril konisk rør: 35 ml F12 (Hams medium), 11,5 ml DMEM, 0,5 ml L-glutamin, 0,5 ml 100x penicillin / streptomycin, 2,5 ml af føtalt bovint serum (FBS), 250 ug humant insulin, 500 ng af human epidermal vækstfaktor (EGF).
- For at gøre 500 ml 3T3 medium, bland 50 ml FBS, 5 ml 100x penicillin / streptomycin og 5 ml L-glutamin med 500 ml DMEM.
- For at gøre 500 ml keratinocyt serum-frit medium, tø EGF og bovin hypofyse ekstrakt (BPE) kosttilskud (forudsat med medierne). Føj tillæggene til den 500 ml flaske basen medium og tilsæt 5 ml 100x penicillin / streptomycin
5. dyrkning af og bestråle 3T3 celler som en Feeder Source
- Forbered 3T3 medium omfattende DMEM, 10% FBS, 1x penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin.
- Kultur 3T3 celler i væv-behandlede T-75 kolber mindst 3 dage før ankomsten af patientprøver.
- Lige før ankomsten af patientprøver, Trypsinisér 3T3-celler med 5 ml 0,25% trypsin-EDTA pr kolbe og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter, eller indtil de fleste celler er flydende
- Der tilsættes 5 ml 3T3 medium for at stoppe reaktionen. Aspirer cellesuspensionen og overføres til en 15 ml konisk rør. Spin i 5 minutter ved 300 x g.
- Aspirer mediet og resuspender cellerne i et defineret volumen af Trypan blå for celletælling. Kombiner 10 pi celler med 10 pi Trypan blå at udelukke døde celler. Belastning 10 pi af denne opløsning på et hæmocytometer til celletælling.
BEMÆRK: For denne protocol, udsåningstæthed for bestrålede 3T3 celler er 10.900 celler pr cm 2, som er lig med 600.000 celler pr 100 mm plade. - Alikvot antallet af celler, der er nødvendige til pladen en 100 mm plade pr patientprøve og resuspender i 25 ml 3T3 medium i en 50 ml konisk rør og bestråle med 3000 rad.
- Efter bestråling, spin-celler ned i 5 minutter ved 300 xg og resuspender i betinget omprogrammering medium på 5 ml pr 100 mm plade.
- Sæt røret til side, indtil klædningen af patientens celler sker senere i protokollen (se trin 7.6).
6. Indhentning, bevare og transport pædiatriske Esophageal Biopsier
- Tilsæt 5 ml komplet keratinocyt serum-frit medium med 100 ug / ml primocin til 15 ml koniske rør og bringe det til den medicinske facilitet på is.
BEMÆRK: Disse rør medium kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 måneder. - Opnå ca. 8 esophageal biopsier på timig om endoskopi og separat som følger:
- Placer seks biopsier i 15 ml koniske med fuldstændige keratinocyt serum gratis medium med 100 ug / ml primocin og sted på våd is.
- Placer en biopsi i 5 ml bufferet formalin og sted på våd is.
- Placer en biopsi i en lille biopsi kryoformen med optimal skære temperatur sammensatte.
- drop straks denne støbeform i et bægerglas isopentan anbragt i flydende nitrogen. Når frosne, placere kryoformen i en prøve pose og opbevar på tøris i en polystyren skum container.
- Placer rørene indeholder biopsier i medium eller formalin i en forsegles pose og derefter ind i en forsendelseskasse indeholder våd is. Seal og mærke boksen med en biohazard etiket og transportere det til laboratoriet.
BEMÆRK: Beholderen, der indeholder den tøris og frosne biopsi også forseglet og mærket med et biologisk farlige etiket.
7. BehandlingPatient Tissue for Downstream Kultur og analyse
- Ved ankomsten til laboratoriet, overføre den frosne biopsi på tøris til -80 ° C fryser for downstream sektionering eller RNA ekstraktion. Prøven anbringes i formalin. Opbevar i et 4 ° C køleskab og lad det løse natten over.
- Spin de resterende biopsier ned ved 300 xg, og suge mediet. Tilsæt 10 ml dispase opløsning til konisk rør, stempel og tillader den at inkubere ved 37 ° C i et vandbad i 15 minutter.
- Efter inkuberingen spin biopsier ned ved 300 x g. Aspirere på mellemlang og resuspender biopsier i 5 ml 0,05% trypsin-EDTA.
- Overfør 5 ml trypsin-EDTA indeholdende biopsier til en 100 mm steril plade og mos biopsier op over 2 steriliserede barberblade så fint som muligt.
- Overfør 5 ml trypsin-EDTA indeholdende hakket biopsier til en ny 15 ml konisk. Skyl pladen to gange med yderligere 5 ml 0,05% trypsin-EDTA og tilføje til den koniskerør. Inkubér røret i 10 minutter i et 37 ° C vandbad.
- Efter inkuberingen spin biopsier ned ved 300 xg (1,4 rpm) i 5 min og aspireres mediet. Tilsæt 5 ml betinget omprogrammering medium til koniske rør samt 5 ml betinget omprogrammering medium, der indeholder de bestrålede feeder-celler (se trin 5.7).
- Tilføj ROCK inhibitor (1 pi / ml) til 10 ml cellesuspension og plade efter opsugning gelatinen fra vævskulturskål. Der inkuberes ved 37 ° C.
8. Dyrkning og ekspanderende celler
- Efter ca. 5 dages dyrkning, aspireres det oprindelige medium indeholdende det hakkede-biopsi stykker og skyl skålen 2-3 gange med 5 ml sterilt PBS. Tilføj nye medie til pladen herunder ROCK inhibitor ved 10 uM.
- Efter at have nået 70% sammenflydning, udvide cellerne. Tilsæt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA til pladen og inkuber i et 37 ° C inkubator ikke mere end 2,5 min til fjernelse af the feederceller. Efter denne inkubering aspireres trypsin-EDTA og skyl pladen med 5 ml PBS.
- Aspirer PBS, og der tilsættes 5 ml 0,25% trypsin-EDTA til pladen og inkuberes i 5-10 min eller indtil cellerne er løse fra pladen. Tilføj lige store mængder medium til pladen for at standse reaktionen og overføre alle fluidet til et 50 mL konisk rør og spin ned ved 300 x g i 5 min.
- Resuspender celler i et defineret volumen af betinget omprogrammering medium og blandes 10 pi af suspensionen med 10 pi trypanblåt. Regn med en hæmocytometer at bestemme totale antal celler.
- At udvide celler, tilsættes 1 million humane øsofageale celler til en 150 mm plade sammen med 1,2 millioner bestrålede 3T3-celler i et totalt volumen på 15 ml. Tilføj frisk ROCK inhibitor på 10 uM og tilføj cellesuspensionen til en gelatineovertrukket 150 mm skål.
9. Freeze og Store Menneskelig Esophageal epitelceller
- For at gøre frysning medium, tilsættes 10%DMSO til betinget omprogrammering medium. Efter trypsinbehandling og optælling, udportionerer cellerne til at fryse i en ny 50 ml konisk rør og spin ned ved 300 xg i 5 min.
- Aspirer medium og tilsæt frysemedium ved et volumen på 2 ml pr cryovial. Når cellesuspensionen er homogen, aliquot 10 6 celler i pre-mærkede cyrovials. Sted i en frysning beholder ved -80 ° C i mindst 24 timer forud for at flytte hætteglassene til langsigtet lagring i flydende nitrogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et resumé af de vigtigste skridt i at isolere esophageal epitelceller fra patient biopsier er opsummeret i figur 1. Kolonier af epitelceller vil dannes i ca. 4-5 dage og vil være omgivet af fibroblast fødeceller (figur 2A). Da disse kolonier udvide de vil fusionere med andre kolonier at danne større kolonier (figur 2B). Når kulturerne er blevet 70% sammenflydende, de skal udvides (figur 2C). For at sikre at fibroblaster fjernet fra pladen før fjernelse epitelcellerne, er 0,05% trypsin-EDTA anvendes i op til 2,5 minutter til fjernelse automaterne. Fraværet af foderautomater skal ligne figur 2D. De adhærerende epitelceller derefter trypsinbehandlet med 0,25% trypsin-EDTA og udpladet igen på nye bestrålede feeder celler (figur 2E).
(figur 3A ). Disse celler blev også analyseret ved passage 1 for epitel markører via flowcytometri og mere end 90% af de tilstedeværende celler fra tre patienter var positive for EpCAM (figur 3B). Celler blev også analyseret via immunofluorescens ved passagerne 1 og 3 at sikre fænotypen på disse 3 passager blev ikke ændrer sig. Farvningen demonstrerer de vedvarende epithelial markør E-cadherin (figur 4A-D), stamfader markør P63 (Figur 4E-H), proliferationsmarkør KI-67 (Figur 4I-L) og epithelial tight junction-protein TJP1 (Figur 4M-P ).
Endelig blev en vækstkurve afbildet under anvendelse af en cellelinje fra et ikke-syg patient at evaluere fordoblingstiden af disse celler i betinget omprogrammering kultur. Celler blev udpladet med 100.000 celler på dag 0 og blev fundet at være lige lidt over 500.000 celler på dag 4 (figur 5). Fordoblingstiden blev beregnet til at være ca. 36-40 timer. Det forventes, at syge celler vil have en langsommere fordoblingstid, dog bør alle patienter vurderes særskilt at tage højde for individuelle forskelle.
1 ">
Figur 1: Oversigt over Isolering og dyrkning Menneskelig Esophageal epitelceller fra Pediatric Biopsier. Biopsier opnået fra pædiatriske patienter efter informeret samtykke og transporteret i keratinocyt serumfrit medium til laboratoriet. Disse biopsier derpå behandlet med 1 U / ml dispase, efterfulgt af hakning af vævet med sterile barberblade og endelig behandling med 0,05% trypsin-EDTA. Cellesuspensionen tilsættes derefter til bestrålede fødeceller i betinget omprogrammering medium. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dyrkning og udvidelse Humant Esophageal epitelceller. Efter 5 dage i betinget omprogrammereming medium, esophageal epitelceller begynder at danne små brosten kolonier (A), som til sidst konvergerer til dannelse af større kolonier (B). Når vævskulturskål når 70% konfluens (C) er pladerne behandlet for en meget kort tid med 0,05% trypsin-EDTA for at fjerne feeder celler, og samtidig bibeholde vedhæftningen af epitelceller (D). Epitelcellerne fjernes derpå med 0,25% trypsin-EDTA og udpladet igen med nye fødeceller. Blot 24 timer efter at opdele disse celler, de vil danne nye kolonier og fortsætte med at formere sig (E). Forstørrelse er 100X. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flow cytometri og QRT-PCR Analyse Celler Udvidet i Kultur. (A) repræsentant genekspression af celler i kulturen ved passage 1 af betinget omprogrammering demonstrerede en 6 fold stigning i P63-ekspression, en markør for progenitorceller såvel som et fald i epiteliale markører CDH1 og TJP1 sammenlignet med biopsi genekspression. Dette indikerer cellepopulationen er i en mere progenitor-lignende tilstand og derfor er mere stærkt proliferativ. Genekspression 24 timer efter omprogrammering (efter fjernelsen af feeder-celler og ROCK Inhibitor) demonstrerer øget CDH1 og TJP1 udtryk, men et fald i P63 udtryk. (B) Flowcytometrianalyse af celler fra flere patienter opnået ved passage 1 viser større end 90% af cellerne, der udtrykker EpCam. Patient 27 betegner ikke-EOE patientens celler, mens patienterne 26 og 28 er EOE patientens celler. Klik her to se en større version af dette tal.
Figur 4: immunfluorescensfarvning af celler ved Passages 1 og 3. Celler dyrket i betinget omprogrammering medium med bestrålede feeder celler udtrykker E-cadherin (A - D) samt progenitor markør P63 (E - H). Disse celler er stadig proliferative ved passage 3 (I - L). Endelig disse celler udtrykker tight junction-protein 1 (TJP1), hvilket også er i overensstemmelse med en epitelial fænotype (M - P). Kerner modfarvet med DAPI (blå) og påvises antistoffer ved anvendelse af en Alexa Fluor 546-antistof (orange). 2. Antistof (Ab) kontrol repræsenterer ikke-specifik binding af det sekundære antistof til vævet (Q, R). Scale barer = 50um. Forstørrelse er 200X. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Vækst Curve Celler i Betinget Omprogrammering. Celler i betinget omprogrammering medium fra en ikke-syg patient blev podet i en defineret tæthed og replikater af tre blev talt hver dag i 4 dage. Vækstkurven blev genereret ved anvendelse af disse celletal og fordoblingstid blev beregnet på basis af antallet opnået på dag 4 og dag 0. fordoblingstid på disse celler er ca. 36-40 timer. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vigtigste skridt for at isolere og udvide esophageal epitelceller fra patient biopsier er: 1) i tilstrækkelig grad at dissociere biopsi væv med minimal celledød; 2) at sikre ROCK inhibitor sættes til cellekulturmediet ved hver udskiftning af mediet; 3) Brug ikke flere feeder celler end anbefalet; 4) opretholde en ren aseptisk kultur; og 5) passage celler lige før nå sammenløb.
På grund af de patientrelaterede forskelle i biopsiprøver opnået for betinget omprogrammering, er det rimeligt at forvente forskelle i vækst kinetik, fænotype og evne til at udvide til flere passager. Typisk 4 esophageal biopsier opnået fra hver patient til celleisolering. Når dissocieret, vi netto ca. 300,000-600,000 celler på dag 0. Dette udvider til over 10 millioner celler ved passage 3 i gennemsnit. Morfologi af kolonier, der danner skal ligne brosten morfologi beskrevet for epitelial cellelinjer <sup class = "xref"> 25 (figur 2). En prøve af celler i kultur bør analyseres via QRT-PCR, flowcytometri og immunofluorescens for epithelceller markører for at sikre populationerne ekspanderende faktisk epithelial oprindelse (figur 3). Bør cellerne ikke udtrykker epiteliale markører (E-cadherin EpCAM, TJP1), bør cellelinjen afsluttes og kasseres. Det forventes, at mere end 90% af de tilstedeværende celler er EpCAM positive hvis de epitel oprindelse. For at vurdere, om kulturerne ændrer fænotype eller tabe epitel ekspression, immunfluorescens eller flowcytometri bør anvendes til at evaluere epiteliale markører (E-cadherin), stamfader ekspression (P63), og epiteliale tight junction proteiner (TJP1). Efterhånden som cellerne passeres det forventes, at fænotypen ikke bør ændre, bør proliferation ikke falde, og disse celler skal vise epithelial ekspression samt progenitor ekspression (figur 4 (figur 5). Celler, der findes ikke at fordoble i mere end 5 dage vil sandsynligvis være senescent og bør kasseres.
Det er blevet beskrevet, at celler isoleret fra patienter med inflammatoriske processer til stede, såsom EoE, besidder epitelceller, der har en reduceret proliferativ hastighed, nedsat E-cadherin ekspression (figur 3, Patienter 26 og 28) og en høj grad af apoptose 26. Derfor er det ikke urimeligt at have svært dyrkning af celler fra en alvorligt syg patient ved hjælp af denne metode. Det er muligt, at cellerne kun kan modstå et par passager eller bare indledende passage. Dette bør stadig give investigator med et større antal celler end oprindeligt isoleret. Dog kan dette tal ikke være hensigtsmæssigefor alle foreslåede undersøgelser. Da disse celler bliver brugt til i sidste ende at studere esophageal sygdom eller konstruere en esophageal udskiftning, er det vigtigt at huske disse celler er kun ansvarlig for mucosal regenerering. Andre celletyper, såsom fibroblaster, neuroner, glatte muskelceller og blodkar er også lige så vigtigt at studiet af esophageal sygdom og til vævsdyrkningsapplikationer.
Denne teknik giver en patient-specifik celle kilde, som er et uvurderligt værktøj til at studere sygdommen patogenese samt tjener som en potentiel reservoir af patient-specifikke celler til esophageal væv tekniske applikationer. Celler anvendes til såning biomaterialer til kirurgisk implantation skal være fri for genetiske abnormiteter, virale sekvenser og ikke danner teratomer. Anvendelsen af stamceller (multipotente eller pluripotente) genererer for mange uønskede celletyper efter differentiering, hvoraf nogle kan danne teratomer, hvis de ikke har undergået differentiation. Desuden denne celle kilde fænotype er konsistent og kræver ikke oprensning eller fjernelse af uønskede celler. Den ideelle cellekilde vil være celler, der findes i den samme anatomiske placering, der bliver manipuleret. Ved denne metode disse esophageal epitelceller bliver brugt til at genbefolke slimhinde en esophageal stillads. er behov for yderligere celletyper for esophageal regenerering; var imidlertid i fokus i denne teknik for at sikre slimhinden blev reseeded og ikke ufuldstændig, da dette kan føre til lækage, striktur og perforering.
Ud over at udnytte disse celler til mekanik nye kirurgiske muligheder for spiserøret, kan disse celler også anvendes til at studere esophageal sygdomsprocesser samt skærmen for nye terapeutiske metoder til behandling af disse tilstande. Eosinofil esophagitis (EoE) er beskrevet som en allergisk sygdom i spiserøret, med den nøjagtige mekanisme og patogenese endnu ikke fuldt beskrevet. Aktuel behandling regiments omfatter elimination kostvaner, orale steroider og flere endoskopier. Ingen assay eksisterer for at vurdere, hvad der udløser den inflammatoriske proces for hver patient, som fører læger til at bruge en "gæt og marker" tilgang, som er lang og ofte frustrerende for patienten. Da denne metode til patient-specifik celle ekspansion ikke udnytter lentiviral transduktion eller genetisk modifikation, muligheden for permanente ændringer genotypen af cellerne fra omprogrammering proces er minimal. Det betyder, at cellerne teoretisk forbliver uændret i forhold til in vivo-miljø. Evnen til at teste patientens celler in vitro for at identificere den udløsende middel ville være nye og i sidste ende kan føre til udvikling af nye diagnostiske eller terapeutiske midler til disse pædiatriske patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
