Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo de 4 estágios para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de linhas de células estaminais pluripotentes humanas.
Abstract
As células estaminais pluripotentes têm a capacidade de auto-renovação e diferenciação de várias linhagens, o que os torna numa fonte atraente para a geração de células progenitoras pancreáticas que pode ser usado para o estudo e tratamento futuro da diabetes. Este artigo descreve um protocolo de diferenciação de quatro estágios concebido para gerar células progenitoras pancreáticas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Este protocolo pode ser aplicado a um certo número de linhas de células pluripotentes estaminais humanas (HPSC). A abordagem adoptada para gerar células progenitoras pancreáticas é diferenciar hESCs para modelar com precisão as principais fases do desenvolvimento pancreático. Isto começa com a indução da endoderme definitiva, o que é conseguido através da cultura das células na presença de Activina A, Factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e CHIR990210. Maior diferenciação e padronização com Fator de Crescimento 10 (FGF10) e Dorsomorphin gera células que se assemelham a foregut posterior. A adição de RetinÓico, NOGGIN, SANT-1 e FGF10 diferencia células foregut posterior em células característicos da endoderme pancreático. Finalmente, a combinação do factor de crescimento epidérmico (EGF), a nicotinamida e NOGGIN conduz à geração eficiente de Pdx1 + / + NKX6-1 células. A citometria de fluxo é realizada para confirmar a expressão de marcadores específicos em estágios fundamentais do desenvolvimento pancreático. Os NKX6-1 + / + progenitores pancreáticas Pdx1 no final do estágio 4 são capazes de gerar células beta maduras após transplante em ratinhos imunodeficientes e pode ser ainda mais diferenciado para gerar células produtoras de insulina in vitro. Assim, a geração eficiente de Pdx1 + / NKX6-1 + progenitoras pancreáticas, como demonstrado neste protocolo, é de grande importância, pois proporciona uma plataforma para estudar o desenvolvimento pancreático humano in vitro e fornece uma fonte de células com o potencial de se diferenciar a células beta que poderia eVentually ser utilizado para o tratamento de diabetes.
Introduction
A prevalência de diabetes está a aumentar e de acordo com a Canadian Diabetes Association, estima-se que mais de 11 milhões de pessoas no Canadá são diabéticos ou pré-diabéticos, com 5-10% destes indivíduos com diabetes tipo 1 (DM1) 1. DM1 é uma doença auto-imune que é causada pela destruição das células beta produtoras de insulina que estão localizados dentro das ilhotas de Langerhans. Atualmente, as pessoas que vivem com DM1 necessitam de fontes exógenas de insulina 2. Apesar dos avanços na terapia com insulina, os pacientes DM1 continuar a ter um tempo difícil regular os seus níveis de glicose no sangue e continuam a sofrer tanto hipo e hiperglicemia. Uma forma promissora de tratamento para restabelecer a normoglicemia em DM1 é a utilização de células estaminais embrionárias humanas (hESCs), que poderiam ser utilizados para gerar um fornecimento ilimitado de células beta produtoras de insulina tanto in vivo como in vitro 3,
A tentativa mais bem sucedida na geração de células produtoras de insulina a partir de hESCs in vitro é de recapitular os eventos embrionárias que ocorrem durante o desenvolvimento pancreático 4, 5. Isso envolve a manipulação de vias de sinalização distintas para modelar com precisão as principais fases do pâncreas em desenvolvimento. Desenvolvimento pancreático começa com a indução da endoderme definitivo, que se caracteriza pela expressão de CXCR4 e CD117 (c-kit) 8, 9. regulação precisa da definitive organização endoderme é necessário para a formação do tubo digestivo, a qual é então submetida a anterior para posterior padronização e ventral-dorsal. A dorsal e ventral do pâncreas gomos emergir a partir da região do intestino anterior posterior, que expressa o gene homeobox pancreático e duodenal (Pdx1), que é necessária para o desenvolvimento pancreático 10. O dorsal e ventral gomos fundem para formar o pâncreas, que depois sofre uma extensa remodelação epitelial e expansão 11. Compromisso com o sistema endócrino e exócrino linhagem é acompanhada pela geração de células progenitoras multipotentes (PPM) que expressam, entre outros, os factores de transcrição Pdx1, Nkx6.1 e Ptf1a 12, 13. PPM que se tornarão células endócrinas e ductal continuam a expressar Nkx6-1 enquanto diminui a expressão Ptf1a. Contrariamente a isto, as células de linhagem exócrinas perderá expressioN de Nkx6-1 e manter a expressão Ptf1a 12.
O factor de transcrição Nkx6-1 tem um papel chave no desenvolvimento pancreático, particularmente durante a diferenciação de células progenitoras endócrinas para células p. Como descrito anteriormente, a exclusão de Nkx6-1 resulta na formação diminuída de células beta do pâncreas 14 durante o desenvolvimento. Portanto, a geração de células p produtoras de insulina, tanto in vitro e in vivo requer a indução eficiente de Nkx6-1.
Recentemente, desenvolveu um protocolo para gerar eficiência Pdx1 + / NKX6-1 + progenitoras pancreáticas de hPSCs. Estes progenitores pancreáticas HPSC derivados de gerar células beta maduras em cima do transplante em ratinhos imunodeficientes 3. O protocolo de diferenciação pode ser dividida em quatro etapas características de: 1) indução endoderme definitiva, 2) padronização foregut posterior, 3) especificação de pâncreas e 4) a indução NKX6-1. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de cada passo da diferenciação dirigida.
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Protocol
1. Preparação de Soluções e mídia
Nota: Preparar todos os meios para cultura de células em um ambiente estéril. Meios tem de ser feito e usado imediatamente. Reagente detalhes são fornecidos na Tabela Materiais.
- mídia diferenciação
- Prepare Dia 0 Diferenciação Meio: Meio RPMI com 1% de glutamina, 2 uM CHIR 99021, 100 ng / ml de Activina A, 10 4 H MTG.
- Prepare Dia 1-2 Diferenciação Meio: Meio RPMI com 1% de glutamina, 100 ng / ml de Activina A, 10 4 H MTG, 5 ng / ml de bFGF, Ácido 50 ^ g / ml ascórbico.
- Prepare Dia 3-5 Diferenciação de mídia: Meio RPMI com 1% de glutamina, 1% de B27, 10 4 M MTG, 0,75 mM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
- Prepare Dia 07/06 Diferenciação Meios: DMEM com 1% de glutamina, 1% de B27, 50 ug / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM sant-1, 2 uM de ácido retinóico, 50 ng / ml NOGGIN.
NOTA: retinóicoÁcido deve ser adicionado ao meio passado e mídia deve ser protegido da luz para evitar a degradação oxidativa 15. - Prepare Dia 12/08 Diferenciação Meios: DMEM com 1% de glutamina, 1% de B27, 50 ug / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml de hEGF, nicotinamida a 10 mM.
- Preparar tampão de FACS: 10% de FBS em PBS, menos de cálcio e de magnésio.
Diferenciação 2. HESC
NOTA: HESC são descongeladas, passadas e expandido em ratos irradiados fibroblastos embrionários na presença de uma mídia baseada em KOSR suplementado com bFGF 16. HESCs estão prontos para a diferenciação quando as células atingem 80-95% de confluência. Neste momento, as colónias devem ser grandes com fronteiras definidas e um 'abobadado' estrutura (Figura 1A). Toda a cultura de células é realizada no de fundo plano, de cultura de tecidos tratados placas revestidas com gelatina a 0,1%. Tipicamente, as células são cultivadas em 6 ouplacas de 12 poços, em volumes de mídia de 2 ml ou 1 ml, respectivamente.
- No dia 0, começam a diferenciação através da substituição de meios de comunicação baseada em KOSR de Dia 0 Diferenciação de mídia.
- Nos dias 1 e 2, agitar suavemente a placa para remover as células mortas da camada simples antes de aspirar. Substituir com o Dia 1-2 Diferenciação de mídia.
- No dia 3, as células de colheita para citometria de fluxo. Se as células expressam mais de 90% CXCR4 + / CD117 +, avance para o passo 2.4.
- Nos dias 3 e 5, agitar suavemente a placa para remover as células mortas da camada simples de antes da aspiração. Substituir com o Dia 3-5 Diferenciação de mídia.
- Nos dias 6 e 7, substitua com o Dia 6-7 Diferenciação de mídia.
- Nos dias 8, 10 e 12, substitua com o Dia 12/08 Diferenciação de mídia.
- No dia 13, as células de colheita para citometria de fluxo para determinar Pdx1 e expressão NKX6-1.
3. Células de colheita para Análise de Citometria de Fluxo
- Dissociar as células com1x solução de tripsina comercial de acordo com o protocolo do fabricante e incubar a 37 ° C durante 3 min.
- Remoção da solução de tripsina comercial e ressuspender as células individuais em 1000 ul de tampão de FACS com 30 ul de DNase I.
- células de filtro, utilizando um filtro de células de malha de nylon de 35 mm e transferir para um tubo de microcentrífuga.
- células centrifugar a 455 xg por 5 min. Preparar células para qualquer coloração vivas ou fixadas.
4. Coloração para citometria de fluxo
- Fluxo de preparação para a coloração ao vivo no dia 3
- Ressuspender as células em 1.000 mL FACS buffer. Transferir 200 ul (cerca de 1-3 x 10 5 células) em duas cavidades de uma placa de 96 poços (para ambas as amostras não coradas e manchados).
- Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa.
- Mancha com anticorpos primários conjugados, CXCR4: APC e CD117: PE (ver MATERIAIS Tabela) para 30 min à temperatura ambiente protegida da luz.
- Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa.
- Suspenda as amostras em 100 mL FACS buffer.
- Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa.
- Ressuspender cada amostra e de transferência, num volume total de 300-500 ul de tampão de FACS a 1 ml micro tubos de ensaio ou tubos de 5 ml de fundo redondo.
- As amostras são executados no citômetro de fluxo 17. Se as amostras não pode ser executado imediatamente, armazenar a 4 ° C protegido da luz.
- Fluxo de preparação para a coloração fixo no dia 13
- Ressuspender o sedimento de células em solução de fixação / permeabilização comercial durante 24 horas a 4 ° C.
- Centrifugar a amostra a 455 xg durante 5 min. Ressuspender em 400 ul solução Perm / Wash.
- Transferir 200 ul da amostra (cerca de 0,5-1 x 10 6 células) para twO poços de uma placa de 96 poços (para controlo de IgG e Pdx1 / NKX6-1 coloração). Centrifugar a 931 g durante 2 min.
- Ressuspender as peletes de células em 100 ul de solução de Perm / Wash contendo anti-Pdx1 e anticorpos de controlo de isotipo ou primário anti-NKX6-1 (ver Materiais Tabela). Incubar durante a noite a 4 ° C.
- Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa. Suspenda as amostras em 100 ul solução Perm / Wash.
- Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa.
- Ressuspender as amostras em 100 ul Perm / Wash contendo anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 1 hora ao abrigo da luz.
- Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa.
- Suspenda as amostras em 100 ul Perm Solution / Wash.
- Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa.
- Repcomer passo 4.2.9 e 4.2.10.
- Ressuspender cada amostra e de transferência, num volume total de 300-500 ul de tampão de FACS a 1 ml micro tubos de ensaio ou tubos de 5 ml de fundo redondo.
- As amostras são executados no citômetro de fluxo 17. Se as amostras não pode ser executado imediatamente, armazenar a 4 ° C protegido da luz.
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Representative Results
Geração eficiente de células progenitoras pancreáticas baseia-se no crescimento e manutenção de células indiferenciadas, seguido pela adição precisa de moléculas sinalizadoras específicas durante o protocolo de diferenciação, tal como ilustrado no esquema na Figura 1A. No dia 0, as células indiferenciadas deve ser 80-95% confluentes e colónias devem ter bordas definidos (Figura 1A). Durante a Fase 1, a mídia provavelmente vai parecer nublados desde a morte celular é bastante comum nesta fase. Até o final da Fase 1, as células devem co-expressam os marcadores endoderme definitivas, CXCR4 e CD117, numa proporção superior a 90% (Figura 1B).
Como as células se diferenciam ao longo do protocolo de quatro estágios, suas mudanças de morfologia de uma aparência alongada, oval-like (observada nos níveis 1 e 2) para as células mais pequenas, arredondadas (como visto nos estágios 3 e 4) (
Figura 1: Esquema de diferenciação de células progenitoras do pâncreas de hESCs e dados de suporte. (A) Representação esquemática da indução de células progenitoras a partir de pâncreas hESCs. Dia de diferenciação, DevelopmentAL fase, meios de base, e as citoquinas adicionadas em cada fase estão incluídos. Abaixo, imagens de contraste de fase nas fases-chave de diferenciação de pâncreas são mostrados. Em todas as figuras representativas, células H1 foram diferenciadas de acordo com o protocolo de diferenciação de 4 estágios descrito acima. Dia 0, hESCs indiferenciadas; Estágio 1, Endoderma definitivo; Fase 2, Posterior Foregut; Fase 3, Pdx1 + Endoderma; Fase 4, NKX6-1 + endoderme / progenitoras pancreáticas. Barra de escala = 200 pm. (B) Dia 3 representante citometria de fluxo lotes para CXCR4: PE e CD117: coloração de anticorpos APC. amostra Unstained na esquerda, amostra corada na direita. (C) Dia 13 enredo citometria de fluxo representativo para células progenitoras pancreáticas estágio-4 derivada expressando NKX6-1 e Pdx1. controle de IgG na esquerda, amostra corada na direita. hESC - células estaminais embrionárias humanas, a Lei A - Activina A; bFGF - fator de crescimento de fibroblastos básico, FGF10 - fator de crescimento de fibroblastos 10, DM - dorsomorphin, NOG - NOGGIN, RA - ácido retinóico, EGF - fator de crescimento epidérmico, NA - nicotinamida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Gerando sucesso NKX6-1 + progenitoras pancreáticas de hPSCs in vitro baseia-se no uso de culturas de alta qualidade de hPSCs e diferenciação dirigida envolvendo a regulação precisa de vias de sinalização específicas que regem as principais fases de desenvolvimento durante o desenvolvimento pancreático. Embora este protocolo pode ser utilizado para induzir a expressão robusta de NKX6-1 através de uma variedade de linhas HPSC como previamente mostrado 3, para assegurar a geração eficiente NKX6-1 as seguintes considerações devem ser feitas. É importante que todas as preparações de culturas de células e meios de comunicação é efectuada num ambiente estéril, a fim de evitar a contaminação. É importante que as colónias de células estaminais embrionárias humanas, atingiram confluência apropriado e não começou a diferenciar antes de se iniciar o dia 0 de diferenciação. Começando diferenciação com hESCs que não são ideais pode resultar na indução ineficiente da endoderme e do processo de desenvolvimento definitivofases al. É por isso que é crítico para analisar as células no dia 3 por citometria de fluxo para garantir a indução eficaz da endoderme definitiva. A percentagem de duplo positivo CXCR4 + CD117 + células no dia 3, deve ser maior do que 90% para o desenvolvimento pancreático eficiente 3. Se a percentagem de células que expressam tanto o CXCR4 e CD117 é inferior a 90%, a indução eficiente de células progenitoras pancreáticas provavelmente será comprometida (resultados não mostrados). Além disso, contrariamente ao que foi anteriormente publicado, não é necessário lavar as células com meio RPMI antes de se alimentar com a fase 1 média 16. agitação suave da placa antes de aspirar a mídia é suficiente para remover as células mortas da camada simples.
A adição de dorsomorphin na fase 2 foi apresentado apenas a ser necessário para linhas específicas HPSC 18. Assim, é importante determinar se dorsomorphin é necessária quando se trabalha com di linhas HPSC fferent. Além disso, a duração da fase 3 foi mostrado para ser crítico para especificar a utilização de células progenitoras monohormonal ou polyhormonal e é dependente da linha de células 3. Assim, quando se trabalha com uma nova linha HPSC é importante para determinar a duração que as células devem ser cultivadas na Fase 3 de mídia para determinar as condições ideais para a indução NKX6-1. Para determinar isto, as células devem ser cultivadas na Fase 3 meios durante 1-4 dias e analisadas 5 dias mais tarde por citometria de fluxo para a expressão NKX6-1.
Eficientemente geração de populações enriquecidas em células NKX6-1 + é importante, como Nkx6-1 é crítico para o desenvolvimento βcell 14. Embora outros tenham desenvolvido protocolos que podem diferenciar células estaminais embrionárias humanas para células NKX6-1 + (cerca de 60% derivados de H1 + NKX6-1 células e 55% derivadas de HUES8 PDX + / NKX6-1 + células) 4,"xref"> 5, o nosso método gera consistentemente> 80% Pdx1 células derivadas de H1 + / NKX6-1 +. No entanto, o nosso protocolo de diferenciação depende da utilização de fibroblastos de rato embrionárias, o que limita seu uso para a pesquisa somente, como ainda temos de otimizar o método em Boas Práticas de Fabricação. Embora não tenhamos tentado criopreservação nossos estágio-4 células derivadas Pdx1 + / NKX6-1 +, esta abordagem tem sido realizada com sucesso por Schulz et al. , Que demonstraram que os agregados pancreáticas criopreservadas foram capazes de reter a sua função in vivo 19.
Neste artigo descrevemos um protocolo de 4 estágios para gerar de forma eficiente + / NKX6-1 + progenitoras pancreáticas Pdx1 a partir de uma variedade de linhas de HPSC. Ao diferenciar HPSC por quatro etapas fundamentais do desenvolvimento pancreático, este protocolo fornece um modelo para estudar o desenvolvimento do pâncreas humano in vitro. Furthermore, uma vez que as células Pdx1 + / + NKX6-1 ter o potencial para gerar células produtoras de insulina tanto in vivo como in vitro (dados não mostrados) 3, 4, 5, o derivado de células estaminais embrionárias humanas Pdx1 + / + NKX6-1 pancreático progenitores fornecer uma fonte possível para o tratamento de diabetes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este manuscrito foi apoiado pelo financiamento do Toronto General e Fundação Ocidental e o Prêmio de Pós-Graduação Banting e Melhor Diabetes Centre-University Health Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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