Summary
本文介绍了一种在不需要复杂的高成本设备的情况下, 制作凹 microwells 的鲁棒方法。采用磁力、钢珠和通孔阵列, 在 3 cm x 3 cm 烷 (microwells) 衬底上形成几百个。
Abstract
椭球区域性是理解细胞行为的有用工具, 因为它提供了一个在体内类似的三维环境。各种球体的生产方法, 如无粘结表面, 微调烧瓶, 悬挂滴, 和 microwells 已被用于研究细胞间的相互作用, 免疫活化, 药物筛选, 干细胞分化, 和化生成。在这些方法中, microwells 与三维凹几何已经得到了科学家和工程师的注意, 由于他们的优势, 统一大小的球体生成和轻松的反应, 个别椭球可以监测.尽管提出了使用柔性膜和冰光刻等成本效益高的方法, 但这些技术存在着严重的缺点, 如难以控制模式尺寸、实现较高的长宽比和生产大面积的 microwells。针对这些问题, 提出了一种在不需要复杂的高成本设备的情况下制作凹 microwells 的鲁棒方法。该方法利用了 30 x 30 通孔阵列、几百微米级的钢珠和磁力, 在 3 cm x 3 cm 烷 (microwells) 基底上制造了900个。为了证明我们的方法对细胞生物学应用的适用性, 我们培养脂肪干细胞3天, 成功地生产椭球使用我们的微平台。此外, 我们进行了一个静磁场模拟研究的机制, 即磁力被用来捕获钢珠在通孔。我们认为, 所提出的微制备方法可以应用于许多基于球体的细胞研究, 如药物筛选、组织再生、干细胞分化和肿瘤转移。
Introduction
生长成球状形态的细胞比二维平面区域性1更类似于实体组织。考虑到这一优势, 采用椭球的方法来改善细胞与细胞相互作用的研究2,3, 免疫激活4, 药物筛选5, 和差异性6。此外, 椭球结合多种细胞类型最近已应用于 organoids (近生理三维 (3D) 组织), 这是非常有用的研究人类发展和疾病7。几种方法已被用于生产椭球。最简单的方法是利用非粘合表面, 使细胞聚集在一起, 形成椭球。培养皿可以用牛血清白蛋白、pluronic F-127 或疏水性聚合物 (如聚 2-乙甲基丙烯酸酯) 来处理, 使其表面不粘附8, 9。微调烧瓶方法是另一种众所周知的生产大量椭球10,11的方式。在这种方法中, 细胞通过搅拌来保持悬浮, 以防止它们附着在基体上。相反, 浮动单元格聚合以形成椭球。无粘结面法和微调瓶法均能产生大量的椭球。但是, 它们受到限制, 包括控制球体尺寸的困难, 以及每个球体的跟踪和监测。作为对此类问题的一种补救方法, 另一种球形生产方式, 即悬挂跌落法可以采用12。这包括将细胞悬浮液沉淀在培养皿盖子的下侧。这些下落通常是15到30µL 在大小并且包含大约300到3000个细胞13。当盖子是倒置的, 下落由表面张力举行。每个下落的微重力环境集中细胞, 然后形成唯一椭球在自由的液体空气接口。悬挂下降法的优点是它提供了一个受控的大小分布, 而它很容易跟踪和监测每个球体, 相对于非胶粘剂表面和微调烧瓶的方法。然而, 这种方法在椭球的大量生产和生产过程本身是过度劳动密集型的情况下产生了一个不利因素。
微阵列是一个平板, 有许多微尺寸的井, 每一个直径不等, 从100到1000µm。在使用 microwells 时, 球体的生产原理与非粘性表面方法相似。好处包括 microwells 提供空间之间的 microwells 分离的细胞或椭球, 这样, 它是易于控制的球体大小, 同时也使它易于监测每个单一的球体。随着大量的 microwells, 高吞吐量球体的生产也成为可能。microwells 的另一个优势是根据用户独特的实验目的, 选择不同形状的水井 (六面体、圆柱形、三角形棱柱)。然而, 一般来说, 一个三维 (3D) 凹 (或半球) 形状被认为是最适合生产统一尺寸的单椭球。因此, 凹 microwells 的用处已经报告了许多细胞生物学研究, 如那些检测胚胎干细胞分化的心肌细胞14, 胰岛细胞簇的胰岛素分泌,15,肝细胞酶活性为16, 肿瘤耐药性椭球17。
不幸的是, 制作 microwells 往往需要专门的微设施;传统的光刻方法需要曝光和开发设备, 而反应离子蚀刻的方法需要等离子和离子束设备。这类设备费用高昂, 加上复杂的制作过程, 给无法进入微的生物学家带来了高门槛。为了克服这些问题, 提出了其他成本效益高的方法, 如冰光刻18 (使用冷冻水滴) 和柔性膜法14 (使用膜、通孔衬底和真空)。然而, 这些方法也有严重的缺点, 如难以控制的模式大小, 实现高宽比, 和生产大面积 microwells。
为了克服上述问题, 我们提出了一种新的凹微制造方法, 利用孔基板、钢珠和磁铁阵列。利用这种方法, 利用磁力辅助的自锁金属珠 (图 1) 的机理, 可以制作数以百计的凹球形 microwells。制作过程涉及使用极少数昂贵和复杂的设施, 不需要许多先进的技能。因此, 即使是不熟练的人也很容易承担这种制作方法。为了证明所提出的方法, 在凹 microwells 培养人脂肪干细胞, 产生椭球。
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Protocol
1. 通过孔阵列铝板和磁铁阵列的制备
- 准备两个50毫米 x 50 毫米 (或更大) 的铝板。每个板材的厚度为300µm, 是珠粒直径的一半。
- 在其中一个铝板上形成一个 30 x 30 通孔阵列, 使用带有Φ550µm 微钻头的 CNC 旋转雕刻机, 其转速为30毫米/秒, 主轴速度为 8000 RPM。每个孔之间的距离 (中心到中心) 是 1 mm (图 1a和图 2a, i)。
- 使用与 1.2 (图 1a和图 2a, ii) 中描述的程序相同的步骤, 在其他铝板上形成一个 30 x 30 阵列的Φ750-µm 通孔。
- 在两个铝板的四角上, 使用粘胶带和形成Φ3 mm 对齐孔, 以彼此连接这两个板块。
- 在15% 硫酸中浸泡12小时的铝板以清洁其表面。由于铝表面的薄层氧化铝使其具有耐腐蚀性, 因此该酸处理不会改变板材的孔径和厚度。
- 形成一个 30 x 30 阵列的1个 1 x 1 毫米钕磁铁 (具有磁性强度为 0.363 N)。确保每个磁铁是相反的极性对它的邻居。为了防止磁体阵列的破裂或散射, 使用双面胶带 (图 2a、 iii 和嵌入图 2) 将 30 x 30 mm 的铝板连接到磁体阵列的底部。
2. 磁珠捕集工艺
- 对齐和堆叠两个铝板 (顶板: 750-µm 孔板, 底板: 550-µm 孔板) 使用准备的对准孔在每个板块的四角 (图 1b)。
- 通过将 M3 螺栓插入对准孔中, 将两个板锁定在一起, 然后用螺母固定螺栓 (图 1b)。
- 堆叠在准备好的磁铁阵列上的铝板组件 (图 1b, 2b和2c)。在堆叠过程中, 将磁体阵列与铝板上的孔阵列对齐。然后使用粘胶带固定磁铁阵列的位置。
- 在板组件上放置足够数量的φ mm SUJ2 钢珠, 并使用丙烯 (或非金属) 板对珠子进行操作, 使珠子在每个孔 (图 1c、 1d和1e) 同时被困住去除未在孔中的多余的珠子。
- 小心取下顶部板, 以避免不必要的散射和错位的珠子 (图 1f)。
3. 凹微制造
- 移动凹微模具, 生产步骤2.1 至 2.5, 以上, 以培养皿。
- 混合烷 (硅橡胶) 单体和固化剂根据制造商的指示19与一个硅氧烷单体: 固化剂比10:1。
- 通过使用干燥和真空泵来除去在该混合物中被困住的气泡, 以消除气体的混合物。
- 使用与 3.3 (图 1f) 中描述的过程相同的步骤, 将该混合物倒入凹微模和脱气中。
- 在80° c 的板上烘烤 2 h 的硅氧烷混合物, 形成一个珠嵌入的硅橡胶衬底 (图 1g)。
- 从模具 (图 1g) 中卸下固化的硅基板。在去除过程中, 用洗涤瓶喷涂甲醇从模具中分离出硅烷基板。
- 使用 15 mm x 2 mm 磁铁, 从硅基板上取下被夹住的钢珠 (图 1h)。在这个过程中, 任何足够强的磁铁从硅氧烷基板中提取珠子都可以使用。
4. 球体培养
- 在本研究中, 用 24-井板上的Φ14 mm 活检穿孔, 切割凹微图案的硅橡胶衬底。
- 在121° c 和 15 psi 的高压灭菌器中消毒所产生的Φ14 mm 的硅基板。
- 将灭菌后的硅基板置于24井盘中。
- 用 4% (w/v) pluronic F-127 溶液将整个硅烷基板涂上一整夜, 防止细胞附着在微表面。在涂层过程中, 通过移或使用超声波清洗器, 去除凹 microwells 中的气泡。
- 使用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗 F-127 溶液三次。
- 种子1毫升的细胞介质 (Dulbecco 氏改良的鹰培养基) 解决方案 (其中包含 2 x 106细胞) 在硅烷基板上。请注意, 播种密度可以根据目标球体的大小和/或目标细胞类型而改变。在这里, 脂肪来源的干细胞 (ASC) 被使用。
- 用1000µL 吸管抽吸1毫升培养基, 以去除未被困在 microwells 中的多余细胞 (图 3)。
- 孵育的细胞在36.5 ° c, 湿度的 > 95%, 和 5% CO2条件。在我们的研究中使用的陶瓷的情况下, 细胞聚集到一个球体在48小时。
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Representative Results
通过以下步骤2.1 到 3.7, 成功地制作了凸模和微模式。(图 4)。商业钢珠被困在 30 x 30 通孔阵列。珠子被紧紧地抱着, 珠子和相应的通孔之间没有缝隙 (图 4a)。预制凹微的形状为凹半球形, 直径为600µm, 与钢珠相同 (图 4b)。凹微的横截面 (图 4c) 显示相邻微的距离为1毫米 (中心至中心), 与通孔相同。Φ14 mm 凹微衬底, 这是放置在24井板, 包含超过 120 microwells (图 4d)。
在凹 microwells 中培养脂肪干细胞。我们在Φ14 mm 凹微阵列上播种 2 x 106单元格。24小时后, 单元格聚合为椭球, 如图 4所示。在我们的微阵列中形成的椭球的平均直径为185.68 ±22.82 µm (天 1,图 5a, 5c)。在3天, 细胞变得更加聚合, 椭球的平均直径下降到147.00 ±17.11 µm (图 5b, 5d)。
图 1: 制作过程示意图.(a) 使用 CNC 雕刻机, 在铝板上制作 30 x 30 Φ550和750µm 通孔阵列。(b) 使用对准孔对齐两个通过板。随后, 对齐的板被堆叠在磁铁阵列上。(c) 在板材上播种足够数量的钢珠。(d) 用丙烯板将珠子刮到通孔阵中的珠子。(e) 珠子被困在通孔阵列中。(f) 去掉顶板 (Φ750-µm 通孔阵列), 并将未的混合料倒入模具中。(g) 在80˚C 2 h 烘烤后, 硫化硅烷被 unmolded。(h) 固化的硅烷抓住钢珠。然后用钕磁铁 (15 毫米, 厚度为2毫米) 去除珠子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 制作过程.(a) 准备两个通孔板和磁铁阵列。i) 铝板有750µm 通孔阵列。二) 铝板有550µm 通孔阵列。iii) 30 x 30 阵列1毫米 x 1 毫米 x 1 毫米磁铁。(b) 堆叠和对齐的板材的顶部视图。(c) 堆叠和对齐的板和磁铁阵列的底部视图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 通过后退半月板去除过多的细胞.通过有抱负的介质, 表面张力是由气液界面引起的, 然后表面张力在微基底表面上废弃过多的细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 凸模和预制微阵列.(a) 通过孔阵列铝板中的陷珠。被困的珠子充当模具制造凹 microwells。珠粒大小为600µm。标尺是1毫米 (b) 和 (c) 扫描电镜图像的制作 microwells。每个制作的微有一个半球形, 直径600µm。(d) Φ14-毫米微阵列在24井板上。该阵列包含超过120凹 microwells。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 在凹微阵列中培养椭球.Φ14毫米微阵列以 2 x 106陶瓷种子, 培养3天。(a) 在1天培养椭球;细胞开始形成椭球。标尺是2毫米 (b) 培养的椭球在3天;形成的椭球是更加严密的结构, 而他们的平均直径从185.68 ±22.82 µm 在天1到147.00 ±17.11 µm 在天3。刻度条是2毫米 (c) 1 天球体的放大图像。刻度条是500µm. (d) 3 天球体的放大图像。刻度栏为500µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 磁通密度矢量的模拟结果.用静磁模块计算了磁体阵列的磁场密度。仿真结果表明, 磁通密度最强的是在每个磁铁的中心, 导致珠子被困在通过孔的中心, 他们成为安全固定。刻度线为 2 mm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 磁铁阵列的磁场分布.每个磁铁对它的邻居都是相反的极性。在相邻磁体的界面上, 水平磁场占主导地位, 而垂直磁场在每个磁体的中心最强。这些方向力引导一个珠子到磁铁的中心。(a) 磁铁阵列的磁场。(b) 磁场矢量, 由静磁模拟确定。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 限制使用单大磁铁和珠大小.(a) 与使用一组小磁铁的情况不同, 当使用一个大磁铁时, 几乎所有的珠子都趋向于在高密度磁场形成的磁铁的边缘或中心移动。此外, 珠子连接形成一个链形。刻度线是10毫米. (b) 用φµm 珠和1毫米 x 1 mm x 1 毫米磁铁阵列制作的连接微的 SEM 图像。使用尺寸太大的珠子相对于磁体的大小, 可以在相邻的 microwells 之间的墙上创建一个小孔。刻度栏为100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 在珠圈补漏白过程中选择合适的顶板厚度和孔尺寸的重要性.(a) 如果顶部板太厚, 将出现双重陷阱。(b) 反之, 如果顶板太薄, 有一个趋势的珠子脱落。(c) 如果通孔的大小大于珠径, 则可能出现双圈闭和磁珠错位。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
这种制作方法面临的主要挑战是在铝板的通孔阵列中的珠子的安全固定。为了解决这一难题, 以 30 x 30 磁铁阵列的形式使用磁力来稳固地固定珠子, 如图 6和7所示。磁体阵列的磁通密度与极性相反, 在每个磁体表面的中心最强。因为磁力的强度取决于磁通密度, 所以珠子被引导到每个磁铁的顶面中心, 在那里他们被放置在位置。如果使用一个大尺寸的磁铁 (5 厘米 x 5 cm x 1 厘米), 珠子, 特别是位于极端外孔的磁珠, 往往被吸引到在磁体边缘产生的高强度磁场。使用大磁铁的另一个问题是, 珠子会自发地粘在一起, 形成小的珠子链 (图 8a)。
上部板 (750 µm 孔) 的作用是服务坑几何到陷珠。由于这个坑结构, 它是可能的划痕的珠子与丙烯酸板创建大量的被困珠阵列一次 (协议2.4 和图 1c和1d)。如果不使用顶板, 每个珠子必须手动插入到基地 (550 µm 孔) 一次。
我们的方法的局限性包括需要一个 CNC 雕刻机是最昂贵的设备使用的方法。这种数控机床的价格是3000美元左右。然而, 这仍然比传统的软光刻设备便宜得多。我们的方法的另一个固有的局限性是对小磁铁的需要, 和 microwells 之间的差距是取决于磁铁的大小, 这是1毫米, 在本文所描述的示范。这将是很难减少这一差距更大, 因为磁铁小于500µm 是不容易获得。此外, 珠子的最大尺寸也受到限制。被俘获的珠子被磁铁磁化了。如果磁珠之间的间隙太窄, 粘附在一起的几率就会高于一些 microwells 的孔, 如图 8b所示。因此, 当使用 1 mm x 1 mm x 1 mm 磁铁时, 不推荐直径为700µm 或以上的珠子
与其他制造方法如柔性膜14、冰光刻18和深反应离子蚀刻20相比, 这种制作方法不需要特殊的光刻设备, 允许微位置易于控制, 并能产生一个标准化的凹微形状。此外, 还提出了对凹形几何形状的生产, 即对硅橡胶的湿蚀刻21、灰度光刻22和背面漫射光光刻23 。然而, 在微的湿刻蚀需要一个长方形结构首先做凹形和圆的, 并且不适合做开放微。灰度光刻方法的优点是利用现有的光刻设备, 但对高价位的设备和灰度相片掩模的需求是一个劣势。背面扩散光光刻是另一个最近报道的方法, 有用的制造凹 microwells 与不同的纵横比, 但只有在低分辨率的模式密度。
凹微加工的关键步骤是选择顶板的厚度和通孔尺寸 (步骤1.1 和 1.3)。如果通孔板太厚, 可以在每个通孔中捕获多个珠子 (图 9a);如果它太薄, 珠子将不会被固定在步骤 2.4, 从而从通孔错位 (图 9b)。在较大的通孔的情况下, 可能会出现多个陷印和位错 (图 9c)。
作为选择磁铁尺寸和通孔板厚度的指南, 建议磁铁的大小和 "通孔板" 的厚度是根据珠子的大小。磁体的尺寸必须大于珠子的直径, 通孔板的厚度不应超过珠粒的直径。然而, 由于选择磁铁和板材厚度是经验, 更详细的优化和参数研究将包括在未来的研究。
我们的方法的未来目标包括制作干细胞生态位类似 microwells 的仿生体外毛囊24, 自定义 microwells 化生成25, 以及各种不同大小的 microwells 阵列, 用于研究肿瘤细胞和免疫细胞对球体大小的依赖性。
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Disclosures
作者没有利益冲突透露。
Acknowledgments
这项研究由科学、ICT 和未来规划部 (NRF-2014R1A1A2057527 和 NRF-2016R1D1A1B03934418) 资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
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