Summary
Här visar vi en enzymatisk metod för att isolera primära hepatocyter från vuxna möss, och vi beskriver kvantifiering av ett inflammatoriskt svar med användning av ELISA och realtids-PCR.
Abstract
Levern spelar en avgörande roll i regleringen av systemisk inflammation. Vid kronisk njursjukdom i synnerhet reagerar levern som svar på uremiskt miljö, oxidativ stress, endotoxemi och minskad clearance av cirkulerande proinflammatoriska cytokiner genom att producera ett stort antal akut-fasreaktanter. Experimentella verktyg för att studera inflammation och den underliggande roll hepatocyter är viktigt att förstå reglering och bidrag lever cytokiner till en system akutfassvar och en långvarig pro-inflammatoriska scenario, särskilt i ett intrikat miljö såsom kronisk njursjukdom. Sedan studera komplexa mekanismer för inflammation in vivo förblir utmanande, resurskrävande och kräver vanligen användning av transgena djur, primära isolerade hepatocyter ger ett kraftfullt verktyg för att få mekanistiska insikter lever akutfasreaktion. Eftersom detta in vitro-teknik har måttliga kostnader, hög reproducerbarhet och gemensam teknisk kunskap, primära isolerade hepatocyter kan också lätt användas som en screening. Här beskriver vi en enzymatisk baserad metod för att isolera primära murina hepatocyter, och vi beskriver bedömningen av ett inflammatoriskt svar i dessa celler med hjälp av ELISA och kvantitativ realtids-PCR.
Introduction
Kronisk njursjukdom (CKD) kan definieras som ett tillstånd av akut och kronisk inflammation en. Hos patienter med kronisk njursjukdom, serumnivåer av phosphaturic hormonet fibroblasttillväxtfaktor 23 (FGF23) successivt öka för att bibehålla serumfosfat homeostas 2. Ökade serum FGF23 nivåer är oberoende i samband med kardiovaskulär morbiditet och mortalitet bland patienter som börjar hemodialysbehandling tre, fyra. Dessutom har flera kliniska studier visat en stark korrelation mellan förhöjda FGF23 nivåer och serumnivåer av C-reaktivt protein (CRP), interleukin-6 (IL-6) och tumömekrosfaktor α (TNF) 5, 6. Dessutom i en experimentell studie, har vi nyligen visat att FGF23 direkt kan rikta hepatocyter och orsakar ett inflammatoriskt svar genom att öka CRP och IL-6 produktion i levern 7. Därför kan FGF23 fungera som en cirkulerande faktor som bidrar till systemisk inflammation i CKD.
I början av 70-talet, primära hepatocyter isolerades och studerades för första gången 8. Sedan dess primära odlade leverceller har i stor utsträckning använts för att undersöka metabolisk behandling, hormonella funktion, läkemedelsmetabolism och toxicitet samt immunitet och inflammatoriska svar 9, 10. Tidigare protokoll har främst beskrivit enzymatiska isolering av primära hepatocyter från human levervävnad 11, 12. Medan en utmärkt modell, lämnar ut det här möjligheten att studera hur genetisk manipulation påverkar komplexa leversignaleringsmekanismer samt funktionella konsekvenser vid olika typer av stimuli. I det följande beskriver vi isoleringen av murina primära hepatocyter. Notably, kan effekten av flera mediatorer av den hepatiska akutfasreaktion, såsom lipopolysackarid (LPS), IL-6 och FGF23 analyseras på ett enkelt, snabbt och reproducerbart sätt 13.
Häri presenterar vi ett protokoll för enzymatisk isolering av hepatocyter från vuxna möss, och vi visar att etablerade inducerare av inflammation, såsom LPS och IL-6, samt nya inflammatoriska mediatorer, såsom FGF23, direkt kan stimulera uttryck och utsöndring av inflammatoriska cytokiner, såsom CRP och IL-6 i odlade hepatocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll och experimentella förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Miami Miller School of Medicine.
1. Beredning
- Förvärm leverperfusion media och levern smälta media i ett vattenbad vid 37 ° C.
- Inrätta en perfusion pump (30 ml / min). Noggrant Prefill slangsystemet hos pumpen med leverperfusion media. Undvika eventuella luftbubblor i systemet och förbereda den stereotaktiska mikroskop.
- Coat cellodlingsskålar med användning av kollagen typ I enligt tillverkarens protokoll.
2. Lever Recovery
- Söva givaren musen med syre / isofluran inandning (isofluran 4% / 2 L / min syre).
- Upprätthålla anestesi genom att sänka isofluran till 2-2,5% eller genom att injicera ketamin (100 mg / kg kroppsvikt intraperitonealt) och xylazin (10 mg / kg kroppsvikt intraperitoneally). Kontinuerlig isoflurananestesi är att föredra eftersom ketamin sänker blodtrycket och kan orsaka levertoxicitet.
- Placera sövda musen på en absorberande dyna. Fäst mus extremiteter med tejp.
- Raka och desinficera buken av musen och utföra en ventral laparotomi från pubis till hjärn gränsen i levern med hjälp av kirurgiska saxar med vassa / trubbiga tips. Incisionsfilm bukväggen på båda sidor, kaudalt av membranet.
- Exponera den nedre hålvenen (IVC) genom att försiktigt flytta tarmen till den högra sidan. dissekera noggrant fettvävnad runt IVC användning av sterila bomulls spets pinnar och vinklad spets pincett.
- Incise suprahepatic membranet och öppna brösthålan med två sido snitt med fina kirurgiska saxar med skarpa / vassa spetsar. Ligate bröst IVC använder kirurgiska siden (5/0).
- Cannulate infrarenala IVC med hjälp av en skärmad iv kateter, försiktigt bort nålen,anslut perfusion pumpen och börja perfusion av levern. Om det utförs på rätt sätt, bör levern omedelbart börja blekna och svälla.
- Transekt portvenen tillåta lämplig dränering av blod och perfusion medier med fina kirurgiska saxar.
- BEGJUTA levern med cirka 30 ml leverperfusion media, och sedan byta till levern smälta media (30 ml). Stäng av perfusion pumpen och ta bort kanylen när perfusionen är klar.
- Försiktigt exponera de centrala delarna av levern och lokalisera bindväv som förbinder de lever lober. Ta den centrala förbindelse fibrerna och noggrant dissekera alla vävnader som håller levern på plats och försiktigt bort levern.
- Överför omedelbart levern i en 50 ml polypropylen koniska rör som innehåller 15 ml lever smälta media.
OBS: Det finns ingen specifik tidslinje för detta steg. Efter perfusion förblir levern i Digest media för transport till en steril cellodling huva. alla ärubsequent steg skall utföras i en steril miljö.
3. Isolering och behandling av celler
- Inom en cellkultur huva, överföra levern från 50 ml polypropylen koniska rör innehållande matsmältningen medier i en steril vävnadsodlingsplatta.
- Använda steril pincett, försiktigt riva de fyra lober i levern. Om det utförs på rätt sätt, bör matsmältning mediet blir grumlig på grund av att isolera hepatocyter från levern.
- Med hjälp av en 25 ml steril pipettspets, filtrera grumliga matsmältning mediet genom ett 70 pm nylon cell sil i en ny 50 ml polypropylen koniska rör för att avlägsna osmälta vävnadspartiklar och cellrester.
- Upprepa steg 3,2 och 3,3 med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Detta hjälper till med att ta bort eventuella rest hepatocyter från levern.
- Centrifugera vid 50 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten innehållande överskott av cellrester och försiktigt återsuspendera celler i 25 ml kall 1xWilliams Medium E.
- Med användning av en 25 ml steril pipettspets, filtrera resuspension genom ett nytt 70 | im nyloncellfilter in i ett 50 ml polypropen koniskt rör för att uppnå en renare suspension.
- Upprepa steg 3,5 och 3,6 för ytterligare tre tvättar med kallt Williams Medium E 1x att få en tydligare cellsuspensionen.
- Efter den sista tvättsteget, för att aspirera supernatanten avlägsna överskott cellrester. Återsuspendera och filter celler i 25 ml varm Williams Media E 1x som innehåller primära hepatocyte upptining och plätering tillskott genom en ny 70 pm nylon cell sil i en 50 ml polypropylen koniska rör.
- Räkna celler i 25 ml cellsuspension med användning av en hemocytometer. I genomsnitt räknar 15 - 20 miljoner celler per vuxen lever. Bestämma cellviabiliteten med användning av trypan blue-färgning.
- Plate celler i 2 ml Williams Media E 1x som innehåller primära hepatocyte upptining och plätering tillskott på en kollagenbelagd sex brunnar cell kultur kluster (9 x 10 5 celler per brunn).
- Efter 4 timmar, byta media till Williams Media E 1x som innehåller primära hepatocyter underhålls tillskott.
- Efter 24 h serum svälta celler med Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) medium 1x för 6 timmar.
- Behandla celler med PBS som vehikel, FGF23 (25 ng / ml), LPS (100 | ig / ml) eller IL-6 (50 ng / ml) i serumfritt medium och inkubera i 24 h.
4. Isolering av RNA
- Förbereda RNA med användning av en kommersiell spinnkolonn kit enligt tillverkarens instruktioner.
5. Generera cDNA från isolerat RNA genom omvänd transkription
- Tillsätt 200 ng isolerat RNA-prov till ett PCR-rör.
- Lägga 14 mikroliter av endonukleas fritt H2O till PCR-rör från steg 5,1.
- Tillsätt 4 | il av omvänt transkriptas för att PCR-rör från steg 5,1.
- Återsuspendera innehåll försiktigt för att göra blandningen homogen; centrifugera försiktigt. Placera PCR-rör innehållande blandningen i en termocykler. Köra termocykler för omvänd transkription: 1 cykel av 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) och håll sedan vid 4 ° C. Den slutliga produkten kommer att vara den önskade cDNA.
6. Analys av celler genom kvantitativ realtids-PCR (qPCR)
- Förbered 96-brunnar.
- Placera alla komponenter i qPCR reaktion på is: en mikroliter cDNA, 0,25 | iM framåtriktad primer, 0,25 | iM bakåtriktad primer, 5 mikroliter SYBR Green, 3,5 mikroliter PCR-kvalitet vatten till en total volym av 10 mikroliter. Med hjälp av SYBR Green, förbereda Master Mix för att köra alla prover i tre exemplar.
- När Master Mix är klar, att virvel göra homogen. Alikvotera 9 mikroliter av qPCR Master Mix i varje brunn i en 96-wll platta. Efter, tillsätt försiktigt 1 ^ il av cDNA i varje brunn. Total reaktionsvolym kommer att bli 10 | il.
- Efter laddning är klar, försegla 96-brunnars platta med optiskadhesiva filmen och centrifugera kort 96-brunnars platta (50 x g under 1 min).
- Kör prover i realtid-PCR instrument. Placera förseglade 96-brunnar i realtid-PCR instrument och köra prover som per instrumenttillverkarens rekommendationer. Exempel på standard och snabba cykler ingår nedan.
- För standardcyklingsparametrar, använd följande: initial denaturering vid 94 ° C under 120 s, därefter 40 cykler av 94 ° C under 15 s, 60 ° C under 60 s, och därefter eventuellt håll vid 4 ° C.
- För snabba cykelparametrar: använda följande: initial denaturering vid 94 ° C under 30 s, därefter 40 cykler av 95 ° C under 5 s, 58 ° C under 15 sekunder, och sedan 72 ° C under 10 s.
- Se instrumentmanual för vägledning om hur man analyserar data.
7. Analys av cellsupernatanter genom ELISA
NOTERA: Alla steg utförs enligt tillverkarens protokoll.
- Fördela 398 mikroliter utspädningsmedel i separata rör. Pipett 2 mikroliter av cellvätskan provet i 398 mikroliter utspädningsröret. Detta kommer att ge en utspädning veck 200.
- Upprepa steg 7.1.1 för varje prov som skall testas.
- Pipettera 100 mikroliter av 200-faldigt utspädda provet och en standard i brunnar i en 96-brunnars platta.
- Inkubera 96-brunnars platta vid 25 ° C under 45 min på en mikroplattskakanordning vid 150 rpm.
- Tvätta brunnarna 5 gånger med 1 x tvättbuffertlösning. När den sista tvättningen är klar, ta bort alla kvarvarande tvättlösning med absorberande papper.
- Tillsätt 500 mikroliter av HRP-konjugat-reagens i varje brunn.
- Upprepa steg 7.2.2 - 7.2.3.
- Pipettera 100 mikroliter av tetrametylbensidin (TMB) reagens i varje brunn i 96-brunnars platta.
- Blanda försiktigt 96-brunnars platta vid 25 ° C under 20 min på en mikroplattaskakanordning vid 150 rpm. Stoppa reaktionen genom att direkt tillsätta 100 pl av stopplösning till varje brunn och blanda försiktigt. När stopplösningen tillsätts färgen ska gulna. Detta informerar att stopplösning har blivit korrekt blandade.
- Med användning av en mikrotiterplattläsare, fastställa den optiska densiteten vid 450 nm i den första 5 min.
- Beräkna en tabell av genomsnittliga absorbansvärden (A 450) för varje prov och varje standard.
- Montera en standardkurva genom att plotta A 450 medelvärdet för varje standard mot dess standardkoncentration i ng / ml på en linjär graf. Tillåta x-axeln för att representera koncentrationen och y-axeln för att representera A 450 värden.
- Med användning av detta A 450 från varje utspätt prov, bestämma koncentrationen av det önskade proteinet i ng / ml från standardkurvan.
- Multiplicera provkoncentrationen med utspädnings factor. Detta kommer att möjliggöra bestämning av verkliga koncentrationen av det önskade proteinet i cellöverstående prov.
- Rita konstruerade tabellen från prover till ett linjediagram. Om OD 450 värden faller utanför standardkurvan bör proverna spädas på lämpligt sätt och testas på nytt.
- Normalisera resultaten till 500.000 celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histologi
Representativa ljus mikroskopiska bilder av primära isolerade och odlade celler visas i Figur 1A. Immunocytokemisk analys visar att isolerade hepatocyter uttrycker starkt albumin (röd) liksom fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) (grönt). Kärnor färgades med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå). (Figur 1B).
Kvantitativ realtids-PCR
Primära isolerade hepatocyter behandlades med FGF23 (25 ng / ml) LPS (100 | ig / ml) eller IL-6 (50 ng / ml) under 24 h och mRNA-nivåer av CRP och IL-6 analyserades genom kvantitativ realtids-PCR . FGF23, LPS och IL-6 markant ökat uttryck av CRP och IL-6. (Figur 2A)
Cellodlingssupernatanter från isolerade primära hepatocyter analyserades med ELISA för CRP-nivåer. I linje med vår kvantitativ realtids-PCR-analys, LPS, IL-6 samt FGF23 behandlingar ökat kraftigt CRP-nivåer i cellsupernatanter jämfört med PBS-behandlade celler. (Figur 2B)
Figur 1: (A) Faskontrast mikroskopisk bild av isolerade murina primära hepatocyter. 24 timmar efter plätering celler uppvisar en hexagon liknande form och ofta verkar bi-kärnbildas. (Skalstreck = 100 | am); (B) Immunofluorescens mikroskopisk analys avslöjar att majoriteten av isolerade celler uttrycker albumin (röd), en hepatocyt-specifik markör. Celler också mycket uttrycka FGFR4 (grön). DAPI fläckar kärnor. Ursprunglig förstoring 40X. (Skala bar = 50 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kvantitativ realtids-PCR analys av isolerade Murina primära hepatocyter att bestämma CRP och IL-6 Expression. (A) LPS, IL-6 och FGF23 behandlingar öka avsevärt mRNA-nivåer av CRP vid jämförelse med PBS-behandlade celler. (Värden uttrycks som faldig förändring ± SEM, p <0,01, n = 3 oberoende isoleringar). (B) Celler behandlade med LPS, IL-6 eller FGF23 visar också en betydande ökning av mRNA-nivåer av IL-6 jämfört med PBS behandlingar. (värden uttrycks som faldig förändring ± SEM, p <0,001; n = 3 oberoende isoleringar) (C) Kvantifiering av CRP-proteinnivåer isupernatanter från isolerade murina primära hepatocyter genom enzymkopplad immunsorbentanalys (ELISA). LPS, IL-6 och FGF23 öka avsevärt CRP proteinnivåer i jämförelse med PBS behandlingar. Värden representerar CRP koncentrationer i mg / dl per 500.000 celler. (P <0,05, n = 3 oberoende isoleringar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolera primära hepatocyter från möss är ett snabbt, billigt och tillförlitligt verktyg för att studera inflammatoriska responser ex vivo. Om det utförs på rätt sätt, kan resultaten lätt genereras och återges på ett lämpligt och kostnadseffektivt sätt. bör bedömas följande punkter noggrant för att säkerställa en lyckad isolering.
Det kirurgiska ingreppet och kanylering av IVC bör utföras under narkos och inte efter dödshjälp. En ung, oerfaren utredare kommer att behöva mer tid i början att bli bekant med de anatomiska särdrag hos mus buken och utföra en korrekt kanyle. Att hålla donatordjuret lever tills perfusion startar, kommer att öka lönsamheten av isolerade celler. Ligering av den överlever IVC skall ske, eftersom det kommer att avsevärt öka utbytet av isolerade hepatocyter. Alternativt kan en mikrokirurgisk klämma placeras på IVC.Emellertid efter torakotomi, kommer djuret att bli avliden inom ett par minuter. Därav alla efterföljande steg ska utföras snabbt för att säkerställa att levern bibehåller tillräckligt blodflöde tills initiering av perfusion. För kanyle är användningen av en infällbar intravenös kateter rekommenderas. Efter kanyle IVC, kan kateter nålen försiktigt tillbaka, vilket minimerar risken för fartygets perforering. Det sista kritiska steget är anslutningen av perfusionssystemet till katetern. Efter avlägsnande av nålen från katetern, bör blodet rinna ut ur änden av katetern innan du ansluter den till en perfusion pump. Detta steg minimerar risken för att luft-emboli, vilket kan orsaka en signifikant minskning av mängd samt kvaliteten på isolerade celler.
När perfusionen inleds ska levern omedelbart och homogent ändra färg från rött till en blekgul. Delar återstående röda indikerar insufficient perfusion eller närvaro av luft-emboli. bör upprepade gånger utföras tvättning och filtrering av isolerade celler. Detta kommer att säkerställa effektivt avlägsnande av överskott av cellrester. Friska isolerade hepatocyter vidhäftar inom de första 4 h av pläteras. Följaktligen kan plätering media ändras till underhållsmedium vid denna tidpunkt. Efter inkubation över natten, kommer cellerna att visas i en mer hexagonal form med en framträdande kärna. Hepatocyter kan också vara bi-nukleär (Figur 1A). Granulering eller cellulär blåsbildning är en indikator för en dålig isolering. Om hepatocyter kontinuerligt inte fäster ordentligt eller cellviabiliteten förblir låg, bör mängden matsmältnings media som används för perfusion ändras. Detta bör undvika över- eller underdigestion av levervävnad.
Om det krävs en högre avkastning av celler, kan en antero perfusion via portådern utföras. Klaunig et al. har visat att denna speciella teknik kan öka den totala cellutbyte. alternatively kan följande portvenen kanyle intermittent spännan av IVC tillämpas. Detta kommer med jämna mellanrum att öka trycket under perfusion och förmodligen även kan öka antalet isolerade celler. Perfusion tid samt perfusionshastighet kan behöva justeras 14. Men vi har inte utfört alternativa perfusion protokoll.
Efter en första lyckad isolering, bör en hepatocyte specifik immunfärgning (t.ex. för albumin) utföras för att säkerställa renheten hos isoleringen (Figur 1B). 24 timmar efter isolering, bör hepatocyter vara serum svalt för fyra till åtta timmar och sedan används för behandlingar. När man studerar den akutfassvar, kan celler behandlas med LPS, som är kända för att inducera inflammation via Toll-like receptor 4 och NF-kB 15. Pro-inflammatoriska cytokiner, såsom IL-6, förmedlar sina effekter genom interleukin receptorer 16.Dessutom har vi nyligen visat att FGF23 kan aktivera FGFR4 och PLCγ / kalcineurin / NFAT vägen och framkalla en inflammatorisk reaktion i levern 7, 17. För att säkerställa tillräcklig transkription och translation av målgener bör celler behandlades i 24 h. Isolering av mRNA och på varandra följande analys av genuttryck med användning av kvantitativ realtids-PCR tillsammans med ELISA av cellsupernatanter ger robust information som lätt kan upprepas. Detta medger undersökningen av nya pro-inflammatoriska mediatorer, dess hepatiska receptorer och deras på varandra följande nedströmssignaleringsmekanismer. Isolerade primära celler, speciellt från transgena djur kommer att ge bättre resultat jämfört med generiska cancercellinjer såsom HepG2 och Hep3B celler. På grund av sin enkelhet, kan även användas denna metod för visningar för att undersöka effekten av nya läkemedel. Ändå studera komplexa farmakologisk eller pato-physiologiska mekanismer kommer att kräva ytterligare bekräftande experiment, huvudsakligen i en in vivo-miljö.
Vi har inte utfört långtidsstudier sedan isolerade hepatocyter tenderar att dedifferentiate inom ett par dagar. Detta kan dock övervinnas genom speciella cellodlingsteknik, som rapporterats av andra 18. Dessa inkluderar en kollagendubbel gel konfiguration, hepatocyt sfäroider, samodling med endotelceller, och micropatterned samkulturer med 3T3-J2 fibroblaster. Sammantaget isolering av primära murina vuxna hepatocyter ger ett kraftfullt verktyg för forskare som är intresserade av metabolomik, inflammation, immunitet och lever svar på droger och gifter. Den kännetecknas av enkla genomförbarhet, måttliga kostnader och snabb reproducerbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH (R01HL128714 till CF) och (F31DK10236101 till KS) och American Heart Association (CF och AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
