Summary
Bu çalışmada, protein-protein etkileşimleri hibrid β-lactamase teknolojisini temel alan bir conductimetric Biyoalgılayıcı kullanarak eğitim için yeni bir yöntem rapor. Bu yöntem proton β-lactams hidroliz üzerine sürümü kullanır.
Abstract
Biyosensörler patojen algılama, moleküler tanı, çevresel izleme ve gıda güvenliği denetimi gibi çeşitli alanlarda uygulanan ve giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu bağlamda, çeşitli protein-protein etkileşim çalışmaları verimli muhabir enzimler olarak β-laktamaz kullanılır. Ayrıca, eklemeleri ve peptidler yapısal proteinler/etki alanlarının kuvvetle kabul yeteneğini chimeric proteinleri oluşturmak için bu enzimler kullanımı teşvik eder. Bir son çalışmada, Bacillus licheniformis Bağdat β-lactamase bir tek etki alanı antikor parçası eklenir. Nanobodies, adı da verilen bu küçük etki alanları üzerinden Devegiller tek zincir antikorların antijen bağlayıcı etki alanları olarak tanımlanır. Ortak çift zincir antikorlar gibi gösteriyorlar yüksek benzeşim ve özelliklerine kendi hedefleri için. Elde edilen chimeric protein β-lactamase aktivite korurken hedefine karşı yüksek bir yakınlık sergiledi. Bu nanobody ve β-lactamase moieties işlevsel kalır göstermektedir. Mevcut çalışma, biz Biyoalgılayıcı teknoloji hibrid β-lactamase sistemi birleştirir detaylı bir protokol raporu. Nanobody hedefine için özel bağlayıcı enzimin katalitik aktivitesi tarafından yayımlanan proton conductimetric bir ölçüm sayesinde tespit edilebilir.
Introduction
Biyosensörler fiziksel veya kimyasal sinyal aygıtları için güç çeviriciler1adlandırılan biyo moleküler bir etkileşim birleştirmek analitik cihazlar vardır. Kaydedilen sinyalleri yorumlanır ve immobilize ve ücretsiz ortakları arasındaki etkileşimleri izlemek için dönüştürülür. Biyosensörler çoğu analitler hormonlar veya farklı patojen işaretleri2gibi algılamak için bir antikor kullanımı gerektirir. Farklı sensör biçimleri kullanılabilir ve kitle tabanlı, manyetik, optik ve elektrokimyasal biyosensörler içerir. İkincisi arasında en sık kullanılan sensörler vardır ve bir bağlama olayı elektrik sinyaline dönüştürerek işlev. Performansları ve hassasiyetleri tüm antikor tabanlı biyosensörler, güçlü aslında iki parametre üzerinde bağlıdır: i) antikor ve II)2sinyal oluşturmak için kullanılan sistem özelliklerini kalitesi.
Antikorlar iki ağır zincir ve iki hafif zincirleri oluşan yüksek moleküler kütlesi dimerik (150-160 kDa) proteinlerdir. Hafif ve ağır zincirleri arasındaki etkileşimi çoğunlukla hidrofobik etkileşimler yanı sıra bir korunmuş disülfür bağ stabil. Her zincir antijen aslında tamamlayıcı belirlenmesi bölgeleri (CDR1-2-3) adlı üç hypervariable bölgeler ile etkileşim bir değişken etki alanı içerir. Alan, tam uzunlukta antikorlar düşük maliyetli ifade sistemleri (örneğin, E. coli) ile büyük ölçekli bir ifade çok sayıda gelişmeler rağmen genellikle istikrarsız ve toplanan protein üretimi için açar. Bu yüzden3 (ScFvs ≈ 25 kDa) tek-zinciri değişken parçaları gibi çeşitli antikor parçaları mühendislik. Bunlar sırasıyla bir ağır ve kovalent sentetik amino asit dizisi tarafından bağlanan bir hafif zincirleri değişken etki alanından oluşur. Ancak, bu parçaları kez zavallı bir istikrar görüntülemek ve toplamak, onların hidrofobik bölgeler solvent4büyük bir bölümünü ortaya çıkarmak bu yana eğilimi var. Bu bağlamda, tek zincir Devegiller antikor parçaları, nanobodies veya VHHs, olarak anılacaktır ScFvs mükemmel alternatifler görünmektedir. Bu etki alanları Devegiller tek zincir antikorlar değişken adlarına karşılık. Geleneksel antikorlar, aksine Devegiller antikorlar yoksun hafif zincirleri yüklenir ve yalnızca iki ağır zincir5içerir. Bu nedenle, nanobodies en küçük monomeric antikor (12 kDa) geleneksel antikorlar6için benzer bir ilgi ile bir antijen bağlamak mümkün oluşuyor. Ayrıca, geliştirilmiş kararlılık ve diğer tam uzunlukta antikorlar veya antikor parçaları ile karşılaştırıldığında çözünürlük mevcut. Son olarak, kendi küçük boyutları ve genişletilmiş kendi CDR3 döngüleri onları şifreli epitopları tanımak ve enzim etkin sitelere7,8' e bağlamak izin verir. Günümüzde, bu etki alanlarının büyük ilgi alıyorsanız ve Biyoalgılayıcı teknoloji kombine edilmiştir. Örneğin, Huang ve ark. nanobody tabanlı Biyoalgılayıcı algılama ve miktar insan Prostat spesifik antijen (PSA)9için geliştirdik.
Bahsedilen-yukarıda olarak, elektrik sinyal oluşturmak için kullanılan sistemin verimliliği Biyoalgılayıcı deneyleri önemli bir parametre belirtilir. Bu nedenle, elektrokimyasal biyosensörler enzim tabanlı artan ilgisini çekti var ve sağlık, gıda güvenliği ve çevre izleme gibi çeşitli uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu biyosensörler bir substrat katalitik hidroliz üzerinde elektrik sinyali oluşturmak için sana bir enzim tarafından güveniyor. Bu bağlamda, β-laktamaz daha belirli, daha duyarlı ve kolaylaştırmak alkalen fosfataz veya horseradish peroksidaz10gibi birçok diğer enzimler deneysel olarak gösterilmiştir. Β-laktamaz onları hidrolize tarafından Beta-laktam antibiyotik bakteriyel direnç sorumlu olan enzimlerdir. Onlar monomeric, çok kararlı, verimli ve küçük boyutu var. Ayrıca, etki alanı/peptid eklemeleri β-laktamaz içine protein-ligand etkileşimleri eğitim için verimli araçlar olmak gösterildi BI fonksiyonel chimeric proteinleri üretir. Gerçekten de, son yıllarda yapılan çalışmalarda TEM1 β-lactamase sonuçları antikor değişken parçaları bu ekleme onun hedef antijen için yüksek benzeşimli bağlamak mümkün kalır bir chimeric protein göstermiştir. İlginçtir, antijen bağlayıcı TEM1 katalitik aktivitesi11,12allosteric yönetmelik ikna etmek için gösterildi. Ayrıca, protein etki alanı ekleme izin veren bir döngü Bacillus licheniformis Bağdat β-lactamase protein-ligand etkileşimleri13 izlemek için uygundur fonksiyonel chimeric proteinler oluşturduğu çeşitli çalışmalarda gösterdi ,14. Biz son zamanlarda taksi-Lys3, Bağdat15bu keyfi ekleme site adında bir nanobody takılı. Bu nanobody tavuk-yumurta-beyaz lizozim (HEWL) bağlamak için ve onun enzimatik aktivite16etkisizleştirmek için gösterildi. Biz Bağdat-taksi-Lys3, adında oluşturulan melez protein yüksek özgüllük muhafaza / β-lactamase aktivite kaldı HEWL karşı benzeşme değişmeden gösterdi. Sonra başarıyla hibrid β-lactamase teknolojisi bir elektrokimyasal Biyoalgılayıcı için kombine ve üretilen elektrik sinyal miktarı Bağdat-taksi-Lys3 ve bir elektrot üzerinde immobilize HEWL arasındaki etkileşimin bağımlı olduğunu gösterdi. Nitekim, β-laktam antibiyotik Bağdat tarafından hidroliz nicel bir elektrik sinyali dönüştürülebilir bir proton açıklaması neden olmaktadır. Bu birleşimi bir elektrokimyasal Biyoalgılayıcı hibrid β-lactamase teknolojisiyle hızlı, hassas, nicel ve üretilen sinyal gerçek zamanlı ölçüm sağlar. Bu metodoloji burada açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein numune hazırlama
- Üretmek ve hibrid protein Bağdat-taksi-Lys3 bizim önceki çalışma15' te bildirildiği gibi arındırmak. 50 mM fosfat tampon pH 7.4 ile aşağıdaki oluşturma protein saklayın: NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1,44 g ve KH2PO4 800 mL distile su içinde çözünmüş 0,24 g gidermek 7,4 önce çözüm pH nihai çözüm 1 sesini L. filtre sterilize protein çözüm.
- Bir tavuk yumurta akı lizozim (HEWL) stok çözüm hazırlamak. 100 mg (40.000 adet/mg) ticari olarak satın alınan HEWL 10 ml (PBS bkz: adım 2.1.1) fosfat tampon salin geçiyoruz. Protein çözüm 0,22 mikron kesim ile filtreleri kullanarak filtreleme tarafından sterilize.
2. Biyoalgılayıcı deneyleri
-
Çözüm ve tampon hazırlama
- 50 mM PBS NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO41,44 g ve KH2PO4 800 mL distile su içinde 0,24 g çözülerek hazırlayın. İçin pH 7.4 1 N HCl veya 1 N NaOH 1 L. filtre sterilize ve 4 ° C'de saklamak için çözüm sesini daha önce ayarlayın
- Kazein hidrolizat yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan PBS 100 ml 3 g çözülerek doygunluk/engelleme çözüm hazırlamak (bkz. Adım 2.1.1). Filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
- Kazein hidrolizat yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan PBS 100 ml 1 g çözülerek bağlama çözüm hazırlamak (bkz. Adım 2.1.1). Filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
- Bir çamaşır çözüm hazırlamak (% 0,1 ara - PBS) yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan PBS 100 ml Tween 20 (% 100) 100 μL ekleyerek (bkz. Adım 2.1.1). 4 ° C'de mağaza
- Bir elektrot hazırlık çözüm hazırlamak (%1 Triton X-100-PBS) Triton X-100 (% 100) 1 mL 100 ml yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan PBS ekleyerek (bkz. Adım 2.1.1). 4 ° C'de mağaza
- Bir elektrot rejenerasyon çözüm (3.5 M KCl) 26 g KCl son hacim için distile suda çözülerek hazırlamak 100 mL. Filtre sterilize ve mağaza 4 ° C'de
- 5 mM NaCl çözüm 0,29 gr NaCl son hacmi 1 L. filtre sterilize ve 4 ° C'de depolamak için distile suda çözülerek hazırlamak Sonra bir algılama çözüm (4 mM benzylpenicillin) benzylpenicillin 20 ml 5 mm NaCl çözüm 26.7 mg çözülerek hazırlayın. Filtre sterilize ve -20 ° C'de depolayın
-
Sensör hazırlık ve rejenerasyon
Not: Polyaniline cips geliştirilmiş olup, lütfen Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus ve Prof. Y. Glupczynski'nın (Katolik Üniversitesi of Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne) tarafından sağlanan sensör kaplı. Bu sensörler sentezlemek için kullanılan polyaniline elektro-polimerizasyon protokolleri yanı sıra sensör açıklaması onların önceki iş17' ayrıntılı. Kısaca, bu sistem ile klasik baskılı devre kartı (PCB) tekniklerle üretilen sekiz bireysel fiş yeniden kullanılabilir sensörleri kullanır. Bireysel cips üç elektrot oluşan lekeler yuvarlak. Üsttekini çalışma elektrot olan elektro sentezlenmiş hangi polyaniline üzerinde yapıldı. Orta bir referans elektrot ve alt elektrot sayaç elektrot oluşturmaktadır. Hem, başvuru ve sayaç elektrotlar katı Ag/AgCl amalgam karbon tabaka üzerine kullanarak functionalized.- Elektrot 3 yıkama ipuçları 300 µL/iyi elektrot hazırlık çözüm içeren bir 96-şey plaka kuyu daldırma tarafından gerçekleştirmek (%1 Triton X-100-PBS, bkz: adım 2.1.5.). Her yıkama nazik oda sıcaklığında karıştırma ile 2 min için gerçekleştirin.
- Elektrotlar 300 µL/iyi nazik oda sıcaklığında karıştırma ile 2 min için distile su içeren bir 96-şey plaka kuyu içine belgili tanımlık keyif daldırma tarafından durulayın.
- Elektrotlar ipuçları 300 µL/iyi rejenerasyon çözüm içeren bir 96-şey plaka kuyu daldırma tarafından yeniden (3.5 M KCl, bkz: adım 2.1.6) gecede 4 ° C veya oda sıcaklığında 1 h.
- Elektrot 3 yıkama ipuçları 300 µL/iyi fosfat tampon tuz içeren bir 96-şey plaka kuyu daldırma tarafından gerçekleştirmek (bkz. Adım 2.1.1.). Her yıkama nazik oda sıcaklığında karıştırma ile 2 dakika boyunca gerçekleştirin.
-
Tahlil bağlama sensör üzerinde gerçekleştirilen
- Kat HEWL 40 µg/mL HEWL elektrot yüzeyine PBS içinde hazırlanan bir 15 µL damla yatırma tarafından elektrot PANI (polyaniline) yüzeyine. Gecede 4 ° C veya oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya.
- Elektrot fosfat tampon salin ile üç yıkama gerçekleştirmek (bkz. Adım 2.1.1) sensör cips elektrot bölümlerini 300 µL/iyi fosfat tampon tuz içeren bir 96-şey plaka kuyu daldırma tarafından. Her yıkama nazik oda sıcaklığında karıştırma ile 2 min için gerçekleştirin.
- Elektrotlar engelleme çözüm bir 50 µL damla ekleyerek emdirmek (bkz. Adım 2.1.2) elektrot yüzeyine. Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. O zaman üç kez önceki açıklandığı gibi yıkama (bkz. Adım 2.3.2) adım.
- Bağdat-taksi-Lys3 çözüm çözüm bağlama içinde 20 µg/ml seyreltik (bkz. Adım 2.1.3) ve 15 µL damla elektrotlar üzerine seyreltilmiş Bu çözümün uygulama. Oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. Antijen-nanobody reaksiyon sonra yıkama çözüm kullanarak önceki adımda üç kez açıklanan yıkayın (bkz. Adım 2.1.4). Elektrot kez PBS ile yıkayın (bkz. Adım 2.1.1).
- Tespiti için dijital multimetre için bakır-devreleri bölümü üzerinden sensör çip takın. Sonra bir 50 µL damla algılama çözüm uygulayarak sensör yanıt başlatmak (bkz. Adım 2.1.7) üzerine pozitif elektrotlar ve NaCl 5 mM çözüm (bkz. Adım 2.1.7) negatif elektrot üzerine bir 50 µL damla uygulanıyor. Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. Gürültülerinden dijital multimetre ile izleyin.
Not: Multimetre Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus ve Prof. Y. Glupczynski'nın (Katolik Üniversitesi of Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. tarafından sağlanan Bu potansiyostat bilgisayar kontrollü yolu ile a USB liman ve aynı anda sekiz farklı fiş sensörün analiz eder. Yunus ve meslektaşları17 tarafından oluşturulan yazılım zamana karşı başvuru ve örnek elektrot arasındaki gürültülerinden farkı ölçümleri temsil eden gerçek zamanlı bir çizim oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tasarım ve mühendislik chimeric protein Bağdat-taksi-Lys3
Şekil 1 BalP A sınıfı β-lactamase izin veren bir döngü içine taksi-Lys3 ekleme Bacillus licheniformistemsil eder. Ekleme Asp198 ve Lys199 kalıntıları arasında gerçekleştirildi. Trombin bölünme site taksi-Lys3 her tarafında kullanılmaya başlandı. Bağdat-taksi-Lys3 chimeric protein kodlama bir bünye ifade plazmid ile dönüştürülmüş hücrelerin Ampisilin küçük bir konsantrasyon huzurunda büyümeye başardık. Bu sonuç hibrid β-lactamase doğru katlanmış çözünür, ve başarılı bir şekilde verimli Ampisilin karşı direnç sağlar nerede bakteri periplasmic uzaya atılır gösterir. Daha fazla bizim chimeric protein bifunctionality analiz ettik. Bizim önceki çalışmalarda bildirildiği gibi bizim veri β-lactamase yanı sıra chimeric protein taksi-Lys3 moieties onların biyolojik etkinlikler15muhafaza gösterdi.
Conductimetric Biyoalgılayıcı tahlil
Sensör bu tahlil için kullanılan fiş Şekil 2'de gösterildiği. Bu deneyler için kullanılan sensörler 8 cips içerir. Her çip üç elektrot içerir: bir çalışma elektrot, bir karşı elektrot ve bir referans elektrot. 8 Bu fişleri 4 Çift sensör olarak olarak düzenlenmiştir. Her çift için bir fiş etiketli "-" Oysa çip etiketli "+" test örneğine karşılık gelen bir negatif kontrol için karşılık gelen.
Şekil 3 Hibrid β-lactamase teknoloji potentiometric Biyoalgılayıcı için bir araya getiren bu çalışmada kullanılan deneysel kurulumunun şematik açıklamasını temsil eder. Bu kurulum, iki elektrot kullanılır: i) bir referans elektrot ve II) bir polyaniline (PANI) kaplı elektrot. HEWL PANI kaplanmış elektrot gibi diğer çalışmalar18,19' rapor adsorbe. Yeterli yıkar, Bağdat-taksi-Lys3 sonra (için "+" fiş etiketli) veya Bağdat olmadan eklenen nanobody (için "-" fiş etiketli) elektrotlar üzerinde uygulanır. β-laktam (benzylpenicillin) elektrotlar üzerinde ek, elektrot gürültülerinden değişiklikleri ölçülür. Nitekim, β-laktam hidroliz β-laktamaz tarafından proton bir yayın oluşturur; hangi elektrot gürültülerinden çok kısa tepki süresi ile önemli değişiklikler oluşturmak için gösterildi. Şekil 4'de Biyoalgılayıcı deneyleri Bağdat-taksi-lys3 PANI elektrot üzerinde immobilize HEWL için bağlama tespit ve immobilize β-lactamase aktivitesinden kaynaklanan proton yayın ölçme tarafından izlenen gösterir. Buna ek olarak, deneme eklenen herhangi bir nanobody Bağdat ile gerçekleştirildiğinde gürültülerinden fark algılandı.
Şekil 1: chimeric protein Bağdat-taksi-Lys3 HEWL ile etkileşim gösteren düzeni. Bağdat camgöbeği, taksi-Lys3 turuncu ve mavi HEWL gösterilir. Bu rakam Bağdat tridimensional yapıları birleştirerek elde edildi (PDB ID: 4BLM) ve taksi-Lys3/HEWL kompleksi (PDB ID: 1MEL). β-lactamase 2 etki alanları içerir: α/β hem α etki, katalitik sitesi arayüzü her iki etki alanı arasında yer almaktadır. Sokmak için kullanılan SAP sarı ile vurgulanmış ve solvent maruz döngü α etki alanında yer alan. Taksi-Lys3 N ve C-terminal bölgelerinde kırmızı renkte gösterilir. Taksi-Lys3 CDR3 döngü HEWL katalitik site ile ilgili kişileri çoğunu yapar. Taksi-Lys3 HEWL için bağlama enzimatik faaliyetlerini engeller. Bu rakam ve sonuçları burada sunulan bizim önceki çalışma15' te yayınlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: resim deneyde kullanılan sensörün. Her sensör 8 bireysel fiş bir grup içerir. Her yonga üzerinde üç elektrotlar vardır: bir çalışma elektrot, bir referans elektrot ve bir sayaç iyon elektrot. Bakır kaplı bölüm için bir bilgisayara bağlı bir dijital multimetre takılı. Bireysel fiş 4 Çift düzenlenmiş nerede "-" etiketli chipler negatif kontrol elektrotlar ve "+" etiketli chipler örnek elektrotlar. Bu kurulum farklı deneysel çoğaltır veya HEWL tanır / β-lactamase konsantrasyonları aynı anda test edilecek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: bizim Biyoalgılayıcı assay olarak kullanılan deneysel kurulumunun şematik gösterim. HEWL PANI (polyaniline) kaplı elektrot immobilize. Chimeric protein Bağdat-taksi-Lys3 sonra elektrot uygulanmıştır. Proton benzylpenicillin hidroliz tarafından indüklenen sürümü ölçerek belirlenir, immobilize β-lactamase etkinlik, HEWL ve chimeric protein arasındaki etkileşimi doğrudan orantılıdır. Proton serbest kullanıcı tarafından yorumlanabilir bir sinyal dönüştürülür elektrik kondüktansı değişiklikler neden olmaktadır. Kaplı PANI ve referans elektrot arasında bir fonksiyonu olarak gözlenen gürültülerinden fark evrimi. Bu rakam ve sonuçları burada sunulan bizim önceki çalışma15' te yayınlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: grafik olarak gösterilmesi conductimetric Bağdat-taksi-Lys3 spesifik etkileşime HEWL için gösterilen ölçümleri. Benzylpenicillin ek bir okla belirtilir. Bu potansiyel farkı antibiyotik hidroliz meydana gelen proton yayın kaynaklanır. Ölçümleri ile hibrid protein Bağdat-taksi-Lys3 (kırmızı) ve yerel β-lactamase Bağdat olmadan herhangi bir eklenen nanobody (mavi), bir negatif kontrol yapıldı. Farklı eğrileri farklı fiş üzerinde gerçekleştirilen bağımsız ölçümleri temsil. Bu rakam ve sonuçları burada sunulan bizim önceki çalışma15' te yayınlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada biz Bağdat β-lactamase bir taşıyıcı protein kullanarak bir nanobody functionalize için bir yöntem mevcut ve biz başarılı bir şekilde potentiometric sensör assay olarak elde edilen melez protein uygulayabilirsiniz göstereceğiz. Kovalent kaplin elektrik sinyali üretir enzimatik aktivite için antikor bölümünün diğer Biyoalgılayıcı deneyleri için karşılaştırıldığında çalışmalarımızın ana yenilik yönüdür. Bu sözde protein ekleme teknoloji avantajları ve bu bölümün ana odak-ecek var olmak sınırlamalar sunar.
Hibrid β-lactamase teknolojisinin avantajları.
Β-laktamaz verimli enzimlerdir
Duyarlılık ve bir Biyoalgılayıcı sinyal-gürültü oranı etkileyen en önemli parametrelerden biri sinyal oluşturmak için kullanılan enzimatik faaliyettir. Bu bağlamda, β-laktamaz birkaç avantajları sunmak: Bunlar küçük (≈29 kDa), monomeric, çok kararlı ve daha da önemlisi, yüksek belirli etkinlikleri ve potentiometric sensörü deneyleri glikoz gibi kullanılan diğer enzimler ile karşılaştırıldığında yüksek ciro sergi oksidaz, üreaz, lipaz, peroxydase veya alkalen fosfataz20. Tüm bu nedenlerden dolayı β-laktamaz çeşitli Biyoalgılayıcı deneyleri için tercih enzimlerdir.
β-lactamase içine doğrudan ekleme üretim verim ve eklenen protein/etki alanı kararlılığını artırabilirsiniz.
Birçok immunosensor deneyleri sınırlayıcı yönleri biridir analit2algılamak için kullanılan antikor kalitesini (istikrar, saflık gibi). Şu anda, düşük maliyetli üretim sistemleri antikorlar veya antikor parçaları (örneğin E. coli) zorlu kalır ve sık sık yoksul çözünürlük ve istikrar21ile toplanan proteinler için yol. Hibrid β-lactamase teknolojimiz daha önce bu stratejiyi ifade verim ve eklenen protein etki alanları14kararlılığını geliştirir geldiğinden beri bu zorlukların üstesinden gelmek için iyi bir yaklaşım gibi görünüyor. Özellikle, hibrid β-lactamase sistemimizi kullanarak mevcut çalışmada, Bağdat-taksi-Lys3 adlı chimeric protein başarıyla E. coli çok iyi verim (kültür litre başına saf protein ≈10 mg) ile ifade edilen ve homojenliği için saf.
Antikor ve enzimatik moieties arasında kovalent bağlantı daha ucuz ve daha hızlı sensör deneyleri yapar
Geleneksel immunosensors içinde analit algılama sensörü çipte immobilize birincil antikor kullanımı gerektirir. Daha sonra bir enzim veya etiketli bir sonda birleştiğinde ikincil bir antikor da ölçülebilir bir sinyal oluşturmak için gereklidir. Bu yaklaşım, birkaç incubations ve yıkama adımları içerir ve bu nedenle zaman alıcı olabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı birkaç antikorlar gereklidir ve ikincil antikor ve bir enzim/sonda arasında kovalent bağlantı da gereklidir beri pahalıdır. Buna ek olarak, sistemimiz sadece algılayıp analit ölçmek için bir melez protein kullanır ve bu nedenle ikincil antikor kullanımı olmadan izleme gerçek zamanlı sağlar.
Ayrıca, β-laktamaz allosteric anahtarı gibi davranış22,23teşhir hibrid proteinleri üretmek için gösterildi sınıf içine bu etki alanı ekleme unutmamak gerekir. Böyle anahtarları çok sayıda uygulama Biyoalgılayıcı tabanlı deneyleri içinde bulabilirsin.
Hibrid β-lactamase teknolojisi sınırlamalar.
Protein Mühendisliği tarafından indüklenen sınırlamalar.
Bu sistemde ana zorluk tasarım ve antikor yan β-lactamase ekleyerek bir melez protein elde etmektir. Elde edilen bu chimeric protein bifonksiyonel olmalıdır: enzimatik yan antikor yan yüksek afinite ile hedeflenen analit bağlamak gerekir ise β laktam antibiyotik elektrik sinyali oluşturmak için verimli bir şekilde hydrolyse mümkün kalmalıdır ve özgüllüğü. Bifonksiyonel chimeric protein elde etmek için çeşitli parametreler steric kısıtlamaları önlemek için dikkat edilmesi gereken. İlk kritik nokta ekleme sitesi konumudur. Birden çok ekleme noktası olası24,25,vardır gösterilmiştir rağmen26, pozisyonlar kez çözücü içinde yer alan ekleme döngüler uzakta aktif taşıyıcı protein maruz. Bu potansiyel konformasyon değişiklikleri veya steric engel tarafından eklenen protein indüklenen en aza indirir. Aynı nedenlerle, bu da aktif eklenen protein uzakta ekleme sitesinden değişiklikler onun faaliyet önlemek için yer olması önerilir. Son olarak, esnek veya komşu N - ve C-terminal ekstremitelerde mevcut proteinlerin ekleme daha iyi tolere edilecektir. Gerçekten de, uzak ve katı ekstremitelerde her iki ortaklarına chimeric protein steric kısıtlamalar empoze ve böylece ilgili biyolojik faaliyetlerini değiştirebilirler. Bu nedenle, eklenen protein boyutunu elde edilen chimeric protein üzerinde sadece küçük etkisi vardır söz önemlidir. Gerçekten de, bu büyük yapılandırılmış etki alanlarında başarıyla β-laktamaz onların N ve C terminali ekstremitelerde esnek olduğu sürece ya da birbirlerini13,14,2, yakın eklenebilir ki gösterilmiştir 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. çalışmanın, Bağdat ekleme sitedeki uzakta--dan onun aktif yer almaktadır ve eklenen nanobody uzak paratope bulunan nispeten uzun ve esnek ekstremitelerde (x-ışını yapısında görünmeyen) vardır. Bu özellikleri en az steric kısıtlamaları her iki ortaklarına hibrid protein biyolojik olarak aktif yüzeyler üzerinde empoze olun. Eklenen protein bir taşıyıcı protein içine uygun giriş için önerilen ölçüt sunmaz, ancak, bu potansiyel steric kısıtlamaları düşürmek için mühendis bağlayıcı bölgeleri için mümkündür. Gerçekten de, taşıyıcı bağlanmak için esnek bir bağlayıcı (örneğin Gly-Ser tekrarlar) ve eklenen protein varlığı önemli ölçüde artış büyük ve yapısal proteinler ekleme bir taşıyıcı bir30 karşı dayanıklılık için gösterildi ,12.
Sınırlamalar için elektrokimyasal doğal biyosensörler.
Elektrokimyasal/potentiometric biyosensörler gelişimi sürekli büyüyen bir alan haline gelmiştir rağmen bu deneyleri Biyoalgılayıcı deney tasarımı yaparken dikkat edilmesi gereken önemli kısıtlamalar bulunmaktadır. İlk, H+ çıkış veya alımını içeren tüm biyosensörler çok zayıf tamponlu çözümleri kullanılmasını sağlayın (Yani < 5 mM) önemli potansiyel farkları ölçmek amacıyla31 . H+ serbest bırakılmasıyla indüklenen pH değişimi protein özellikleri ve sinyal oluşturmak için kullanılan enzimatik aktivite etkileyebilir. İkinci olarak, pH ve iyonik Birlikten kuvvet biofluids önemli ölçüde değişir ve sonuç olarak yanıt önemli değişimler sonucunda ve arka plan gürültü biyosensörler32artırmak. Bu nedenle, çeşitli araştırma grupları Nanoteknolojide aygıt33, arabirimi gerçekleşen işlemler için sinyal-gürültü oranı artırmak için elektrokimyasal sensörü öğelerin boyutunu azaltmak için geliştirmek için çalıştık 34 , 35. sonuç olarak, Ayrıca onun hedef32' ye bir molekül bağlama dan kaynaklanan sinyal artırmak için aynı enzim birkaç molekülleri ile etiketli antikor molekülleri geliştirmek mümkündür. Ancak, bu sınırlamaları rağmen son derece verimli ve hassas cihazlar ile algılama (LODs) 10-8 10-11 M36aralığındaki tahmini sınırlarını conductometric/biyosensörler kalır.
Bu çalışmada, biz ve biz başarılı bir şekilde bir sınıf A β-Bağdat adlı lactamase HEWL hedefleyen bir nanobody ekleyebilir, oluşturulan melez protein her iki biyolojik faaliyetleri korur göstermiştir: i) sıkı HEWL ve II) kapasite hydrolyse bağlama Beta-laktam antibiyotik. Bu çalışmada çeşitli nanobodies veya antikor parçaları Bağdat içine yerleştirilmesi ve potentiometric sensörü deneyleri bu melez protein teknolojisinde uygulanması için kavramının bir kanıtı olarak kabul ettiğiniz anlamına gelir. Bu teknoloji potansiyel olarak çeşitli protein epitopları algılamak için kullanılan ve çok sayıda tanı araçları'nda uygulanan. Nitekim, geliştirme ve bu tür deneyleri etkin kullanımı toplumumuzda çok önemli hale gelmiştir ve temelde sosyal ve ekonomik ihtiyaçları için düşük maliyetli tarafından tahrik ve özellikle gıda ve sağlık sistemleri gibi çeşitli alanlarda teknolojileri kullanımı kolay gelişmekte olan ülkeler. Ayrıca, Nanoteknolojiler böyle sensörlerin geliştirilmesinde giderek daha fazla rol oynamak. Günümüzde, sinyal işleme teknolojisi sinyal işleme37için akıllı telefonlar ve tabletler ve farklı smartphone uygulamaları zaten var gibi taşınabilir aygıtlarda kullanılabilir. Örneğin, son zamanlarda, bir potentiometric algılayıcı cihaz38izleme glikoz konsantrasyonu sağlamak için smartphone entegre edilmiştir. Sağlık uzmanları, bu tür yenilikçi cihazlar daha önemli sağlık çözümleri önümüzdeki yıl39,40yılında olacak eminiz.
Sonuç olarak, bu iş potansiyeli ve protein ekleme teknolojimiz avantajları gösteren bir örnek temsil eder. Umarız Bu eser araştırma ve tıbbi amaçlar için yenilikçi ve kullanışlı teknolojileri geliştirmeye katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Valon bölgesi, Belçika SENSOTEM ve NANOTIC araştırma projeleri çerçevesinde yanı sıra ulusal fon için bilimsel araştırma (F.R.S.-F.N.R.S) finansal destek için kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L.
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E.
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).
