Summary
Skalerbare konstruert blodkar ville forbedre klinisk anvendelse. Ved hjelp av lett sizable 3D-trykt guider, ble ringer av vaskulær glatt muskulatur laget og stablet inn i en rørformet form, danner en vaskulær pode. Grafts kan være dimensjonert for å møte spekter av menneskelige koronar dimensjoner ved å endre 3D-trykt guide størrelse.
Abstract
Koronarsykdom er fortsatt en ledende dødsårsak, påvirker millioner av amerikanere. Med mangel på autologe vaskulære implantater tilgjengelige, utviklet grafts har stort potensial for pasientbehandling. Imidlertid utviklet vaskulære implantater er vanligvis ikke lett skalerbar, noe som krever fremstilling av tilpassede former eller polymer-rør for å tilpasse til forskjellige størrelser, som utgjør en tidkrevende og kostbar praksis. Menneske arterier varierer i lumen diameter fra ca 2,0 til 38 mm og veggtykkelse fra ca 0,5-2,5 mm. Vi har laget en metode, kalt "Ring Stabling Method", hvor variable størrelse ringer av vev av den ønskede celletype, demonstrert her med vaskulære glatte muskelceller (SMC), kan lages ved hjelp av guider av senter innlegg å kontrollere lumen diameter og ytre skall for å diktere fartøyet veggtykkelse. Disse vev ringene blir deretter stablet for å skape en rørformet konstruksjon, etterligne den naturlige formen av et blodkar. Fartøyet lengde kan be skreddersydd ved ganske enkelt å stable den nødvendige antallet ring å utgjøre lengden nødvendig. Med vår teknikk, kan vev av rørformede former, tilsvarende til et blodkar, kan lett fremstilles i en rekke dimensjoner og lengder for å tilfredsstille behovene til klinikken og pasienten.
Introduction
I behandling av koronarsykdom (CAD), er en pasientens egne blodårer høstet som pode materiale for bypass operasjon. Men ofte, syke pasienter trenger ikke levedyktige fartøy å donere til seg selv, og i tilfeller der de gjør, fører donor området betydelig ytterligere skade og har en alvorlig risiko for infeksjon. 1 Engineered vaskulære implantater kunne fylle dette behovet. Skalerbarhet er av største betydning for tekniske fartøy for å møte det store omfanget av pasient fartøy størrelse krav. Men dagens metoder for tekniske fartøy ikke er lett skalerbar, og vanligvis krever ombygging av komplekse former eller polymer stillaser. Mest konstruert grafts enten anvende en polymer rørformet stillas som er podet med vaskulære fibroblaster, glatte muskler, eller endotelceller; eller rulle en cellefolien rundt en dor for å skape en vev rør. To konstruert vaskulære implantater i kliniske studier er basert på en decellularized polymer-ECM-plattform. 2, 3, 4 Polymer transplantater som er tilgjengelige for bruk i vaskulær reparasjon er allerede kjent for å ha problemer med åpenhet, som kan oppstå som et stort problem med langvarig anvendelse av en podet med en vedvarende tilstedeværelse polymer. Rørformede formene har blitt brukt til å fremstille helt cellulære fartøy, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, som prosedyrene ville kreve ytterligere utforming og verktøy produksjon for tilpassede støpeformer for å fremstille fartøyer i en rekke størrelser .
Metoden beskrevet her omfatter en ny teknikk for å lage enkelt skalerbar konstruert vaskulærgrafts hjelp passelig 3D trykte innstikk og tradisjonelle kulturskåler. 14 Cellene blir sådd ut plater med inserts av en sentral post og ytre skall. Innlegget kontroller lumen diameter og lar cellen monolayer å selv montere inn en ring av vev. Det ytre skall styrer tykkelsen av ringen, og dermed veggtykkelsen av den endelige beholderen. Utførte vev ringene blir deretter stablet for å danne en rørformet, vaskulær transplantasjon. Fordelen med denne metoden, betegnet "ringen stables Method", er at en eventuell vedhengende celletype kan bli sådd ut på platen oppsett og vev ringer eller rør av enhver størrelse som er nødvendig for den ønskede anvendelse kan dannes ved ganske enkelt å modifisere ledeinnsatser. Sammenlignings teknikker i tissue engineering oppretting ringer av vev forblir vanskelig å skalere, 15, 16 som krever ombygging av muggsopp for hver ønsket størrelse. I tillegg, vaskulære implantater laget ved hjelp av denne fremgangsmåten kan fremd i 2-3 uker, flere uker raskere sammenlignet med andre konstruerte fartøyer. 6 For klinikken, kan denne tidsavvik gjøre en betydelig forskjell i behandlingen av en pasient forverret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture Forberedelse
- Utnytte menneskelige aorta glatte muskelceller kjøpt kommersielt.
- Opprettholde celler i glatt muskelcellevekst materiale bestående av 88,6% 231 media, 0,1% hver av rekombinant humant insulin (rH-insulin), rekombinant human fibroblast vekstfaktor (rH-FGF), rekombinant human epidermal vekstfaktor (rH-FGF), og askorbinsyre; og 5% hver av føtalt bovint serum (FBS) og L-glutamin; og 1% antibiotika / antimycotic.
MERK: Hver vekstfaktor, FBS og L-glutamin er kjøpt som en vaskulær media vekst kit. - Endre media hver 48. time inntil cellene er ca 90% sammenflytende og klar for vev seeding.
- Oppbevar celler i en inkubator i mellom medie endringer for ekspansjon.
2. Utarbeidelse av 3D Trykt Setter og Custom silikon Støpt Plates
- Bruk en kommersiell 3D-printer (f.eks Replicator Mini) for 3D utskrift plate inserts.
- Bruk open kilde 3D design software som Blender for å lage 3D-modeller av de trykte ytre-skjell og innlegg.
- Eksportere modellen driver fil via en STL-format slik at for portabilitet til 3D-printer programvare.
- Produser trykte innlegg og ytre skall ved hjelp av poly (melkesyre) filament (PLA) lastet inn i 3D-skriveren.
- Etter utskrift, utføre en 30-minutters suge i en 70% -100% etanol løsning å sterilisere hver innsatsen.
- Fremstille en 01:10 herdemiddel for å basere polymerblanding av poly (dimetylsiloksan) (PDMS) silikonpolymer og tillate blandingen å avgasse ved romtemperatur i 10 min.
- Definere petriskål størrelsene som brukes som små (35 mm), middels (60 mm) og store (100 mm).
- Tilsett 2 ml, 4 ml og 6 ml av uherdet silikon til hver liten, middels og stor plate, henholdsvis, og skape et tynt lag over hele bunnen av petriskålen.
- Lag innlegg for den lille platen ved å helle PDMS inn i en100 mm plate til en høyde på 7 mm og la det herde på en varm plate ved 60 ° C i ca 2-3 timer. Bruk deretter en 5 mm biopsi slag å slå ut sylindriske innlegg. Bruke en liten mengde av uherdet PDMS for å sikre hver PDMS sylinder og til midten av hver enkelt liten plate.
- For de mellomliggende og store plater, før fullstendig herding av PDMS i bunnen av platen, plasserer 3D trykte innleggene 10 mm og 20 mm i diameter sentralt i hver mellomliggende og store plater, henholdsvis. For de store platene, i tillegg plassere en 3D trykt ytre skall ca 66,7 mm i diameter ekvidistanse fra stillingen.
- Tillat hver tallerken til å herde i friluft på en varm plate ved 60 ° C i ca 2-3 timer, slik at 18 timer for avgassing av polymeren. Feste trykte komponenter til platen i riktig region og orientering som vist i figur 1.
- Tilsett en løsning av 70% etanol med 30% destillert vann i 30 minutter til innsiden av alle plates for sterilisering og deretter dekke hver plate.
- aspirer forsiktig etanol fra hver plate og la det lufttørke.
- Ordne hver plate i et biologisk sikkerhetskabinett (BSC) ved siden av lokket, med forsiden opp. Utsette platene og lokk for UV-lys i henhold til BSC i 30 minutter for å fullføre steriliseringen. Steril teknikk utføres med hvert skritt etter UV-eksponering.
3. Utarbeidelse av fibrin hydrogel, Seeding med glatte muskelceller og vedlikehold av plater
- Bland en løsning av fibrin-gel inneholdende vekstmedier + 0,01% TGF-β1 i mengder av 0,5 ml, 1,1 ml og 1,81 ml for små, middels og store plate størrelser, henholdsvis.
- Legg 40 ul, 88,4 mL og 145 mL av trombin, fra et lager på 100 U / ml, til mediet i hver liten, middels og stor plate, respektivt. Virvle hver plate for hånd for å sikre at trombin blir jevnt blandet i mediet.
- Deretter legger 1601; L, 354 pl og 580 pl fibrinogen, fra et lager på 20 mg / ml, dråpevis sirkulært til den trombin-media blanding til hver liten, middels og stor plate, respektivt. Virvle for hånd for å sikre blanding og fordeling av hydrogelen i et jevnt lag.
- Tillat hydrogel til å herde i 10-15 minutter ved romtemperatur.
- Trypsineres glatte muskelceller ekspandert i 150 mm cellekulturplater og sentrifuger i henhold til standard protokoller. Den resulterende pellet bør resuspendert i 3 ml differensiering materiale bestående av 98% - 231 media, 1% FBS og 1% antibiotisk / antimykotisk.
- Kraftig blande-celler ved å titrere opp og ned med en 2 ml pipette for å bryte opp eventuelle celleklumper. Cellene telles med et hemocytometer og skape en cellesuspensjon på 2 x 10 6 celler / ml, 1,0 x 10 7 celler / ml og 1,4 x 10 7 celler / ml for små, middels og store plater hhv.
- Tilsett 1 ml av hver cellesuspensjon intoa tilsvarende 50 ml konisk merket liten, middels og stor. Sette opp ytterligere 50 ml konisk på denne måte for hver ekstra vev ring ønskelig.
- Legg differensiering media til hver konisk for å oppnå slutt seeding volum av 2 ml, 4 ml og 5 ml for hver små, middels og store kar, henholdsvis. Deretter forsiktig pipettér den celleløsning dråpevis på toppen av den fremstilte hydrogel i hvert tilsvarende plate.
- Plasser platene, og i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Endre differensiering media hver 48-72 timer for hver plate. I tilfellet av den større plate, endrer media innledning etter 24 timer, og deretter endre det hver 48-24 timer for å kompensere for den store celle seeding tetthet.
- Etter 2-4 dager som ringene vil ha helt kontrahert i mot innlegget, tilsett 10 mL, 20 mL og 35 mL av TGF-β1 til hver liten, middels og stor ring, henholdsvis. Etter eksponering til TGF-β; 1 i minst 24 timer, ringene er klar til å bli håndtert.
4. Montering av Vaskulær Konstruer og vedlikehold
- Før fremstillingen av den endelige vaskulær konstruksjon, er en spesialisert beholder er laget for å holde den ferdige beholderen.
- For den lille fartøyet, skape en høy plate for ring stabling ved å kutte en 2-tommers delen av toppen av en 50 ml polykarbonat konisk rør, og deretter PDMS lim klippekanten inn i en 35 mm plate. Bruk det koniske lokk som platen lokket.
- For middels og store kar høy ring stabling av platene, skjæres et 1,75-tommers diameter polykarbonat rør i 2,5 tommers seksjoner i lengderetningen for å tjene som de høye plateveggene. For de høye plate i bunnen, kuttet en 0.125-tommers-tykke polykarbonat ark i 2-tommers diameter sirkel stykker. Ved hjelp av akryl løsemiddel sement, binde polykarbonat rør delen til rundskrivet avkappede. Bruk av lokket fra en 60 mm petriskål som lokk for den høye plate.
- 3D priv ut innlegg 5, 10 og 20 mm i diameter og 50 mm i lengde.
- Tilsett 10 ml av uherdet silikon til hver beholder. Før fullstendig herding av PDMS, sentralt plasser hvert innlegg opprettet i trinn 4.1.3 i hver liten, middels og stor beholder.
- La det herde på en varm plate satt til 60 ° C i 2-3 timer.
- Sterilisere med en oppløsning av 70% etanol med 30% destillert vann i 30 minutter.
- aspirer forsiktig etanol fra hver beholder og deretter la det lufttørke i BSC. Deretter ordne beholdere i hette med hver plate plassert ved siden av lokket, med forsiden opp. Utsettes for UV-lys i henhold til BSC i ytterligere 30 minutter for ytterligere sterilisering. Bruk steril teknikk for hvert skritt etter UV-eksponering.
- Ved hjelp av svært fin pinsett, forsiktig fjerne hver tett rullet glatt muskulatur hydrogel ring fra sin post og overføre til den tilsvarende større beholder med høye innlegg.
- Bruk et partang i hver hånd og løfte den ene siden av ringen fra stillingen, og deretter den andre. Vær nøye med å beskytte og opprettholde lumen.
- Utfører overføring med denne to-hånds metoden, glir først den ene siden, og deretter den andre siden av ringen på den høye stolpe. Ved hjelp av milde, gradvise bevegelser, og jobber perifert, sakte presse ringen ned på høye innlegg. Deretter stables vev ringer inntil den ønskede fartøyet lengde er blitt oppnådd, med hver ring tilsetning av omtrent 1-2 mm av lengden til den ferdige konstruksjonen.
- Med ring stabelen plassert på de høye 3D trykt innlegg, snu platen slik at innlegget er parallell med arbeidsflaten.
- Ved hjelp av en mikropipette tilsettes 40, 80 og 160 ul av trombin ved en konsentrasjon på 100 U / mL forsiktig til den ytre overflaten av hver små, middels og store kar, henholdsvis. Under tilsetning av trombin, sakte rotere platen for å sikre jevn dekning av alle overflater av konstruksjonen.Dette vil være den basis for fibrin-lim anvendes for å feste ringen stabelen konstruksjonen i de første dagene etter konstruksjon.
- Deretter legger 40, 80 og 160 ul av fibrinogen i en konsentrasjon på 20 mg / ml til hver liten, middels og stor konstruksjon, henholdsvis, ved hjelp av en mikropipette, mens konstruksjonen roterer raskt. Den trombin og fibrinogen raskt satt inn i en fast gel gang blandet. På grunn av den korte herdetiden, sett på fibrinogen så raskt og jevnt som mulig.
- Tilsett 20 ml av differensiering media for hver beholder som inneholder konstruktet. Plasser fartøy i en 37 ° C inkubator inntil nødvendig. Endre media hver 3-5 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her demonstreres er fabrikasjon av 3 forskjellige konstruerte vaskulære graft størrelser (figur 1), som viser at Ring Stabling Method (RSM) er skalerbar. For å bevise anvendbarhet, de 3 ulike fartøystørrelser valgt relateres til selve mennesket fartøystørrelsen for venstre fremre nedstigende arterie (liten; lumen diameter = 4 mm) 17, synkende aorta (middels; lumen diameter = 10 mm) og stigende aorta (store; lumen diameter = 20 mm) 18. Veggtykkelsen er omtrent 500 um for de små ringer, og omtrent 1500 mikrometer for både middels og store ringer. Hvert fartøy er bygget demonstrert ved å stable 6 ringer, tilsvarende en lengde på ca. 6 mm for det lille kar og 9 mm for mellomstore og store skip. Lengde er basert på veggtykkelsen av hver enkelt ring.
Histologisk analyse avdekkethøy cellularitet i alle ringer størrelser (figur 2). Red materialet avgrenser fibrin gel. I små ringer, er en liten mengde gjenværende fibringel sett på den ytre kant av ringen. I de større ringer, ble noen av fibringel ispedd celleinnholdet. I Masson s Trichrome flekken, kan indikasjoner på produksjonen av kollagen (merket med blå) sees i de mellomliggende og store ringer.
For å bestemme celle-fenotype etter ringdannelse, ble vev ringer analysert ved hjelp av immunofluorescens for antistoffer til a-glattmuskel aktin (SMA) og tropomyosin (figur 3). Alle ringstørrelser var positive for begge antistoffer, verifisere at glatt muskulatur fenotype ble opprettholdt.
Strekktesting ble utført på de forskjellige størrelser ringene for å bestemme deres mekaniske egenskaper (figur 4). Den U-stretch, et mekanismercal testeapparat, ble brukt til å strekk-test små og mellomliggende ringer og fartøy, mens en Instron ble brukt til å strekk-test store ringer og fartøy. Elastisitetsmodul (E), strekkfasthet (UTS) og svikt styrke (FS) data ble innsamlet. Et gjennomgående trekk ble observert med økende styrke samkjøre til økende ringing og fartøystørrelse.
Cell seeding nummeret som er nødvendig for å skape varierte store ringene økte omtrent lineært med seeding areal (figur 5). For å skape større ringer, ble minst 14 millioner celler som trengs for å skape den abdominal aorta store ringer.
Seks-ring stabler, eller fartøy, ble testet for deres evne til å motstå strømningen. Konstruksjoner ble lastet inn i en spesialbygd perfusjon system (figur 6) og underkastet flyte i opp til 5 minutter ved strømningshastigheter 100-417 ml / min. fartøy vari stand til å motstå strømningen. Minor lekker ble observert ved fartøyet ender, på kontaktene til perfusjon system.
Figur 1: Bygging av de skalerte konstruerte fartøy. A) Diagram av prosessen med å skalere konstruerte fartøyer, som starter med plate forberedelse, celle såing og fartøyet bygning. Demonstrerte er tre forskjellige størrelse B) ringer og C) fartøy. D) Representant stort fartøy er helt biologisk og ligner naturlig vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Histologisk analyse. rong> H & E og Massons Trichrome flekker viser levedyktig cellularity hele ringen tykkelsen for alle ringstørrelser. Trichrome flekker avdekke områder av kollagen produksjonen angitt av blå (blå piler). Store ringer viste fibringel islett, sannsynligvis på grunn av brettingen av den relativt større overflateareal av cellefolien. Skala barer: små ringer = 200 mikrometer; mellomringer = 200 um; og store ringer = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunofluorescensanalyse for glatte muskel markører. Alle ringstørrelser var positive for glatte muskel kontraktile proteiner α-glatt muskel aktin (SMA) og tropomyosin (TM). Skala barer = 200 mikrometer.belastning / 55322 / 55322fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Strekkprøving analyse. Stress-belastningskurver for alle størrelser av ringer og fartøy viste en generell trend med en økning i styrke korrelere med økning i ring / fartøystørrelse. Ringer og fartøy ble strukket perifert. Parametere vurderes fra grafene var elastisk modulus, strekkfasthet og svikt styrke (oppført i tabell 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Cell seeding antall korrelasjon til seeding surfess området. Basert på humane aorta glatte muskelceller. Overflatearealet er definert som det område i den ringformasjonsplater mellom midtstolpen og platen vegg eller ytre skall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Six-ring fartøyet utsettes for perfusjon analyse. A) Custom-bygget perfusjon system for strømningstester. B) Konstruert fartøyet lastes inn i perfusjonssystemet. Tre skip ble perfusjon testet for lekkasjer i opptil 5 minutter under strømningsforhold. Fartøyene holdt seg stabilt under flyt, med mindre lekker på fartøyet slutt kontakter knyttet til systemet slangen. Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.
Animert Figur 1: Demonstrasjon av perfusjon strømmen gjennom en konstruert fartøy. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
| Liten | Mellom | Stor | |||||
| ringer | Elastic Modulus (kPa) | 13.6 ± 2.25 | (N = 6) | 14,5 ± 1,2 | (N = 3) | 17,2 ± 2,2 | (N = 4) |
| Endelig strekkfasthet (kPa) | 34,5 ± 10,2 | 39.6 ± 2.98 | 50.9 ± 10.6 | ||||
| Unnlatelse Strength (kPa) | 34,5 ± 10,2 | 39.6 ± 2.98 | 50.9 ± 10.6 | ||||
| fartøy | Elastic Modulus (kPa) | 49.7 ± 2.80 | (N = 3) | 59.8 ± 3.90 | (N = 2) | 79,8 ± 10,1 | (N = 2) |
| Ultimate strekkfasthet (kPa) | 115 ± 6,90 | 137 ± 12,0 | 192 ± 86,9 | ||||
| Unnlatelse Strength (kPa) | 96,2 ± 12,2 | 60,7 ± 12,1 | 173 ± 92,2 | ||||
Tabell 1: Strekkfasthetsegenskaper av de skalerte ringer og fartøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The Ring Stacking Method presenterer flere fordeler i forhold til dagens vaskulære vev konstruert konstruere teknikker. RSM kan tilpasses for å skape menneskelige skip av alle størrelser ved ganske enkelt å tilpasse legg og ytre skall dimensjoner. Vår metode gjør det mulig for utvikling av polymer-fri konstruerte fartøyer sammensatt utelukkende av humane celler og hurtig nedbrytning av bærermateriale som finnes i kroppens naturlige sårheling prosess. Polymer grafts er kjent for å forårsake restenose i klinikken og kan bli problematisk hvis finnes i konstruerte grafts. Cell seeding nummer må endres for hver annen størrelse vev ring. En graf av celletallet til såing flateareal er vist i figur 5 fra hvilken seeding tall kan tilnærmes og / eller ekstrapolert. Det bør bemerkes at den celletypen som brukes her er humane aorta-glattmuskelceller. For å tilpasse RSM til forskjellige celletyper, cellestørrelse og formeringshastigheten må tas iomtanke og optimal seeding tetthet. For eksempel har vi også laget human-fibroblast-ringer med den RSM, og har funnet at minst 2x antall celler som er nødvendig i forhold til SMC. Hvilken som helst ønsket lengde av fartøyet kan bygges ved tilsetning av ringene. Ring stabler har blitt dyrket i opptil 2 måneder og holdt seg stabilt. Middels og store ringer er begge holdes på den riktige 1500 um veggtykkelse, selv om de er hver konstruert på en 60 mm og 100 mm plate, henholdsvis ved plassering av et ytre skall i den 100 mm plate. Dette viser anvendeligheten av den ytre mantel for å kontrollere og å oppnå den passende veggtykkelse for en gitt kar. I trinn 3.3.1, blir TGF-β1 til fordi den er kjent for å stimulere produksjonen av kollagen 19 og har den observerte effekten av å trekke til ringene. Når ringene er fullstendig rullet, blir en dose av TGF-β1 tilsatt i det siste trinnet, og ringene er klar for bruk 1 dag senere. TGF-β1 gjør forbedre produksjonen av kollagen i ringene, som vist i de Trichrome-bilder (Figur 2).
Celler i de små ringene er mer rund og kompakt, mens i 2 større størrelser, celler langs ytterkantene viser en grad av innretting med vevet kant og sammen med andre innrettede celler. Sistnevnte kan tyde på et senere stadium av celle modenhet, utviklet seg fra høyere celleinnholdet i de større ringer, og følgelig en større grad av intercellular signalisering for å oppmuntre til modenhet. Fibrin gel interspersion i større ringer kan tyde på at større celleplater tendens til å kaste noe som de ruller. De histologiske bilder som viser dette fenomenet ble tatt en dag etter komplett ring rulle opp- og dermed er det forståelig at fibrin gel, som tar 2 uker å degradere i kultur, vil fortsatt være til stede. Dyrking ringene i minst 2 uker skal forringe fibrin gel, etterlater et fullt mobil konstruere.
nt "> Alpha-glatt muskel aktin (SMA) utgjør de tynne filamenter som letter sammentrekning og tropomyosin er en kontraktile proteiner. 20, 21 Både SMA og tropomyosin var til stede i alle størrelse ringer, med den sterkeste, mest jevnt fordelt signal i mellom ringene. Dette fenomenet kan skyldes en høyere grad av celletetthet og organisasjon, stimulere en økning i sammentreknings operandi utvikling.Elastisitetsmodul indikerer elastisiteten av ringene, og den økende E fra små til store ringer antyder en økning i kollagen og elastin produksjon. Maksimal strekkfasthet er den høyeste styrke utholdt av ringene uten å briste. Svikt styrke er poenget med vev svikt. For ringene, tilsvarer UTS FS. For fartøyene, er UTS større enn FS, som viser at den endelige styrke av beholderen skyldes en kombinasjon av mekanisk bidraget fra alle ringeri beholderen, og svikt punkt er på grunn av den svakeste ringen.
Styrken i våre konstruerte fartøyer lå i kPa rekkevidde, mens innfødte menneskelige fartøyene har styrker innenfor MPa rekkevidde. For å styrke våre fartøy mot at innfødte fartøyer, undersøker vi teknikker for å øke ekstracellulære matrise produksjon, nemlig at av kollagen og elastin. Vekstfaktorer som fremmer kollagen og elastin produksjon for tiden blir brukt til våre ringer for å undersøke om strekkegenskaper vil øke.
I tillegg til mekaniske egenskaper, funksjonelle målinger av muskelkontraksjon er relevante for kar ytelse. Muskelstimulering og sammentrekning av faktorer som acetylkolin og adrenalin kan brukes til å teste muskelsammentrekningskraft. Slike eksperimenter blir vurdert for våre fremtidige studier.
Samlet sett viser våre resultater at Ringen Legging metode kan lett skaleresfor å oppnå en rekke konstruerte vaskulære vev størrelser. Skalering til de største menneskelige fartøy, for eksempel 40 mm lumen diameter aorta, ville trolig kreve utvikling av en vasa vasorum, microvasculature naturlig til stede i store størrelser fartøy, som vår lab utvikler for tiden. I tillegg er endotelcelle sjiktet (dvs. den intima) som typisk linjer lumen av lag medier er viktig for etablering av riktig hemodynamikk i en beholder. Vår lab arbeider for tiden med etablering av intima i vår SMC ring stabelen ved hjelp av humane vaskulære endotelceller. Med disse kombinerte teknologiene, ville konstruerte fartøyer har større anvendbarhet til klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke våre stipendiat Lam lab kolleger Ammar Chishti og Bijal Patel for deres type assistanse med noen av histologi og cellekultur. Finansieringen ble gitt av Wayne State University Nanofellowship (CBP), oppstart midler og Cardiovascular Research Institute Seed Grant (MTL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Aortic Smooth Muscle Cells | ATCC | PCS-100-012 | vascular smooth muscle cells |
| Medium 231 | Gibco (Life Technologies | M-231-500 | media specific to vascular smooth muscle cells |
| Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PSC-100-042 | growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability |
| Replicator Mini 3D printer | MakerBot | N/A | 3D printer |
| Poly(lactic acid) 3D ink (PLA) | MakerBot | N/A | 3D printer filament |
| Poly(dimethlysiloxane) (PDMS) | Ellworth Adhesives | 3097358-1004 | polymer for gluing plate parts |
| Fibrinogen | Hyclone Labratories, Inc. | SH30256.01 | fibrin gel component |
| Thrombin | Sigma Life Sciences | F3879-5G | fibrin gel component |
| Tranforming Growth Factor-Beta 1 | PeproTech | 100-21 | growth factor for stimulating collagen production |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | for cell counting |
| Polycarbonate tubing | US Plastics | PCTUB1.750X1.625 | material for making tall, ring stacking plates |
| Polycarbonate sheet | Home Depot | 409497 | material for making tall, ring stacking plates |
| Adhesive polymer solvent | SCIGRIP | 10799 | material for making tall, ring stacking plates |
| Instron 5940 | Instron | N/A | tensile testing machine |
| U-Stretch | Cell Scale | N/A | tensile testing machine |
| Smooth Muscle Actin | MA5-11547 | Thermo Fisher | antibody |
| Tropomyosin | MA5-11783 | Thermo Fisher | antibody |
References
- Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
- Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials. Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).
- McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).
- Wystrychowski, W., et al. First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).
- Konig, G., et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).
- Gui, L., et al. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).
- Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).
- Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. Allogeneic human tissue-engineered blood vessel. J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).
- Dahl, S. L., et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci Transl Med. 2 (68), (2011).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Meier, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery. J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).
- Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts. Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).
- Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).
- Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
- Fearon, W. F., et al. Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation. Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).
- Erbel, R., Eggebrecht, H. Aortic dimensions and the risk of dissection. Heart. 92 (1), 137-142 (2006).
- Ha, D. M., et al. Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease. J Transl Med. 14, 39 (2016).
- Skalli, O., et al. Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes. J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).
- von der Ecken, J., et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
