Abstract
بيولوجيا البناء ونهج البيولوجيا التركيبية لخلق حياة اصطناعية تنطوي على التجمع من أسفل إلى أعلى من المواد البيولوجية أو غير بيولوجية. وقد حظيت هذه النهج قدرا كبيرا من الاهتمام في مجال البحوث على الحدود بين العيش والمواد غير الحية واستخدمت لبناء خلايا اصطناعية على مدى العقدين الماضيين. على وجه الخصوص، العملاق الحويصلات (مشاهد عامة) وغالبا ما تستخدم أغشية الخلايا الاصطناعية. في هذه الورقة، ونحن تصف إعداد مشاهد عامة التغليف المجهرية معبأة غاية كنموذج من الخلايا التي تحتوي على الجزيئات الحيوية مكثف للغاية. تم عن طريق وسيلة مستحلب الطرد المركزي بسيط الماء في النفط أعدت مشاهد عامة. على وجه التحديد، تم استخدام الخالط لاستحلب محلول مائي يحتوي على مواد إلى أن تكون مغلفة والنفط التي تحتوي على الدهون الفوسفاتية المنحل، والطبقات مستحلب الناتجة بعناية على سطح محلول مائي آخر. وبعد ذلك طرد نظام الطبقات رس توليد مشاهد عامة. وقد استخدمت هذه الطريقة قوية لتغليف المواد بدءا من الجزيئات الصغيرة إلى المجهرية.
Introduction
على نهج البيولوجيا بناء، أو الاصطناعية هو وسيلة رائعة لاستكشاف الحدود بين العيش ومادة غير حية. لأن الخلية هي الوحدة الصغرى اللازمة للحياة كما نفهمها حاليا ذلك، مختلف الباحثين حاولوا بناء خلايا اصطناعية من بسيطة، المواد الكيميائية مفهومة جيدا بحيث الظواهر التي تحدث داخل هذه الخلايا الاصطناعية يمكن دراستها، مع الهدف النهائي المتمثل في توضيح أصل الحياة ودراسة وظائف أساسية من الخلايا الحية 1، 2، 3. على وجه الخصوص، حويصلات 4، والتي هي microcompartments كروية مصنوعة من جزيئات محبة للجهتين ويمكن تغليف الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات 5 و 6 و 7 الحمض النووي، 8، 9،معشوقة = "XREF"> 10، وغالبا ما تستخدم كنماذج من الأغشية البيولوجية.
ويمكن تصنيف حويصلات صغيرة (كما هو موضح التي يبلغ قطرها <100 نانومتر)، كبير (قطر <1 ميكرون)، أو العملاق (قطر> 1 ميكرون). وقد تم دراسة الحويصلات العملاقة (مشاهد عامة) على نطاق واسع لأنها تشبه الخلايا الحية في الحجم والشكل، وهيكل. ونظرا لحجم مشاهد عامة، تغيرات شكلية في الأغشية GV يمكن بسهولة أن يلاحظ في الوقت الحقيقي تحت المجهر الضوئي.
وقد ذكرت عدة طرق لإعداد مشاهد عامة 11، بما في ذلك طريقة ترطيب 12 و 13، وطريقة تجميد أذاب 14، وطريقة electroformation 15 و 16، وطريقة جهاز فلويديك 17 و 18. ومع ذلك، التغليف البروتينات وغيرها من macromolecules في مشاهد عامة بتركيزات عالية عن طريق هذه الأساليب أمر صعب. على وجه الخصوص، فمن صعبة للغاية لتغليف المواد البيولوجية بكميات كافية (20-30 المجلد٪) لمحاكاة بيئة مزدحمة داخل الخلايا 19، 20. لتشكيل مشاهد عامة على الفور، إنشاء ويتز وزملاء العمل على الماء في النفط (ث / س) طريقة مستحلب الطرد المركزي 21، 22. هذا الأسلوب لديه خمسة من الميزات الهامة. أولا، لأن مشاهد عامة من خلال هذه الطريقة التي أعدت لها أدنى lamellarity 23، 24، الأغشية رقيقة حتى أنها يمكن أن تكون مشوهة بسهولة. وقد تمت دراسة GV تشوه غشاء الناجم عن بروتين زد (بكتيري البروتين انقسام الخلايا)، تويولين، والجزيئات الأخرى 25، 26، 27، 28، ونحن لاحظ polyhe DRON مثل تشوه الأغشية GV الناجمة عن التغليف المجهرية 29، 30. ثانيا، يمكن إدراج البروتينات الغشاء في الغشاء الحويصلي بهذه الطريقة، ولو بصعوبة (31). على سبيل المثال، استخدمت مجموعة Yomo هذا الأسلوب لدراسة التركيب في المختبر ونشاط تشكيل المسام من البروتين غشاء α-دموية 32. ثالثا، فمن الممكن لتوليد مشاهد عامة غير المتماثلة التي مكونات الدهون من النشرات الداخلية والخارجية هي مختلفة 22. على سبيل المثال، Whittenton وآخرون. ولدت مشاهد عامة غير متكافئة مع الدهون الموجبة في النشرة الداخلية لتغليف عديد البيوكليوتيد سالبة الشحنة، ومع الدهون المحايدة على النشرة الخارجية لتقليل سمية وامتصاص الخلايا غير محددة 33. رابعا، التركيز وحجم جزء من المواد داخل مشاهد عامة يمكن أن تكون عالية نسبياالصورة = "XREF"> 28، 34. خامسا، أنواع متعددة من المواد يمكن أن تكون مغلفة 35. على سبيل المثال، نيشيمورا وآخرون. مغلفة في المختبر نظام النسخ الترجمة إلى مشاهد عامة واستخدام النظام للتعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ضمن مشاهد عامة 36. هذه الميزات خمسة تجعل ث / س مستحلب الطرد المركزي وسيلة لا غنى عنها لتوليد مشاهد عامة، ومحاكاة الخلية.
في الأعمال السابقة، جمعت مشاهد عامة الناتجة عن الطرد المركزي عن طريق حقنة مجهزة طويلة 16 G إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ التي تحتوي على بعض من محلول مائي النهائي 22. في أيدي فنيين عديم الخبرة، وهذا يمكن أن طريقة جمع تؤدي بسهولة في تلوث GV مع بعض الزيت. في هذه الدراسة، استخدمنا ث / س بروتوكول مستحلب الطرد المركزي التي وضعها الفريق Yomo 23، 37،حيث يتم جمع مشاهد عامة عجلت من خلال ثقب فتح في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي التي يتم إعدادها. ونحن على استعداد لقطات عامة التغليف 1.0 ميكرون المجهرية، التي تشبه في حجمها عضيات داخل الخلايا. استخدام المجهرية سمح لنا لتقدير تركيز من خلال حساب جزء حجمها. إنشاء وسيلة لإعداد مشاهد عامة التي هي معبأة المواد ذات الكثافة هي خطوة هامة لخلق خلايا اصطناعية. لتأكيد جدوى بروتوكول لدينا أنواع مختلفة من المواد الداخلية، وأثبتنا أيضا أن GFP وصغيرة للذوبان في الماء جزيء فلوري (uranine) يمكن أن تكون مغلفة في مشاهد عامة.
Protocol
1. إعداد مشاهد عامة من قبل W / O مستحلب الطرد المركزي الطريقة
- إعداد محلول المخزون من 1،2-dioleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (DOPC، 25 مم) وحل سهم تكساس الأحمر 1،2-dihexadecanoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoethanolamine، triethylammonium الملح (تكساس الأحمر DHPE، 0.20 ملم) في الكلوروفورم وتخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية.
- إعداد الحل النفط.
- تشكيل لفيلم الدهون على السطح داخل قارورة زجاجية 5 مل عن طريق تبخير مزيج من محلول المخزون DOPC (51.0 ميكرولتر والحل الأسهم تكساس الأحمر DHPE (19.2 ميكرولتر) تحت تتدفق غاز النيتروجين.
- احتضان الفيلم تحت ضغط منخفض بين عشية وضحاها ثم قم بإضافة 1.0 مل من البارافين السائل (0،86-0،89 جم / سم 3) إلى القارورة. التفاف القارورة في رقائق الألومنيوم واحتضان ذلك في 80 ° CO / N في بقية. تركيزات النهائية من DOPC وتكساس الأحمر DHPE هي 1.3 و 3.8 س 10-3 ملمعلى التوالي، وDOPC: تكساس الأحمر DHPE نسبة المولي 100: 0.3.
- إعداد تشتت مائي داخلي.
- في 1.5 مل microtube بغطاء، مزيج 237.5 ميكرولتر من تشتت 1.0 ميكرون المجهرية nonfluorescent (2.5 المجلد٪) و 12.5 ميكرولتر من تشتت 1.0 ميكرون المجهرية الفلورسنت (2.5 المجلد٪)؛ وهذا يتوافق مع 95: 5 (ت / ت) نسبة nonfluorescent إلى المجهرية الفلورسنت.
- إضافة 64 ملغ من السكروز تليها 125 ميكرولتر من حل مخزنة تريس (TBS، 1 م) و 875 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. جزء الحجم النهائي للالمجهرية 0.5 المجلد٪، وتركيزات النهائي من تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) والسكروز هي 0.1 و 0.15 م على التوالي.
- دوامة microtube لمدة 30 ثانية ثم يصوتن لمدة 10 دقيقة.
- تحضير محلول مائي الخارجي.
- بعد إعداد 10 مل من محلول مخزنة تريس (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.5 درجة الحموضة]، 0.15 M glucبيئة نظام التشغيل) في نفس الإجراء الأوساط المائية الداخلية، ووضع 1 مل من الحل في 1.5 مل بغطاء microtube. دوامة microtube لمدة 30 ثانية ثم يصوتن لمدة 10 دقيقة.
- إعداد فصيل عبد الواحد / س مستحلب يحتوي المجهرية.
- خلط 1 مل من محلول النفط (البرافين السائل يحتوي على DOPC وتكساس الأحمر DHPE) مع 300 ميكرولتر من محلول مائي داخلي في 1.5 مل microtube.
- يستحلب العنصرين في microtube باستخدام الخالط الميكانيكية (محرضا مع ريش التي تدور بسرعة عالية) تعمل في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في RT.
- ترسيب مشاهد عامة.
- طبقة بلطف 300 ميكرولتر من ث / س مستحلب على السطح العلوي من 1 مل من محلول مائي الخارجي في 4 درجات مئوية في 1.5 مل بغطاء microtube. فتور microtube لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- جمع لقطات عامة.
- مباشرة بعد تقشعر لها الأبدان وmicrotube،أجهزة الطرد المركزي أنه في 18000 ز س لمدة 30 دقيقة. الحصول على مشاهد عامة عجل بها ثقب أسفل microtube مع الدبوس وجمع قطرة واحدة في تعقيمها 1.5 مل microtube.
- قطيرة تمييع GV عجلت 10-100 أضعاف من حيث الحجم مع محلول مائي الخارجي إذا تم الحصول على لقطات عامة لتم الحصول عليها بكميات كبيرة بما يكفي لجعل المراقبة صعبة.
2. المجهر مراقبة من مشاهد عامة
- إعداد عينة الفحص المجهري.
- وضع غرفة الحضانة لاصقة للفي الموقع تفاعل البلمرة المتسلسل والتهجين (حجم غرفة 9 ملم × 9 مم × 0.3 مم) على رأس غطاء زجاجي المجهر.
- باستخدام micropipette، عجلت إيداع 25 ميكرولتر من المخفف مشاهد عامة على المنطقة عينة وتضع على الفور غطاء زجاجي آخر (حوالي 0.15 مم) على الجزء العلوي من غرفة الحضانة.
- سجل الكونترا تدخل الفرقصور ر المجهري للمشاهد عامة.
- تسجيل صور المجهر الحويصلات مع المجهر (10X، 20X، 40X والأهداف) مجهزة مصباح هالوجين 12V100WHAL-L.
- إجراء مضان الملاحظات المجهر.
- إدراج وحدات مضان مرآة U-FBNA وU-FMCHE في المجهر. تناسب الوحدات مع 470-495 نانومتر، و565-585 نانومتر الإثارة مرشحات، على التوالي، ومع مرشحات الانبعاثات التي تنقل 510-550 نانومتر، و600-690 ضوء نانومتر، على التوالي.
Representative Results
ويتضح ث / س طريقة مستحلب الطرد المركزي فوتوغرافيا وتخطيطي في الشكل 1. الصورة التخطيطي في الشكل 1 تشير إلى أن العامل الأكثر أهمية لنجاح هذه الطريقة هو أن الثقل النوعي للمحلول مائي داخلي يجب أن تكون أكبر من ذلك من محلول مائي الخارجي، بحيث مشاهد عامة سوف يعجل أثناء الطرد المركزي. وبالإضافة إلى ذلك، وتشكيل أحادي الطبقة الشحمية في واجهة ث / س يتطلب أن يكون قد أدى إلى تثبيط النظام لمدة 10 دقيقة بعد الطبقات مستحلب على محلول مائي الخارجي. لأن شكل مشاهد عامة عن طريق التحويل من قطرات مستحلب عبر واجهة ث / س، يجب الضغوط الأسموزية في الطبقات المائية الداخلية والخارجية تكون هي نفسها. كتجربة السيطرة، فإننا مشاهد عامة أعد أيضا لا تحتوي على المجهرية عن طريق عملية هو موضح في الشكل (1) والخطوة 1.3، إلا أن محلول مائي داخلي كانأعدت دون المجهرية.
يتم عرض مجموعة من مشاهد عامة عجل بعد الطرد المركزي في الشكل 2. بالإضافة إلى المرحلة نصف شفاف في قاع microtube، لاحظنا أيضا، مرحلة وسيطة العكرة البيضاء في الخارجي مائي حل (الشكل 2A). وكانت هذه المرحلة المتوسطة الغنية في تجمعات المجهرية والنفط، في حين أن المرحلة أسفل احتوت على مشاهد عامة. ولذلك، بعد ثقب أسفل microtube مع الدبوس (الشكل 2B)، جمعنا فقط أول قطرة (الشكل 2C)، التي تحتوي على كميات هائلة من مشاهد عامة. من المهم للتأكد من أن يتم جمع ما لا يزيد عن اثنين من قطرات. قد تحتوي على أي قطرات إضافية تجمعات المجهرية والدهون، الأمر الذي سيؤدي في أقل كثافة من مشاهد عامة. تشتت حويصلي التي تم الحصول عليها في كثير من الأحيان تحتوي على مواد مغلفة خارج مشاهد عامة لأن مشاهد عامة ofteن تمزق أثناء الطرد المركزي. للحصول على مشاهد عامة فقط، وهي طريقة الفرز مثل غسيل الكلى، والترشيح هلام، أو مضان تنشيط الخلايا الفرز يجب أن يتم اختياره، ونظرا لأحجام مواد تغليف. إذا لزم الأمر للغرض الذي مشاهد عامة المترسبة هي لاستخدامها، فإنها يمكن أن تضعف مع محلول مائي الخارجي. في بعض الحالات، مددت المرحلة المتوسطة إلى أسفل الأنبوب، مما يشير إلى أن أي الحويصلات التي شكلت عقدت معا عن طريق النفط.
حصلنا التفاضلية المجهري تدخل والفحص المجهري مضان الصور من مشاهد عامة من دون المجهرية (الشكل 3A، 3B) ومع المجهرية (الشكل 3C -3 و). تمشيا مع تقارير سابقة 23، 37، تشكلت مشاهد عامة مع lamellarity أدنى من بروتوكول لدينا. الدهون مترافق مع تكساس الأحمر DHPE، والتي تنبعث fluores الحمراءcence استخدمت، بحيث تشكل الحويصلات يمكن التأكد من مباشرة التي تصور لغشاء رقيق. من 160 مشاهد عامة التي حصلنا عليها، كانت 55 المجهرية مغلفة و 105 فارغة، وإعطاء نسبة من التغليف من 34٪.
نحن مصممون على جزء من حجم (φ، المجلد٪) من المجهرية في مشاهد عامة من خلال الطريقة التالية. لأن كل GV يحتوي على عشرات إلى عدة مئات من المجهرية، عد كل المجهرية تحت المجهر الضوئي هو التحدي. ولذلك، فإننا خلط nonfluorescent 1.0 ميكرون المجهرية مع كمية صغيرة من المجهرية الفلورسنت، والتي تم عدها يدويا تحت المجهر مضان. تم احتساب عدد (N) من المجهرية مغلفة بضرب عدد (ن) من المجهرية الفلورسنت تحسب يدويا عن طريق 20 (على أساس الأصلي 95: 5 [ت / ت] نسبة nonfluorescent إلى المجهرية الفلورسنت). قيمة ال66. ثم المقدر كما نيفادا 100 / V، حيث الخامس هو حجم المجهرية والخامس هو حجم GV الفردية. لاحظ أن تقدير N من ن يؤدي إلى أخطاء العد، ويجب أن تؤخذ هذه الأخطاء في الاعتبار عند حساب φ. وقدرت قيمة φ من N، التي تم حسابها مباشرة الى 20 ن، وهذا بدوره أدى إلى احتمال أن φ يمثل بدقة القيمة الحقيقية هي <50٪. في الواقع، لا يتقلب إلى حد ما حول 20 ن، لذلك نحن بحاجة إلى أن تنظر فيه بوصفه 20 (ن ± ط)، حيث كنت هو الخطأ في ن. قدرنا انا من اجل ان احتمال ن ± ط يمكن أن يكون أكثر من 50٪ التي تم الحصول عليها على أساس توزيع بواسون. قدرنا ط، وهذا بدوره يسمح لنا لحساب 20 (ن ± ط) وقيم66. التي شملت عد أخطاء لمشاهد عامة بأقطار من 10 و 15 ميكرومتر (الجدول 1). ووفقا لهذا الإجراء، وقدرت نسبة حجم المجهرية في GV هو مبين في الشكل 3C أن تكون 11 ± 3٪ المجلد. كانت دقة حجم جزء يحسب 10-30٪.
نتائجنا تشير إلى أننا مغلفة بنجاح 1 ميكرون المجهرية في مشاهد عامة في جزء صغير الحجم الكبير. وكنا أيضا قادرا على تغليف المواد الأخرى في 100 مول٪ DOPC مشاهد عامة باستخدام نفس محلول مائي الخارجي ونفس البروتوكول (الشكل 4). على وجه التحديد، تم إعداد مشاهد عامة تحتوي على 0.1 ميكرومتر المجهرية من حل مخزنة تريس التي تحتوي على 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 0.15 M السكروز، و 0.5 المجلد٪ المجهرية الفلورسنت من خلال بروتوكول صفها للمشاهد عامة تحتوي على المجهرية 1.0 ميكرومتر ( الشكل 4A). بعد اعلاه بروتوكول الموصوفةه، DOPC مشاهد عامة تحتوي على GFP (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.5 درجة الحموضة]، 0.15 M السكروز، و 100 ميكروغرام / مل GFP، 4B الشكل) ومشاهد عامة تحتوي على uranine (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.5 درجة الحموضة]، 0.15 M السكروز، و 30 ميكرومتر uranine، الشكل 4C) أعدت أيضا.
| ن | N | φ (10 ميكرون قطر) | φ (15 ميكرون قطر) |
| 3 | 60 ± 20 | 6.0 ± 2.0 | 1.8 ± 0.6 |
| 4 | 80 ± 20 | 8.0 ± 2.0 | 2.4 ± 0.6 |
| 5 | 100 ± 20 | 10 ± 2 | 3.0 ± 0.6 |
| 6 | 120 ± 30 | 12 ± 4 | 3.6 ± 1.2 |
| 10 | 200 ± 32 | 20 ± 3 | 5.9 ± 0.9 |
| 20 | 400 ± 45 | 40 ± 5 | 12 ± 2 |
| 30 | 600 ± 55 | - | 18 ± 2 |
| تم تحديد من أخطاء كما هو موضح في النص؛ n = عدد المجهرية عدها يدويا. N = العدد الكلي للالمجهرية مغلفة. | |||
الجدول 1: أرقام وحجم الكسور (φ، المجلد٪) من الجزئي لذلك. تم تحديد من أخطاء كما هو موضح في النص؛ n = عدد المجهرية عدها يدويا. N = العدد الكلي للالمجهرية مغلفة.
الشكل 1: تدفق الفصل الفن والتخطيطي تصوير من W / O مستحلب الطرد المركزي الطريقة. (أ) حل النفط تتكون من DOPC وتكساس الأحمر DHPE (100: نسبة 0.3 الرحى) في البارافين السائل. (ب) تشتت مائي الداخلية تتكون من السكروز والمجهرية في عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك. (ج) محلول مائي الخارجي تتكون من الجلوكوز في المخزن تريس، حمض الهيدروكلوريك. (د) خليط من 1 مل من محلول النفط و 300 ميكرولتر من تشتت مائي داخلي. (ه) الاستحلاب مع الخالط (10،000 دورة في الدقيقة، 2 دقيقة). (و) ث / س مستحلب. (ز) التصفيف من 300 ميكرولتر من مستحلب في 1 مل من محلول مائي الخارجي. (ح) معجل مشاهد عامة فقط بعد الطرد المركزي. (ط) تصوير تخطيطي لمبدأ ث / س طريقة مستحلب الطرد المركزي. ويشير السهم الأسود في اتجاه تسريع الطرد المركزي. .jpg و"الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ثقب من Microtube. (أ) معجل مشاهد عامة فقط بعد الطرد المركزي (يصور أيضا في الشكل 1H). ويشير القطع الناقص الأحمر في قطرة من تشتت GV عجل. (ب) ثقب من microtube مع الدبوس. تم الحصول على بيليه الذي يحتوي على مشاهد عامة من خلال ثقب microtube بالقرب من أسفل مع الدبوس وجمع قطرات من الحفرة. (ج) القطرة من مشاهد عامة المترسبة (المشار إليها الأصفر السهم) تشتت المخفف مع محلول مائي الخارجي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
together.within الصفحات = "1"> 
الشكل (3): صور مجهرية من مشاهد عامة. (أ) صورة التدخل التفاضلية النقيض المجهري لGV دون المجهرية. وكان قطر GV حوالي 10 ميكرون. شريط النطاق = 10 ميكرون. صورة مجهرية (ب) الإسفار من GV دون المجهرية. من انبعاث مضان أحمر من تكساس الأحمر DHPE. (ج) التفاضلية صورة مجهرية تدخل على النقيض من GV تحتوي على المجهرية. (د) الإسفار المجهري صورة من 1.0 ميكرون المجهرية (المجهرية YG الكربوكسيل) داخل GV. وكان عدد من المجهرية الفلورسنت تحسب (ن) 6. قدرنا الأخطاء (ط = 2) على أساس توزيع بواسون. ثم قدرنا العدد الكلي للالمجهرية الداخلية (N = 20 (ن ± ط)) كان 120 ± 40. وقد حسبت أنGV الواردة 1.0 ميكرون المجهرية في جزء صغير الحجم (φ = نيفادا 100 / V) ما يقرب من 11 ± 3 المجلد٪، حيث الخامس هو حجم المجهرية والخامس هو حجم مشاهد عامة. (ه) الإسفار المجهري صورة غشاء GV. من انبعاث مضان أحمر من تكساس الأحمر DHPE. (و) مدموجة صورة من الصور في لوحات d و e. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التفاضلية التدخل التباين ومضان المجهري صور من مشاهد عامة مع المواد مغلف مختلفة. المجهر فرق التدخل النقيض (أعلى) والمجهري مضان (القاع) صورمشاهد عامة تحتوي على (أ) 0.1 ميكرون المجهرية، (ب) GFP، و (ج) uranine. الحانات النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يجب أن يتم اختيار النوعي للالمائي الداخلي المتوسطة التشتت ومحلول مائي الخارجي بعناية. لث / س مستحلب ليعجل في محلول مائي الخارجي أثناء الطرد المركزي، يجب أن يكون الثقل النوعي للداخلية المتوسطة تشتت مائي أكبر من ذلك من محلول مائي الخارجي. حاولنا لإعداد مشاهد عامة باستخدام الحلول الداخلية والخارجية دون السكريات، ولكن حصلنا على أي مشاهد عامة في ظل هذه الظروف، لأن محلول مائي داخلي لم يكن لديها كتلة كافية لعبور التداخل بين المرحلتين. إذا كان هناك اختلاف الضغط الاسموزي كبير بين الحلين، مشاهد عامة أن يعجل في محلول مائي الخارجي قد يتقلص أو تمزق. لذلك، يجب أن يكون الضغط الاسموزي داخل وخارج مشاهد عامة المساواة. ولتحقيق ذلك، كنا السكروز كما المذاب في تشتت مائي داخلي والجلوكوز كما المذاب في محلول مائي الخارجي؛ وكانت كل من السكريات في نفس التركيز. كل من الملحSS = "XREF"> 22 والسكر 23، 35، 38 وقد استخدمت لهذا الغرض، ولكن تستخدم السكر عادة لأنه أقل سمية وأكثر قابلية للذوبان من الملح. ومع ذلك، إذا تم إضافة الكثير من السكر، قد حان لقطات عامة لفي اتصال مع الجزء السفلي من الزجاج غطاء والانهيار. هناك عدة استراتيجيات لتجنب هذا. استراتيجية واحدة هي لتقليص الفارق الثقل النوعي بين الحلول الداخلية والخارجية المائية بحيث مشاهد عامة تترسب تحت ظروف معتدلة. على وجه التحديد، وطاف تشتت GV عجلت يمكن تبادلها مع حل مطابق للمحلول مائي الداخلي للحد من إمكانية تمزق الحويصلي من الالتصاق على الزجاج غطاء نتيجة الطفو. استراتيجية أخرى هي precoat كلا من النظارات غطاء مع رقيقة الدهون فيلم 29.
الإعداد المناسب وحضانة مستحلب وأهمية. كنا البارافين السائل لإعداد الحل النفط. الزيوت المعدنية 26، 31، الدوديكان 21، 33، وsqualane 33 و 39 وأيضا كثيرا ما يستخدم الزيوت المذيبات. لأن هذه المواد تختلف في الثقل النوعي، اللزوجة، والتوتر السطحي، أعداد مختلفة من الحويصلات تشكل حتى عند استخدام ظروف الطرد المركزي نفسها 33. للحصول على الحويصلات مع خصائص الهدف، لا بد من تحسين جاذبيات واللزوجة من المحاليل المائية الداخلية والخارجية محددة فضلا عن إعداد acceleration.For الطرد المركزي للمرحلة النفط، يجب أن يحدث حضانة في درجة حرارة عالية وجافة البيئة مثل حاضنة أو ديهيدراتور. في هذه الدراسة، ونحن تسخين البارافين السائل إلى 80 درجة مئوية إلى حل تماما الدهون molecules.In بالإضافة إلى ذلك، ينبغي مستحلبتكون على استعداد فقط حسب الحاجة ويجب أن يخضع فورا إلى الطرد المركزي لأنه غير مستقر بعد إعدادها و ث / س قطرات تلتحم بسهولة مع بعضها البعض. مستحلب يمكن تحضير كميات كبيرة من صوتنة، vortexing ل، أو التنصت. ومع ذلك، باستخدام الخالط يسمح للتحضير السريع لكميات كبيرة من مستحلب وأسهل استحلاب في النفط مع اللزوجة العالية. ومن المهم أيضا أن الطبقات مستحلب على محلول مائي الخارجي بلطف وبسرعة ثم يبرد في 4 درجات مئوية. لاختصار الوقت بين استحلاب والطرد المركزي، ونظام محلول مائي النفط الخارجي يمكن prechilled قبل الطبقات مستحلب على ذلك، والنظام برمته ويمكن بعد ذلك طرد immediately.If كان التعكر الأبيض يبدو أسرع أو أبطأ من المعتاد، والميكانيكية الخالط يجب أن تشطف جيدا لإزالة المنظفات التنظيف. وبالإضافة إلى ذلك، قبل استحلاب، يجب أن يكون الحل النفط، محلول مائي داخلي، ومستحلب صeturned إلى درجة حرارة الغرفة.
تسارع الطرد المركزي السليم مهم أيضا. بواسطة الطرد المركزي في 18000 ز س، كنا قادرين على إعداد مشاهد عامة مع المواد الداخلية واحدة مغلفة في تركيز عال. عندما يطلب من تغليف المواد متعددة، فمن الأفضل للحد من تسارع الطرد المركزي. على سبيل المثال، وقد تحقق نظام تجميع الأكتين التغليف سبع مركبات مع الطرد المركزي في أقل من 350 غرام × 35. في الحالات التي الطرد المركزي غير مرغوب فيه، لقطات عامة يمكن الحصول عليها عن طريق ضبط تركيز السكر أو عجل مستحلب تحت تأثير كتلته الخاصة 38، 40، 41.
طريقة ذكرت هنا واثنين من القيود الرئيسية. واحد هو أن جزيئات النفط (البارافين، في هذه الحالة) يمكن أن تذوب في غشاء GV، كما أشار إلى ذلك Weitض مجموعة 21. عندما يكون المطلوب الإدراج من بروتين الغشاء في غشاء GV، يجب النظر في آثار جزيئات النفط تتعايش على البروتين. الحد الآخر هو اختلاف حجم الكسر. في هذه الدراسة، قدرنا أن الكسور حجم المجهرية في مشاهد عامة تراوحت 4-30 المجلد٪، وكانت الكسور حجم يست متطابقة إلى نسبة حجم من محلول مائي الداخلي المستخدمة لإعداد GV. على الرغم من أننا كنا قادرين على تغليف المجهرية في مشاهد عامة في جزء حجم عالية بما فيه الكفاية لمراقبة المجهر، وهذه الطريقة ليست مناسبة لإعداد مشاهد عامة مع توزيع جزء حجم موحد. وقد أفيد أن توزيع microsphere حجم كسور يتغير أثناء الطرد المركزي 34.
يتم استخدام ث / س طريقة مستحلب الطرد المركزي عادة لتشكيل مشاهد عامة تحتوي على مواد مغلفة. ومع ذلك، فقد وصفت بعض التقارير عجبر مشاهد عامة التغليف المواد الميكروسكيل 34، 42. مؤخرا، تم بناء الروبوتات الجزيئية التي تحتوي على جهاز الحمض النووي مغلفة أو جهاز الجزيئي 43 و 44. مشاهد عامة مع مقصورات هي الخيار الأول لهذه الأنواع من التطبيقات؛ وبالتالي، التقنيات، مثل بلدنا، التي يمكن أن تستخدم لتغليف المجهرية المغناطيسية والمجهرية مع functionalization سطح متنوعة من المتوقع أن يكون مفيدا 44.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر توموكو ياماغوتشي لرسم صورة تخطيطية في الشكل 1. وأيد هذه الدراسة من قبل مشروع أوكازاكي ORION معهد أوكازاكي التكاملي العلوم البيولوجية من ذي جلف توداي معاهد العلوم الطبيعية (NINS)؛ من مشروع مركز البيولوجيا الفلكية (لا AB281010.) من NINS. بواسطة منحة في والمساعدات للبحوث العلمية في المجالات المبتكرة (ترتيب الديناميكية للنظم البيولوجية الجزيئية لخلق وظائف متكاملة) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) (بدون 25102008)؛ بواسطة منحة في والمساعدات للعلماء الشباب (ب) (لKK، لا 15K17850.) من JSPS. andby منحة في والمساعدات للبحوث آخر للبدء في إنشاء (لYN، لا. 15H06653) من JSPS. وقدم دعم إضافي من خلال منحة من معهد نوغوشي، منحة من مؤسسة كاو للفنون والعلوم، ومنحة من المياه KURITA ومؤسسة البيئة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
| Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
| Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
| GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT: | |||
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
| Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy microhomogenizer |
| Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
| Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
| Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470 - 495 nm Emission filter: 510 - 550 nm |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565 - 585 nm Emission filter: 600 - 690 nm |
References
- Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
- Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
- Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
- Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
- Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
- Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
- Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L.
- Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
- Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
- Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
- Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
- Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
- Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
- Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
- Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683 (2016).
- Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
- Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
- Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
- Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853 (2014).
- Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
- Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).
