Summary
Здесь мы опишем протокол 4 этапа к дифференцировке эмбриональных стволовых клеток человека к NKX6-1 + панкреатических клеток - предшественников в пробирке. Этот протокол может быть применен к различным плюрипотентных стволовых клеточных линий человека.
Abstract
Плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью самостоятельно возобновлять и дифференцироваться в нескольких родословных, что делает их привлекательным источником для генерации панкреатических клеток-предшественников, которые могут быть использованы для изучения и дальнейшего лечения сахарного диабета. В данной статье рассматривается протокол дифференциации четыре этапа, предназначенный для создания панкреатических клеток-предшественников из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Этот протокол может быть применен к ряду человеческого плюрипотентных стволовых клеток (HPSC) линий. Подход, используемый для создания панкреатических клеток-предшественников, чтобы дифференцировать ЭСК точно моделировать основные этапы развития поджелудочной железы. Это начинается с индукцией окончательного эндодермы, что достигается посредством культивирования клеток в присутствии активин A, базовый фактор роста фибробластов (bFGF) и CHIR990210. Дальнейшая дифференциация и структурирование с фактор роста фибробластов 10 (Fgf10) и Dorsomorphin формирует клетки, напоминающие задней кишки. Добавление Сетчаткаовая кислота, башка, САНТ-1 и FGF10 различает клетки задней передней кишки в клетки поджелудочной железы, характерных энтодермы. И, наконец, сочетание эпидермального фактора роста (EGF), никотинамид и Noggin приводит к эффективной генерации Pdx1 + / NKX6-1 + клеток. Проточная цитометрия проводится для подтверждения экспрессии специфических маркеров на ключевых этапах развития поджелудочной железы. В Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатические клетки - предшественники в конце 4 -й стадии, способные генерировать зрелые бета - клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей и может быть дополнительно дифференцированы , чтобы генерировать инсулин-продуцирующие клетки в пробирке. Таким образом, эффективная генерация Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатические клетки - предшественники, как показано в этом протоколе, имеет большое значение , поскольку она обеспечивает платформу для изучения развития поджелудочной железы человека в пробирке и обеспечивает источник клеток с потенциалом дифференциации в -клетки, которые могли бы Э.В.entually использоваться для лечения сахарного диабета.
Introduction
Распространенность сахарного диабета возрастает , и в соответствии с Канадской ассоциации диабета, по оценкам, более 11 миллионов человек , в Канаде являются диабетическая или prediabetic, 5-10% этих лиц , имеющих сахарный диабет 1 типа (СД1) 1. СД1 является аутоиммунным заболеванием, которое вызывается разрушением продуцирующих инсулин бета-клеток, которые расположены в островках Лангерганса. В настоящее время, люди , живущие с СД1 требуют экзогенных источников инсулина 2. Несмотря на успехи в инсулинотерапии, у пациентов СД1 продолжают иметь трудное время регулируя уровень глюкозы в крови и продолжают страдать как гипо- и гипергликемии. Перспективной формой лечения для восстановления нормогликемии в СД1 является использование человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые могут быть использованы для создания неограниченный запас инсулина производства бета - клеток , как в естественных условиях и в пробирке 3,
Самая успешная попытка генерации продуцирующих инсулин клеток из ЭСК в пробирке является резюмировать эмбриональных события , которые происходят во время развития поджелудочной железы 4, 5. Это включает в себя манипуляции различных сигнальных путей, чтобы точно моделировать основные этапы развивающейся поджелудочной железе. Поджелудочной развития начинается с индукцией окончательного энтодермы, которая характеризуется выражением CXCR4 и CD117 (c-KIT) 8, 9. Точное регулирование definitАйв организация энтодермы необходим для формирования кишечной трубки, который затем подвергается передне-к-задней и вентральной-дорсального кучность стрельбы. Спинной и брюшные панкреатические почки выходят из области задней кишки, выражающего поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки гомеобоксный ген (Pdx1), который необходим для развития поджелудочной железы 10. Спинной и брюшные почки предохранителей , чтобы сформировать поджелудочную железу, которая затем подвергается интенсивному эпителиальной ремоделирования и расширение 11. Стремление к эндокринную и экзокринной линии сопровождается поколением мультипотентных клеток - предшественников (ПДК) , которые выражают, среди прочего, транскрипционные факторы Pdx1, Nkx6.1 и Ptf1a 12, 13. ПДКп , которые станут эндокринные и протоковой клетки продолжают выражать Nkx6-1 при одновременном снижении экспрессии Ptf1a. В противоположность этому, клетки линии преемственности экзокринных потеряет expressioп Nkx6-1 и поддерживать Ptf1a выражение 12.
Фактор транскрипции Nkx6-1 играет ключевую роль в развитии рака поджелудочной, в частности , во время дифференцировки эндокринных клеток - предшественников к бета - клеток. Как было описано выше, удаление результатов Nkx6-1 в нарушенного формирования бета - клеток поджелудочной железы в процессе развития 14. Поэтому, создавая производящие инсулин бета - клеток в пробирке и в естественных условиях требует эффективной индукции Nkx6-1.
Недавно мы разработали протокол , чтобы эффективно генерировать Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатических клеток - предшественников из hPSCs. Эти HPSC полученные из панкреатических прародителей образованием зрелых бета - клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей 3. Протокол дифференциации можно разделить на 4 этапа характеристику: 1) окончательной индукции энтодермы, 2) задняя передняя кишка структурирование, 3) поджелудочная спецификации и 4) NKX6-1 индукции. Здесь мы приводим подробное описание каждого шага направленной дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление растворов и средств массовой информации
Примечание: Подготовьте все средства массовой информации для культивирования клеток в стерильной среде. СМИ должны быть сделаны и использованы немедленно. Детали Реагент представлены в таблице материалов.
- Дифференциация СМИ
- Приготовьте день 0 Дифференциация Носитель: RPMI среде с 1% глутамина, 2 мкМ CHIR 99021, 100 нг / мл активин А, 10 4 M MTG.
- Подготовка День 1-2: дифференцировки RPMI среде с 1% глутамина, 100 нг / мл активин A, 10 4 M MTG, 5 нг / мл bFGF, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
- Подготовка День 3-5: дифференцировки RPMI среде с 1% глутамина, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 мкМ Dorsomorphin, 50 нг / мл FGF10.
- Подготовьте 6-7 сут дифференцировки: DMEM с 1% глутамина, 1% B27, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл FGF10, 0,25 мкМ SANT-1, 2 мкМ ретиноевой кислоты, 50 нг / мл Noggin.
Примечание: ретиноевойКислота должна быть добавлена в средствах массовой информации в последний раз, и средства массовой информации должны быть защищены от света для предотвращения окислительной деструкции 15. - Готовят день 8-12 дифференцировки: DMEM с 1% глутамина, 1% B27, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл Noggin, 100 нг / мл hEGF, 10 мМ никотинамид.
- Подготовка FACS буфера: 10% FBS в PBS, минус кальция и магния.
2. дифференцировке ЭСК
Примечание: HESC оттаивают, пассированные и расширена на облученный мышиных эмбриональных фибробластов в присутствии KOSR сред на основе дополненной bFGF 16. ЭСК готовы к дифференциации, когда клетки достигают 80-95% слитности. В это время колонии должны быть большими с определенными границами и 'купольного' структуры (Рис . 1А) Вся культура клеток выполняется в плоскодонных, культуры тканей обрабатывали планшеты, покрытые 0,1% желатином. Как правило, клетки выращивают в 6 или12-луночные планшеты, в объемах средств по 2 мл или 1 мл.
- В день 0 начинают дифференцировку путем замены KOSR на основе средств массовой информации с дня 0 Дифференциация Media.
- В дни 1 и 2, осторожно встряхните пластину, чтобы удалить мертвые клетки из монослоя до того аспирационных. Заменить на день 1-2 Дифференциация Media.
- На 3-й день, урожай клеток для проточной цитометрии. Если клетки экспрессируют более чем на 90% CXCR4 + / CD117 +, перейдите к шагу 2.4.
- В те дни, 3 и 5, осторожно встряхните пластину, чтобы удалить мертвые клетки из монослоя до аспирационных. Заменить День 3-5 Дифференциация Media.
- В дни 6 и 7, заменить День 6-7 Дифференциация СМИ.
- В дни 8, 10 и 12, заменить День 8-12 Дифференциация СМИ.
- На 13-й день, урожай клеток для проточной цитометрии для определения Pdx1 и NKX6-1 выражение.
3. Сбор клеток для анализа потока цитометрии
- Диссоциируют клетки с1x раствор коммерческий трипсин в соответствии с протоколом производителя и инкубировать при 37 ° С в течение 3 мин.
- Удалить коммерческое решение трипсина и ресуспендируют отдельных клеток в 1000 мкл FACS буфера с 30 мкл ДНКазы I.
- Фильтрующие элементы с использованием 35 мкм нейлоновый сетчатый фильтр клеток и перенос в микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга клетки при 455 мкг в течение 5 мин. Подготовка клетки для живого или любой фиксированной окраски.
4. Окрашивание для проточной цитометрии
- Расход препарата для живого окрашивания на 3 -й день
- Ресуспендируют клеток в 1000 мкл FACS буфера. Передача 200 мкл (приблизительно 1-3 × 10 5 клеток) на две лунки 96-луночного планшета (для обоих неокрашенных и окрашенных образцов).
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Пятно с первичными конъюгированные с антителами, CXCR4: APC и CD117: PE (см M aterials таблицу) для 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Образцы Ресуспендируют в 100 мкл FACS буфера.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Ресуспендируют каждого образца и перенос в общем объеме 300-500 мкл FACS буфера для 1 мл микропробирок или 5 мл с круглым дном пробирки.
- Выполнить образцов на проточном цитометре 17. Если образцы не могут быть запущены сразу же, хранят при температуре 4 ° С в защищенном от света.
- Расход препарата для фиксированного окрашивания на 13 -й день
- Ресуспендируют осадок клеток в коммерческом растворе фиксации / пермеабилизации в течение 24 ч при температуре 4 ° С.
- Центрифуга образца при 455 х г в течение 5 мин. Ресуспендируют в 400 мкл раствора Пермь / промывочного.
- Передача 200 мкл образца (приблизительно 0,5-1 × 10 6 клеток) к ТВтO лунки 96-луночного планшета (для IgG контроля и Pdx1 / NKX6-1 окрашивания). Центрифуга при 931 мкг в течение 2 мин.
- Ресуспендируют гранул клеток в 100 мкл раствора Пермь / промывочного содержащего анти-Pdx1 и анти-NKX6-1 антитела первичного или изотипа контроля (см Материалы таблицу). Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета. Образцы Ресуспендируют в 100 мкл раствора Пермь / промывочного.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Ресуспендируют образцы в 100 мкл / Пермь Wash, содержащие вторичные антитела, при комнатной температуре в течение 1 ч, защищенном от света месте.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Образцы Ресуспендируют в 100 мкл Пермского / промывочного раствора.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- репседят шаг 4.2.9 и 4.2.10.
- Ресуспендируют каждого образца и перенос в общем объеме 300-500 мкл FACS буфера для 1 мл микропробирок или 5 мл с круглым дном пробирки.
- Выполнить образцов на проточном цитометре 17. Если образцы не могут быть запущены сразу же, хранят при температуре 4 ° С в защищенном от света.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективная генерация панкреатических клеток - предшественников опирается на правильный рост и поддержание недифференцированных клеток с последующим точным добавлением специфических сигнальных молекул во время протокола дифференцировки, как показано на схеме на рисунке 1А. В день 0, недифференцированные клетки должны быть на 80-95% сплошности и колонии должны иметь определенные края (Фигура 1А). Во время стадии 1, СМИ, скорее всего, появится облачно, так как гибель клеток является довольно распространенным явлением на этом этапе. К концу стадии 1, клетки должны совместно выразить окончательные маркеры энтодермы CXCR4 и CD117, в пропорции , превышающей 90% (Фигура 1В).
Как клетки дифференцируются по всему протоколу четырехступенчатой, их морфология изменяется от вытянутой, овальной, как внешний вид (наблюдается на этапах 1 и 2) на более мелкие, круглее клеток (как показано на этапах 3 и 4) (
Рисунок 1: Схема поджелудочной железы дифференцировки клеток - предшественников из ЭСК и вспомогательных данных. (А) Схема индукции поджелудочной прародителя из ЭСК. День дифференциации, девелопментал стадии, базовые средства массовой информации, а также цитокины, добавленные на каждом этапе включены. Ниже фазового контраста изображения на ключевых стадиях дифференцировки поджелудочной железы показаны. Во всех представительных фигур, H1 клетки дифференцировались в соответствии с протоколом дифференцировки 4 стадии, изображенной выше. День 0, недифференцированные ЭСК; 1-й этап, Definitive энтодермы; 2-й этап, Задней Передняя кишка; Этап 3, Pdx1 + энтодермы; Этап 4, NKX6-1 + энтодермальные / панкреатические клетки - предшественники. Шкала бар = 200 мкм. (B) День 3 Представитель проточной цитометрии участков для CXCR4: PE и CD117: меченых антител APC. Необработанный образец на левом, окрашенном образце справа. (C) 13 день представитель проточной цитометрии участок на стадии 4-получены панкреатических клеток - предшественников , экспрессирующих NKX6-1 и Pdx1. контроль IgG на левом, окрашенном образце справа. чЭСК - человеческие эмбриональные стволовые клетки, Акт A - активин A; bFGF - основной фактор роста фибробластов, FGF10 - фактор роста фибробластов 10, DM - dorsomorphin, NOG - башка, RA - ретиноевая кислота, EGF - эпидермальный фактор роста, NA - никотинамид. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешно генерации NKX6-1 + панкреатических клеток - предшественников из hPSCs в пробирке основана на использовании высоких культур качества hPSCs и направленной дифференцировки , включающих точное регулирование конкретных сигнальных путей , которые регулируют основные этапы развития в процессе развития поджелудочной железы. Хотя этот протокол может быть использован , чтобы вызвать устойчивую экспрессию NKX6-1 через множество HPSC линий , как показано ранее 3, для обеспечения эффективного NKX6-1 поколение следующие соображения должны быть сделаны. Важно, чтобы все культуры клеток и средств массовой информации подготовка проводится в стерильной среде, чтобы предотвратить загрязнение. Важно, что чЭСК колонии достигли соответствующего сплошности и не начали дифференцировать до начала 0-й день дифференцировки. Начиная с дифференциации ЭСК, которые не являются оптимальными могут привести к неэффективному индукции энтодермы и продолжающегося развития окончательногоаль этапы. Именно поэтому крайне важно, чтобы проанализировать клетки на 3-й день с помощью проточной цитометрии для обеспечения эффективной индукции окончательного энтодермы. Процент двойного положительного CXCR4 + CD117 + клеток в 3 -й день , должно быть больше 90% для эффективного панкреатического развития 3. Если процент клеток, экспрессирующих как CXCR4 и CD117 ниже, чем 90%, эффективная индукция панкреатических клеток-предшественников, вероятно, будет нарушена (результаты не показаны). Кроме того, вопреки тому , что была ранее опубликована, не надо мыть клетки с RPMI перед подачей на стадии 1 , средства массовой информации 16. Осторожном встряхивании пластины до аспирационных носителя достаточно, чтобы удалить мертвые клетки из монослоя.
Добавление dorsomorphin на стадии 2 было показано, что требуется только для определенных HPSC линий 18. Таким образом, важно, чтобы определить, является ли dorsomorphin необходимо при работе с ди fferent линии HPSC. Кроме того, продолжительность этапа 3 было показано , что иметь решающее значение для определения либо monohormonal или polyhormonal клеток - предшественников и является клеточная линия зависящих от 3. Таким образом, при работе с новой линией HPSC важно определить продолжительность, что клетки должны культивировать в стадии 3 СМИ, чтобы определить оптимальные условия для NKX6-1 индукции. Для определения этого клетки следует культивировать на стадии 3 средства массовой в течение 1-4 дней и анализировали через 5 дней с помощью проточной цитометрии для NKX6-1 экспрессии.
Эффективно генерации популяции , обогащенные в NKX6-1 + клеток имеет важное значение, так как Nkx6-1 имеет решающее значение для развития βcell 14. В то время как другие были разработаны протоколы , которые могут дифференцировать ЭСК для NKX6-1 + клеток (примерно 60% H1 полученных NKX6-1 + клеток и 55% HUES8 происхождения PDX + / NKX6-1 + клеток) 4,"Xref"> 5, наш метод последовательно генерирует> 80% H1 полученный Pdx1 + / NKX6-1 + клеток. Тем не менее, наш протокол дифференциации основан на использовании мышиных эмбриональных фибробластов, что ограничивает его использование для исследования только, как мы до сих пор оптимизировать метод в надлежащей производственной практики. Несмотря на то, что мы не пытались криоконсервируют нашей сцене-4 , полученные Pdx1 + / NKX6-1 + клеток, этот подход был успешно выполнен Шульца и др. , Который показал , что криоконсервированных панкреатических агрегаты были способны сохранять свою функцию в естественных условиях 19.
В этой статье мы опишем протокол 4 этапа эффективно генерировать Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатических клеток - предшественников из множества HPSC линий. Дифференцируя HPSC через четыре ключевых этапах развития поджелудочной железы, этот протокол обеспечивает модель для изучения развития поджелудочной железы человека в пробирке. ФюртАНДРЕЕВ, так как Pdx1 + / NKX6-1 + клетки имеют потенциал для создания инсулин-продуцирующие клетки , как в естественных условиях и в пробирке (данные не показаны) 3, 4, 5, чЭСК производные Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатический клетки-предшественники обеспечивают возможный источник для лечения сахарного диабета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта рукопись была поддержана финансирование из Торонто общего и Западного Фонда и Высшей премии Бантинг и Лучший Диабет Центр-университет сеть здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
