Summary
Uitbreiding van menselijke kinderen oesofageale epitheelcellen gebruikmaking voorwaardelijke herprogrammering biedt onderzoekers met een patiënt-specifieke populatie van cellen die kunnen worden gebruikt voor de engineering oesofageale constructen autologe implantatie defecten of letsel behandelen en dienen als een reservoir voor therapeutische screeningstesten.
Introduction
Slokdarmkanker tissue engineering en eosinofiele esophagitis (EoE) hebben de focus van het onderzoek in veel laboratoria de afgelopen tien jaar geweest. Aangeboren afwijkingen, zoals slokdarmatresie worden waargenomen bij ongeveer 1 op 4000 levendgeborenen, waardoor de onvolledige ontwikkeling van de slokdarm leidt tot het onvermogen om te eten 1. De incidentie en prevalentie van EoE hebben op de stijging sinds de identificatie van de ziekte entiteit 1993. De incidentie van EoE varieerde 0,7-10 / 100.000 per jaar en de prevalentie varieerde 0,2-43 / 100.000 2 geweest. Een aantrekkelijke nieuwe chirurgische benadering van de behandeling lange periode slokdarmatresie bestaat uit het genereren van weefselconstructen voor implantatie gebruikmaking eigen cellen van de patiënt. Deze cellen samen met synthetische steigers zullen autologe construct die geen immunosuppressie vereist genereren. Sommige groepen zijn al begonnen met het ons te onderzoekene van stamcellen-achtige cellen slokdarm weefselmanipulatie 3 en het gebruik van natieve slokdarm epitheelcellen aan het slijmvlies herbevolking 4-7. Ziekten die in de slokdarm van pediatrische patiënten zijn vaak moeilijk te diagnosticeren of te bestuderen zonder tussenkomst. Bovendien, met behulp van diermodellen of in vitro onsterfelijk gemaakte cellijn modellen voor pediatrische ziekten zoals EoE omvatten niet de exacte pathogenese van de ziekte of de patiënt specifieke 8 verschillen. Daarom is de mogelijkheid om ziekteproces een patiënt in vitro bestuderen teneinde specifieke ziekte triggering antigenen te identificeren, evalueren en onderliggende mechanismen te onderzoeken drugbehandelingen nieuw zouden zijn en een clinici informatie die kan helpen bij de behandeling van patiënten.
Er zijn veel autologe of patiënt-specifieke celtypen die voor gebruik in tissu voorgesteld geweeste engineering en de studie van de menselijke ziekte pathogenese. Enkele van deze celtypen zijn beperkt in hun vermogen om voldoende cellen van een specifiek fenotype genereren een grote scaffold zaad of voer high throughput in vitro studies. Het gebruik van pluripotente of multipotente stamcellen is het onderwerp van veel onderzoek gediscussieerd echter beperkingen en tekortkomingen van het gebruik van deze cellen zijn goed beschreven 9. Het gebruik van menselijke embryonale stamcellen is zeer besproken en presenteert een groot aantal ethische kwesties. Belangrijker, deze cellen vormen teratomas, die vergelijkbaar met een tumor, als ze niet worden onderscheiden van hun pluripotente toestand voor het leveren ze in een levende gastheer 10. Bovendien zou het gebruik van embryonale stamcellen patiënt-specifiek en zou een allogene reactie en de noodzaak van immuunsuppressie 10 opwekken. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn pluripotente cellen die kunnenworden afgeleid uit eigen cellen van de patiënt. Somatische cellen, zoals huidcellen, kunnen worden geïnduceerd om een pluripotente toestand met verschillende geïntegreerde als niet-geïntegreerde technieken. Deze cellen dienen dan als een patiënt-specifieke cel bronnen voor tissue engineering of de ziekte van onderzoek. De integratie van ongewenst genetisch materiaal in deze cellen is veel zorg omschreven en zelfs als sequenties volledig verwijderd lijken iPSCs een epigenetische "memory" naar het celtype waaruit ze zijn afgeleid 11 behouden. Deze cellen zullen teratomas vormen in vivo als niet vóór transplantatie 11 gedifferentieerd. Vele differentiatie protocollen zijn onderzocht gericht op epitheliale lijnen 12, 13, 14, echter, is het zeer belangrijk op te merken dat de celtypen verkregen eind differentiatie niet homogeen en only hebben een fractie van het celtype. Dit resulteert in een lage opbrengst en de noodzaak om het gewenste celtype te zuiveren. Hoewel iPSCs zijn een potentiële patiënt-specifieke cel bron, het proces voor het verkrijgen van een celtype van belang zijn voor beide tissue engineering of de ziekte van onderzoek is zeer inefficiënt.
Menselijke epitheelcellen met succes geïsoleerd uit een verscheidenheid aan zowel zieke als niet-zieke weefsels in het menselijk lichaam met inbegrip van: 15 long-, borst- 16, 17 dunne darm, colon 18, blaas 19 en de slokdarm 20. Het is belangrijk op te merken dat de humane primaire cellen een eindig aantal passages waarin het fenotype wordt gehandhaafd 21, 22. Helaas betekent dit dat het aantal cellen nodig zijn voor ziekte onderzoek of zaaien een aangelegde scaffoldvoor implantatie niet wordt verkregen. Daarom zijn nieuwe technieken die nodig zijn om de patiënt cellen uit te breiden, terwijl nog steeds een epitheliale fenotype behoud. Voorwaardelijke herprogrammering van normale en kankercellen epitheelcellen gebruik te maken van feeder-cellen en ROCK-remmer werd in 2012 beschreven door Liu et al. 2 3. Deze techniek werd gebruikt om kankercellen epitheelcellen verkregen uit biopsieën van prostaatkanker en borstkanker gebruikt bestraalde voedingscellen, ROCK inhibitor en voorwaardelijke herprogrammering medium breiden. Het doel was om voldoende cellen voor in vitro assays zoals drugs screenen. Deze techniek kan uitbreiden epitheelcellen onbeperkt door "herprogrammering" deze cellen een stam- of voorouder-achtige toestand, die zeer proliferatieve. Het is aangetoond dat deze cellen niet-tumorigene en hebben het vermogen om teratomas 23, 24 vormen bezitten. Bovendien is er geenchromosomale abnormaliteiten of genetische manipulaties waren aanwezig na passage van deze cellen in kweek deze techniek 23, 24. Belangrijker, deze cellen zijn alleen in staat te differentiëren in de natieve celtype plaats. Daarom biedt deze techniek een groot reservoir van patiënt specifieke epitheelcellen voor ziekte onderzoek of weefselmanipulatie zonder de noodzaak voor immortalisatie.
Verkrijgen epitheelweefsel van een specifiek orgaan om ziekteprocessen bestuderen vaak beperkt is en niet altijd mogelijk vanwege het risico patiënt. Voor die patiënten met oesofageale ziekte of gebreken, endoscopische biopsie retrieval is een minimaal invasieve benadering voor het verkrijgen van epitheelweefsel die kunnen worden gedissocieerd en voorwaardelijk geherprogrammeerd onbepaalde celbron die specifiek is voor het slijmvlies van de slokdarm van die patiënt. Dit zorgt dan voor in vitro studiesvan de epitheelcellen ziekteprocessen en onderzoeken op mogelijke therapeutische evalueren. Een ziekteproces die sterk kunnen profiteren van deze aanpak is eosinofiele oesofagitis, die is beschreven als allergische aandoening van de slokdarm 8. Allergietesten en therapeutische benaderingen kunnen in vitro worden geëvalueerd middels eigen epitheelcellen van de patiënt en deze informatie kan dan binnen de behandelend arts worden doorgegeven geïndividualiseerde behandelingen te ontwikkelen. De techniek van voorwaardelijke herprogrammering in samenhang met het verkrijgen endoscopische biopten van pediatrische patiënten biedt de mogelijkheid om normale slokdarm epitheelcellen onbeperkt uitbreiden van een patiënt. Deze cel bron kan dus samen worden samen met natuurlijke of synthetische steiger aan een patiënt-specifieke chirurgische optie voor gebreken, ziekte of trauma te bieden. Het hebben van een onbepaald aantal cellen zou helpen engineer oesofageale constructies die beschikken over een volledig reseededlumen met oesofageale epitheelcellen om te helpen regenereren van de overblijvende celtypen vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Slokdarm biopten werden verkregen na geïnformeerde toestemming werd verkregen van de ouders / verzorgers van de pediatrische patiënten en in overeenstemming met de institutionele Review Board (IRB # 13-094).
1. steriliseren van instrumenten en gelatine-oplossing
- Autoclaaf tang, scheermesjes en scharen voorafgaand aan de behandeling van weefsel om besmetting te voorkomen.
- Tot 200 ml 0,1% gelatineoplossing te combineren 200 mL gedestilleerd water met 0,2 g gelatine. Autoclaaf en afkoelen voor gebruik.
2. Coating Tissue Culture Plates
- Ongeveer 2 uur voor celisolatie, voeg genoeg 0,1% gelatine een weefselkweekplaat (100 mm) te bedekken en incubeer bij 37 ° C in een celkweek incubator.
Opmerking: Deze platen kunnen van tevoren worden gemaakt en bewaard in de incubator voor gebruik.
3. Het maken Enzymoplossing voor Dissociatie
- Ongeveer 30 minuten voorafgaand aan de cel isolatie, afgewogen10 eenheden van dispase op een saldo op basis van de eenheden per milligram concentratie op de flacon. Plaats het poeder in een 15 ml conische buis met 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en in een 37 ° C waterbad.
4. Maken celkweekmedium
- Tot 50 ml voorwaardelijke herprogrammering medium maken, meng de volgende bestanddelen in een steriele conische buis: 35 ml F12 (Ham's Medium), 11,5 ml DMEM, 0,5 ml L-glutamine, 0,5 ml 100 x penicilline / streptomycine, 2,5 ml foetaal runderserum (FBS), 250 ug humane insuline, 500 ng humane epidermale groeifactor (EGF).
- Om 500 ml medium te 3T3, meng 50 ml FBS, 5 ml 100x penicilline / streptomycine en 5 ml L-glutamine met 500 ml DMEM.
- Tot 500 ml keratinocyt serum vrij medium te ontdooien EGF en runderhypofyse-extract (BPE) supplementen (bij de media). Voeg de aanvullingen op de 500 ml fles basismedium en voeg 5 ml 100x penicilline / streptomycine
5. Het kweken en Bestralen 3T3 cellen als een Feeder Source
- Bereid 3T3, omvattende DMEM, 10% FBS, 1 x penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine.
- Cultuur 3T3-cellen in weefsel behandeld T-75 kolven ten minste 3 dagen voor de aankomst van de patiënt monsters.
- Net voor de komst van patiëntenmonsters, trypsinize 3T3 cellen met gebruik van 5 ml 0,25% trypsine-EDTA per kolf en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten of totdat de meeste cellen drijven
- Voeg 5 ml 3T3 medium om de reactie te stoppen. Zuig de celsuspensie overgebracht in een 15 ml conische buis. Centrifugeren gedurende 5 min bij 300 x g.
- Zuig het medium en resuspendeer de cellen in een bepaald volume van trypan blauw voor celtelling. Combineer 10 pi cellen met 10 pi van trypan blauw om dode cellen te sluiten. Belasting 10 pi van deze oplossing op een hemocytometer voor celtelling.
LET OP: Voor deze protocol, zaaidichtheid voor bestraalde 3T3 cellen 10.900 cellen per cm 2, die gelijk is aan 600.000 cellen per 100 mm plaat. - Aliquot het aantal cellen noodzakelijk om een 100 mm plaat per patiënt monster en resuspendeer plaat in 25 ml 3T3 medium in een 50 ml conische buis en bestralen met 3000 rad.
- Na bestraling, spin-cellen naar beneden voor 5 min bij 300 xg en resuspendeer in voorwaardelijke herprogrammering medium bij 5 ml per 100 mm plaat.
- Zet de buis weg totdat de beplating van de patiënt cellen later plaatsvindt in het protocol (zie stap 7.6).
6. Het verkrijgen, Behoud en vervoeren Pediatric Oesofageale Biopsieën
- Voeg 5 ml compleet keratinocyt serumvrij medium met 100 ug / ml primocin tot 15 ml conische buizen en brengen de medische inrichting op ijs.
Opmerking: Deze buizen drager kan gedurende maximaal 2 maanden worden bewaard bij 4 ° C. - Het verkrijgen van ongeveer 8 oesofageale biopsies op de time van endoscopie en apart als volgt:
- Plaatsvindt zes biopsieën in de 15 ml conische met volledige keratinocyt serum vrij medium met 100 ug / ml primocin en plaats op nat ijs.
- Plaats een biopsie in 5 ml gebufferde formaline en leg ze op nat ijs.
- Plaats een biopsie in een kleine biopsie cryomold met een optimale snij-temperatuur compound.
- Onmiddellijk vallen deze vorm in een beker isopentaan geplaatst in vloeibare stikstof. Eenmaal bevroren, plaats de cryomold in een specimen zak en op te slaan op droog ijs in een piepschuim container.
- Plaats de buisjes met biopten in medium of formaline in een afsluitbare zak en vervolgens in een scheepvaart doos met nat ijs. Seal en het etiket van de doos met een biologisch label en het vervoer naar het laboratorium.
LET OP: De container die het droogijs bevat en bevroren biopsie wordt ook afgesloten en gelabeld met een biologisch label.
7. VerwerkingPatiënt Tissue voor Downstream Cultuur en Analyse
- Bij aankomst in het laboratorium, de overdracht van de bevroren biopsie op droog ijs tot -80 ° C vriezer voor downstream snijden of RNA-extractie. Plaats het monster in formaline. Opslaan in een 4 ° C koelkast en laat 's nachts op te lossen.
- Spin de resterende biopten neer op 300 xg, en zuig het medium. Voeg 10 ml Dispase oplossing van het conische buis, afdichting en laat het incuberen bij 37 ° C in een waterbad gedurende 15 min.
- Na de incubatie, draai de biopten neer op 300 x g. Zuig het medium en resuspendeer biopsieën in 5 ml 0,05% trypsine-EDTA.
- Breng de 5 ml trypsine-EDTA bevattende biopsies een 100 mm steriele plaat en gehakt biopsies middels 2 gesteriliseerde scheermesjes zo fijn mogelijk.
- Breng de 5 ml trypsine-EDTA bevattende gehakt biopsieën in nieuw 15 ml conische. Spoel de plaat tweemaal met 5 ml 0,05% trypsine-EDTA en toevoegen kegelvormigebuis. Incubeer de buis gedurende 10 minuten in een 37 ° C waterbad.
- Na de incubatie, draai de biopten neer op 300 xg (1,4 toeren) voor 5 min en zuig het medium. Voeg 5 ml voorwaardelijke herprogrammering medium de conische buis en de 5 ml voorwaardelijke herprogrammering medium dat het bestraalde voedingscellen (zie stap 5,7).
- Voeg ROCK inhibitor (1 pi / ml) aan de 10 ml celsuspensie en plaat na het opzuigen van de gelatine weefselkweekschaal. Incubeer bij 37 ° C.
8. Het kweken en uitbreiden Cellen
- Na ongeveer 5 dagen kweken zuig het eerste medium dat gehakt biopsie stukjes en spoel de schaal 2-3 maal met 5 ml steriel PBS. Voeg nieuwe medium aan de plaat met inbegrip van ROCK-remmer bij 10 uM.
- Bij het bereiken van 70% confluentie, uitbreiden van de cellen. Voeg 5 ml 0,05% trypsine-EDTA op de plaat en incuberen in een 37 ° C incubator hoogste 2,5 min te verwijderen the voedingscellen. Na deze incubatie zuig het trypsine-EDTA en spoel de plaat met 5 ml PBS.
- Zuig het PBS en voeg 5 ml 0,25% trypsine-EDTA op de plaat en incubeer gedurende 5-10 min of totdat de cellen los van de plaat. Voeg gelijke hoeveelheden van medium aan de plaat om de reactie te stoppen en de overdracht van al het fluïdum naar een 50 mL conische buis en spin neer op 300 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer cellen in een bepaald volume van voorwaardelijke herprogrammering medium en meng 10 pi van de ophanging met 10 pi van trypan blauw. Reken op een hemocytometer totale aantal cellen te bepalen.
- Cellen breiden, voeg 1.000.000 menselijke esophagus cellen een 150 mm plaat met 1,2 miljoen bestraalde 3T3 cellen in een totaal volume van 15 ml. Voeg frisse ROCK-remmer bij 10 pM en voeg de celsuspensie om een gelatine beklede 150 mm schaal.
9. Freeze en Store Human Oesofageale epitheelcellen
- Om bevriezing medium te maken, voeg 10%DMSO voorwaardelijke herprogrammering medium. Na trypsinizing en tellen aliquot cellen te bevriezen in een nieuwe 50 ml conische buis en spin neer op 300 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het medium en voeg vriesmedium met een volume van 2 ml per cryoflesje. Zodra de celsuspensie homogeen, aliquot 10 6 cellen in gelabelde cyrovials. Breng in een houder invriezen bij -80 ° C gedurende ten minste 24 uur voor het verplaatsen van de flesjes voor langetermijnopslag vloeibare stikstof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de belangrijkste stappen bij het isoleren esophageal epitheelcellen van patiënt biopsies wordt samengevat in figuur 1. Kolonies van epitheelcellen wordt gevormd in ongeveer 4-5 dagen en wordt omringd door fibroblast feeder-cellen (Figuur 2A). Aangezien deze kolonies uit te breiden zullen zij fuseren met andere kolonies tot grotere kolonies (figuur 2B) te vormen. Zodra de kweken 70% confluent zijn geworden, moeten ze worden uitgebreid (Figuur 2C). Opdat fibroblasten worden verwijderd uit de plaat voorafgaand aan het verwijderen van de epitheelcellen, wordt 0,05% trypsine-EDTA gebruikt tot 2,5 minuten om de voeders te verwijderen. De afwezigheid van feeders moet gelijk aan figuur 2D-kijken. De hechtende epitheliale cellen worden vervolgens getrypsiniseerd met 0,25% trypsine-EDTA en opnieuw uitgeplaat op nieuwe bestraalde voedingscellen (figuur 2E).
(Figuur 3A ). Deze cellen werden ook geanalyseerd doorgang 1 voor epitheliale merkers via flowcytometrie en meer dan 90% van deze drie patiënten cellen waren positief voor EpCAM (Figuur 3B). Cellen werden geanalyseerd via immunofluorescentie op passages 1 en 3 te zorgen voor fenotype boven die 3 passages niet veranderen. De kleuring toont de persistentie van epitheliale marker E-cadherine (Figuur 4A-D), progenitor marker P63 (Figuur 4E-H), proliferatie merker KI-67 (Figuur 4I-L) en epitheliale tight junction eiwit TJP1 (Figuur 4M-P ).
Tenslotte werd een groeicurve uitgezet met behulp van een cellijn van een niet zieke patiënt de verdubbelingstijd van deze cellen in kweek voorwaardelijke herprogrammering evalueren. Cellen werden uitgeplaat bij 100.000 cellen op dag 0 en bleken net iets meer dan 500.000 cellen op dag 4 (figuur 5) zijn. De verdubbeling van de tijd werd berekend op ongeveer 36-40 h bedragen. Verwacht wordt dat zieke cellen een tragere verdubbelingstijd moet echter zou elke patiënt afzonderlijk worden geëvalueerd om rekening te houden individuele verschillen.
1 ">
Figuur 1: Overzicht van de Isolatie en kweken van menselijke slokdarmkanker epitheelcellen van Pediatric biopten. Biopsies verkregen van pediatrische patiënten na geïnformeerde toestemming en keratinocyt serumvrij medium naar het laboratorium getransporteerd. Deze biopten worden vervolgens behandeld met 1 U / ml dispase, gevolgd door hakken van het weefsel met steriele scheermessen en tenslotte behandelen met 0,05% trypsine-EDTA. De celsuspensie wordt vervolgens toegevoegd aan bestraalde voedingscellen in voorwaardelijke herprogrammering medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het kweken en uitbreiden van Human Esophageal epitheelcellen. Na 5 dagen in voorwaardelijke herprogrammerenming medium, esophageal epitheelcellen beginnen overal geplaveide kolonies (A), die uiteindelijk samen tot grotere kolonies (B) te vormen. Zodra de weefselkweekplaat bereikt 70% confluentie (C), worden de platen behandeld voor een zeer korte tijd met 0,05% trypsine-EDTA op de feeder cellen te verwijderen, terwijl de hechting van epitheelcellen (D) handhaven. De epitheliale cellen worden vervolgens verwijderd met 0,25% trypsine-EDTA en opnieuw uitgeplaat nieuwe voedingscellen. Slechts 24 uur na de splitsing van deze cellen zullen nieuwe kolonies vormen en blijven prolifereren (E). De vergroting bedraagt 100X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: flowcytometrie en qRT-PCR Analyse van cellen in kweek geëxpandeerd. (A) Representatieve genexpressie van cellen in kweek bij passage 1 voorwaardelijke herprogrammering toonde een 6-voudige toename van P63-expressie, een marker van progenitorcellen en een afname van epitheliale merkers CDH1 en TJP1 vergelijking met de biopsie genexpressie. Dit geeft de celpopulatie in een progenitor-achtige toestand en daarom hoger proliferatieve. Genexpressie 24 uur na herprogrammering (na verwijdering van voedingscellen en ROCK Inhibitor) demonstreert verhoogde CDH1 en TJP1 expressie maar een daling van P63-expressie. (B) Flowcytometrie analyse van cellen van verschillende patiënten verkregen bij passage 1 tonen meer dan 90% van de cellen die EpCAM. Patiënt 27 representeert niet- EoE patiënt cellen, terwijl patiënten 26 en 28 zijn EoE patiënt cellen. Klik hier to bekijk een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Immunofluorescentie kleuring van cellen op Passages 1 en 3. Cellen gekweekt in voorwaardelijke herprogrammering medium met bestraalde voedingscellen express E-cadherine (A - D) en voorlopercellen marker P63 (E - H). Deze cellen nog proliferatieve bij passage 3 (I - L). Tenslotte, deze cellen tot expressie tight junction eiwit 1 (TJP1), die overigens in overeenstemming met een epitheliaal fenotype (M - P). Kernen zijn tegengekleurd met DAPI (blauw) en antilichamen worden gedetecteerd met een Alexa Fluor 546 antilichaam (oranje). 2de antilichaam (Ab) controle vertegenwoordigt aspecifieke binding van het tweede antilichaam aan het weefsel (Q, R). Schaalbalken = 50urn. Vergroting is 200X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: groeicurve van Cellen in voorwaardelijke herprogrammeren. Cellen voorwaardelijke herprogrammering medium van een niet zieke patiënt werden gezaaid bij een bepaalde dichtheid en replicaten van drie werden dagelijks geteld gedurende 4 dagen. De groeicurve werd gegenereerd met behulp van deze cellen en verdubbelingstijd werd berekend op basis van het aantal verkregen op dag 4 en dag 0. De verdubbelingstijd van deze cellen is ongeveer 36-40 uur. Fout balken geven de standaard fout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste stappen om te isoleren en vergroten esophageal epitheelcellen van patiënt biopsies zijn: 1) voldoende dissociëren biopsie weefsel met minimale celdood; 2) zorgen ROCK inhibitor wordt toegevoegd aan het celkweekmedium bij elke mediumverversing; 3) Gebruik niet meer feeder-cellen dan aanbevolen; 4) handhaven van een schone aseptische cultuur; en 5) passage cellen vlak voor het bereiken van samenvloeiing.
Door de patiënt verschillen in biopsie monsters verkregen voor voorwaardelijke herprogrammering, is het redelijk om verschillen in groei kinetiek, fenotype en het vermogen om uit te breiden naar meerdere passages verwachten. Typisch worden 4 esophageal biopsieën verkregen van elke patiënt voor celisolatie. Eenmaal los, we netto ongeveer 300,000-600,000 cellen op dag 0. Dit vergroot tot meer dan 10 miljoen cellen door passage 3 op het gemiddelde. Morfologie van kolonies die vorm moet vergelijkbaar zijn met kasseien morfologie beschreven voor epitheliale cellijnen kijken <sup class = "xref"> 25 (figuur 2). Een monster van cellen in kweek te worden geanalyseerd via qRT-PCR, flowcytometrie en immunofluorescentie voor epitheliale merkers te zorgen voor de uitbreidende populatie inderdaad epitheliale oorsprong (figuur 3). Als de cellen niet epitheliale markers (E-cadherine, EpCAM, TJP1) te drukken, moet de cellijn worden beëindigd en weggegooid. Verwacht wordt dat meer dan 90% van de onderhavige cellen EpCAM als zij worden epitheliale oorsprong. Om te evalueren of de kweken veranderen fenotype of verliezen epitheliale expressie, immunofluorescentie of flowcytometrie worden gebruikt om epitheliale merkers (E-cadherine) progenitor expressie (P63) en epitheliale tight junction eiwitten (TJP1) evalueren. Aangezien de cellen gepasseerd wordt verwacht dat fenotype niet verwisselen, moet proliferatie niet verminderen en deze cellen moeten epitheliale expressie en voorlopercellen expressie (Figuur 4 tonen (figuur 5) hebben. Cellen die niet als dubbel langer dan 5 dagen waarschijnlijk verouderend zijn en moet worden weggegooid.
Het is beschreven dat cellen geïsoleerd uit patiënten met ontstekingsprocessen aanwezig, zoals EoE bezitten epitheliale cellen die een verlaagde proliferatieve snelheid hebben, verminderde E-cadherine (Figuur 3, patiënten 26 en 28) en een hoge mate van apoptose 26. Daarom is het niet onredelijk moeilijk kweken van cellen van een ernstig zieke patiënt met deze methode. Het is mogelijk dat cellen alleen bestand tegen een aantal passages of zelfs eerste passage. Dit zou nog steeds De onderzoeker met een groter aantal cellen dan oorspronkelijk geïsoleerd. Echter, dit aantal niet geschikt zijnvoor alle voorgestelde studies. Omdat deze cellen worden gebruikt om uiteindelijk te bestuderen oesofageale ziekte of construct een slokdarm vervangen, is het belangrijk om te onthouden deze cellen zijn alleen verantwoordelijk voor mucosale regeneratie. Andere celtypen zoals fibroblasten, neuronen, gladde spiercellen en bloedvaten zijn ook net zo belangrijk voor de studie van oesofageale ziekte en voor weefselregeneratie toepassingen.
Deze techniek biedt een patiënt-specifieke cel bron die is een waardevol instrument voor het bestuderen van de ziekte pathogenese evenals dienen als een potentieel reservoir van patiënt-specifieke cellen voor slokdarmkanker tissue engineering-toepassingen. Gebruikte cellen zaaien biomaterialen voor chirurgische implantatie moet vrij zijn van genetische afwijkingen, virale sequenties en niet teratomas vormen. Het gebruik van stamcellen (multipotent of pluripotente) genereert te veel ongewenste celtypes differentiatie, waarvan sommige kunnen teratomas vormen als ze niet Gesplitste hebben ondergaantiatie. Bovendien is deze bron cel fenotype consistent en heeft zuivering of verwijdering van ongewenste cellen vereisen. De ideale celbron zullen cellen die in dezelfde anatomische locatie die wordt gemanipuleerd. In deze benadering deze oesofageale epitheelcellen worden gebruikt aan het slijmvlies van de slokdarm scaffold bevolken. Extra celtypen zijn nodig voor slokdarmkanker regeneratie; echter, was de focus van deze techniek om ervoor te zorgen het slijmvlies was reseeded en niet onvolledig, omdat dit kan leiden tot lekkage, vernauwing en perforatie.
Naast het gebruik van deze cellen voor engineering van nieuwe chirurgische opties voor de slokdarm, kunnen deze cellen ook worden gebruikt om oesofageale ziekteprocessen en screenen voor nieuwe therapeutische benaderingen voor deze aandoeningen bestuderen. Eosinofiele oesofagitis (EoE) wordt beschreven als een allergische aandoening van de slokdarm, met het exacte mechanisme en pathogenese nog niet volledig beschreven. De huidige behandeling regiments omvatten eliminatiediëten, orale steroïden en meerdere endoscopies. Geen test bestaat om te evalueren wat triggers het ontstekingsproces voor elke patiënt, die artsen leidt tot een "gok en controleer" benadering gebruiken die lang en vaak frustrerend voor de patiënt. Omdat deze wijze van patiëntspecifieke celexpansie niet lentivirale transductie of genetische modificatie te gebruiken, de mogelijkheid blijvende veranderingen in het genotype van de cellen van het herprogrammeringsproces minimaal. Dit betekent dat de cellen in theorie gelijk aan de in vivo omgeving blijven. Het vermogen om patiënten te testen cellen in vitro te identificeren triggerend instrument zou nieuw zijn en kan uiteindelijk leiden tot de ontwikkeling van nieuwe diagnostica en therapieën voor deze pediatrische patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
