Summary
Procédé pour l'auto-intégration de séchage induite par des biopolymères megamolecular sur l'interface air-liquide cristallin est fournie ici. Cette méthodologie sera utile non seulement pour comprendre les potentiels macroscopiques de biopolymères, mais aussi comme une méthode d'évaluation des matériaux souples dans les domaines biomédical et environnemental.
Abstract
Les organismes vivants qui utilisent de l'eau sont toujours sujettes à sécher dans l'environnement. Leurs activités sont caractérisées par des structures macro-micro et à base de biopolymères, comme on le voit dans le cas de l'eau en mouvement dans les faisceaux vasculaires et de l'eau dans l'hydratation des couches de la peau. Dans cette étude, nous avons développé un procédé pour évaluer l'effet des solutions à cristaux liquides aqueux (LC) composées de biopolymères sur le séchage. Comme LC biopolymères ont un poids megamolecular, nous avons choisi d'étudier les polysaccharides, les protéines du cytosquelette, et l'ADN. L'observation des solutions de biopolymère au cours du séchage sous lumière polarisée révèle auto-intégration milliscale à partir de l'interface air-LC instable. La dynamique des solutions aqueuses de biopolymères LC peuvent être contrôlées par évaporation de l'eau à partir d'une cellule d'un côté ouvert. En analysant les images prises en utilisant une lumière à polarisation croisée, il est possible de reconnaître les changements spatio-temporels dans le paramètre d'ordre d' orientation. Ceméthode peut être utile pour la caractérisation non seulement des matériaux artificiels dans divers domaines, mais aussi les tissus vivants naturels. Nous croyons qu'il fournira une méthode d'évaluation des matériaux souples dans les domaines biomédical et environnemental.
Introduction
En se concentrant sur les structures rigides, en forme de tige de biopolymères, matériaux souples dynamiques ont été utilisées pour diverses applications, y compris les matrices de biofilm de polysaccharide 1, « gels actifs » composés de protéines du cytosquelette 2 et « ADN origami » des formes souhaitées 3. Pour clarifier les propriétés structurelles, de nombreuses stratégies ont été explorées, telles que microscopie électronique à transmission, microscopie électronique à balayage, microscopie à force atomique et la microscopie à fluorescence confocale. Cependant, ces méthodes sont principalement effectuées dans un état statique ou séché, il est difficile d'expliquer les comportements dynamiques dans les échelles macroscopiques, comme on le voit dans les systèmes vivants réels. Récemment, nous avons observé avec succès le comportement dynamique de biopolymères sur l'interface air-LC aqueuse à travers une lumière polarisée 4. Au cours de la visualisation de la structure orientée pendant le séchage du biopolymèresolution, les changements temporels indiqués auto-intégration de biopolymères sur l'interface air-LC instable.
Ici, nous décrivons un protocole pour le séchage des solutions LC biopolymères à l'interface air-LC en utilisant des instruments polarisés. Par opposition à d' autres analyses de la phase à cristaux liquides qui ne tient pas compte de séchage 5, 6, la dynamique LC au cours du processus de séchage ont été étudiés ici en évaluant le paramètre d'ordre d' orientation dans la vue latérale de la phase fluide dans une cellule ouverte d' un côté . La combinaison de l'évaporation de la cellule et l'utilisation d'instruments à polarisation autorisées pour la surveillance macroscopique avec une direction d'évaporation contrôlée. De plus, il est possible de valider les dossiers de séchage en mettant l' accent sur les structures cristallines des microdomaines adsorbées, qui ont été affectées par le poids moléculaire, la concentration, etc. Pour démontrer l'efficacité de la méthode, le pro de séchagecessus de biopolymères de base avec des formes de tiges rigides, telles que des polysaccharides, des microtubules (MT), et de l'ADN, ont été étudiés. Nous avons choisi ces biopolymères parce qu'ils sont des exemples typiques de macromolécules hiérarchiques avec des poids megamolecular, et leurs interactions intermoléculaires leur permettent de former des états LC.
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Protocol
1. Instruments
- Dispositif de Polarisation
- Pour construire un dispositif de polarisation, une source de lumière avec une lampe à halogène, un guide de lumière, des polariseurs, un étage d'échantillon, un rail optique, la tige se tient, et un appareil photo reflex mono-objectif numérique (voir la figure 1C et les matériaux de la liste pour la polarisation parties du dispositif).
2. Préparation de la solution de biopolymère
- Solutions polysaccharidiques
- Dissoudre Sacran 7 (0,5 g) dans de l' eau pure (100 ml) , on a agité à ~ 80 ° C pendant plus de 12 h. Au cours de la dissolution, recouvrir le récipient avec une pellicule de plastique pour empêcher l'évaporation. Préparer une solution aqueuse de gomme xanthane de la même manière.
- Refroidir les solutions à ~ 25 ° C pour obtenir 0,5% en poids de solutions aqueuses.
- Centrifuger la solution pour éliminer les impuretés Sacran (48400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 times).
- solution MT
- Préparer une solution de tubuline 0,5% en poids (1 ml) dans un tampon de Britton-Robinson (80 mM pipérazine N, N '-bis (2-éthanesulfonique) (PIPES), 1 mM d' éthylène glycol-bis (éther β-aminoéthyl) - N, N, N 'N' acide tétraacétique (EGTA), et 5 mM de MgCl2, pH 6,8) sur de la glace 8.
- Utiliser 0,5% en poids de solution de tubuline (50 pi) et la guanosine-5' - [(α, β) -methyleno] triphosphate (GpCpp) (5 pi) pour préparer une solution de tubuline contenant GpCpp (50 ul). Incuber à 37 ° C pendant 3 h pour obtenir un noyau MT stable.
NOTE: Le rôle de GpCpp est de soutenir la formation MT et de supprimer complètement la dépolymérisation de MT à la tubuline. - Mélanger la solution de tubuline 0,5% en poids (950 ul) et la solution de tubuline contenant GpCpp (50 ul) à ~ 25 ° C pendant 1 jour pour obtenir une solution stable de MT 0,5% en poids.
- Solution d'ADN
- Préparer une solution d'ADN de 0,5% en poids (1 ml) dans une solution tampon Tris-EDTA (Tris 10 mM, pH 8,0, 1 mM EDTA).
- Garder les à 25 ° C 0,5% en poids de solutions d'échantillon de biopolymère pour l'expérience de séchage.
3. Les expériences de séchage et d'observation sous la lumière de polarisation croisée
- Solutions dans une cellule d' un côté ouvert (figure 1A)
- Couper une feuille de silicium (voir Matériaux List) dans une forme appropriée d'une épaisseur de 1 mm (dimension intérieure de 15/05 mm, 1 mm, et ~ 20 mm; la figure 1A).
- Assembler une cellule ouverte d'un côté constitué d'une entretoise de silicium à dimension intérieure de 15/05 mm, 1 mm, et ~ 20 mm et de deux lames de verre non modifiées (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fixer les deux côtés de la cellule avec deux clips à l'avance afin de maintenir la solution d'échantillon de fuir.
- Lentement ajouter chacune de la solution de biopolymère à 0,5% en poids (100-300 ul) en utilisant une taille de pores de ~ 1 mm pipettete pointe à chaque cellule à ~ 25 ° C. Éliminer les bulles d'air à partir des cellules en utilisant une aiguille de seringue.
- Placer les cellules dans un four avec une circulation d'air à 60 ° C sous pression atmosphérique pour l'évaporation; la direction d'évaporation est opposée à celle de la gravité.
- Couper une feuille de silicium (voir Matériaux List) dans une forme appropriée d'une épaisseur de 1 mm (dimension intérieure de 15/05 mm, 1 mm, et ~ 20 mm; la figure 1A).
- Observations sous une lumière à polarisation croisée (figure 1B-1C)
- Fournir de la lumière directement visible par l'intermédiaire d'une lampe halogène de 100 W avec une source de lumière de surface plane sur une grande surface (80 mm x 80 mm). Ajuster les polariseurs à 45 ° et 135 ° à l' aide des supports (Figure 1C).
- Fixer les positions de la source de lumière, des polariseurs, l' étape d'échantillonnage, et la caméra à l' aide d' un rail supports optiques et de tige (figure 1c). Placez la scène de l'échantillon entre les deux polariseurs (la distance entre les polariseurs doit être ~ 5 cm). Placez l'appareil photo ~ 20 cm de la scène de l'échantillon pour permettre mise au point.
- A certains moments, placez les échantillons de l'étape 3.1.3 entre le polarizers sur la scène parallèle au plan XZ et couvrir l'appareil avec un rideau noir; le dispositif proprement dit est représenté sur la figure 1C.
- Photographier les échantillons à travers des polariseurs croisés linéaires en utilisant un appareil photo reflex mono-objectif numérique avec un objectif zoom standard (voir Matériaux List). Contrôlez les réglages de l'appareil, comme la distance focale, en utilisant un logiciel informatique (voir la liste des matériaux).
- Analyse spatio-temporelle de l'intensité lumineuse transmise (Figure 1C)
- Pour évaluer le changement du paramètre d'ordre dans le processus orientationnel de séchage, de recueillir des photos toutes les heures pendant 24 h.
- Mesurer l'intensité de la lumière transmise le long de la ligne centrale dans la direction Z en tant que valeur de gris en utilisant un programme de traitement d'image (par exemple, ImageJ).
- Tracer la courbe de la valeur de gris en fonction de la distance de la face supérieure ouverte.
- Les observations microscopiques de moins ligh polarisation croiséet (Figure 1D)
- Pour vérifier les méthodes, faire des observations microscopiques avec un microscope de polarisation équipé d'une caméra CCD 9. Maintenir une première plaque de retard ordre dans le trajet lumineux. Contrôler les conditions pour les photos à l'aide d'un logiciel PC.
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Representative Results
Utilisation du dispositif tel que représenté sur la figure 1, l'auto-intégration de microdomaines à macrodomain sur une interface air-LC séchage a été évaluée (Figure 2A). Comme la première démonstration de l'expérience de séchage, deux types de polysaccharides megamolecular, Sacran (M w = 1,9 x 10 7 g mol -1) et la gomme de xanthane (4,7 x 10 6 g mol -1), ont été comparés. La figure 2B montre des photographies des solutions dans la cellule sous lumière polarisée croisée. Avant le séchage, il est possible d'observer plusieurs régions lumineuses avec la lumière transmise dans un état dispersé dans les deux solutions. Après séchage à 60 ° C pendant 6 h, la région au-dessous de l'interface air-LC dans la solution Sacran est devenu significativement élevée. Cela signifie que les domaines forment une structure macroscopiquement orientée à l'interface, similaire à la formation de la couche de peau dans un procédé de gel-rétraction"xref"> 10. D'autre part, l'intensité de la solution xanthane diminue considérablement lorsque la température était juste passée de 25 ° C à 60 ° C, et quelques petites macrodomaines ont été observées sous l'interface. En effet, la mobilité de la microdomaines xanthane est beaucoup plus sensible à la température que celle du microdomaines Sacran. Les différences critiques de l'orientation de l'interface ont ainsi été détectés en utilisant le dispositif de polarisation.
La figure 2C et film S1 montrent les résultats de l' analyse spatio-temporelle pour le processus de séchage dans la solution Sacran. L'intensité de la lumière transmise indique le paramètre d'ordre d'orientation du microdomaine. L'intensité de pic autour de l'interface air-liquide a augmenté de manière significative, et l'épaisseur a augmenté de ~ 2 mm. Ces résultats indiquent clairement que les microdomaines commencent à orienter de l'interface air-LC unD se transformer en un domaine de milliscale parallèle à l'interface. A partir de cette observation en lumière polarisée, il est ainsi possible de visualiser les mouvements du fluide dans le processus de séchage.
Les différences entre la gomme xanthane et Sacran en termes de taille et macrodomain direction d'orientation ont également été confirmés par un microscope de polarisation dans un premier ordre lame à retard (Figure 2D). La phase liquide a montré une région Sacran bleu, ce qui signifie qu'un seul macrodomain formée à l'interface. En revanche, la phase de fluide de la gomme de xanthane a montré des régions bleu, jaune, et rose, ce qui signifie que les multiples macrodomaines formés avec des orientations arbitraires.
Cette méthode a également été étudiée pour comparer trois types de biopolymères rigides de base avec des poids de megamolecular - polysaccharides (Sacran: M w = 1,9 x 10 7 g mol -1, microdomaineslongueur> 20 pm), MTs (M w = 10 9 -10 10 g mol -1, la longueur de microdomaine> 10 um), et de l' ADN (M w = 1,3 x 10 6 g mol -1, la longueur de microdomaine <1 pm) - dans un environnement physiologique à 37 ° C. Avant le séchage comme indiqué sur la figure 3B, la solution Sacran et la solution MT montré similaires états LC, avec des domaines dispersés dans toute la région. Au cours du processus de séchage, les domaines dans la solution MT ont également fait l'auto-intégration de l'interface air-LC, et les domaines dispersés ont été intégrés dans un seul macrodomain. D'autre part, la solution d'ADN n'a montré aucune orientation spécifique dans la phase liquide. Dans le cas de la solution MT et la solution d'ADN préparée avec des tampons, il est important de noter que l'intégration est affectée par les variations de la concentration en sel, le pH et la force ionique pendant le séchage.
(figure 3C). Le record de séchage Sacran présentait des intensités de biréfringence importantes en raison de la formation de macrodomain unique milliscale. Pour le dossier de séchage MT, nous avons observé des faisceaux ondulés où le grand axe était parallèle à l'axe X. En revanche, la fiche de séchage de la solution d'ADN a montré macrodomaines en forme de grains <5 um de diamètre et dans des directions arbitraires. A partir de ces observations, il est clair que la taille macrodomain est affectée par la longueur des microdomaines en forme de bâtonnets. Il est ainsi possible d'évaluer l'orientation directionnelle des microdomaines biopolymères en observant les enregistrements de séchage à l'aide d'un microscope de polarisation.
En conclusion, les méthodes utilisant la lumière polarisée ont été utiliséspour l'auto-intégration de biopolymères megamolecular sur l'interface air-LC de séchage. La dynamique des solutions aqueuses de LC ont été contrôlées par évaporation de l'eau à partir d'une cellule d'un côté ouvert. En analysant les images prises en utilisant une lumière à polarisation croisée, il a été possible de reconnaître les changements spatio-temporels et le paramètre d'ordre d'orientation. Considérant que le processus de séchage démontré est similaire à des processus naturels, cette méthode serait utile pour la caractérisation non seulement des matériaux artificiels dans divers domaines, mais aussi des tissus vivants naturels. Nous pensons que cela pourrait fournir une méthode d'évaluation des matériaux souples dans les domaines biomédical et environnemental.
Figure 1: Expérience de séchage. (A) Représentation schématique des solutions dans une cellule d' un côté ouvert. (B)Illustration schématique du dispositif expérimental utilisé pour l'observation sous lumière polarisée croisée. Les polariseurs sont habituellement ajustés à 45 ° et 135 °. (C) Le dispositif réel. Ce chiffre a été modifié de la référence 6. Droit d' auteur: American Chemical Society, 2016. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Procédé de séchage de solutions aqueuses de la gomme Sacran polysaccharides et de xanthane. (A) Illustration schématique de l'auto-intégration sur l'interface air-LC de séchage. (B) vues latérales de deux types de solutions de polysaccharide à leur état initial et après6 h de séchage à 60 ° C sous une lumière polarisée croisée. Les concentrations initiales de polymère étaient de 0,5% en poids. (C) Transmis intensité de la lumière à travers un Nicols croisés sur une ligne dans la direction Z pour chaque image prise à un instant donné. (D) Polarisation images microscopiques des solutions de polymère dans la cellule après 6 h de séchage à 60 ° C. Les flèches rouges: macrodomaines sur l'interface. Ce chiffre a été modifié de la référence 6. Droit d' auteur: American Chemical Society, 2016. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Procédé de séchage de solutions aqueuses de biopolymères et les enregistrements de séchage. (A) Les sources des polysaccharides (cyanobactéries), (MTs du cerveau porcin), et l'ADN (testicules de saumon Les). (B) Vues de côté de Sacran, MT, et des solutions d'ADN pendant le séchage à 37 ° C sous une lumière polarisée croisée. Les concentrations initiales de polymère étaient de 0,5% en poids. (C) images microscopiques des films de polymère séché sur le substrat de verre à travers les directions données des Nicols croisés. Toutes les barres d'échelle sont de 50 um. Ce chiffre a été modifié de la référence 6. Droit d' auteur: American Chemical Society, 2016. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film S1: Le processus de séchage de la solution Sacran pendant le séchage à 60 ° C, observée en utilisantNicols croisés. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce film.
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Discussion
Il était parfois difficile pour la caméra de se concentrer sur l'échantillon en raison de l'intensité lumineuse transmise étant trop faible. Dans de tels cas, en plaçant un film de matière plastique transparente étendue sur la scène a aidé à organiser la mise au point. La limitation de la résolution observable dépendait de l'objectif de la caméra, ~ 10 um dans ce cas. La limite observable de l'épaisseur de l'échantillon, Ay, est fonction de l'intensité lumineuse maximale de la lampe, ~ 10 mm dans ce cas.
L'avantage du dispositif représenté sur la figure 1B est qu'il permet des photos en vue latérale de l'échantillon à prélever au cours du processus de séchage. L'observation peut être réalisée sans compter sur le plan horizontal, qui est utilisée dans les microscopes classiques. En se tenant la cellule ouverte d'un côté au cours des expériences de séchage, la direction d'évaporation est régulée et dans le sens inverse de la gravité. Le suivi de la vue de côté permet également le calcul du rat de séchagee 4.
À l'avenir, en plaçant les régulateurs de température et d'humidité sur la scène échantillon du dispositif, il sera possible de suivre automatiquement les changements temporels dans le paramètre d'ordre orientationnel. En outre, un équilibre dans la configuration pour surveiller le changement de poids contribuerait à l'estimation de la concentration. Cette méthode peut également être utilisée pour clarifier le processus de gonflement anisotrope de polysaccharide hydrogels 11, 12. Il serait donc possible de surveiller les changements structurels des actionneurs souples.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'aide pour les jeunes scientifiques (16K17956) du ministère de l'Education, Culture, Sports, Science et Technologie du Japon, Kyoto Le Centre technoscience, et la Fondation Mitani pour la recherche et le développement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
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