Summary
För att studera äggstockstumörprogression i en fysiologiskt relevant modell, flercelliga spheroids odlades i en mikroanordning under simulerad vätskeflöde. Denna dynamiska 3D-modell emulerar intraperitoneal miljö med de cellulära och mekaniska komponenter där äggstockscancer metastas inträffar.
Abstract
Äggstockscancer kännetecknas av omfattande peritoneal metastas, med tumörsfärer vanligen återfinns i de maligna ascites. Detta är förenat med dålig kliniska resultat och för närvarande saknar effektiv behandling. Både den tredimensionella (3D) miljö och dynamiska mekaniska krafter är mycket viktiga faktorer i detta metastaserande kaskad. Emellertid traditionella cellkulturer misslyckas med att rekapitulera denna naturliga tumörmikromiljön. Således, in vivo-liknande modeller som kan emulera intraperitoneal miljö är av uppenbar betydelse. I denna studie har en ny mikroflödes plattform bukhinnan inrättats för att efterlikna situationen för äggstockscancer sfäroider i bukhålan under metastas. Äggstockscancer sfäroider som erhållits under en icke-vidhäftande tillstånd odlades i mikroflödessystem kanaler belagda med peritoneala mesotelceller utsattes för fysiologiskt relevant skjuvspänning. Sammanfattningsvis, denna dynamiska 3D äggstockscancer-mesothelium microfluidic plattform kan ge ny kunskap om grundläggande cancerbiologi och fungera som en plattform för potentiell läkemedelsscreening och utveckling.
Introduction
Äggstockscancer är den mest dödliga gynekologisk cancer och kännetecknas av omfattande peritoneal spridning och bildandet av malign ascites en. Denna omfattande peritoneal metastas utgör en stor klinisk utmaning och är associerad med dåliga kliniska resultat. Skillnad från de flesta solida karcinom som metastaserar via blodet, äggstockscancer sprider främst inom den peritoneala håligheten. Tumörceller existerar som flercelliga aggregat / spheroids under processen av metastaser 2. Det faktum att suspensionskultur kan berika äggstockscancer stamceller / tumör-initierande celler antyder vidare att dessa sfäroider kan vara associerad med både tumör aggressivitet och förbättrad chemoresistance 3, 4. Det finns skillnader i läkemedelssvar mellan 2D- och 3D-kulturer, som förmodligen har olika molekylära mekanismer 5.
_content "> Den väsentliga interaktion med mesothelium konstruerar primära mikro för äggstockstumörprogression. Dessa mesotelceller ligga på en extracellulär matris (ECM), där fibronektin är en allestädes närvarande beståndsdel. En länk mellan det ökade uttrycket av mesotelceller härrörande fibronektin och tumörprogression har visats. fibronektin är högst närvarande i malign ascites 6, 7. ovarian cancerceller har även möjlighet att inducera utsöndring av fibronektin från mesotelceller i syfte att främja tidig äggstockscancer metastas 8.Emerging bevis visar att mekaniska stimuli, inklusive skjuvspänning, kan modulera cellmorfologin, genexpression, och således de fenotyper av tumörceller 9, 10, 11. Som malign ascites utveckla och ackumuleras under tumor progression, är äggstockstumörceller exponerade för fluidflöde och den resulterande skjuvspänningen. Ett antal grupper, vårt ingår, har visat effekterna av skjuvspänning på äggstockscancer progression, inklusive cytoskelettsystemen modifieringar, epitelial-to-mesenkymala övergångar och cancer stemness 12, 13, 14, 15. Således är det viktigt för undersökning av tumör peritoneal metastas en fysiologiskt relevant mikromiljö. De nuvarande in vitro hydrodynamiska odlingssystem har begränsningar på härma och styrning av en konstant, låg, fysiologiskt relevant skjuvspänning 16, 17, 18, 19. Konventionell in vitro metoder med fokus på antingen cellulära eller mekanisk miljö är fortfarande begränsade iimitera komplexitet intraperitoneal mikro med rätt fysiologisk relevans.
Här, i syfte att konstruera en ny modell av bukhinnan att övervinna begränsningarna hos konventionella strategier och att främja studiet av intraperitoneal fack i cancermetastaser, var en 3D mikroflödes-baserad plattform med kontrollerad vätskeflöde utformade. I denna modell, äggstockscancer sfäroider samodlades med primära humana peritoneala mesotelceller i mikroflödessystem marker under kontinuerlig fluidflöde (Figur 1A). Mesotelcellerna plattades på fibronektin. Icke-vidhäftande äggstockscancer sfäroider såddes i mikroflödessystem kanaler med kontinuerligt flöde mediet perfusion av en sprutpump. Både 3D-miljön och de dynamiska mekaniska krafterna är mycket viktiga faktorer i den metastatiska kaskaden. Denna plattform kan användas för att undersöka den intraperitoneala mikromiljön i termer av komplexa cellular och co-culture interaktioner, liksom med avseende på dynamiska mekaniska signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikroflödessystem enhet Design och Fabrication
- Mikroflödeshuvudmallen
- Design och dra mikroflödeskanalmönstret med någon datorstödd konstruktion (CAD) programvara.
OBS! Normalt CAD-ritningen kan skickas till en fotomask företaget att producera fotomasken. Den mikroflödes Konstruktionen består av tre identiska parallella kanaler, var och en med följande dimensioner: 4 mm x 25 mm x 250 ^ m (bredd x längd x höjd) och ställa in två mm från varandra. Båda kanal ändar utformade med 127 ° vinkel för att underlätta vätske ingång och utgång (Figur 1B). Kanalen som används i detta protokoll rapporterades i en tidigare publikation 13. - Tvätta kiselskivan med ultrasonikering (500 W / 42 kHz) i aceton, isopropanol och avjoniserat vatten i 15 min vardera. Torka skivan med trycksatt kvävgas. Upphetta kiselskiva på en värmeplatta vid 250 ° C under 15 min till helt torrDet.
- Spin-coat ett skikt av SU-8 2075 fotoresist (125 ^ m tjocka) på kiselskivan med en spinnhastighet av 1800 varv per minut. Baka fotoresisten-belagda skivan direkt på en värmeplatta vid 65 ° C och sedan vid 95 ° C, för att avlägsna överskott av lösningsmedel, till 5 och 25 minuter, respektive (enligt SU-8 produktmanual).
- Upprepa steg 3 och spin-coat ytterligare ett lager av SU-8 2075 fotoresist för att erhålla en slutlig tjocklek av 250 pm. Baka fotoresisten-belagda skivan direkt på en värmeplatta vid 65 ° C under 7 minuter och därefter vid 95 ° C under 30 min. Långsamt kyla skivan till rumstemperatur. Inte kyla med tryckluft.
- Rikta och sätta fotomasken direkt ovanpå skivan. Utsätta den för UV-ljus i 20 sekunder för att tvärbinda mönstret.
- Baka skivan med fotoresisten vid 65 ° C och 95 ° C på en värmeplatta för 5 och 12 minuter, respektive, för att avlägsna lösningsmedlet för polymerisation (enligt SU-8 produktens manual). Efteråt kyla skivan för attrumstemperatur.
- Avlägsna den icke-tvärbundna fotoresist genom nedsänkning av skivan i SU-8 utvecklare för 25 min. Skölj skivan med isopropanol och torka den med tryckluft.
OBS: Om en mjölkaktig lösning observerades vid sköljning med isopropanol, vilket tyder på ofullständig utveckling, sänk skivan tillbaka till SU-8 utvecklare för en längre utvecklingstid. - Placera skivan på en varm platta vid 180 ° C under 10 min för att läka mönstret från potentiella sprickor. Stäng av värmeplattan och långsamt kyla ner skivan till rumstemperatur genom att lämna den på den varma plattan.
- Tillsätt några droppar av triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl) silan i en flaska cap. Sätt flaskan cap i vakuumexsickator. Placera skivan intill flaskans lock för att silaniseras wafern under 10 min.
- Design och dra mikroflödeskanalmönstret med någon datorstödd konstruktion (CAD) programvara.
- PDMS-chip tillverkning
- Linda den tunna skivan med aluminiumfolie för att skapa en hållare.
- Blanda polydimetylsiloxan (PDMS) bas och härdare på en 10: 1 viktförhållandemed en centrifugal mixer under blandning och avgas funktion. Häll PDMS blandningen långsamt på skivan till en höjd av cirka 5 mm. Avlufta PDMS under vakuum under 40 min. Bota PDMS i en ugn vid 65 ° C under 2 h.
- Dra försiktigt PDMS platta från befälhavaren och trimma PDMS längs kanalerna tills det är storleken på en glasskiva. Stansa PDMS med en 1-mm biopsistans att skapa inloppen och utloppen hos anordningen.
- Rengör PDMS ytan med tryckluft och tejp för att ta bort damm och PDMS skräp.
- Placera PDMS platta, med kanalsidan vänd uppåt, in i en plasma renare. Placera en ren glasskiva i plasma renare tillsammans med PDMS platta.
- Behandla PDMS och glasskiva enligt luftplasma vid hög RF-nivå under 1 min. Binda PDMS till objektglaset för att skapa en irreversibel kovalent bindning.
- Placera PDMS chip på en varm platta vid 150 ° C under 1 h för att öka bindningsstyrkan och för att återföra hydrophobicity av PDMS före användning.
2. Ympning av mikroflödes Chip med primära Peritoneala mesotelceller (HPMC)
- Fibronektin beläggning av mikroflödessystem kanaler
- Sterilisera mikroflödessystem kanal med 30 mikroliter av 75% etanol. Avlägsna etanolen och skölj två gånger med 30 mikroliter steriliserat fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med användning av en pipettspets. Grundligt aspirera PBS i kanalerna.
OBS: För att minimera kontaminering, bör mikroflödes cellodling noggrant genomföras under helt aseptiska förhållanden med hjälp av ett laminärt flöde huva. - Förbered en 10 mikrogram / ml fibronektin lösning i serumfritt M199: MCDB105 (1: 1) medium. Pipett lösningen upp och ner, med särskild omsorg för att undvika bubbelbildning. Inte virvel.
- Sakta fylla varje kanal med 30 mikroliter av fibronektin lösning. Försegla kanalerna med tejp och inkubera chipet över natten vid 4 ° C.
- Sterilisera mikroflödessystem kanal med 30 mikroliter av 75% etanol. Avlägsna etanolen och skölj två gånger med 30 mikroliter steriliserat fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med användning av en pipettspets. Grundligt aspirera PBS i kanalerna.
- Odlings HPMC i 10% fetalt bovint serum (FBS) odlingsmedium (M199: MCDB105 kompletterat med 10% FBS och 100 E / ml penicillin / streptomycin) under 5% CO2 vid 37 ° C tills 80% konfluens.
- Skölj HPMC med 3 ml PBS och trypsinize med 2 ml 0,05% trypsin / 0,01% EDTA (TE) lösning under 30 s. Neutralisera med 4 ml 10% FBS-odlingsmedium och spinn ner cellerna vid 1000 xg under 5 min.
- Resuspendera HPMC i 2 ml 10% FBS-odlingsmedium. Räkna antalet celler med en hemocytometer och justera cellkoncentrationen till 3,5 x 10 6 / ml.
- Värma fibronektin-belagda mikroflödeschip i en 37 ° C inkubator under 5 min före användning. Helt aspirera fibronektin lösning.
- Långsamt pipettera 30 pl HPMC suspensionen i varje kanal. Försegla kanalerna med tejp och placera anordningarna i CO2 inkubator över natten.
- Äggstockscancer sfäroid formation
- Bibehålla den humana äggstockscancer-cellinje SKOV-3 i 5% FBS-odlingsmedium (M199: MCDB105 med 5% FBS och 100 E / ml penicillin / streptomycin) under 5% CO2 vid 37 ° C före experimenten.
- Lös 0,5% agaros i sterilt vatten genom kokning. Dispensera 50 mikroliter av agaros-lösning i varje brunn i 96-brunnsplattor. Låt plattorna i huven under 20 minuter för att låta agarosen stelna; stelnat agaros belägga brunnarna kan förhindra cellvidhäftning och indikerar att plattorna är klara för användning.
- Skölj SKOV-3-celler med 3 ml PBS. Trypsinize med 2 ml av TE-lösning under 3 minuter. Neutralisera med 4 ml 5% FBS-odlingsmedium och spinn ner cellerna vid 1000 xg under 5 min.
- Räkna SKOV-3 cellantalet med en hemocytometer och återsuspendera cellerna i 5% FBS-odlingsmedium vid en densitet av 5000 celler / ml. transfer 200 mikroliter av cellsuspension i varje agaros-belagd brunn och kultur under 5% CO2 vid 37 ° C under 48 h.
- Cancer sfäroid loading
- Överföra cancer sfäroider till ett 50-ml centrifugrör för-vättes med 1 ml serumfritt medium och spinn ner vid 750 xg under 5 min.
OBS: Pre-fuktade pipettspetsar och centrifugrör kan förhindra oönskad sfäroid fastsättning på centrifugrören. - Förbereda 2,5 | j, g / ml av 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) lösning i serumfritt M199: MCDB105 medium. Resuspendera cancer sfäroider i en ml CMFDA lösning och inkubera vid 37 ° C under 30 min. Centrifugera vid 750 x g under 5 min.
- Skölj cancer sfäroiderna med 2 ml serumfritt medium och centrifugera vid 750 xg under 5 min. Upprepa detta steg två gånger för att avlägsna kvarvarande fluorescerande färg från mediet.
OBS: Den fluorescerande signal kan kvarhållas i sfäroider under mer än 96 h. - Resuspendera cancernsfäroider i serumfritt M199: MCDB105 mediet och räkna sfäroid antalet med en hemocytometer. Justera koncentrationen till 2.000 sfäroider / ml med serumfritt medium.
- Före sfäroid lastning, långsamt injicera 100 mikroliter av serumfritt M199: MCDB105 medium för att tvätta bort de icke-vidhäftade mesotelceller inuti kanalerna.
OBS: En snabb injektion, aspiration eller bubbelbildning kommer att leda till avskiljandet av mesothelial monolager. - Belastning 30 mikroliter av fluorescensmärkt sfäroid suspensionen i varje kanal. Placera mikroflödeschip in i CO2 inkubator.
- Överföra cancer sfäroider till ett 50-ml centrifugrör för-vättes med 1 ml serumfritt medium och spinn ner vid 750 xg under 5 min.
- Perfusion plattformsenheten och co-kultur
- Bifoga en spruta laddad med färskt, serumfritt M199: MCDB105 medium till en 1 m lång slang.
- Placera sprutan på sprutpumpen och fäst kolven och kroppen av sprutan. Installera sprutpump i horisontellt läge på samma höjd som mikroflödes chip inuti inkubatorn.
NOTE: Antalet och storleken på sprutor beror på antalet kanaler som används och hur länge experimentet. - Snabbt ingjuta hela röret med medium genom att hålla snabbspolning framåt-knappen tills mediet flödar slangen.
- Köra injektionen vid den önskade flödeshastigheten. Uppskatta väggen skjuvspänningen med hjälp av följande ekvation:
där τ representerar väggen skjuvspänningen i kammaren, ǫ = flöde, μ = viskositet (0,01 g cm -1); h = flödeskammare höjd, och w = flödeskammaren bredd. - Ansluta slangen till inloppet av kanalen. Placera den överskjutande inloppsslangen i inkubatorn för att säkerställa att mediet värms innan injiceras in i kanalerna. Att underlätta anslutningen mellan slangen och kanalen, kan respektive anslutningar väljas. OBS: Akta att inte införa någon bubblan till SyrinGE, slangar och anslutningar.
- Ansluter utloppet av kanalen till en 50-ml koniska rör för att samla upp utflödet medium med en kort utmatningsrör.
OBS: Den fullständiga dynamiska samodlingssystemet visas i figur 1D.
4. Observation av HPMC och cancer sfäroiderna efter Perfusion
- Beakta HPMC och cancer sfäroider med en ljusfält eller fluorescensmikroskop och ta bilder efter 1 timme av perfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll var en mikroflödes plattform inrättas för att modellera äggstockscancer sfäroider med mesotelceller enligt hydrodynamiska förhållanden. Primära humana peritoneala mesotelceller odlades i mikroanordning under 16 h och observerades under ett ljusfältsmikroskop. Såsom visas i fig 2A, var kanalbotten framgångsrikt täckt med ett monoskikt av HPMC. Det är viktigt att notera att bubbelbildning under fibronektin eller HPMC mönstring kommer att leda till kanal beläggning misslyckande. Genom icke-vidhäftande suspensionskultur, flercelliga sfäroider med diametrar på cirka 100 pm, som är ungefär lika stor som de som återfinns i patienternas ascites, genererades och märktes med grönt fluorescerande färgämne, CMFDA. Sfäroiderna fördes sedan till HPMC-belagda mikroflödessystem kanaler och förblev i suspension. Cell morfologier iakttogs under mikroskop och bilder fångades (Figur 2B). De fluorescensmärkta cancer sfäroider kan lätt skiljas från mesotelcellerna enligt ett fluorescensmikroskop (figur 2C).
Figur 1. Ett dynamiskt 3D Peritoneal mikroanordning för modellering Ovarian Cancer flercelliga Spheroid beteenden. (A) Schematisk beskrivning av ett mikrofluidchip som används för att samodling äggstockscancer sfäroider med HPMC enligt flödestillstånd. (B) Schematiskt diagram som visar utformningen av mikroflödessystem kanaler. (C) Ett fotografi av en mikroflödessystem chip som används i protokollet, med sina kanaler infunderas med färglösning för tydlig visualisering. Bar = 1 cm. (D) fotografi som visar experimentuppställning. Klicka här för att se en större version of denna figur.
Figur 2. Bilder av äggstockscancer Sfär-mesotelceller Dynamic Co-kultur modell. (A) Bilden av HPMC mono odlas i mikroflödessystem kanal. (B) Bilder av äggstockscancer sfäroider i mikroflödessystem kanal belagd med peritoneala mesotelceller enligt faskontrastmikroskopi (till vänster) eller (C) fluorescensmikroskopi (Green, CMFDA, högra panelen). Bar = 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna analys ger en flexibel och fysiologiskt relevant modell som kan införlivas med olika biokemiska och cellbaserade analyser, inklusive, men inte begränsat till, vidhäftningsanalyser, mesothelial clearance-analyser och läkemedelsscreening. Det kan appliceras på utvärdering av effekten av den intraperitoneala mikro på cancerutveckling. Däremot kan flera experimentella betingelser måste optimeras, beroende på syftet med projektet (t.ex. antalet HPMC och cancer sfäroider sådda per kanal, co-odlingstiden, etc.). Andra celltyper i den intraperitoneala mikromiljö, såsom fibroblaster, endotelceller eller immunceller, kan också inkluderas i systemet i syfte att studera de väsentliga interaktionerna mellan äggstockscancer sfäroider och närliggande celler. Andra ECM-komponenter, såsom laminin, vitronektin, eller kollagen, kan också användas. En svaghet med detta protokoll som kan behöva övervägas är att även omkoppling av näringsämnen påfyllning och skjuvspänning påminner om den som ses in vivo, det finns ingen separat styrning av näringsämnen påfyllning och skjuvspänning i vårt nuvarande system. Dessutom kommer tekniker såsom on-chip trypsinering i kombination med fluorescensaktiverad cellsortering att krävas för att separat samla ovariala cancerceller och HPMC för ytterligare molekylära studier om olika typer av celler.
Denna teknik uppvisar flera fördelar jämfört med traditionella metoder. Först 3D co-kultur bättre härmar kommunikationen mellan mellan äggstockscancerceller och mesotelceller in vivo. För det andra, celler odlas under fluidic flödet men inte i statiskt tillstånd, vilket ger ett cellulärt svar som är potentiellt representativ för situationen in vivo 12, 13. Vidare kan vätskeflödet styras exakt, imitera hydrodynamic förhållanden i olika skeden av tumörprogression.
Sammanfattningsvis, den dynamiska 3D äggstockscancer-mesothelium modell co-kultur presenteras här ger en flexibel ram för modellering tumör beteende i bukhålan. Med denna modell, kan interaktionen mellan cancerceller och mesotelcellerna enligt en dynamisk hydrodynamisk tillstånd analyseras omsorgsfullt. Det kan kraftigt öka vår förståelse av de bakomliggande mekanismerna för metastasutvecklingen och kan också underlätta terapeutisk utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Hong Kong Research Grant rådet (bidrag 17.122.014, C1013-15G, 719813E, och 17.304.514). AST Wong är en mottagare av Croucher Senior Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
