Abstract
Конструктивный биология и синтетической биологии подход к созданию искусственной жизни включать снизу вверх сборку биологических или небиологических материалов. Такие подходы получили значительное внимание в исследованиях на границе между живой и неживой материей и были использованы для создания искусственных клеток в течение последних двух десятилетий. В частности, гигантский везикулы (GVs) часто использовались в качестве искусственных клеточных мембран. В этой статье мы опишем подготовку GvS заключающих высоко упакованных микросферы в качестве модели клеток, содержащих конденсированные высоко биомолекул. В GVs были получены с помощью простого метода эмульсии центрифугирования вода-в-масле. В частности, гомогенизатор использовался для эмульгирования водного раствора, содержащего материалы для инкапсулирования и масло, содержащее растворенные фосфолипиды, и полученную эмульсию осторожно наслаивают на поверхность другого водного раствора. Слоистая система затем центрифугировали то генерации GvS. Этот мощный метод был использован для инкапсулирования материалов, начиная от небольших молекул микросферы.
Introduction
Конструктивная, или синтетический, биологический подход является увлекательным направлением для изучения границы между живой и неживой материи. Поскольку клетка является минимальной единицей, необходимое для жизни, как мы сейчас понимаем, различные исследователи попытались построить искусственные клетки из простых, хорошо понятных химических веществ, так что явления, которые происходят в таких искусственных клеток могут быть изучены, с конечной целью выяснении происхождение жизни и изучение основных функций живых клеток 1, 2, 3. В частности, везикулы 4, которые представляют собой сферические microcompartments из амфифильных молекул и могут инкапсулировать биологические молекулы , такие как белки 5, 6 и 7 , ДНК, 8, 9,деваха = "Xref"> 10, часто использовались в качестве моделей биологических мембран.
Пузырьки могут быть классифицированы как малые (определенный как имеющий диаметр <100 нм), крупные (диаметром <1 мкм) или гигантской (диаметр> 1 мкм). Гигантские везикулы (GvS) были изучены, потому что они похожи на живые клетки, по размеру, форме и структуре. Вследствие размера GvS, морфологические изменения в мембранах GV легко можно наблюдать в реальном времени под оптическим микроскопом.
Известно несколько способов приготовления GvS поступало 11, в том числе метод гидратной 12, 13, методом замораживания-оттаивания 14, метод electroformation 15, 16, и способ струйного устройства 17, 18. Тем не менее, инкапсулирующие белки и другие MACROMolecules в GvS при высоких концентрациях с помощью этих методов трудно. В частности, чрезвычайно сложной задачей , чтобы инкапсулировать биологические материалы в достаточном количестве (20-30% по объему) , чтобы имитировать переполненной среды внутри клеток 19, 20. Для формирования GVs мгновенно, Вайц и его коллеги установили вода-в-масле ( в / м) методом центрифугирования эмульсии 21, 22. Этот метод имеет пять важных особенностей. Во- первых, потому , что GVs , приготовленные этим способом , имеют низкую ламеллярности 23, 24, их мембраны являются настолько тонкими , что они могут быть легко деформируется. Г.В. деформации мембраны , индуцированное FtsZ (белок бактериальной клетки деление), тубулина и других макромолекул было изучено 25, 26, 27, 28, и мы наблюдали polyhe ДРОН-как деформация GV мембран , индуцированных инкапсулирования микросфер 29, 30. Во- вторых, мембранные белки могут быть вставлены в везикулярного мембрану с помощью этого метода, хотя и с трудом 31. Например, группа Yomo использовали этот метод для изучения синтеза в лабораторных условиях и порообразующего активность мембранного белка альфа-гемолизина 32. В- третьих, можно генерировать асимметричные GvS , в которых липидные компоненты внутреннего и наружного листков различны 22. Например, Whittenton и др. генерируемые асимметричные GVs с катионными липидами во внутреннем листке инкапсулировать отрицательно заряженные полинуклеотиды, и с нейтральными липидами на внешней листка , чтобы уменьшить токсичность и неспецифическую клеточного поглощения 33. В-четвертых, концентрация и объемная доля веществ внутри GvS может быть относительно высокимs = "Xref"> 28, 34. В- пятых, несколько типов материалов могут быть инкапсулированы 35. Например, Нисимура и др. инкапсулированные системы транскрипции-трансляции в пробирке в GvS и использовали систему для выражения зеленого флуоресцентного белка (GFP) в пределах GvS 36. Эти пять функций делают без эмульсии центрифугирования незаменимым методом для создания клеточных имитирующие GvS.
В предыдущей работе, GVs , сгенерированные с помощью центрифугирования собирали с помощью шприца , оборудованного длинной 16 G из нержавеющей стали иглы , содержащей некоторые из окончательного водного раствора 22. В руках неопытного техников, этот метод сбора может легко привести к загрязнению GV с некоторыми из нефти. В данном исследовании мы использовали протокол эмульсии центрифугирование з / о , разработанный группой Yomo 23, 37,в котором собраны осажденные GVs через отверстие открыто в нижней части трубки центрифуги, в которых их получают. Мы подготовили GvS инкапсулирующие 1,0 мкм микросферы, которые близки по размерам к внутриклеточных органелл. Использование микросферы позволило оценить их концентрацию путем расчета их объемной доли. Создание метода для получения GvS, в котором материалы плотно упакованы, является важным шагом для создания искусственных клеток. Для подтверждения полезности предлагаемого протокола для различных типов внутренних материалов, мы также показали, что GFP и небольшой водорастворимое флуоресцентное молекула (uranine) может быть воплощен в GvS.
Protocol
1. Приготовление GvS в W / O Emulsion центрифугировани Method
- Готовят раствор 1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-фосфохолина (DOPC, 25 мМ) и исходного раствора Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- зп глицеро-3-фосфоэтаноламин, триэтиламмониевую соль (Texas Red DHPE, 0,20 мМ) в хлороформе и хранить растворы при -20 ° с.
- Подготовить масляный раствор.
- Образующие липидный пленку на внутренней поверхности стеклянной пробирке объемом 5 мл при испарении смеси ДОФХ исходного раствора (51.0 мкл и маточного раствора техасский красный DHPE (19,2 мкл) при пропусканием газообразного азота.
- Выдержите пленку при пониженном давлении в течение ночи , а затем добавляют 1,0 мл жидкого парафина (0.86-0.89 г / см 3) во флакон. Заверните флакон алюминиевой фольгой и инкубировать его при 80 ° CO / N в состоянии покоя. Конечные концентрации DOPC и Texas Red DHPE являются 1,3 и 3,8 х 10 - 3 мМ, Соответственно, и ДОФХ: молярное отношение техасский красный DHPE составляет 100: 0,3.
- Подготовьте внутреннюю водную дисперсию.
- В 1,5 мл микропробирок с закрытой крышкой, смешайте 237,5 мкл дисперсии 1,0 мкм нефлуоресцирующих микросферы (2,5% по объему) и 12,5 мкл дисперсии 1,0 мкм флуоресцентные микросферы (2,5% по объему); это соответствует 95: соотношение 5 (об / об) нефлуоресцирующих люминесцентным микросферами.
- Добавить 64 мг сахарозы с последующим 125 мкл Трис-буферном растворе (TBS, 1 М) и 875 мкл деионизированной воды. Окончательный объемная доля микросфер составляет 0,5% по объему, а конечные концентрации трис-HCl (рН 7,5) и сахарозы составляет 0,1 и 0,15 м соответственно.
- Вихревой микропробирку в течение 30 сек, а затем разрушать ультразвуком в течение 10 мин.
- Подготовьте внешний водный раствор.
- После приготовления 10 мл Трис-буферном растворе (0,1 М Трис-HCl [pH 7,5], 0,15 М GlucOSE) в том же порядке, что и внутренней водной среде, поместите 1 мл раствора в 1,5 мл микропробирок с крышкой. Вихревой микропробирку в течение 30 сек, а затем разрушать ультразвуком в течение 10 мин.
- Приготовьте ав / м эмульсии , содержащей микросферы.
- Смешайте 1 мл раствора масла (жидкий парафин, содержащий DOPC и Texas Red DHPE) с 300 мкл внутреннего водного раствора в микропробирки объемом 1,5 мл.
- Эмульгировать два компонента в микропробирок с помощью механического гомогенизатора (перемешивающим устройством с лопастями, которые вращаются с высокой скоростью), эксплуатируемых при 10000 оборотах в минуту в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Осадить GvS.
- Аккуратно слоем 300 мкл в / м эмульсии на верхней поверхности 1 мл наружного водного раствора при температуре 4 ° С в 1,5 мл с крышкой микропробирок. Охладить микропробирок в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Соберите GvS.
- Сразу же после охлаждения микропробирок,центрифугируйте при 18000 х г в течение 30 мин. Получают осажденных GvS путем прокалывания нижней части микропробирок с Pushpin и собирая одну каплю в стерилизованную 1,5 мл микропробирки.
- Разведите осаждали Г.В. капелька в 10-100 раз по объему с внешним водным раствором, если полученные GVs получены в количествах, достаточно больших, чтобы сделать наблюдение трудно.
2. Микроскопия Наблюдение GvS
- Приготовьте микроскопии образца.
- Поместите инкубационный камеру клей для на месте полимеразной цепной реакции и гибридизации (размер камеры 9 мм х 9 мм х 0,3 мм толщиной) на верхней части микроскопа покровного стекла в.
- Использование микропипетки, депозит 25 мкл разбавленного осаждали GvS на площади образца и немедленно поместить другой покровного стекла (толщиной приблизительно 0,15 мм) на верхней части инкубационной камеры.
- Запись дифференциальной интерференции контраст микроскопии образы GvS.
- Запись микроскопии изображений везикул с микроскопом (10х, 20х и 40х), снабженный 12V100WHAL-L галогенной лампой.
- Проведение флуоресцентной микроскопии наблюдений.
- Вставьте U-FBNA и U-FMCHE флуоресценция зеркальные блоки в микроскоп. Установить единицы с 470-495 нм и 565-585 нм возбуждения фильтров, соответственно, и с фильтрами выбросов, которые передают 510-550 нм и 600-690 нм свет, соответственно.
Representative Results
Ж / о метод эмульсии центрифугирования иллюстрируется фотографически и схематически на рисунке 1. Схематическое изображение на рисунке 1 показывает , что наиболее важным фактором , определяющим успех этого метода является то, что удельный вес внутреннего водного раствора должно быть больше , чем у наружного водного раствора, так что GVs будет осаждаться во время центрифугирования. Кроме того, образование липидного монослоя при W / O-интерфейс требует, чтобы система охлаждаться в течение 10 минут после того, как эмульсия наслаивается на внешнем водном растворе. Так как формы GvS путем переноса капель эмульсии через W / O интерфейс, осмотические давление во внутренних и внешних водных слоев должны быть одинаковыми. В качестве контрольного эксперимента, мы также подготовили GVs , не содержащие микросферы с помощью процесса , показанного на фиг.1 , и шаг за шагом 1.3, за исключением того, что внутренний водный растворприготовлена без микросферы.
Коллекция осажденных GvS после центрифугирования, показан на фиг.2. В дополнение к полупрозрачное фазы в самом низу микропробирок, мы также наблюдали белый, мутная промежуточная фаза в наружном водный раствор (рис 2а). Эта промежуточная фаза была богата скоплениями микросферы и масла, в то время как нижняя фаза содержала GvS. Таким образом, после того, как пирсинг в нижней части микропробирок с канцелярской кнопки (рисунок 2b), мы собрали только первую каплю (фиг.2С), который содержал огромное количество GvS. Важно, чтобы убедиться, что не более двух капель не собираются; любые дополнительные капли могут содержать агрегированные микросферы и липидов, что приведет к более низкой плотности GvS. Полученная дисперсия везикулярного часто содержали инкапсулированные материалы за пределами GvS потому что GvS ofteп разрыв во время центрифугирования. Для того, чтобы получить только GvS, метод сортировки, такие как диализ, гель-фильтрации, или флуоресценцией сортировка клеток должна быть выбрана из-за размеров обволакивающей материалов. При необходимости для целей, для которых осажденные GVs должны быть использованы, они могут быть разбавлены с наружным водным раствором. В некоторых случаях промежуточная фаза распространяется на нижней части трубки, предполагая, что любые пузырьки, которые образовывались, скрепленных маслом.
Получены дифференциальные интерференционной микроскопии и флуоресцентной микроскопии образы GvS без микросферы (рис 3а, 3b) и с микросферы (рис 3в -3 F). В соответствии с предыдущими сообщениями 23, 37, GVs с низким ламеллярности были сформированы нашего протокола. Липиды, конъюгированные с Texas Red DHPE, излучающие красный fluoresценция, были использованы таким образом, чтобы образование везикул может быть непосредственно подтверждено визуализации тонкой мембраны. Из 160 GvS, что полученные нами, 55 капсулированные микросферы и 105 были пусты, что дает соотношение инкапсулирования 34%.
Мы определили объемную долю (ср,% по объему) микросфер в GvS с помощью следующего метода. Поскольку каждый GV содержит десятки до нескольких сотен микросферы, считая все микросферы под оптическим микроскопом является сложной задачей. Таким образом, мы смешали нефлуоресцирующих микросферы 1,0 мкм с небольшим количеством флуоресцирующих микросфер, которые были вручную подсчитывались под флуоресцентным микроскопом. Общее количество (N) капсулированных микросфер рассчитывали путем умножения числа (п) вручную подсчитанных флуоресцентных микросфер 20 (на основе оригинала 95: 5 [об / об] соотношении нефлуоресцирующих к флуоресцентных микросфер). Значение66; Затем была оценена как Nv 100 / V, где V представляет собой объем микросферы и V является объем индивидуального GV. Следует отметить , что оценка N из п приводит к подсчета ошибок, и эти ошибки должны быть приняты во внимание при расчете ф. Величина ф оценивалась из N, который был непосредственно в расчете на 20 л, а это , в свою очередь , привело к вероятности того, что ф точно отражает истинное значение <50%. На самом деле, N колеблется в некоторой степени около 20 мк, поэтому мы должны рассматривать его как 20 (п ± г), где я есть ошибка в п. По нашим оценкам I , с тем , что вероятность п ± я мог бы быть больше , чем 50% , полученные на основе распределения Пуассона. По нашим оценкам I, в свою очередь , позволило вычислить 20 (п ± г) и значения66; который включал подсчет ошибок для GvS с диаметром от 10 до 15 мкм (таблица 1). В соответствии с этой процедурой, объемная доля микросфер в GV , показанных на рисунке 3в, по оценкам, 11 ± 3% по объему. Точность расчетной объемной доли была на 10-30%.
Наши результаты указывают на то, что мы успешно инкапсулированы 1 мкм микросферы в GvS при высокой объемной доли. Мы также смогли инкапсулировать другие материалы на 100% мол ДОФХ GvS с использованием того же наружного водного раствора и тот же протокол (рисунок 4). В частности, GVs, содержащие 0,1 мкм микросферы изготавливались из трис-буферном растворе, содержащем 0,1 М Трис-HCl (рН 7,5), 0,15 М сахарозы и 0,5% по объему флуоресцентные микросферы с помощью протокола, описанного для GvS, содержащих 1,0 мкм микросферы ( На рисунке 4а). Следуя протоколу, описанному Абовуд, ДОФХ GVs , содержащий GFP (0,1 М Трис-HCl [рН 7,5], 0,15 М сахарозы, и 100 мкг / мл GFP; фиг.4В) и GvS содержащие uranine (0,1 М Трис-HCl [pH 7,5], 0,15 М сахарозы, и 30 мкМ uranine, также были получены Рисунок 4C).
| N | N | φ (10 мкм в диаметре) | φ (15 мкм в диаметре) |
| 3 | 60 ± 20 | 6,0 ± 2,0 | 1,8 ± 0,6 |
| 4 | 80 ± 20 | 8,0 ± 2,0 | 2,4 ± 0,6 |
| 5 | 100 ± 20 | 10 ± 2 | 3,0 ± 0,6 |
| 6 | 120 ± 30 | 12 ± 4 | 3,6 ± 1,2 |
| 10 | 200 ± 32 | 20 ± 3 | 5.9 ± 0,9 |
| 20 | 400 ± 45 | 40 ± 5 | 12 ± 2 |
| 30 | 600 ± 55 | - | 18 ± 2 |
| а ошибки были определены , как описано в тексте; п = количество подсчитанных вручную микросферы; N = общее количество капсулированных микросфер. | |||
Таблица 1: Числа и объемные доли (φ,% по объему) микросферы а. а ошибки были определены , как описано в тексте; п = количество подсчитанных вручную микросферы; N = общее количество капсулированных микросфер.
Рисунок 1: Flow Ch искусство и схематическое изображение W / O эмульсии центрифугировани методом. (А) масляный раствор , состоящий из DOPC и Texas Red DHPE (100: 0,3 мольное отношение) в жидком парафине. (Б) внутреннюю водную дисперсию , состоящую из сахарозы и микросферы в буфере Трис-HCl. (В) наружный водный раствор , состоящий из глюкозы в буфере Трис-HCl. (Г) Смесь 1 мл масляного раствора и 300 мкл внутренней водной дисперсии. (Е) эмульгирование с помощью гомогенизатора (10000 оборотов в минуту, 2 мин). (Е) ж / м эмульсии. (Г) наслоение 300 мкл эмульсии на 1 мл внешнего водного раствора. (З) Осажденный GVs только после того, как центрифугирование. (Я) Схематическое изображение принципа ж / о методе эмульсии центрифугирования. Черная стрелка указывает направление центробежного ускорения..jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Прокалывание микропробирок. (А) Осажденный GVs только после центрифугирования (также изображен на рисунке 1 ч). Красный эллипс указывает на капельку осажденного дисперсии GV. (Б) Прокалывание микропробирок с канцелярской кнопки. Осадок, содержащий GvS получали путем прокалывания микропробирок вблизи дна с помощью Pushpin и сбора капель из отверстия. (С) капелька осажденных GvS (обозначается желтой стрелкой) дисперсии , разбавленного с наружным водным раствором. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Микроскопия Изображения GvS. (А) Дифференциальный интерференционный контраст микроскопии изображение GV без микросферы. Диаметр GV составляла около 10 мкм. Шкала бар = 10 мкм. (Б) люминесцентной микроскопии изображение GV без микросферы. Красная флуоресценция, излучаемый Texas Red DHPE. (С) Дифференциальный интерференционный контраст микроскопии изображение GV , содержащего микросферы. (D) люминесцентной микроскопии изображение 1,0 мкм микросферы (YG карбоксилатные микросферы) внутри GV. Количество подсчитанных флуоресцентных микросфер (п) было 6. Мы оценили ошибки (я = 2) на основе распределения Пуассона. Тогда мы оценили общее количество внутренних микросферы (N = 20 (п ± г)) составило 120 ± 40. Было подсчитано, чтоGV содержала 1,0 мкм микросферы при объемной доле (φ = Нв 100 / V) приблизительно 11 ± 3% по объему, где V есть объем микросфер и V является объем GvS. (Е) люминесцентной микроскопии изображение GV мембраны. Красная флуоресценция, излучаемый Texas Red DHPE. (Е) Объединенное изображение изображений в панели г и д. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Дифференциальная интерференционного контраста и флуоресцентной микроскопии Изображения GvS с различными инкапсулированы материалов. Дифференциальный интерференционный контраст микроскопии (сверху) и флуоресцентной микроскопии (внизу) изображенияGVs , содержащие (а) от 0,1 мкм микросферы, (б) GFP, и (с) uranine. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Удельные массы внутренней водной дисперсионной среде и к внешней водного раствора должна быть тщательно подобраны. Для ж / м эмульсии для осаждения в наружный водный раствор во время центрифугирования, удельный вес внутренней водной дисперсионной среды должна быть больше, чем у наружного водного раствора. Мы попытались подготовить GvS, используя внутренние и внешние решения без сахара, но мы не получали ни одного GvS в этих условиях, потому что внутренний водный раствор не имеет достаточную массу, чтобы пересечь помех между двумя фазами. Если есть большая разница осмотического давления между двумя решениями, GvS, которые осаждаются в наружный водный раствор может сжиматься или разрыва. Таким образом, осмотическое давление внутри и снаружи GvS должны быть равны. Для достижения этой цели мы использовали сахарозу в качестве растворенного вещества во внутренней водной дисперсии и глюкозы в качестве растворенного вещества во внешнем водном растворе; оба сахара были в той же концентрации. Обе солисс = "Xref"> 22 и сахара 23, 35, 38 используются для таких целей, но сахар обычно используется , потому что он менее токсичен и более растворимы , чем соли. Тем не менее, если добавляется слишком много сахара, то GVs могут вступать в контакт с нижней части покровного стекла и коллапс. Есть несколько стратегий для предотвращения этого. Одна из стратегий заключается в снижении специфической разности плотности между внутренним и наружным водных растворов так, чтобы GVs осаждаются в мягких условиях; В частности, супернатант осаждали дисперсии Г.В. может быть обменена с раствором, который идентичен внутреннему водному раствору, чтобы уменьшить вероятность разрыва везикулярного адгезией к покровным стеклом в результате плавучести. Другая стратегия заключается в намывных оба покровных стекол с тонкой липидной пленки 29.
Правильная подготовка и инкубация эмульсииважный. Мы использовали жидкий парафин для приготовления раствора масла. Минеральное масло 26, 31, додекан 21, 33, и сквалан 33, 39 также часто используют в качестве растворителей , масел. Поскольку эти материалы различаются по удельному весу, вязкости и поверхностного натяжения, различные числа везикул образуют даже тогда , когда одни и те же условия центрифугирования используются 33. Для получения везикул с целевыми свойствами, важно, чтобы оптимизировать Удельные и вязкостей внутренних и внешних водных растворов, а также центробежный препарат acceleration.For масляной фазы, инкубация должна происходить при высокой температуре и в сухом среда, таких как инкубатор или водоотделитель. В этом исследовании мы нагревали жидкого парафина до 80 ° С до полного растворения липидов molecules.In Кроме того, эмульсия должнабыть подготовлены только по мере необходимости, и должны быть немедленно центрифугировали, поскольку она нестабильна только после того, как он подготовлен и без капельки легко сливаться друг с другом. Эмульсия может быть получен в больших количествах путем обработки ультразвуком, встряхивания или накладкой. Тем не менее, с помощью гомогенизатора позволяет быстрого приготовления больших количеств эмульсии и более легкого эмульгирования в масле с высокой вязкостью. Кроме того, важно, чтобы эмульсия наслаивать на внешнем водном растворе осторожно и быстро, а затем охлаждали при 4 ° С. Для того, чтобы сократить время между эмульгирования и центрифугирования, водная система масляного раствора аута может быть prechilled до того, как эмульсия наслаивается на него, и вся система может быть затем центрифугируют immediately.If белый мутность появляется быстрее или медленнее, чем обычно, механическая гомогенизатор необходимо тщательно промыть, чтобы удалить моющие средства. Кроме того, перед эмульгированием, масляный раствор, внутренний водный раствор, и эмульгатор должен быть гeturned до комнатной температуры.
Правильное центробежное ускорение также имеет важное значение. Центрифугированием при 18000 х г, мы смогли подготовить GvS с одним внутренним материалом , инкапсулированного в высокой концентрации. Когда требуется инкапсуляция нескольких материалов, то лучше уменьшить центробежное ускорение. Например, система актина сборки капсулирования семь соединений достигалось с центрифугированием при менее 350 х г в 35. В тех случаях , в которых центрифугирование нежелательно, GVs может быть получено путем изменения концентрации сахара или путем осаждения эмульсии под действием собственной массы 38, 40, 41.
Метод сообщаемые здесь имеет два основных ограничения. Одним из них является, что молекулы масла (парафин, в данном случае) могут быть растворены в мембране GV, как уже было отмечено, на Weitг группы 21. Когда вставка мембранного белка в мембрану GV желательно, то необходимо учитывать эффекты сосуществующих молекул масла на белке. Другим ограничением является изменение объемной доли. В этом исследовании мы оценили, что объемные доли микросфер в GvS варьировались от 4-30% по объему; объемные доли не были идентичны объемной доли внутреннего водного раствора, используемого для приготовления GV. Несмотря на то, что мы были в состоянии инкапсулировать микросферы в GvS при объемной доле, достаточно высокой для наблюдения микроскопии, этот способ не подходит для приготовления GvS с равномерным распределением объемной доли. Сообщалось , что распределение объемной доли микросфер изменяется во время центрифугирования 34.
W / O методом эмульсионной центрифугирование обычно используется для формирования GvS содержащих инкапсулированные материалы. Тем не менее, несколько сообщений описали ррепарации GvS заключающих Microscale материалы 34, 42. В последнее время , молекулярные роботы , содержащие инкапсулированный устройство ДНК или молекулярный устройство было построено 43, 44. GVs с отделениями являются первым выбором для такого рода приложений; Поэтому, методы, такие , как наша, которые могут быть использованы для инкапсулирования магнитных микросфер и микросферы с разнообразной функционализации поверхности можно ожидать , чтобы быть полезным 44.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Томоко Ямагучи для рисования схематическое изображение на рисунке 1. Это исследование было поддержано Окадзаки ORION Проекта Окадзаки Института интегративной Bioscience из theNational институтов естественных наук (NINS); в центре проекта астробиологии (без AB281010.) из NINS; по дотация для научных исследований по инновационным районам (динамическим упорядочением биомолекулярных систем для создания интегрированных функций) из Японского общества содействия развитию науки (JSPS) (без 25102008.); грантом-в-помощь для молодых ученых (B) (до KK, не 15K17850.) от JSPS; andby грантом-в-помощь для научно-исследовательской деятельности Start-Up (для YN, нет. 15H06653) от JSPS. Дополнительная поддержка была оказана за счет гранта от Ногучи института, грант от Kao фонда искусств и наук, а также грант от Куриты воды и Фонда окружающей среды.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
| Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
| Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
| GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT: | |||
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
| Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy microhomogenizer |
| Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
| Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
| Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470 - 495 nm Emission filter: 510 - 550 nm |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565 - 585 nm Emission filter: 600 - 690 nm |
References
- Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
- Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
- Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
- Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
- Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
- Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
- Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L.
- Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
- Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
- Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
- Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
- Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
- Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
- Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
- Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683 (2016).
- Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
- Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
- Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
- Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853 (2014).
- Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
- Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).
