Summary
Este protocolo descreve a detecção de microscopia confocal de receptor acoplado a proteína G (GPCR) internalização em células de mamífero. Ele inclui a cultura de células de base, transfecção, e procedimento de microscopia confocal e fornece um método eficiente e facilmente interpretável para detectar a localização subcelular e internalização de GPCR expresso-fusão.
Introduction
As células possuem carga máquinas tráfico para o transporte de materiais-tais como ligantes, microrganismos, nutrientes e proteínas transmembranares-into a célula de informação, energia e outros fins 1, 2 extracelular. É crítico para a homeostase celular, a função do tecido, e a sobrevivência das células em geral. A expressão com base em células de proteínas de fusão fluorescentes é uma maneira poderosa para o estudo da localização e internalização de receptores transmembranares, tais como G receptores acoplados à proteína (GPCR), em vias de sinalização 3.
A expressão das proteínas de fusão marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) da medusa Aequorea victoria, combinado com as técnicas de detecção por fluorescência directa, ganhou uma vasta aceitação no-direccionamento proteína investigação 4, 5, 6. DETECTI baseada em GFPon tem a vantagem de permitir a imagens em tempo real de células vivas, evitando artefatos de fixação 7. Uma série de vectores de clonagem versáteis foi construído para facilitar a expressão de proteínas de fusão para GFP em várias células 8, 9. O vector pEGFP-N1 é um vector de plasmídeo amplamente utilizado e comercializado que codifica uma proteína fluorescente verde melhorada (EGFP), a qual foi optimizada a partir do tipo selvagem de GFP por fluoresccia mais brilhante e mais elevada expressão em células de mamíferos. Para observar o sinal fluorescente de EGFP expressa em células de mamíferos, a microscopia de fluorescência deveria ser conduzido com a excitação a 488 nm e a emissão a 507 nm, de preferência com microscopia confocal.
Monitorando a localização subcelular e internalizao mediada por ligando dos receptores é uma técnica comum para investigar a transdução de sinal e da função de GPCR 10 até>, 11. Na maioria dos casos, a internalização conduz à dessensibilização dos GPCRs (a atenuação da resposta do estímulo, a despeito da presença de agonistas) 12, 13. Os receptores interiorizados podem ser incorporados no lisossoma e degradado, ou eles podem ser reciclados de volta para a superfície celular, dependendo da natureza dos receptores e as linhas de células utilizadas nas experiências.
Os receptores da hormona libertadora de gonadotropina (GnRHR) pertencem à família GPCR e tem uma estrutura típica de GPCR proteína, com um terminal amino extracelular, um terminal -COOH intracelular, e sete transmembranar (TM) 14 de domínios. A transfecção do plasmídeo recombinante Sj GnRHR-EGFP (com o gene de GnRHR de Sepiella japonica) e a detecção de microscopia confocal de GnRHR Sj marcaram-EGFP (expressos em células HEK293) foi relatada Previoudissimulado, e fluorescência de GFP foi estabelecido como um repórter para ensaios de localização da proteína transmembranar de 15. Agora, a internalização de Sj GnRHR, activado por S. japonica-hormona libertadora de gonadotropina (GnRH Sj), foi demonstrada em modos dependente do tempo e da dose por microscopia confocal.
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Protocol
1. Preparação de células
- recuperação de células
- Transferir as células criopreservadas 293 de rim embrionio humano (HEK293) a partir de um tanque de azoto líquido para um banho de água a 37 ° C e agitar continuamente durante 1-2 min.
- Adicionar 10 mL de meio de crescimento equilíbrio nas (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% de soro de bovino (FBS), e 1% de solução de penicilina-estreptomicina fetal) para uma placa de cultura celular de 10 cm. Delicadamente adicionar as células descongeladas ao meio de crescimento equilibrado.
- Incubar as células em uma jaqueta de água incubadora de CO2 a 37 ° C com uma atmosfera humidificada contendo 95% de ar e 5% de CO 2 durante 2-4 h.
- Depois de 2 - 4 h, verificar que as células são ligadas. Substituir o meio de crescimento e equilibrada de cultura por outro 24-48 h.
NOTA: A alteração do meio de crescimento equilibrada é útil porque remove sulfóxido de dimetilo (DMSO) e protege contra os danos celulares.
- <strong> passagem celular
- Depois de 24 - 48 h, quando as células foram cultivadas até à confluência perto, descartar o meio de crescimento equilibrada e lavar as células com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Agitar o prato delicadamente.
- Descartar o PBS e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA (solução salina, 0,25% de tripsina e 0,02% de EDTA). Para digerir completamente as células, rodar o prato cuidadosamente e aspirar para fora da solução de tripsina-EDTA. Colocar o prato no 37 ° C, com camisa de água incubadora de CO 2 durante 3 min.
NOTA: Durante este período, preparar três novas placas de cultura celular de 10 cm e adicionar 10 mL de meio de crescimento equilibrado a cada um. - Usando um microscópio de luz, determinar se as células de ter levantado a partir do fundo do prato. Adicionar 2 mL de meio de crescimento equilibrada ao prato. Misturar por pipetagem e pipetar imediatamente 0.6 ml da suspensão de células a cada uma das novas pratos. Misturar suavemente por pipetagem e permitir que as células a incubar a 37 ° C e 5% de CO 2.
Sementeira 2. celular
- Depois de 24 - 48 h, quando as células foram passadas cultivadas até à confluência perto, descartar o meio de crescimento equilibrada e lavar as células com 2 ml de PBS. Agitar o prato delicadamente.
- Descartar o PBS e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA. Para digerir completamente as células, rodar o prato cuidadosamente e aspirar para fora da tripsina-EDTA. Colocar o prato no 37 ° C, com camisa de água incubadora de CO 2 durante 3 min.
NOTA: Durante este período, preparar uma placa de 6 poços por adição de 2 mL de meio de crescimento equilibrado a cada poço. - Adicionar 1 mL de meio de crescimento equilibrada ao prato, se, sob observação microscópica, as células de ter levantado a partir do fundo da placa. Misturar por pipetagem e imediatamente pipetar 0,1 ml de suspensão de células (o volume é ajustado de acordo com a densidade de crescimento de células) para cada poço da placa de 6 poços preparado (placa de células-menos de 6 poços com 2 mL de meio de crescimento equilibrada). Misturar suavemente por pipetagem e permitir que as células-se a incubar a 37 ° C e 5% de CO 2.
Transfecção 3. celular
- Um método de transfecção, com as formulações de lipossomas
NOTA: Por favor, veja a tabela de materiais de reagente de transfecção 1.- No dia seguinte, assegurar que as células devem ser 85 - 95% confluentes.
- Adiciona-se 3 ug de ADN de plasmídeo (500 ng / mL) e 100 de meio de soro reduzido para um tubo de microcentrífuga estéril, e misturar suavemente. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Preparar 9 mL do Reagente 1 e 100 de meio de soro reduzido em um outro tubo de microcentrífuga, e misturar suavemente. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Combinar a mistura plasmídeo diluída com reagente diluído 1 (volume total = 215 ul). Misturar suavemente e incuba-se durante 20 min à temperatura ambiente.
- meio aspirado a chapa de células cultivadas, e adicionar 1,5 ml de DMEM fresco sem FBS.
- Adicionar 215 uL de ADN-transfmistura reagente a cada exão, gota a gota bem, e misturar suavemente por agitação da placa.
- Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 4-8 h. Substituir com DMEM fresco com 10% de FBS.
- Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante mais 24 - 48 h antes da execução de todas as experiências.
- Método de transfecção 2, com as formulações de lipossomas
NOTA: Por favor, veja a tabela de materiais de reagente de transfecção 2.- Adicionar meio de soro de 2 ug de ADN de plasmídeo (500 ng / ml), 4 ul de Reagente 2 e 100 uL reduzidos para um tubo de microcentrífuga estéril. Misturar suavemente e incuba-se durante 15 min à temperatura ambiente.
- Adicionar a mistura de transfecção para as células de um modo gota a gota.
- Após a transfecção, as células incubar durante 24 - 48 h a 37 ° C e CO2 a 5%, antes da execução de todas as experiências.
4. Cultura de Células em lamínulas
- Rémover o meio de crescimento a partir da cultura da placa de 6 poços.
- Lavar a monocamada de células com 1 ml de PBS sem cálcio e magnésio.
- Adicionar 0,5 ml de tripsina-EDTA. Agitar o prato com cuidado e aspirar off tripsina-EDTA. Incubar a placa de cultura durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. O tempo de incubação real varia de acordo com a linha celular utilizada.
NOTA: Durante este período, preparar uma nova placa de 12 poços e adicionar 15 mm de diâmetro tampa estéril desliza para cada poço. As lamelas revestidas com lisina, laminina, colagénio ou podem melhorar a fixação das células para células HEK293 que se desprendem facilmente. - Quando as células são separadas, adicionar um meio de crescimento completo ml pré-aquecido a cada poço. Misturar por pipetagem e transferir imediatamente o número necessário de células para a placa de 12 poços com lamelas. Adicionar meio de crescimento completo e fresco a cada poço para ajustar o volume total para 1 mL
- Incubar as células durante 16 - 24 h a 37 ° C e CO2 a 5%.
NOTA: Depois de 30 -60 min, a maioria das células vai ter aderido às lamelas estéreis.
5. confocal Detecção de Microscopia
- localização celular
- Depois de 16 - 24 h, quando as células foram cultivadas até à confluência em perto as lamelas estéreis na placa de 12 poços, adicionar a sonda de membrana, DII, a cada poço, dando uma concentração final de 5 uM. Permitir que as células a incubar durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Após 30 min, remover o meio de crescimento equilibrada e lavar as células duas vezes em PBS frio (2-8 ° C).
- Fixar as células por adição de 1 mL de uma solução de paraformaldeído a 4% (em PBS) a cada poço. Agitar suavemente durante 15 min.
Cuidado: O paraformaldeído é moderadamente tóxica por contacto com a pele ou por inalação, e designada como um provável carcinógeno humano. Produtos químicos exaustores, recintos ventilados de equilíbrio ou de outras medidas de protecção deve ser utilizado durante o tratamento de pesagem e de paraformaldeído. </ Li> - Lavam-se as células fixadas duas vezes em PBS. Adicionar 200-300 mL de DAPI (4' , 6-diamidino-2-fenilindol) solução (0,5 ug / mL) a cada poço e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Lavar as células duas vezes com PBS. Cuidadosamente remover as lamelas a partir da placa e pavio o excesso de PBS. Inverta em lâminas de microscópio carregados com uma gota de meio de montagem (50% v / v de glicerol / água). Retire o excesso de meio de montagem dos slides.
- internalização celular
- Depois de 16 - 24 h, quando as células foram cultivadas até à confluência em perto as lamelas estéreis na placa de 12 poços, remover o meio de crescimento equilibrada e adicionar fresco, meio DMEM aquecido (37 ° C). Incubar as células durante 1 h a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Tratar as células com diferentes concentrações (0, 10 -12, 10 -9, e de 10 -6 M) de ligando durante 30 min e tratá-los com 10 -6 M de ligando para diferentes tempos (0,10, 30, e 60 min).
- Lavar as células duas vezes em PBS frio (2-8 ° C). Fixar as células por adição de 1 mL de uma solução de paraformaldeído a 4% (em PBS) a cada poço. Agitar suavemente durante 15 min.
- Lavar as células duas vezes em PBS. Cuidadosamente remover as lamelas a partir da placa e pavio fora o excesso de PBS. Inverta em lâminas de microscópio carregados com uma gota de meio de montagem (50% v / v de glicerol / água). Retire o excesso de meio de montagem dos slides.
- microscopia confocal
- Ligue o hardware de microscópio confocal, incluindo a potência da lâmpada de mercúrio, PC microscópio, scanner e laser. Entre para conta do sistema operacional, o lançamento do software, verifique a configuração e selecione laser. Ligue as diferentes unidades de sistema de microscopia confocal na ordem de acordo com as instruções.
- Colocar as lâminas preparadas no palco microscópio. Coloque a amostra sobre a lente objetiva usando o controlador palco. Adicione uma gota de óleo de cedro ema lamela, quando a lente de imersão em óleo é seleccionado. Coloque as lamínulas em lâminas de frente para a lente.
- Encontrar as células de interesse sob a microscopia fluorescente.
- Alternar para o modo digitalizar. Escolha a potência do laser e a faixa espectral do fluoróforo emissões. Capturar as imagens confocal de alta qualidade por intensidade do laser de afinação e outros parâmetros.
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Representative Results
A Figura 1 mostra um exemplo de um sistema de microscópio confocal. A Figura 2 apresenta a expressão de pEGFP-N1 em células HEK293. O sinal de GFP foi detectado no citoplasma e núcleo. A Figura 3 mostra a localização subcelular de GnRHR de S. japonica em células HEK293, consistente com os nossos resultados publicados anteriormente 15. A proteína de fusão com a marca de EGFP na extremidade C-terminal de Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) apareceu verde nesta experiência quando sob MCVL. O núcleo corado com DAPI foi revelado em azul. coloração DII destacado da membrana celular no vermelho. O sinal de amarelo na superfície da célula na imagem resultante da concentração indicada a coincidência de vermelho e verde, o que demonstra a localização da membrana de plasma de GnRHR de Sj.
As Figuras 4 e 5 mostramos resultados dos ensaios de internalização Sj GnRHR em células HEK293. Para visualizar a internalização de Sj GnRHR, as células foram tratadas com a hormona libertadora de gonadotropina (Sj GnRH) 15 em diferentes concentrações durante 30 minutos (Figura 4), ou que foram tratados com uma única concentração (10 - 6 M) para diferentes durações ( A Figura 5). Na ausência de GnRH Sj, fusão do receptor de controlo (CTL) teve a localização da membrana de plasma. Como mostrado na Figura 4, a diferentes concentrações de ligando, a internalização do Sj GnRHR procedeu de uma forma dependente da dose, e o receptor foi completamente internalizado a partir da superfície da célula com o 10 - ligando de 6 M. Como mostrado na Figura 5, os resultados da análise do decurso no tempo da internalização do receptor com 10-6 M de ligando demonstrado que internalizadoSj GnRHR era detectável 10 minutos após a estimulação agonista, e extrema internalização ocorreu em 60 min. Observação com microscopia confocal a partir destas figuras, revelou que a proteína de fusão Sj GnRHR-EGFP fluorescente foi localizada principalmente na membrana de plasma e foi dramaticamente e rapidamente internalizado na cula em resposta ao péptido Sj GnRH em células HEK293.
Figura 1. Um exemplo de um microscópio confocal de sistema. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Microscopia Confocal de GFP em Proteína Controlo pEGFP-N1-transfectadas células HEK293 . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Localização dos GnRHR de Sj-EGFP proteína de fusão em células HEK293 por Microscopia Confocal. O núcleo corado com DAPI é mostrado em azul. coloração DII, mostrado em vermelho, destaca a membrana celular. Sj proteína de fusão de EGFP-GnRHR é mostrado em verde. Na imagem mesclada, amarelo indica a coincidência dos sinais vermelhos e verdes. Todas as imagens representam pelo menos três experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. A internalização de GnRHR Sj-EGFP proteína de fusão em células HEK293 em um curso de tempo por Microscopia Confocal. Células HEK293 transfectadas com o plasmídeo de GnRHR Sj-EGFP foram activadas por tratamento com diferentes concentrações de GnRH durante 30 min. O caso de controlo foi, sem estimulação com GnRH (CTL). Todas as imagens representam pelo menos três experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. A internalização de GnRHR Sj-EGFP proteína de fusão em células HEK293 em um modo dependente da dose por Microscopia Confocal. Células HEK293 transfectadas com o plasmídeo de GnRHR Sj-EGFP foram activadas por tratamento com 10-6 M de ligando para d diferenteurations. O caso de controlo foi, sem estimulação com GnRH (CTL). Todas as imagens representam pelo menos três experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado fornece um método eficiente e facilmente interpretável para detectar a localização subcelular e internalizao de protea de fus de GPCR expresso em culas HEK293. A técnica pode ser facilmente adaptado para muitos genes diferentes e tipos de células, tais como para a localização celular e a internalização do receptor corazonin de Bombyx mori em HEK293 e BMN células 16.
A aplicação bem sucedida deste ensaio poderoso depende de alguns fatores-chave. Mais importante é a boa saúde das células, o que é essencial para a transfecção eficiente e de qualidade de dados. O tempo de incubação a transfecção, o intervalo entre a transfecção e outras experiências, e a passagem de células transfectadas para cobrir deslizamentos antes de imagem, são todos os passos em que o dano para as células de cultura é possível. Portanto, a manutenção da boa saúde das células é um requisito importante para todas as etapas neste experimento. Além disso, evitando as células fortemente comprimidas em culturas densas é vital para adquirir imagens de alta qualidade com microscopia confocal. Para minimizar a influência do marcador fluorescente na localização dos GPCRs, geramos receptores com EGFP fundidos com o terminal C intracelular. A transfecção bem sucedida e eficiente do gene dentro das células também é importante. A eficiência de transfecção podem variar grandemente em diferentes linhas celulares. Portanto, a optimização de certas etapas do protocolo pode ser necessário, dependendo do tipo celular particular utilizado. Por exemplo, no método de transfecção 1, o período de incubação das células transfectadas em DMEM sem FBS pode ser optimizado de acordo com o estado da célula. Além da dosagem do plasmídeo de ADN, a dosagem do reagente de lipossoma e meio de soro reduzido deve ser ajustada de acordo com as linhas de células específicas. Caso contrário, a técnica electrotransfection poderia ser realizada em vez de reagente de transfecção mediada por lipossomas fou eficiência de transfecção aceitável numa linha celular específica. No entanto, é necessário hardware adicional, e as células em suspensão e em um volume pequeno são difíceis de transfectar por electrotransfection. A verdadeira força de ensaio actual, no entanto, encontra-se na comparação entre as mudanças nas mesmas células sob condições de cultura idênticas após manipulações agudas, tais como a internalização de GnRHR Sj em resposta ao ligando de GnRH Sj.
Internalização é um dos mecanismos que controlam predominantes GPCR sinalização para assegurar as respostas celulares a estímulos apropriados 11. Nós podemos facilmente observar mudanças na internalização através de imagens com microscopia confocal. A internalização de GnRHR Sj em uma dose e modo dependente do tempo é claramente revelado na Figura 4.
O protocolo que se descreveu pode ser facilmente adaptado para o rastreio subcelular de outro pr eucarióticaoteins, tais como o receptor de estrogénio nuclear 17. No entanto, a optimização de certas etapas do protocolo irá ser necessário, dependendo dos tipos celulares particulares utilizados, o que exige uma maior exploração e prática. No entanto, tendo em conta que a localização subcelular de proteínas tem uma grande influência sobre a identificação de genes, modificações de proteínas, e as vias de sinalização, este protocolo, com base na pesquisa publicada, pode proporcionar dados de confiança e informações.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
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